La glándula mamaria

La glándula mamaria:

biofábrica para la producción de

proteínas

Conocer los hospederos que permiten la expresión de proteínas recombinantes y sus mecanismos de acción.

Analizar las ventajas y desventajas de los sistemas de expresión con especial énfasis en la glándula mamaria como biofábrica.

Objetivos

La glándula mamaria se identifica como una alternativa apropiada para la producción de proteínas recombinantes con modificaciones postraduccionales propias de eucariontes superiores.

Introducción

El éxito del ensayo consiste en encontrar el vector adecuado para transferir los genes de interés a las células epiteliales mamarias y que la transducción ocurra de manera masiva y eficiente.

Transferencia in situ

Endocitosis mediada por receptor

Uso de pistolas de genes

Vectores adenovirales

Vectores para transferir los genes de interés a las células epiteliales mamarias:

Los vectores adenovirales podrían ser un punto de partida para el desarrollo de sistemas de producción de proteínas recombinantes en la leche de mamíferos genéticamente modificados, mediante la transducción transiente de la glándula mamaria con vectores adenovirales.

La selección de un organismo u otro para la expresión de proteínas de interés biofarmacéuticos está relacionada con los eventos postraduccionales específicos, necesarios para que ocurran los plegamientos correctos que garanticen la actividad biológica de la molécula.

Expresión de proteínas recombinantes

La especie mas estudiado genética y fisiológicamente Escherichia coli.

Las ventajas de este microorganismos son:

La rápida generación de biomasa.

La fácil manipulación genética.Que no requiere de medios de

cultivo. La alta eficiencia en la

incorporación del el material genético foráneo.

Expresión de proteínas recombinantes en microorganismos procariontes

No expresan muchas de las modificaciones postraduccionales.

No se forman puentes disulfuro entre las cisteínas.

No enlazan oligosacáridos a las proteínas.

Desventajas

Se logro modificar genéticamente las rutas enzimáticas de glicosilación de la Pichia pastoris, como una alternativa novedosa para la producción de proteínas recombinantes en microorganismos eucariontes inferiores, la cual permita la obtención de la proteína de interés con un patrón de glicosilación específico y una elevada homogeneidad.

Expresión de proteínas recombinantes en microorganismos

eucariontes inferiores

Las plantas se consideran uno de los sistemas de producción mas seguros, ya que carecen de secuencias de ADN oncógenas

Plantas como biorreactores para la expresión de proteínas

recombinantes

Ventajas: Bajo costo y capacidad de producción

a gran escala, así como a la simplicidad de la cosecha y el almacenaje.

Desventajas: Tiene la limitación de no generar

perfiles de oligosacáridos de tipo complejo, limitando su utilización como agentes terapéuticos en los seres humanos.

Animales como BiorreactoresLa transferencia del material genético para la generación de animales transgénicos se realiza en etapas iniciales del desarrollo embrionario.Lo anterior favorece el paso de la nueva información a la línea germinal del individuo genéticamente modificado.

Principales aplicaciones de los animales transgénicos:

Obtención de modelos animales

Producción de proteínas recombinantes

Las proteínas recombinantes producidas en animales transgénicos se expresan en las células de un tejido específico y se secretan en un fluido corporal determinado.

Limitaciones de la expresión de proteínas en la sangre:

Separación de la proteína recombinante de su homóloga en el hospedero.

La deficiente estabilidad de las proteínas secretadas al suero sanguíneo.

Expresión de proteínas recombinantes en la glándula

mamariaEn la leche de algunos mamíferos, principalmente rumiantes se pueden llegar a producir de 200 g hasta 1 kg de proteína por día.

Ejemplos de proteínas recombinantes producidas en la glándula mamaria: Hormona del crecimiento humana (hGH) Factor de crecimiento neural Proteína C humanaAntitrombina humana (Ath)Lactoferrina humana.

Transgénesis en la glándula mamaria

La expresión de proteínas recombinantes en la glándula mamaria depende de : Casete de expresión utilizadoMétodo para la transferencia del material genético.

Los promotores más utilizados son aquellos que en condiciones naturales regulan la expresión de las proteínas de la leche.

ASPECTOS IMPORTANTES EN LA TRANSGÉNESIS: La fortaleza de los promotores propios de las

proteínas de la leche, ya que varía entre las diferentes proteínas e incluso entre especies

Para un mismo casete de expresión, los niveles de producción de la proteína recombinante varían de una línea transgénica a otra.

La especificidad de los promotores debido a la homología que presentan algunos transgenes con las proteínas endógenas en el hospedero.

Transferencia génicaMÉTODOS PARA LA TRANSFERENCIA

GÉNICA:

Transferencia de genes por vectores retrovirales

Ventajas: Infectan células quiescentes y en

divisiónPresentan una elevada estabilidad y se

evita el efecto de silenciamiento génico Se ha obtenido 60% de eficiencia en

ratones transgénicos, 70% en cerdos transgénicos y 100% en vacas transgénicas.

Desventajas:• Reducida capacidad de clonación• Las secuencias terminales repetidas

que flanquean le genoma retroviral, interfieren con los promotores de mamíferos y disminuyen la expresión de genes que regulan.

Microinyección de ADN:Consiste en la microinyección del ADN

foráneo en el pronúcleo de embriones unicelulares y la inserción al azar del materia genético en el embrión microinyectado.

Hasta la actualidad este método se ha utilizado como la técnica universal de transferencia horizontal de material genético.

Desventajas: Ineficiencia de integración del transgen

en rumiantes y otras especies mayores Tiempo que transcurre para llegar a

obtener un pequeño rebaño que produzca la proteína recombinante de interés

Se debe disponer de muchas hembras donantes y receptoras.

Técnica de Transferencia nuclear de células somáticas (TNCS)

En la actualidad representa un procedimiento alternativo para crear animales transgénicos.

Ventajas:• Permite la introducción directa de transgenes

a ovocitos anucleados• Permite la selección de los embriones

transformados por los métodos convencionales de biología molecular

• Posibilita la selección del sexo en la línea de fundadores

Desventajas:La metodología es

compleja y demanda equipamiento

Los reactivos son muy caros

En vacas los fetos generados por TNCS, se pierden entre el día 35 y el 60 de gestación

Complicaciones en el embarazo, debido al síndrome de feto gigante; también se observan anomalías pulmonares y deficiencias metabólicas, tanto en fetos como en crías nacidas.

Modificación genética in situ del epitelio glandular mamario

Consiste en transferir el ADN directamente a las células que constituyen el epitelio mamario de una hembra adulta.

Ventajas:• Es aplicable a casi todas las especies de

mamíferos independientemente de su fondo genético.

• Permite la inserción de múltiples casetes de expresión

• Reduce considerablemente el tiempo entre la aplicación del método de modificación y la obtención del producto de interés.

Desventajas: Baja eficiencia de la modificación genética Corto tiempo que se mantiene la

expresión de la proteína heteróloga, lo que genera bajos niveles de producción.

Métodos fundamentales para la modificación genética in situ de la

glándula mamaria1. Transfección por métodos físico –

químicosEntre ellas se encuentran: Transfección in situ con complejos

asociados a poli – iones Endocitosis mediada por receptor La Transfección mediada por pistolas de

genes

2. Transducción basada en vectores virales Vectores retrovirales: Tienen la capacidad

de insertarse en el genoma hospedero, para generar modelos de animales útiles en estudios de cáncer de mama y terapia génica. Tienen la desventaja de que se producen muy bajos niveles de expresión.

Vectores adenovirales: Se emplean en ensayos de terapia génica y constituyen en la actualidad una importante herramienta para la transducción in situ de la glándula mamaria.

Desventajas: Corto tiempo de expresión Imposibilidad de volver a transducir los

animales con el vector adenoviral.

Glicosilación de proteínas recombinantes expresadas en la

glándula mamariaLa función biológica de las

modificaciones del patrón de la glicosilación de las glicoproteínas expresadas en la glándula mamaria no está definida.

La simplificación de la maquinaria enzimática del sistema de endomembranas, que es responsable del perfil de glicosilación de las glicoproteínas secretables, podría facilitar el transporte y secreción de estas proteínas.

ConclusionesLa transferencia del material genético para la

generación de animales transgénicos se realiza en etapas iniciales del desarrollo embrionario.

Los principales Métodos para la transferencia génica son: Transferencia de genes por vectores retrovirales, Microinyección de ADN y Técnica de Transferencia nuclear de células somáticas (TNCS).

Los Métodos fundamentales para la modificación genética in situ de la glándula mamaria: Transfección por métodos físico – químicos y Transducción basada en vectores virales