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WAGNER ANTONIO BERNARDES
ESTUDO FITOQUÍMICO, ENSAIOS FARMACOGNÓSTICOS E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE TRIPANOCIDA DE EXTRATOS DE
Aspidosperma macrocarpon Mart.(APOCYNACEAE)
Dissertação apresentada à Universidade de Franca, como exigência parcial para obtenção do título de Mestre em Ciências.
Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Cássio Sola Veneziani Co-orientador: Prof. Dr. Wilson Roberto Cunha.
Franca 2005
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Catalogação na fonte – Biblioteca Central da Universidade de Franca
Bernardes, Wagner Antonio B444e Estudo fitoquímico, ensaios farmacognósticos e avaliação da atividade
tripanocida de extratos de Aspidosperma macrocarpon mart.(apocynaceae) / Wagner Antonio Bernardes ; orientador: Rodrigo Cássio Sola Veneziani, co-orientador: Wilson Roberto Cunha. – 2005
80 f. : 30 cm.
Dissertação de Mestrado – Universidade de Franca Curso de Pós-Graduação Stricto Sensu na Área de Química de Produtos
Naturais – Mestre em Ciências
1. Química – Farmacognosia (plantas). 2. Aspidosperma macrocarpon. 3. Triterpeno. 3. Atividade tripanocida. I. Universidade de Franca. II. Título.
CDU – 54:615.322:616.937
WAGNER ANTONIO BERNARDES
ESTUDO FITOQUÍMICO, ENSAIOS FARMACOGNÓSTICOS E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE TRIPANOCIDA DE EXTRATOS DE Aspidosperma macrocarpon
Mart.(APOCYNACEAE)
Presidente: ____________________________________________ Nome: Prof. Dr. Rodrigo Cássio Sola Veneziani Instituição: Universidade de Franca - UNIFRAN Titular 1: ___________________________________________
Nome: Prof. Dr. Paulo Sérgio Pereira Instituição: Universidade de Ribeirão Preto - UNAERP Titular 2: ____________________________________________
Nome: Prof. Dr. Élcio Rivelino Rodrigues Instituição: Universidade de Franca - UNIFRAN
Franca, ____/____/____
RESUMO BERNARDES, W.A. Estudo fitoquímico, ensaios farmacognóstico, e avaliação da atividade tripanocida de extratos de Aspidosperma macrocarpon Mart.(Apocynaceae). 2005. 80 f. dissertação de Mestrado em Ciências – Universidade de Franca. A doença de Chagas é um sério problema de saúde pública em países sul americanos, dentre eles o Brasil. O seu agente etiológico é o protozoário Tripanossoma cruzi . O presente trabalho teve como objetivos: avaliar in vitro a atividade tripanocida dos extratos brutos, das frações obtidas e das substâncias puras isoladas; avaliar qualitativamente através de ensaios farmacognósticos o perfil químico do vegetal e fracionar os extratos brutos visando o isolamento e a identificação dos componentes químicos presentes em extratos que apresentarem atividade biológica relevante. As folhas e o caule desse vegetal foram estabilizados, pulverizados e submetido à extração com hexano, diclorometano e etanol. Com os ensaios farmacognósticos observou-se a presença de vários metabólitos secundários como: taninos condensados, flavonóides, alcalóides, quinonas, esteróides livres e triterpenos. No extrato diclorometânico (atividade tripanocida significante) foi isolado um triterpeno (ácido ursólico) sendo sua estrutura elucidada através de análise de espectros de RMN de 1H, 13C e massas. Palavras-chave: Aspidosperma macrocarpon; Triterpeno; Atividade tripanocida.
ABSTRACT BERNARDES, W.A. Estudo fitoquímico, ensaios farmacognóstico, e avaliação da atividade tripanocida de extratos de Aspidosperma macrocarpon Mart.(Apocyaneae). 2005. 80 f. dissertação de Mestrado em Ciências – Universidade de Franca.
Chagas disease, a severe public healthy issue in South American countries (including Brasil) is caused by the protozoan Tripanossoma cruzi. It is important to search for new active compounds to be used in the therapeutics and prevention of this disease. The aim of this work is: in vitro evaluation of tripanocidal activity of the extracts, its fractions and isolated compounds; to perform pharmacognostic assays to obtain a chemical profile of the plant and also to isolate chemical compounds of the most active extracts. The leaves and the stem of Aspidosperma macrocarpon (Apocynaceae) were collected, dried and pulverized and then extracted with hexane, dichloromethane and ethanol. Through pharmacognostic assays, it was possible to detect the presence of condensed tannins, flavonoids, alkaloids, quinines, steroids and triterpenes on those extracts. From the dichloromethane extract (the most active extract against Tripanossoma cruzi) was isolated a triterpene (ursolic acid) identified through mass, RMN 1H and 13C spectrometry. Keywords: Aspidosperma macrocarpon, ursolic acid, tripanocidal activity.
AGRADEÇO aos meus pais Antônio e Nair, meus irmãos Adriana, Charles, Rosimeire e demais familiares, a minha namorada Neide, as minhas amigas Maria Valda, Ilda, Valci, Cleide, Maria Goretti,Terezinha, Maria de Fátima, Iêda e Gisélia pelo incentivo, apoio e paciência ao longo desse período e ao professor Isaías pelo incentivo; ao meu orientador, Prof. Dr. Rodrigo Cássio Sola Veneziani e co-orientador: Prof. Dr. Wilson Roberto Cunha, pela paciência nos momentos de dificuldades, pelo companheirismo, amizade e o tempo dedicado a esse trabalho; aos companheiros de viagem Ronaldo, Jéferson e Lílian pela companhia durante as seis horas semanais de estrada ao longo desses dois anos; ao professores Amir, Alvimar, Jacques Eurípedes e Ivan pelo apoio; ao senhor Silas Brasileiro e sua equipe Karina, Glauce e Dora pela valiosa colaboração; à Secretaria De Estado da Educação por ter concedido o meu afastamento durante um ano desse curso o que muito contribuiu para a sua conclusão; aos professores Dr. Marcos e Dr. Élcio pela contribuição durante a qualificação; á professora Drª Alba pela identificação da planta e o professor Dr. Sérgio pelos ensaios. aos professores e colegas do mestrado pelo incentivo; aos técnicos do laboratório Lécio e Izabel pela colaboração; aos alunos do curso de Ciências Biológicas em especial o 8º período pelo apoio e compreensão.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Vegetação do Cerrado........................................................................ 04Figura 2 Distribuição das áreas de cerrado no Brasil........................................ 05Figura 3 A Exemplar de Aspidosperma macrocarpon Mart.................................. 07Figura 3 B Exemplar de Aspidosperma macrocarpon Mart.................................. 08Figura 4 Inflorescência de Aspidosperma macrocarpon Mart........................... 08Figura 5 A Fruto de Aspidosperma macrocarpon Mart........................................ 09Figura 5 B Fruto e semente de Aspidosperma macrocarpon Mart....................... 09Figura 6 Exemplares fêmea e macho respectivamente da espécie Triatoma
infestans.............................................................................................. 11Figura 7 Exemplares fêmea e macho respectivamente da espécie Rhodnius
prolixus................................................................................................ 12Figura 8 Exemplar fêmea da espécie Panstrongylus megistus......................... 12Figura 9 Formas amastigotas do Trypanosoma cruzi desenvolvendo-se
em uma fibra muscular lisa do intestino grosso..................................
13
Figura 10 Forma epimastigota do protozoário encontrada no intestino dos triatomídeos.........................................................................................
14
Figura 11 Trypanosoma cruzi no sangue, em sua fase tripomastigota, apresentando a forma fina................................................................... 14
Figura 12 Trypanosoma cruzi, na fase tripomastigota sangüícola,apresentan- do a forma larga.................................................................................. 15
Figura 13
Estrutura química das drogas usadas no controle da doença de Chagas...............................................................................................
17
Figura 14 Frações do extrato etanólico nos tubos: 1,2,3,4,5,6 e 7..................... 38Figura 15 Testes nas Frações do extrato etanólico nos tubos: 1,2,3,4,5,6 e 7... 38
Figura 16 Frações do extrato etanólico. Testes com reagente de Hager e Meyer...................................................................................................
41
Figura 17 Frações do extrato etanólico hidrolisado............................................. 43
Figura 18 Testes nas Frações do extrato etanólico hidrolisado nos tubos: 1,2,3,4,5,6 e 7......................................................................................
45
Figura 19 Frações do extrato diclorometânico.Testes com reagente de Hager e Meyer respectivamente...............................................................
47
Figura 20 Testes nas Frações do extrato diclorometânico para constituintes fenólicos em meio alcoólico nos tubos: 1,2,3,4,5,6 e 7.......................
48
Figura 21 Testes nas Frações do extrato diclorometânico após hidrólise alcalina dos constituintes neutros........................................................
51
Figura 22 Frações do extrato diclorometânico após hidrólise alcalina dos constituintes neutros em resíduos saponificáveis...............................
52
Figura 23 Testes para fenóis nas frações do extrato diclorometânico após hidrólise alcalina dos constituintes neutros em resíduos saponificáveis......................................................................................
52
Figura 24 Gráfico da avaliação in vitro da atividade tripanocida dos extratos brutos hexânico, diclorometânico e etanólico......................................
54
Figura 25 Gráfico da avaliação in vitro da atividade tripanocida das frações do extrato diclorometânico.......................................................................
55
Figura 26 Cromatograma das frações diclorometano/acetato de etila 1:1 e acetato de etila respectivamente obtidas do extrato diclorometânico...................................................................................
56
Figura27 Cromatograma do precipitado branco obtido do fracionamento da fração diclorometano/acetato de etila 1:1............................................
57
Figura 28 Cromatograma Mistura ácido ursólico + oleanóico (Padrão) e precipitado branco...............................................................................
57
Figura 29 Esqueleto tipo ursano.......................................................................... 58Figura 30 Estrutura do ácido ursólico.................................................................. 59
LISTA DE ORGANOGRAMAS
Organograma 01 Abordagem Fitoquímica – Extrato Etanólico............................. 42Organograma 02 Abordagem Fitoquímica – Extrato Etanólico Hidrolisado.......... 46Organograma 03 Abordagem Fitoquímica – Extrato Diclorometânico.................. 50Organograma 04 Abordagem Fitoquímica – Extrato Diclorometânico (hidrólise
alcalina).....................................................................................
53
LISTA DE QUADROS
Quadro 01 Testes efetuados nos tubos de ensaio............................................... 24Quadro 02 Método de análise do resultado do teste efetuado no tubo1.............. 25Quadro 03 Método de análise dos resultados dos testes efetuados nos tubos
2, 3, 4 e 5............................................................................................
25Quadro 04 Método de análise dos resultados dos testes efetuados nos tubos 6
e 7.......................................................................................................
25Quadro 05 Resultados dos Ensaios Farmacognósticos Extrato Etanólico.......... 38Quadro 06 Resultados dos Ensaios Farmacognósticos Extrato Etanólico
Hidrolisado..........................................................................................
45
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 Massas dos extratos brutos obtidos de Aspidosperma macrocarpon.. 23Tabela 02 Massas obtidas do fracionamento do extrato diclorometânico............ 35Tabela 03 Dados dos principais sinais de RMN 13C da substância isolada
(DMSO, δ ppm, 100 MHz) e valores de δ da literatura para o ácido ursólico.................................................................................................
59
LISTA DE ABREVIATURAS
CCDC – Cromatografia em Camada Delgada Comparativa
CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CLV – Coluna Líquida a Vácuo
DMSO – Dimetilsulfóxido
EM – Espectrômetro de Massas
RMN13C – Ressonância Magnética Nuclear de Carbono
RMN1H – Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
RPMI – Roswell Park Memorial Institute
UV – Ultravioleta
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO....................................................................................................... 01
1 CONSIDERACÕES GERAIS.................................................................. 01
2 O ECOSSISTEMA CERRADO............................................................... 03
3 A FAMÍLIA APOCYNACEAE E O GÊNERO ASPIDOSPERMA............. 06
4 DOENÇA DE CHAGAS........................................................................... 10
5 ENSAIOS FARMACOGNÓSTICO.,FITOQUÍMICA E BIOMONITORA -
MENTO...................................................................................................
18
OBJETIVOS........................................................................................................... 20
MATERIAL E MÉTODOS....................................................................................... 21
1 ESPECIFICAÇÕES................................................................................ 21 1.1 Instrumentos........................................................................... 21 1.2 Colunas e fase estacionária.................................................... 21 1.3 Solventes e reagentes............................................................ 22
2 COLETA E PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS....................................... 22 3 ENSAIOS FARMACOGNÓSTICOS NO EXTRATO ETANÓLICO......... 23
3.1 Operações preliminares ............................................................. 23 3.2 Testes efetuados......................................................................... 23 3.3 Ensaios para saponinas.............................................................. 26 3.4 Testes para alcalóides................................................................ 27
4 ENSAIOS FARMACOGNÓSTICOS NO EXTRATO ETANÓLICO HI -
DROLISADO........................................................................................... 28
4.1 Operações preliminares ............................................................. 28 4.2 Testes para quinonas.................................................................. 28 4.3 Testes para cumarinas................................................................ 28 3.4 Testes para aglicanas e flavanóides........................................... 29
5 ENSAIOS FARMACOGNÓSTICOS NO EXTRATO DICLOROMETÂ -
NICO.......................................................................................................
29
5.1 Operações preliminares ............................................................. 29 5.2 Separação de ácidos fixos fracos e fenóis.................................. 30 5.3 Testes para constituintes fenólicos (em meio alcoólico)............. 30
5.4 Testes para constituintes fenólicos (em meio imiscível com
água) ........................................................................................ 30
5.4.1 Teste para quinonas......................................................... 31 5.4.2 Teste para antranois........................................................ 31 5.4.3 Teste para cumarinas....................................................... 31
6 ENSAIOS FARMACOGNÓSTICO NO EXTRATO DICLOMETÂNICO
HIDRÓLISE ALCALINA.......................................................................... 32
6.1 Separação do Insaponificável..................................................... 32 6.1.1 Teste de esteróides e triterpenos..................................... 33
6.2 Separação dos ácidos do material saponificado......................... 33 6.21 Testes para fenóis............................................................. 33
7 ENSAIOS BIOLÓGICOS........................................................................ 34 8 FRACIONAMENTO E ISOLAMENTO.................................................... 35
8.1 Coluna cromatográfica à vácuo – sílica gel 60............................ 35 8.2 Coluna cromatográfica à vácuo................................................... 36
RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................. 37 1 CONSIDERAÇÕES GERAIS................................................................. 37 2 ENSAIOS FARMACOGNÓSTICOS NO EXTRATO ETANÓLICO......... 37 3 ENSAIOS FARMACOGNÓSTICOS NO EXTRATO ETANÓLICO HI -
DROLISADO...........................................................................................
43
4 ENSAIOS FARMACOGNÓSTICOS NO EXTRATO DICLOMETÂNICO 47 5 ENSAIOS FARMACOGNÓSTICO NO EXTRATO DICLOROMETÂNI -
CO HIDRÓLISE ALCALINA....................................................................
51
6 RESULTADOS DOS ENSAIOS BIOLÓGICOS...................................... 54 6.1 Avaliação in vitro da atividade tripanocida dos extratos brutos... 54 6.2 Biomonitoramento da atividade tripanocida das frações............. 55
7 RESULTADOS DO FRACIONAMENTO DOS EXTRATOS ATIVOS..... 56 8 ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DA SUBSTÂNCIA ISOLADA................. 58
CONCLUSÕES ...................................................................................................... 60
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................... 61
ANEXOS................................................................................................................. 64
INTRODUÇÃO 1 CONSIDERAÇÕES GERAIS.
É provável que a utilização das plantas como medicamento e tão antiga
quanto o próprio homem. Numerosas etapas marcaram a evolução da arte de curar;
porém, torna-se difícil delimitá-las com exatidão, já que a medicina esteve por muito
tempo associada a práticas mágicas, místicas e ritualísticas[1].
Há mais de 3000 anos a.C. os chineses já faziam uso e cultivavam
plantas medicinais, que hoje ainda são utilizadas com eficácia tanto na medicina
popular, como por laboratórios de produtos farmacêuticos.Também os egípcios,
assírios e hebreus, desde 2300 a.C., faziam uso e cultivavam plantas como
medicamentos para cura de várias enfermidades, além de trazerem de suas
expedições outras tantas, as quais introduziam nas suas regiões. Já nessa época
fabricavam cosméticos e embalsamavam seus mortos com preparados à base de
plantas; outras eram usadas como especiarias de cozinha. Entre 460-375 a.C., o
valor terapêutico ou tóxico das plantas tornou-se bem conhecido através da obra
“Corpus Hipocrateum” em que Hipócrates indica para cada enfermidade, o
tratamento adequado. Dioscórides, no começo da Era Cristã, listou em seu tratado
“De Matéria Médica” mais de 500 drogas de origem vegetal, indicando o valor
terapêutico de muitas delas. Na Idade Média na Europa, os druidas e curandeiros
mantinham em segredo a formulação de várias porções curativas preparadas à base
de plantas medicinais. A medicina e o estudo de plantas medicinais nessa época
estagnaram-se. Após essa época apenas alguns mosteiros na Europa mantiveram
viva a literatura medicinal [1].
No Brasil, antes mesmo do seu descobrimento, os índios utilizavam
plantas para cura de doenças, para o preparo de corantes e para ajudar na pesca,
1
além disso, tais conhecimentos eram passados de geração a geração. Com a
colonização do Brasil, a utilização das plantas, para tratamento de doenças,
fundamentalmente apresenta influências não só da cultura indígena, mas também
da africana e européia [1].
O Brasil apresenta imensa disponibilidade de tais recursos que
precisam ser estudados sob o ponto de vista químico e terapêutico. Tais estudos
devem ser realizados urgentemente devido ao declínio e desequilíbrio que os
ecossistemas sofrem (o que leva a extinção de espécies). Também é importante que
instituições e pesquisadores brasileiros realizem tais estudos na tentativa de se
evitar que laboratórios se aproveitam da falta de regulamentação sobre
biodiversidade para patentear plantas com substâncias medicinais utilizadas na
medicina popular e indígena, sem nada pagar ao país de origem. Exemplos podem
ser citados, como os da muirapuama, planta amazônica, patenteada no Japão como
remédio para impotência ou o quebra-pedra patenteado nos EUA para tratamento da
hepatite. Nestes casos, o lucro é somente dos laboratórios, que repassam à
população os altos custos dos medicamentos industrializados, e os países de onde
as substâncias originais são retiradas perdem, anualmente, uma quantia avaliada de
5,4 milhões de dólares em royalties [2].
A magnitude da diversidade brasileira não é conhecida com precisão,
tamanha a sua complexidade, estimando-se a existência de mais de dois milhões de
espécies distintas de plantas, animais e microorganismos. O Brasil é o país com a
maior diversidade genética vegetal do mundo, contando com mais de 55.000
espécies catalogadas [3], de um total estimado entre 350.000 e 550.000.
Considerando-se que mais da metade dessas espécies se encontra nas florestas
tropicais, cuja área corresponde a apenas 7% da superfície da terra [4], essas
regiões devem ser consideradas como prioritárias no estabelecimento de programas
de conservação in situ de germoplasma vegetal.
As plantas são uma fonte importante de produtos naturais
biologicamente ativos, muitos dos quais se constituem em modelos para a síntese
de um grande número de fármacos. Pesquisadores da área de produtos naturais
mostram-se impressionados pelo fato desses produtos encontrados na natureza
revelarem uma gama quase que inacreditável de diversidade em termos de estrutura
2
e de propriedade físico-químicas e biológicas [5]. Apesar do aumento de estudos
nessa área, os dados disponíveis revelam que apenas 15% a 17% das plantas
foram estudadas quanto ao seu potencial medicinal [4].
Ao se considerar a perspectiva de obtenção de novos fármacos, dois
aspectos distinguem os produtos de origem natural dos sintéticos: a diversidade
molecular e a função biológica. A diversidade molecular dos produtos naturais é
muito superior àquela derivada dos processos de síntese, que, apesar dos avanços
consideráveis, ainda é limitada. Além disso, como produtos de organismos que
possuem muita similaridade com o metabolismo dos mamíferos, os produtos
naturais muitas vezes exibem propriedades adicionais às antimicrobianas a eles
associadas [6].
No Brasil, estima-se que 25% dos US$ 8 bilhões de faturamento, em
1996, da indústria farmacêutica nacional, sejam originados de medicamentos
derivados de plantas. Apenas 8% das espécies vegetais da flora brasileira foi
estudada em busca de compostos bioativos e 1.100 espécies vegetais foram
avaliadas em suas propriedades medicinais [7]. Destas, 590 plantas foram
registradas no Ministério de Saúde para comercialização [8].
2 O ECOSSISTEMA CERRADO.
O Brasil possui uma grande diversidade de espécies de plantas que
cobrem sua extensa área territorial, dividida atualmente em seus complexos
ecossistemas: a floresta amazônica, o cerrado, a caatinga, a floresta atlântica, o
pantanal matogrossense e as pradarias de campo limpo [1].
Estima-se que o cerrado contribui com 10.000 espécies de plantas das
60.000 fanerógamas distribuídas pelo país. Sendo uma vegetação que ocupa 1/5 do
território brasileiro e situa em regiões de maior desenvolvimento do Brasil Central, é
natural que as espécies que compõem essa vegetação exerçam forte influência na
medicina popular [1].
3
Pequenas árvores de troncos torcidos e recurvados, de folhas grossas,
esparsas em meio a uma vegetação rala e rasteira, misturando-se às vezes, com
campos limpos ou matas de árvores não muito altas – esses são os cerrados (fig. 1),
uma extensa área de cerca de 200 milhões de hectares, equivalente, em tamanho, a
toda a Europa Ocidental. A paisagem é agressiva e por isso, durante muito tempo,
foi considerada uma área perdida para a economia do país [9].
Os cerrados apresentam relevos variados, embora predominem os
amplos planaltos. Metade do cerrado situa-se entre 300 e 600m acima do nível do
mar, e apenas 5,5% atinge uma altitude acima de 900m. Em pelo menos 2/3 da
região, o inverno é demarcado por um período de seca que prolonga-se por cinco a
seis meses. Seu solo esconde um grande manancial de água, que alimenta seus
rios[9].
A área total é de aproximadamente 2.100.000 km2, com ação antrópica:
700.000 km2 (fig.2) [9].
Figura 1
– Vegetação do Cerrado.
4
Figura 2 – Distribuição das áreas de cerrado no Brasil. Fonte: Ministério do Meio Ambiente. Disponível em: <http://www.mma.org.br>..
Nesse complexo vegetacional encontram-se uma grande variedade de
sistemas ecológicos, variados tipos de solos, climas, relevo e altitude, prevalecendo
em toda sua extensão uma combinação peculiar de condições edáficas e climáticas,
que deu origem à vegetação que a caracteriza – uma vegetação xeromorfa, que
ocorre preferencialmente em clima estacional (mais ou menos seis meses secos),
podendo, não bastante, ser encontrada também em clima ombrófilo[1].
A concentração de princípios ativos ou fármacos na planta depende do
controle genético e dos estímulos proporcionados pelo meio ambiente. Esses
estímulos são caracterizados como situações de estresse, ou seja, excesso ou
deficiência de algum fator de produção para a planta [1].
A grande variedade de sistemas ecológicos no ambiente de cerrado e
a capacidade das plantas que nele vivem, em produzir metabólitos para garantir sua
sobrevivência, justifica o grande interesse em estudos fitoquímicos desse tipo de
vegetação.
5
3 A FAMÍLIA APOCYNACEAE E O GÊNERO ASPIDOSPERMA.
A família Apocynaceae compreende 300 gêneros com mais de 2000
espécies de distribuição marcadamente tropical e subtropical em todo o mundo. São
plantas de hábito variado, ervas, subarbustos, árvores e trepadeiras, na maioria
latescentes e vivem tanto nos campos como nas matas. No Brasil, ocorrem cerca de
376 espécies subordinadas a 41 gêneros[10,11].
Aspidosperma é um gênero de cerca de 43 espécies de distribuição
neotropical [10].
A espécie Aspidosperma macrocarpon Mart. é popularmente chamada:
amargosa, bolsinha, guatambu, orelha de elefante, pau-pereira, pereiro, peroba,
peroba-amargosa, peroba-cetim, peroba-comum, peroba-mirim, peroba-miúda,
peroba-do-rio, peroba-rosa e peroba-de-são-paulo [12].
É uma árvore hermafrodita (fig. 3 A e 3B) de até 15 metros, pubescente
ou velutino, salvo a face ventral das folhas, face anterior do perianto, androceu, face
interna do fruto e semente glabras; tronco e ramos suberosos e látex branco. As
folhas são alternas, simples, pecioladas; limbo com 9 a 23 x 5 a 16 cm, oval ou
aboval, cartáceo a coriáceo; ápice geralmente arredondado a obtuso; base obtusa a
subcordada; nervação igualmente elevada em ambas as faces, nervuras
secundárias 6 a 15 pares, ascendentes, com tendência à bifurcação, formando uma
nervura submarginal; nervuras terciárias pouco evidentes e pecíolo com 1 a 3,2 cm
de comprimento. A inflorescência cimeira congesta, pedunculada, com 30 a 50
flores(fig. 4). Essas com cerca de 1,5 cm, actinomorfas; 5 sépalas, livres, elíptica,
agudas; corola branca, tubulosa, com 5 lobos elípticos-lineares, de prefloração
torcida e fauce calosa; 5 estames, inclusos; filetes curtos, anteras abcordadas,
rimosas, introrsas; ovário súpero; 2 carpelos livres, multiovulados; 1 estilete; 1
estigma, em carretel. O fruto folículo com até 18 cm de comprimento, cinza-escuro,
hemicordado, compresso; valvas crustáceo-lenhosas, de superfície rugosa (fig. 5 A e
5B). As sementes (fig. 5B), com aproximadamente 6,7 a 9 cm de comprimento,
cremes, longo-funiculadas, arredondadas, planas, aladas; núcleo seminífero central;
ala circunjacente, ondulada, margens recortadas [12].
6
A floração ocorre normalmente de agosto a outubro com pico em
outubro, em alguns anos iniciando-se mais cedo, em maio, junho ou julho [13].
A frutificação ocorre principalmente entre março e junho (época seca),
após longo período de maturação [12].
Encontra-se no bioma cerrado e cerradão distróficos, sendo
amplamente distribuída nos seguintes estados: Bahia, Goiás, Maranhão, Mato
Grosso, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, Pará, Piauí, São Paulo, Tocantins e no
Distrito Federal [12].
Sua madeira é usada na construção civil e naval, como cabos de
ferramentas, dormentes, marcenaria, carpintaria, confecção de peças flexíveis e
xilografia. A árvore é ornamental por apresentar copa com folhas prateadas,
principalmente quando novas. Pode ser aproveitada para o paisagismo, em geral, e
para plantios mistos em áreas degradadas de preservação permanente. Em
artesanato, os frutos e as sementes são utilizados na montagem de arranjos [12].
As plantas do gênero Aspidosperma apresentam importância como
detentoras de alcalóides [13,14], grupo de substâncias com notórias aplicações
antimicrobianas. Esses aspectos fundamentam um estudo aprofundado dessas
plantas.
Figura 3 A – Exemplar de Aspidosperma macrocarpon Mart..
7
Figura 3 B – Exemplar de Aspidosperma macrocarpon Mart..
Figura 4 – Inflorescência de Aspidosperma macrocarpon Mart..
8
Figura 5 A – Fruto de Aspidosperma macrocarpon Mart..
Figura 5 B – Fruto e semente de Aspidosperma macrocarpon Mart..
9
4 DOENÇA DE CHAGAS.
A doença de Chagas ou tripanossomíase é uma zoonose que tem
como agente
, seu transmissor e seu
diagnóstico f
O parasito faz parte de um ecossistema exclusivamente americano,
sendo encon
gas humana é encontrada nos seguintes
estados: Rio
hagas afeta mais de 18
milhões de
ínicas, os fatores
prognosticad
etiológico o protozoário Trypanosoma cruzi .
A doença assim como seu agente etiológico
oram descritos pelo pesquisador Carlos Ribeiro Justiniano das Chagas,
em 1909.
trado em extensas áreas do continente, desde o sul dos Estados
Unidos até o sul da Argentina e do Chile.
No Brasil, a doença de Cha
Grande do Sul, parte de Santa Catarina e Paraná, São Paulo, Minas
Gerais, Goiás e estados do Nordeste. Na Amazônia, a doença de Chagas humana é
rara, mas muito comum entre os animais silvestres [15,16].
Dados estatísticos indicam que a doença de C
pessoas nas Américas causando aproximadamente 400.000 mortes
anualmente [17]. No Brasil, um estudo realizado no Município de Londrina (PR), em
1995, apresenta uma estatística, na qual 834 crianças, de idade entre 7 e 14 anos,
apresentaram sorologia positiva para doença de Chagas. Nas Américas, em torno
de 100 milhões de pessoas no continente estão expostas ao risco de serem
infectadas [17,18]. Entre os 211 milhões de habitantes do cone sul do continente
americano, 11 milhões estão infectados e cerca de 54 milhões correm o risco de
também serem, representando 31% da população. De acordo com a Organização
Mundial de Saúde, mais de 50 mil pessoas morrem anualmente em conseqüência da
doença de Chagas [18]. Acima de 6 milhões de pessoas foram infectadas só no
Brasil e próximo de 30% desenvolveram lesões especialmente no músculo do
coração, que caracteriza a fase crônica, incurável da doença [17].
Durante os últimos 80 anos, as manifestações cl
os, complicações e muitos outros aspectos da fase crônica da doença,
tem sido estudados. No entanto, no final da década de 20, em vez de alcançar o
10
controle ou erradicação da doença, há em diversos países da América Latina, tanto
casos agudos como aqueles reportados no começo do século [19].
Um estudo com pessoas acima de 74 anos, na região de Ribeirão
Preto, Estado de São Paulo, revelou que 13 % das doenças cardíacas eram
decorrentes da doença de Chagas [20].
A doença é normalmente transmitida através de seu vetor o triatomíneo
conhecido com “barbeiro”, pertence à ordem Hemiptera, família Reduviidae e à
subfamília Triatominae. É um inseto grande, medindo de 1 a 4 centímetros de
comprimento. Pode ser facilmente distinguido de outros hemípteros por ser
hematófago e possuir uma probóscida retilínea com apenas três segmentos. Os
gêneros de maior interesse para a medicina são: Triatoma, Panstrongylus e
Rhodnius, reconhecíveis pela morfologia da cabeça. As espécies mais eficientes no
contágio humano são Rhodnius prolixus, Triatoma infestans e Panstrongylus
megistus (fig. 6,7 e 8). O contágio ocorre habitualmente durante o repasto sangüíneo
ou logo após, momento em que o inseto normalmente defeca [15].
Figura 6 – Exemplares fêmea e macho respectivamente da espécie Triatoma infestans.
Fonte: REY , 1991,prancha V, foto D.
11
Figura 7 –Exemplares fêmea e macho respectivamente da espécie Rhodnius prolixus. Fonte: REY, 1991, prancha V, foto F.
Figura 8 – Exemplar fêmea da espécie Panstrongylus megistus Fonte: http: // www.sucem.sp.gov.br/doença /chagas acesso 09/09/2004.
12
O parasito é um flagelado da classe Mastigophora, família
Trypanosomatidae e pertence ao subgênero Schizotrypanum [15].
Em seu ciclo vital, o parasito exibe formas amastigota, epimastigota e
tripomastigota, ou de transição entre elas (fig. 9,10,11 e 12).
No organismo dos vertebrados (reservatórios naturais), os parasitos
assumem a forma de tripomastigotas (no sangue) ou de amastigotas (no interior de
diversos tecidos), enquanto que nos insetos triatomídeos encontram-se no tubo
digestivo principalmente como epimastigotas ou tripomastigotas [15].
Figura 9 – Formas amastigotas do Trypanosoma cruzi desenvolvendo-se em uma fibra muscular lisa do intestino grosso. Fonte: REY, 1991, prancha IV.
13
Figura 10 – Forma epimastigota do protozoário, encontrada no intestino dos triatomíneos.
Figura 11 – Trypanosoma cruzi no sangue, em sua fase tripomastigota, apresentando a forma fina. Fonte: REY, 1991, prancha V, foto A.
14
Figura 12 – Trypanosoma cruzi, na fase tripomastigota sangüícola, apresentando a forma larga. Fonte: REY, 1991, prancha V, foto B.
Segundo o Ministério da Saúde, a transmissão através do barbeiro está
sob controle em nosso país, restringindo-se apenas a algumas áreas endêmicas.
Entretanto uma outra maneira de se contrair a doença, ainda mais preocupante por
atingir grandes centros urbanos, é através de transfusão de sangue contaminado em
hospitais, apesar da realização de testes sorológicos com doadores [21].
A transfusão sangüínea constitui o segundo mecanismo de importância
epidemiológica na transmissão da doença de Chagas. O risco varia com o nível de
parasitemia dos doadores, com o volume de sangue transfundido e com o número
de transfusões feitas. A população de alto risco é representada principalmente pelos
hemofílicos e por outros pacientes poli-transfundidos [15]. Além dos testes
sorológicos, a adição de substâncias químicas no sangue armazenado é realizado
com a finalidade de se eliminar o parasita, sendo uma medida profilática que pode
prevenir esse mecanismo de transmissão. Atualmente, a violeta genciana (fig. 13-3)
é a única substância empregada com tal propósito. Ela é eficaz, mas pode causar
efeitos indesejáveis nos pacientes, pois, sendo um corante, deixa o sangue com
uma coloração púrpura podendo os pacientes adquirir essa coloração
temporariamente em sua pele e mucosas. Também foi descrito seu efeito
carcinogênico em roedores [22].
15
Outra modalidade de transmissão é a congênita, que ocorre quando
existem ninhos de amastigotas na placenta, que liberam tripomastigotas em nível da
placenta fetal. Nesses casos pode haver aborto, maceração do feto, prematuridade
ou natimortos. A mortalidade após o nascimento é alta. Mais de cem casos já foram
assinalados no Brasil e no Chile. A transmissão oral pode acontecer em várias
situações como amamentação, pois o Trypanosoma cruzi já foi encontrado em leite
materno na fase aguda da infecção; animais ingerindo triatomíneos infectados;
canibalismo entre diferentes espécies de animais; pessoas ingerindo alimentos
contaminados com fezes ou urina de triatomíneos infectados [15]. Em março de
2005 a imprensa nacional noticiou uma possível contaminação por transmissão oral
no Estado de Santa Catarina, município de Navegantes. A vigilância sanitária até o
momento acredita que a contaminação ocorreu por ingestão de caldo de cana
contaminado.
O transplante de órgãos pode desencadear fase aguda grave, pois o
indivíduo que recebe um órgão transplantado infectado, toma drogas
imunodepressoras e, conseqüentemente, torna-se menos resistente à infecção [15].
Acidentes de laboratório também podem ocorrer entre pesquisadores e
técnicos que trabalham com o parasito, seja no sangue de animais, pessoas
infectadas, meios de cultura ou vetor. A contaminação pode se dar por contato do
parasito com a pele lesada, mucosa oral ou ocular e auto – inoculação [15].
A transmissão pelo coito foi comprovada experimentalmente, em
animais. Porém, na espécie humana, não há relatos [15].
A terapêutica da doença de Chagas continua parcialmente ineficaz,
apesar dos ingentes esforços que vêm sendo desenvolvidos por vários laboratórios e
pesquisadores, em especial de brasileiros, argentinos e chilenos [15].
Diversas drogas vêm sendo testadas em animais e, algumas delas já
estão sendo usadas no homem, mas nenhuma consegue suprimir a infecção pelo
Trypanosoma cruzi e promover uma cura definitiva [15].
Duas das drogas que já estão sendo usadas são o Nifurtimox (fig.13-1)
e o Benzonidazol (fig.13-2). Estes medicamentos são indicados especialmente nos
casos agudos que tenham ocorrido por transmissão natural, por transfusão
sangüínea ou acidental. Precocemente, o objetivo é diminuir a infecção. Nos casos
16
crônicos, apesar da pouca eficiência dos medicamentos, é aconselhável o seu
emprego, principalmente em crianças ou nos acometidos com a forma indeterminada
da doença [16].
OO2N N
H
N
S OO
CH3
N
NNO2
NH
O
(1) Benzonidazol(2) Nifurtimox
NNCH3
CH3CH3
H3C
NH3C CH3
+
(3) Violeta de Genciana
Figura 13 - Estrutura química das drogas usadas no controle da “Doença de Chagas”.
O Nifurtimox tem efeito supressivo na fase aguda da infecção,
provocando queda da temperatura e acelerando o desaparecimento das outras
manifestações clínicas. Age contra as formas sanguíneas e parcialmente contra as
formas teciduais. Os efeitos colaterais (que aumentam com doses mais prolongadas)
são: anorexia, emagrecimento, parestesias, hiperexcitabilidade e depressão
medular. Recentemente, esta droga foi retirada do mercado. Tanto os testes de
laboratório como os ensaios clínicos têm revelado que a eficiência dessa droga varia
com a linhagem do parasito. Por seus efeitos colaterais e necessidade de
acompanhamento laboratorial, ela não pode ser utilizado nos tratamentos de larga
escala e nos casos individuais, requerem consentimento esclarecido do paciente ou
de seus responsáveis [15].
O Benzonidazol tem a mesma eficiência que o Nifurtimox no tratamento
da infecção. Possui efeito apenas contra as formas sanguíneas. Nos casos agudos,
17
esta droga produz remissão rápida da febre e dos outros sintomas, ao mesmo tempo
em que cai a parasitemia. Em 10% dos casos, entretanto, mantém-se a parasitemia,
sem que se saiba se a razão está em um déficit de absorção da droga ou na
resistência de algumas linhagens do Trypanosoma cruzi. Os efeitos colaterais
observados são: anorexia, perda de peso, vertigens, dermatites urticariformes,
cefaléia, sonolência e dores abdominais [15].
O grande número de pessoas contaminadas, as diversas formas de
contágio e a terapêutica que continua parcialmente ineficaz tornam a doença de
chagas um problema de saúde pública nos países sul americanos, justificando os
estudos que objetivam a busca de substâncias ativas para terapia e profilaxia da
doença.
5 ENSAIOS FARMACOGNÓSTICOS, FITOQUÍMICA E BIOMONITORAMENTO.
Nos primórdios da humanidade, as doenças eram mandadas pelos
maus espíritos e forças sobrenaturais. O corpo era regido pelos deuses e a saúde
dos homens dependia de uma boa relação com eles. Era aí que entravam os ofícios
de sacerdotes e xamãs, médicos do corpo e da alma que tinham aprendido com os
animais o que podia ou não ser ingerido. Por meio das plantas, invocavam entidades
do além capazes de tratar a pessoa doente. Mas logo se constatou que, se as
plantas curavam, também podiam matar. Era preciso testá-las uma a uma, até que
se descobrisse seu efeito. O aprendizado envolveu um doloroso exercício de
tentativa e erro – e assim foi sendo desenhada a história da medicina [23].
O termo farmacognosia foi criado em 1815 para designar a ciência que
estudava as matérias de origem natural, usadas no tratamento de enfermidades.
Este termo atualmente se refere com exclusividade às matérias de origem vegetal e
animal. A história, a produção, o armazenamento, a comercialização, o uso, a
identificação, avaliação e o isolamento de princípios ativos de drogas são aspectos
tratados em farmacognosia [24]. Os ensaios farmacognósticos usados nesse
trabalho, foram feitos com o objetivo de definir qualitativamente os principais
18
metabólitos secundários produzidos pelo vegetal. A partir desses ensaios definiu-se
o perfil químico da planta, direcionando os trabalhos de fracionamento e
biomonitoramento.
A pesquisa fitoquímica tem por objetivos conhecer os constituintes
químicos de espécies vegetais ou avaliar a sua presença [25]. O estudo químico de
plantas tem despertado ao longo da história o interesse de farmacêuticos, químicos,
médicos, agrônomos e mais recentemente de leigos, com vistas à descoberta ou à
justificativa das atividades usadas como medicinais [26].
Uma das principais aplicações destes estudos se encontra no âmbito
das ciências farmacêuticas, responsáveis pela criação e produção de novos
medicamentos de origem vegetal, seja freqüentemente subestimada. Numerosas
substâncias deste tipo fazem parte do arsenal terapêutico da medicina do século XX.
Rutina, papaína, morfina, codeína, pilocarpina, reserpina, ergonovina, d-
tubocurarina, digitoxina, vincaleucoblastina, vincristina, atropina etc., são apenas
algumas delas entre muitas [26].
Para uma grande parte dessas aplicações, torna-se necessária a
utilização de métodos de separação, purificação e identificação dos produtos
naturais presentes em plantas e outros organismos. Dessa forma, o
desenvolvimento do estudo químico de plantas (fitoquímica) está diretamente
relacionado à utilização e ao desenvolvimento de técnicas rápidas e precisas, que
permitam o isolamento de compostos de interesse, normalmente presente em
pequenas quantidades, concomitantemente com constituintes químicos já
conhecidos e de grande ocorrência em plantas [27].
Os processos de fracionamento de extratos vegetais com vistas ao
isolamento de substâncias ativas, podem ser monitorados por ensaios direcionados
para avaliação da atividade biológica [28]. Mais recentemente, também vem sendo
utilizado o monitoramento das frações por cromatografia líquida de alta eficiência
acoplada a espectrômetro de massas (CLAE/UV/EM) ou de ressonância magnética
nuclear (CLAE/RMN). Essa combinação possibilita direcionar as operações de
fracionamento para o isolamento daqueles compostos considerados de maior
interesse em função dos dados espectrais obtidos [29].
19
OBJETIVOS Os objetivos do estudo da espécie Aspidosperma macrocarpon Mart. foram:
A. Avaliar in vitro a atividade tripanocida dos extratos brutos, das frações obtidas e
das substâncias puras isoladas.
B. Avaliar qualitativamente através de ensaios farmacognósticos o perfil químico do
vegetal.
C. Fracionar os extratos brutos visando o isolamento e a identificação dos
componentes químicos presentes em extratos que apresentarem atividade
biológica relevante.
20
21
MATERIAL E MÉTODOS 1 ESPECIFICAÇÕES 1.1 Instrumentos
- As concentrações das soluções foram efetuadas em evaporador rotativo sob
pressão reduzida (Marconi, MA 120).
- Revelador CCDC, lâmpada de UV (254 a 366 nm), Mineralight, modelo UVGL –
25.
- Espectro de RMN de 1H e 13C, foram obtidos em espectrômetro BRÜCHER DPX
e DRX.
- Os espectros foram obtidos em espectrômetro Quattro-LC Micromass
(Manchester, Inglaterra).
- As substâncias foram introduzidas no espectrômetro através de bomba de
infusão Harvard Apparatus modelo Holliston MA 01746.
1.2 Colunas e fase estacionária
- Na coluna líquida à vácuo (CLV), foi utilizada sílica Gel 60 (0,0063-0,200 mm
Merk).
- Nas placas cromatográficas em camada delgada comparativa (CCDC), foram
utilizadas placas de vidro (5 x 20 e 10 x 20), sílica Gel 60 GF254 da marca Merk
22
aplicada na forma de suspensão em água (1:2), com espalhador do tipo Desaga
formando-se uma camada de sílica de 0,25mm de espessura.
- Também para CCDC foram utilizadas placas pré-cobertas com sílica 60 F254
multitamanho picotado em 5 x 10 cm da marca Merk.
1.3 Solventes e reagentes
- Para obtenção dos espectros de RMN de 1H e 13C, foram utilizados solventes
deuterados da marca Aldrich.
- Para fracionamento dos extratos brutos em coluna cromatográfica foram
utilizados os seguintes solventes: hexano, diclorometano, etanol, metanol e
acetato de etila.
- Para revelar as placas, foi utilizado ácido sulfúrico P.A., através de nebulização
seguido de aquecimento em chapa a 100oC, por cinco minutos.
2 COLETA DO VEGETAL E PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS
As folhas e caules da planta estudada foram coletados numa área de
cerrado, próximo à Usina de Peixoto (MG), no mês de outubro. Sua identificação foi
feita pela Prof. Dra. Alba Regina Barbosa, docente da Universidade de Franca
(UNIFRAN), São Paulo e a exsicata de número UEC 38672, depositada no herbário da
Universidade de Campinas (UNICAMP), São Paulo.
O material coletado foi desidratado em estufa de ar circulante a 40oC e
depois moídas em moinho de facas, produzindo 640g de pó.
A extração exaustiva foi feita durante seis semanas através de maceração
química, usando hexano, diclorometano e etanol, sendo duas semanas para cada
23
solvente. A cada semana a mistura foi filtrada e concentrada em evaporador rotativo
com baixa pressão.
As massas dos extratos brutos obtidas estão na tabela a seguir: Tabela 01 - Massas dos extratos brutos obtidos de Aspidosperma macrocarpon.
Espécie Extrato Massa (g)
Aspidosperma macrocarpon
Hexânico
Diclorometânico
Etanólico
8,19
16,30
10,10
3 ENSAIOS FARMACOGNÓSTICOS DO EXTRATO ETANÓLICO
3.1 Operações preliminares [26]:
A ressuspensão foi feita com 3g do extrato etanólico de Aspidosperma
macrocarpon com 50mL de álcool etílico 70% e filtrou-se a fração obtida, diluindo-a em
100mL de álcool etílico 70%. Separou-se sete porções de 4mL em tubos de ensaios
numerados e uma porção de 10mL num béquer.
O conteúdo do béquer foi evaporado até a secura (mistura usada para os
ensaios de saponinas). O restante do extrato foi concentrado até obter a metade do
volume, aproximadamente 30mL, sendo acidulado com ácido clorídrico 0,1 mol/L (pH =
4) e filtrado (solução usada para os testes para alcalóide e os testes do extrato
etanólico hidrolisado).
24
3.2 Testes efetuados nos tubos de ensaio preparados na etapa anterior, para analisar a
presença de fenóis, taninos, antocianinas, antocianidinas, flavonóides,
leucoantocianidinas, catequinas, flavanonas, flavonóis, flavanonóis e xantonas.
Os testes efetuados nos sete tubos de ensaio estão representados no
quadro a seguir: Quadro 01 – Testes efetuados nos tubos de ensaio [26].
Tubo Método Metabólitos Testados
01
02
03
04
05
06
07
Na amostra do extrato foram adicionadas três gotas
de solução alcoólica de FeCl3.
Na amostra do extrato foram adicionadas cinco
gotas de HCl 3 mols/L, acidulando (pH = 3).
Na amostra do extrato foram adicionadas cinco
gotas de NaOH 1 mol/L, acalinizando (pH = 8,5).
Na amostra do extrato foram adicionadas sete gotas
de NaOH 1 mol/L, acalinizando (pH = 11).
Na amostra de extrato foram adicionadas sete gotas
de HCl 3 mols/L e aquecida sobre chama por 3
minutos , acidulando (pH = 1).
Na amostra de extrato foram adicionadas sete gotas
de NaOH 1 mols/L e aquecida sobre chama por 3
minutos, acalinizando (pH = 11).
Na amostra do extrato foi adicionada uma fita de
magnésio e 0,5mL de HCl concentrado.
Fenóis e taninos.
Flavonóides, antocianinas
e antocianidinas.
Flavonóides, antocianinas
e antocianidinas.
Flavonóides, antocianinas
e antocianidinas.
Catequinas, flavanonas e
leucoantocianidinas.
Catequinas, flavanonas e
leucoantocianidinas.
Flavanonas, flavanonóis, flavonóis e xantonas.
25
3.2.1 Método de análise dos resultados
Os métodos de análise dos resultados estão representados nos quadros a
seguir:
Quadro 02 - Método de análise do resultado do teste efetuado no tubos1 [26].
Constituintes Cor
Fenóis Entre azul e vermelho
Taninos hidrolisáveis Precipitado de tonalidade azul
Taninos condensados Precipitado de tonalidade verde
Os resultados dos testes nos tubos 2, 3, 4, 5, 6 e 7, foram analisados
observando o aparecimento de cores diversas, de acordo com os quadros a seguir: Quadro 03 – Método de análise dos resultados dos testes efetuados nos tubos 2, 3, 4 e
5. Os traços indicam que não ocorrem alterações na coloração da
mistura[26].
Cor em meio Constituintes pH = 3 pH = 8,5 pH = 11
Antocianinas e antocianidinas Vermelha Lilás Azul púrpura
Flavonas, flavonóis e xantonas - - Amarela
Chalconas e auromas Vermelha - Vermelho púrpura
Flavanonóis - - Vermelho laranja
Quadro 04 - Método de análise dos resultados dos testes efetuados nos tubos 6 e 7.
Os traços indicam que não ocorrem alterações na coloração da mistura [26].
Cor em meio Constituintes pH = 1-3 pH = 11
Leucoantocianidinas Vermelha -
Catequina (taninos condensados) Pardo-amarelada -
Flavonas - Vermelho alaranjada
26
3.3 Ensaios para saponinas [26].
O extrato seco obtido em 3.1, foi extraído duas vezes com 2mL de
clorofórmio, triturando os resíduos; a solução foi filtrada usando algodão e uma pipeta
Pasteur. A mistura foi colocada em um béquer e acrescentada uma pequena porção de
sulfato de sódio anidro. A mistura foi novamente filtrada, usando funil e papel de filtro. A
mistura obtida foi submetida aos seguintes ensaios:
3.3.1 Ensaio I para indicar a presença de esteróides livres e triterpenos pentacíclicos
livres.
A mistura foi colocada em um tubo de ensaio com 1mL de anidrido
acético agitando suavemente. Adicionou-se três gotas de ácido sulfúrico concentrado e
continuou a agitar suavemente.
A análise dos resultados foi feita observando a coloração. A presença de
azul evenescente seguida de verde permanente indica a presença de esteróides livres.
A coloração pardo-avermelhada indica a presença de triterpenóides pentacíclicos livres.
3.3.2 Ensaio II para indicar a presença de saponinas e/ou heterosídeos de saponinas.
Os resíduos insolúveis em clorofórmio obtidos 3.3 foram redissolvidos em
10mL de água destilada e filtrado para um tubo de ensaio e este agitado por três
minutos.
A análise dos resultados foi feita observando a formação de um colarinho
de espuma persistente e abundante.
27
3.3.3 Ensaio III foi usado para confirmar o ensaio II.
No tubo preparado para o ensaio II (3.3.2) foram adicionados 2mL de
ácido clorídrico concentrado, deixando-o por uma hora imerso em banho-maria a 50oC.
Depois de esfriar, neutralizou-se a solução com hidróxido de sódio 1 mol/L e agitou por
três minutos.
A análise dos resultados foi feita observando a presença de precipitado e
a não formação de espuma.
3.4 Testes para alcalóides.
Em 1/3 do extrato concentrado obtido em 3.1 foi adicionado NH4OH até
obter pH = 11. As bases orgânicas foram extraídas em três porções sucessivas de
30mL, 20mL e 10mL da mistura éter etílico-clorofórmio (3:1) em um funil de separação.
A solução éter etílico-clorofórmio foi tratada com sulfato de sódio anidro para eliminar o
excesso de água. As bases orgânicas foram reextraídas usando três porções de 20mL
de ácido clorídrico 0,1 mol/L. A solução éter etílico-clorofórmio foi descartada e a
solução aquosa ácida foi distribuída em dois tubos de ensaio e adicionadas a eles três
gotas dos reagentes de precipitação de alcalóides: “Hager” e “Mayer” (ver página 41).
Os resultados foram analisados observando a formação de precipitado
floculoso.
28
4 ENSAIO FARMACOGNÓSTICO DO EXTRATO ETANÓLICO HIDROLISADO
4.1 Operações preliminares [26].
Em 2/3 do extrato etanólico obtido em 3.1 foi adicionado ácido clorídrico
concentrado até obter uma solução 6mols/L, que foi aquecida sob refluxo por quatro
horas. Durante o refluxo foi observada a formação de precipitado. Depois de esfriar foi
feita a extração usando éter etílico em três etapas: 40mL após uma noite, e em seguida
30mL e 20mL. A solução aquosa ácida foi desprezada e o excesso de água da solução
etérea foi eliminado com sulfato de sódio anidro.
4.2 Teste para quinonas [26].
Em 5mL da solução etérea obtida em 4.1 foi adicionado 2mL de solução
6mols/L de hidróxido de amônia. A mistura foi agitada e em seguida foi colocada em
repouso, ocorrendo à formação de duas fases.
Os resultados foram analisados através da observação da cor vermelha,
na camada aquosa alcalina.
4.3 Teste de cumarinas [26].
O restante da solução etérea usada no teste para quinonas (4.2) foi
concentrado até a secura e redissolvido em 15mL de etanol e filtrado em funil comum
com papel de filtro. Com um capilar foram feitas duas manchas de 1,5cm de diâmetro
em um pedaço de papel de filtro não fluorescente. Em uma das manchas foi aplicado
29
hidróxido de potássio alcoólico 1 mol/L. As duas manchas foram cobertas parcialmente
com um papel opaco não fluorescente e expostas em conjunto à luz UV.
Os resultados foram analisados observando o desenvolvimento de
fluorescência azulada, forte, bem visível na metade não encoberta da mancha
alcalinizada.
4.4 Teste para aglicanas e flavonóides [26].
O restante da solução preparada para o teste de cumarina (4.3) foi
distribuído em sete tubos de ensaio. Sendo efetuados os procedimentos representados
no quadro 01 (ver página 24).
As análises dos resultados foram feitas de acordo à metodologia
representada nos quadros 02, 03 e 04 (ver página 25).
5 ENSAIOS FARMACOGNÓSTICOS NO EXTRATO DICLOROMETÂNICO
5.1 Operações preliminares [26].
A ressuspensão de 3g de extrato diclorometânico de Aspidosperma
macrocarpon foi feita em 50mL de diclorometano, a solução obtida foi filtrada, e ao
filtrado adicionado 35mL de ácido clorídrico 0,1 mol/L por três vezes em funil de
separação. A solução aquosa ácida foi alcalinizada com hidróxido de amônia
concentrado e adicionados 20mL, 15mL e 10mL de éter etílico-clorofórmio na proporção
(3:1), em um funil de separação. A solução éter etílico-clorofórmio foi filtrada e dividida
em dois recipientes. Um dos recipientes foi reservado para análise de ácidos fixos
fracos, fenóis e para hidrólise; no outro foi feita à extração da fase aquosa ácida por três
30
vezes usando 5mL de ácido clorídrico 1mol/L no funil de separação. A solução aquosa
ácida foi filtrada e submetida aos testes para alcalóides (ver item 3.4 página 27).
5.2 Separação dos ácidos fixos fracos e fenóis [26].
A solução éter etílico-clorofórmio obtida na etapa 5.1 foi particionada em
funil de separação sob agitação, com três porções sucessivas de 40mL, 30mL e 20mL
de hidróxido de sódio 2% e uma porção de 50mL de água destilada. A solução aquosa
obtida foi filtrada e acidulada com ácido clorídrico concentrado até pH = 2. A extração
de ácidos e fenóis livres ocorreu por meio de três lavagens sucessivas de 20mL, 15mL
e 10mL de éter etílico, intercalado com vigorosa agitação durante cinco minutos,
seguida de dez minutos de repouso. A solução aquosa foi desprezada. A fase orgânica
foi lavada com 20mL de água destilada e tratada com sulfato de sódio anidro e depois
filtrada; o filtrado foi submetido aos seguintes testes:
5.3 Teste para constituintes fenólicos (em meio alcoólico) [26].
A metade da solução etérea obtida na etapa 5.2 foi concentrada e depois
redissolvida em 15mL de álcool etílico. A solução alcoólica foi distribuída nos sete tubos
e submetida aos testes de acordo com os procedimentos representados no quadro 01
(ver página 24).
As análises dos resultados foram feitas de acordo à metodologia
representada nos quadros 02, 03 e 04 (ver página 25).
31
5.4 Testes para constituintes fenólicos (em meio imiscível com água) [26].
5.4.1 Teste para quinonas.
Em 4mL da solução etérea obtida em 5.2 foram adicionados 2mL de
solução de hidróxido de amônia 6 mol/L. A mistura foi agitada e na seqüência foi
colocada em repouso, ocorrendo a formação de duas fases.
Os resultados foram analisados através da observação da cor vermelha,
na camada aquosa alcalina.
5.4.2 Teste para antranóis.
No tubo do teste anterior (5.4.1) foi adicionado 1mL de água oxigenada
concentrada, sendo agitado e observado por dez minutos.
A análise do resultado foi feita observando coloração. A presença de cor
vermelha, progressivamente mais intensa na fase aquosa, indica a presença de
antranóis.
5.4.3 Teste para cumarina.
O restante da solução etérea usada no teste para quinonas (5.4.1) foi
concentrado até a secura e redissolvido em 15mL de etanol e em seguida filtrado.
Usando um capilar, foram feitas duas manchas de aproximadamente 1,5cm de diâmetro
em um pedaço de papel de filtro não fluorescente. Em uma das manchas foi aplicado
hidróxido de potássio alcoólico 1 mol/L; as manchas foram cobertas parcialmente com
um papel opaco não fluorescente e expostas em conjunto à luz UV.
32
O resultado foi analisado a partir da observação do desenvolvimento de
fluorescência azulada, forte, bem visível na metade não encoberta da mancha
alcalinizada.
6 ENSAIOS FARMACOGNÓSTICOS DOS CONSTITUINTES DO EXTRATO DICLOROMETÂNICO APÓS A HIDRÓLISE ALCALINA DOS CONSTITUINTES NEUTROS.
O extrato original em solvente orgânico (reservado do extrato em solvente
diclometânico 5.1) foi evaporado até secura. Aos resíduos foram adicionados 15mL de
metanol e 15mL de solução de hidróxido de sódio a 70%. A mistura foi aquecida sob
constante agitação até quase secura com o objetivo de assegurar a saponificação
completa [26].
6.1 Separação do insaponificável [26].
No extrato saponificado foi adicionado 100mL de água. A mistura foi
aquecida sob agitação até a homogeneização. Após esfriar, foi feita a extração da
fração insaponificável com funil de separação agitando a mistura com três porções de
20mL de éter etílico. A fase aquosa alcalina foi reservada e a solução etérea lavada
com 30mL de água. A solução etérea foi tratada com sulfato de sódio anidro e em
seguida filtrada e concentrada até a secura.
33
6.1.1 Teste de esteróides e triterpenóides.
Os resíduos insaponificáveis obtidos no procedimento anterior (6.1) foram
redissolvidos em 5mL de clorofórmio. A mistura foi tratada com sulfato de sódio anidro
e colocada em um tubo de ensaio com 1mL de anidrido acético, que foi agitado
suavemente e adicionados cuidadosamente, três gotas de ácido sulfúrico concentrado.
Os resultados foram analisados observando as colorações da solução. A
coloração azul evanescente seguida de verde permanente é indicativo da presença de
esteróides livres. A coloração pardo-avermelhada indica triterpenóides pentacíclicos
livres.
6.2 Separação dos ácidos do material saponificado [26].
A solução aquosa alcalina reservada (separação insaponificável 5.1) foi
filtrada e acidulada com ácido clorídrico 3 mols/L até pH = 2, depois de esfriar foram
adicionados 100mL de éter etílico. A mistura foi agitada num funil de separação que
ficou em repouso separando as fases. A solução etérea foi retirada do funil e lavada
com 30mL de água destilada, tratada com sulfato de sódio anidro e concentrada até a
secura.
6.2.1 Teste para fenóis.
Os resíduos concentrados na etapa anterior (6.2) foram dissolvidos em
5mL de etanol 70% e filtrado. A mistura obtida foi distribuída em sete tubos de ensaio,
sendo efetuados os testes representados no quadro 01 (ver página 24).
34
As análises dos resultados foram feitas de acordo com a metodologia
representada nos quadros 02, 03 e 04 (ver página 25).
7 ENSAIOS BIOLÓGICOS - AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE TRIPANOCIDA DOS EXTRATOS BRUTOS DE Aspidosperma macrocarpon Mart., DAS FRAÇÕES OBTIDAS DO EXTRATO EM DICLOROMETANO E SUBSTÂNCIA ISOLADA.
Os ensaios sobre as formas tripomastigotas foram obtidos de cultura de
macrófagos peritoneais. As células foram cultivadas em meio RPMI, suplementado com
2 x 10-6 mol/L de L-glutamina, 10-5 mol/L de NaHCO3, 100U/mL de penicilina, 100
µg/mL de estreptomicina e 5% de soro bovino fetal inativado, em microplacas de 96
poços (2 x 105 macrófagos/poço, contados por meio de câmara de Neubauer) a 37oC
em ambiente a 5% de CO2, com umidade de 95%.
As formas tripomastigotas foram adicionadas à cultura na proporção de
3:1. Após 7 dias, o sobrenadante foi retirado, centrifugado, sendo então obtidas as
formas do parasita, livres para a realização dos ensaios. Em uma placa de
microtitulação de 96 poços foram adicionados, então, aproximadamente 106 formas do
parasita, e posteriormente foi adicionada à substância em análise (extratos brutos,
frações do extrato diclorometânico e substância isolada), onde, após 24 horas de
incubação, foi realizada a verificação da atividade biológica por meio da técnica
colorimétrica por sal de tetrazolium [MTT; 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
diphenyltetrazolium bromide], de acordo com o descrito na literatura [30], sendo a leitura
realizada em um leitor de microplacas, em comprimento de ondas de 595nm. Os
ensaios foram realizados em triplicata.
Soluções estoques foram preparadas pela dissolução dos extratos e
frações em 100% de dimetilsulfóxido (DMSO). Alíquotas desta solução foram
adicionadas ao sangue infectado, nas doses 0,9, 1,5 e 2,1 µg/mL.
35
8 FRACIONAMENTO E ISOLAMENTO
8.1 Coluna Cromatográfica à Vácuo - sílica gel 60.
A ressuspensão foi feita com 8,8g do extrato diclorometânico de
Aspidosperma macrocarpon com 30mL de diclorometano, acrescentando a mistura,
sílica gel 60 até a absorção completa do solvente.
A coluna cromatográfica foi montada em funil com sílica gel 60, extrato
mais sílica gel 60 , areia lavada e papel de filtro.
A eluição foi feita sob baixa pressão usando 4 litros de cada solvente na
seguinte ordem: hexano, diclorometano, diclorometano/acetado de etila 1:1, acetato de
etila e metanol.
As frações obtidas em cada eluição foram concentradas em evaporador
rotativo sob pressão reduzida. As massas obtidas estão representadas na tabela 2.
Tabela 02 - Massas obtidas do fracionamento do extrato diclorometânico.
Fração Massa (g)
Hexano
Diclorometano
Diclorometano/acetato de etila 1:1
Acetato de etila
Metanol
0,2
0,7
2,8
0,8
0,5
As cinco frações obtidas foram diluídas com diclorometano e aplicadas em
placa cromatográfica com sílica gel 60. As placas foram submetidas à seguinte
seqüência de solventes: hexano/acetato de etila 30%, diclometano/acetato de etila 50%,
acetato de etila e metanol/acetato de etila 20%.
36
8.2 Coluna Cromatográfica à Vácuo.
Conforme o monitoramento em CCDC (ver item 8 página 56), observou-se
que a fração diclorometano/acetato de etila apresentava mancha única e, para refinar
seu isolamento, esta foi submetida à cromatografia à vácuo utilizando 60g de celite e
20g de carvão ativo, areia lavada e anteparo de papel de filtro.
A eluição foi feita sob pressão reduzida usando um litro de solvente
diclorometano/acetato de etila (1:1). A fração obtida foi concentrada em evaporador
rotativo sob baixa pressão e colocada em câmara à vácuo para evaporação do
solvente.
Após repetir a CCDC com a fração purificada, esta foi submetida à
obtenção de espectros de RMN 1H e 13C e de massas visando sua elucidação
estrutural.
37
RESULTADOS E DISCUSSÃO 1 CONSIDERAÇÕES GERAIS Com a aplicação de marcha analítica prospectiva é possível detectar os
principais grupos de constituintes químicos micromoleculares de origem vegetal. São
eles: ácidos fixos fortes e fracos, ácidos graxos, alcalóides, antocianidinas,
antocianinas, antranóis, auronas, bases quaternárias, catequinas, chalconas, cumarina,
esteróides, fenóis simples, flavonas, flavonóis, flavanonas, flavanonóis, glicerina,
heterosídios cianogênicos, leucoantocianidinas, quinonas, resinas, saponinas, taninos
condensados, taninos hidrolisáveis, triterpenóides e xantonas [26]. Nesse trabalho foi
desenvolvida uma marcha analítica com o objetivo de identificar os principais
metabólitos secundários presentes nos extratos etanólico, etanólico hidrolisado,
diclorometânico e diclorometânico hidrolisado.
2 ENSAIOS FARMACOGNÓSTICOS NO EXTRATO ETANÓLICO
2.1 Resultados dos testes efetuados nos tubos de ensaio:
A figura 14 apresenta os tubos antes da aplicação dos testes e a figura 15
apresenta as mesmas frações após os testes. Os resultados estão representados no
quadro 05.
Figura 15 - Testes nas Frações do extrato etanólico nos tubos: 1,2,3,4,5,6 e 7.
Figura 14 - Frações do extrato etanólico nos tubos: 1,2,3,4,5,6 e 7
Quadro 05 - Resultados dos Ensaios Farmacognósticos Extrato Etanólico TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 TUBO 5 TUBO 6 TUBO 7
Precipitado
verdes
indica
taninos
Negativo
Negativo
Vermelho
laranja
indica
flavonóis
Pardo
amarelado
indica
catequinas
Vermelho
alaranjado
indica
flavanonas
Vermelho
intenso
indica
flavanonas,
flavonóis e
flavanonóis
Os polifenóis são substâncias redutoras e, portanto, oxidam-se com
facilidade, resultando em substâncias coradas. A cor desses produtos de oxidação
deve-se ao elevado grau de conjugação. Oxidantes, tais como o cloreto férrico (FeCl3),
são empregados para a caracterização de polifenóis em geral; nesse caso a
positividade é evidenciada pelo desenvolvimento de azul a verde-azulada [25].
A precipitação escura de tonalidade verde indica a presença de taninos
condensados. Os taninos condensados estão amplamente distribuídos em plantas
lenhosas [25].
Os taninos condensados são oligômeros e polímeros formados pela poli-
condensação de duas unidades flavan-3-ol e flavan-3,4-diol. Essa classe de taninos
também é denominada como proantocinidina, devido ao fato de os taninos
38
39
condensados produzirem pigmentos avermelhados da classe das antocianidinas, tais
como cianidina e delfinidina, após degradação com ácido mineral diluído a quente [25].
Os testes nos tubos 2 ,3 e 4 com pH ácido (3,0), alcalino (8,5) e alcalino (11,0) deram
negativos, não sendo possível detectar a presença de alguns compostos fenólicos
simples, como antocianinas, antocianidinas, flavonas, flavonóis, xantonas, chalconas e
auronas, derivados da degradação do tanino condendado ou flavonóides. No tubo 4 pH
alcalino (11,0) foi possível detectar mudança de coloração para vermelho alaranjado,
sendo essa alteração indicativo da presença de flavanonois (di-hidroflavonas), um dos
representantes da classe dos flavonóides. No tubo 5 após acidulação e aquecimento
observou-se mudança intensa de coloração (pardo-amarelado) o que provavelmente é
indicativo da presença catequina, um dos compostos participantes da biogênese do
tanino condensado. No tubo 6 após alcalinização e aquecimento, observou-se
mudança intensa de coloração (vermelho-alaranjado), o que provavelmente é indicativo
da presença flavanonas, uma outra substância da classe dos flavonóides. O teste da
cianidina ou Shinoda (HCl concentrado e magnésio em pó), costuma ser empregado
para a detecção de flavonóides por ser característico para o maior número de
substâncias dessa classe. Através dessa reação, pode-se caracterizar compostos
contendo um núcleo α-benzopirona, pelo desenvolvimento de cor laranja a vermelho
[25]. No tubo 7 após a acidificação com HCl e o acréscimo de magnésio observou-se
mudança de coloração para o vermelho intenso, o que é indicativo da presença de
substâncias da classe dos flavonóides (flavonóis, flavanonas, flavanonóis e/ou
xantonas).
2.2 Ensaios para saponinas.
2.2.1 Ensaio I
Nesse ensaio observou-se coloração de azul evanescente seguida de
verde permanente, indicando a presença de esteróides livres. A reação de Liebermann-
40
Burchard (anidrido acético-ácido sulfúrico concentrado), é empregada na detecção de
esteróides e triterpenos, os primeiros desenvolvem coloração mutável com o tempo,
enquanto que os últimos desenvolvem coloração estável [31].
2.2.2 Ensaio II
Para detectar a presença de saponinas, emprega-se o teste de formação
de espuma, estável na presença de ácidos minerais diluídos [25]. Nesse ensaio não foi
observada a formação de espuma persistente e abundante indicando a ausência de
saponina na fração analisada.
2.2.3 Ensaio III
Não ocorreu a formação de precipitado confirmando o resultado do teste
anterior (2.2.2).
2.3 Teste para alcalóides.
As reações gerais para alcalóides baseiam-se na formação de complexos
insolúveis (precipitados). Como resultados falso-positivo são bastante comuns para
essas reações, previamente à análise, o material a ser analisado deve ser submetido a
extrações ácido/base. As reações gerais empregam os reagentes de Dragendorff (iodo-
bismuto de potássio), Mayer (iodo-mercúrio de potássio) e Wagner (iodo-iodeto de
potássio) e Bertrand (ácido sílico-túngstico) [25]. O reagente de Hager (solução
saturada de ácido pícrico) também é usado para os testes de alcalóide [26].
Nesse teste usando os reagente Hager e Meyer foi observada a formação
de precipitado (fig.16) nos dois tubos testados, sendo indicativo da presença de
alcalóides.
Figura 16 - Frações do extrato etanólico. Testes com reagente de Hager e Meyer respectivamente.
A síntese dos ensaios farmacognósticos no extrato etanólico está
representada no organograma 01:
41
Organograma 02: Abordagem fitoquímica - Extrato Etanólico hidrolisado
42
Fase aquosa alcalina com coloraçãovermelha, indica presença dequinona
Foi agitado ena sequência repousoformando duas fases
Solucão etérea e 2mLde NH4OH 6 mols/L
Negativo para cumarina
Adicionou KOH alcoólico 1mol/Lem papel de filtro e exposto a luz UV
Concentrado atésecura e redissolvidocom 15mL de etanol
Solução etérea e 2mLde NH4OH 6 mols/L
Presença detanino condensado
Tubo 1FeCl3
Negativo
Tubo 2 HCl 3 mols/LpH = 3
Negativo
Tubo 3 NaOH 1 mol/LpH = 8.5
Presença deflavonóis
Tubo 4 NaOH 1 mol/LpH = 11
Presença decatequina
Tubo 5 HCl 3 mols/LpH=1 e aquecido
Presença deflavanonas
Tubo 6 NaOH 1mol/LpH=11 e aquecido
Presença de flavonóis,flavanonas e flavanonóis
Fita de magnésioe HCl concentrado
Testesnos
tubos
Solução etérea e 2mLde NH4OH 6 mols/L
acificada com HCl até 6 mols/Laquecido sob refluxo
extração com éter etílico
40 mL de soluçãoetanólico
3 ENSAIO FARMACOGNÓSTICO DO EXTRATO ETANÓLICO HIDROLISADO
3.1 Teste para quinonas.
Como os derivados antraquinônicos ocorrem nos vegetais em vários níveis
de oxidação, o material a ser analisado deve ser convenientemente tratado para que
ocorra uma oxidação total destes até antraquinonas. A reação característica para
antraquinonas é conhecida como reação de Borntrager. O meio dessa reação é apolar
e, por isso, ela é direcionada para a detecção da agliconas antraquinônicas. Assim,
anteriormente à reação, deve-se proceder à hidrólise [25].
Em meio alcalino, as quinonas hidroxiladas transformam-se nos ânions
fenolatos correspondentes, os quais apresenta intensa coloração púrpura a violeta. A
alcalinização necessária para essa reação pode ser obtida inclusive por soluções de
bases fracas como, por exemplo, hidróxido de amônia [25].
A fase aquosa alcalina (fig.17) obtida para esse teste, apresentou
coloração vermelha sendo indicativo de quinonas (especialmente antraquinonas
hidroxiladas).
Figura 17 - Frações do extrato etanólico hidrolisado Na proveta a fração hidrolisada e no funil a fração alcalinizada para o teste.
43
44
3.2 Teste de cumarinas.
A caracterização das cumarinas no extrato pode ser feita pela observação
do mesmo sob luz ultravioleta (360 nm), pois a maioria possui fluorescência azul
brilhante ou verde. As cumarinas em solução alcalina desenvolvem coloração amarela,
devido ao rompimento do anel lactônico [25].
As famílias mais citadas na literatura pelo conteúdo em cumarinas são:
Apiaceae, Rutaceae, Asteraceae, Farbaceae, Oleaceae, Moraceae e
Thymeleaceae[25].
No teste realizado com o extrato etanólico hidrolisado não foi observada
fluorescência azulada na metade não encoberta da mancha alcalinizada, indicando a
ausência de cumarina.
3.3 Teste para aglicanas e flavonóides
Os heterosídeos são compostos resultantes da ligação covalente formada
entre uma ou mais unidades de açúcar e outra estrutura diferente, chamada de
aglicana. A rigor, a biogênese de um heterosídeo deve ser considerada desde a
formação da aglicana até a ligação desta a uma ou mais unidade de açúcar[25]. Com
hidrólise é possível romper a ligação e liberar os seus constituintes e estes podem ser
detectados por um marcha analítica.
Foram repetidos os mesmos testes realizados no extrato etanólico sem a
hidrólise, observando os mesmos resultados (figura 18 e quadro 06).
Figura 18 - Testes nas Frações do extrato etanólico hidrolisado nos tubos: 1,2,3,4,5,6 e 7.
Quadro 06 - Resultados dos Ensaios Farmacognósticos Extrato Etanólico Hidrolisado TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 TUBO 5 TUBO 6 TUBO 7
Precipitado
verdes
indica
taninos
Negativo
Negativo
Vermelho
laranja
indica
flavonóis
Pardo
amarelado
indica
catequinas
Vermelho
alaranjado
indica
flavanonas
Vermelho
intenso
indica
flavanonas,
flavonóis e
flavanonóis
A síntese dos ensaios farmacognósticos no extrato etanólico hidrolisado
está representada no organograma 02:
45
Organograma 02: Abordagem fitoquímica - Extrato Etanólico hidrolisado
46
Fase aquosa alcalina com coloraçãovermelha, indica presença dequinona
Foi agitado ena sequência repousoformando duas fases
Solucão etérea e 2mLde NH4OH 6 mols/L
Negativo para cumarina
Adicionou KOH alcoólico 1mol/Lem papel de filtro e exposto a luz UV
Concentrado atésecura e redissolvidocom 15mL de etanol
Solução etérea e 2mLde NH4OH 6 mols/L
Presença detanino condensado
Tubo 1FeCl3
Negativo
Tubo 2 HCl 3 mols/LpH = 3
Negativo
Tubo 3 NaOH 1 mol/LpH = 8.5
Presença deflavonóis
Tubo 4 NaOH 1 mol/LpH = 11
Presença decatequina
Tubo 5 HCl 3 mols/LpH=1 e aquecido
Presença deflavanonas
Tubo 6 NaOH 1mol/LpH=11 e aquecido
Presença de flavonóis,flavanonas e flavanonóis
Fita de magnésioe HCl concentrado
Testesnos
tubos
Solução etérea e 2mLde NH4OH 6 mols/L
acificada com HCl até 6 mols/Laquecido sob refluxo
extração com éter etílico
40 mL de soluçãoetanólico
4. ENSAIO FARMACOGNÓSTICO DO EXTRATO DICLOMETÂNICO
O solvente diclorometano é usado para extrair preferencialmente as
seguintes substâncias: bases livres de alcalóides, antraquinonas livres, óleos voláteis,
glicosídeos cardiotônicos [25].
4.1 Teste de alcalóide.
Nesse teste usando os reagente Hager e Meyer foi observada a formação
de precipitado (fig 19) nos dois tubos testados, sendo indicativo da presença de
alcalóides.
Figura 19 - Frações do extrato diclorometânico.Testes com reagente de Hager e Meyer respectivamente.
47
4.2 Teste para constituintes fenólicos (em meio alcoólico)
Figura 20 - Testes nas Frações do extrato
diclorometânico para constituintes fenólicos
em meio alcoólico nos tubos: 1,2,3,4,5,6 e 7
respectivamente.
Os testes negativos em todos o tubos são indicativos da ausência de
ácidos e fenóis livres em meio alcoólico.
4.3 Testes para constituintes fenólicos (em meio imiscível com água).
4.3.1 Teste para quinonas.
Teste negativo indicativo da ausência de quinonas em meio imiscível com
água.
4.3.2 Teste para antranóis.
48
Teste negativo indicativo da ausência de antranóis em meio imiscível com
água.
49
4.3.3 Teste para cumarina.
Teste negativo indicativo da ausência de cumarina em meio imiscível com
água.
A síntese dos ensaios farmacognósticos no extrato diclorometânico está
representada no organograma 03:
Organograma 03: Abordagem fitoquímica - Extrato Diclorometânico
Formação de precipitadopresença de alcalóides
Reagente deHager
Formação de precipitadopresença de alcalóides
Reagente deMayer
Extraçao da fase aquosaácido com HCl 1mol/L
Negativo
Tubo 1FeCl3
Negativo
Tubo 2 HCl 3 mols/LpH = 3
Negativo
Tubo 3 NaOH 1 mol/LpH = 8.5
Negativo
Tubo 4 NaOH 1 mol/LpH = 11
Negativo
Tubo 5 HCl 1 mol/LpH = 1 aquecido
Negativo
Tubo 6 NaOH 1 mol/LpH = 11 aquecido
Negativo
Tubo 7 Fita de magnésioe HCl concentrado
Solução etérea concentrada eredissolvida em álcool etílico
Negativo paraquinona
Negativo paraantranóis
Adicionou águaoxigenada concentrada
Adicionou NH4OH 6 mols/L agitou e colocouem repouso separando duas fases
Negativo paracumarina
Adicionou KOH alcoólico 1mol/Lem papel de filtro e exposto
a luz UV.
Concentrado até secura eredissolvido em 15ml de etanol
Fase etérea lavada e tratadacom sulfato de sódio anidro
Extração de ácidose fenóis com éter
Separação sob agitação comNaOH 2% e água destilada
adicionou soluçãoéter-clorofórmio 3:1
Adicionou HCl 1 mol/Le a soluçao aquosaácido alcalinizada
com NH4OH
Ressuspensão de 3g em50mL de diclorometano
Extrato Diclorometânico
50
5 ENSAIO FARMACOGNÓSTICO DO EXTRATO DICLOMETÂNICO APÓS A HIDRÓLISE ALCALINA DOS CONSTITUINTES NEUTROS.
Observou-se material pastoso se desprendendo do fundo do recipiente,
indicando material saponificado.
5.1 Teste de esteróides e triterpenóides
A reação de Liebermann-Brüchard (anidrido acético – ácido sulfúrico
concentrado) é empregada para a detecção de esteróides e triterpenos; os primeiros
desenvolvem coloração mutável com o tempo, enquanto que os últimos desenvolvem
coloração estável [31].
A presença de coloração estável parda até vermelha, indica a presença de
triterpenos pentacíclicos (fig. 21).
Figura 21 - Testes nas frações do extrato diclorometânico após hidrólise alcalina dos constituintes neutros em resíduos insaponificáveis, para esteróides livres e triterpeno pentacíclico.
51
5.2 Teste para fenóis.
Figura 23 - Testes para fenóis nas frações do extrato diclorometânico após hidrólise alcalina dos constituintes neutros em resíduos saponificáveis.
Figura 22 - Frações do extrato diclorometânico após hidrólise alcalina dos constituintes neutros em resíduos saponificáveis.
Os resultados negativos dos testes em todos os tubos é indicativo da
ausência de fenóis simples, catequinas e flavonóides no saponificado.
A síntese dos ensaios farmacognósticos no extrato diclometânico após a
hidrólise alcalina dos constituintes neutros está representada no organograma 04:
52
Organograma 04: Abordagem Fitoquímica - Extrato diclorometano (hidrólise alcalina)
Presença de triterpenospentacíclicos
Tratada com sulfatode sódio anidro etrês gotas H2SO4
concentrado
Resíduos insaponificáveisredissolvido e 5mL de clorofórmio
Negativo
Tubo 1FeCl3
Negativo
Tubo 2 HCl 3 mols/LpH = 3
Negativo
Tubo 3 NaOH 1 mol/LpH = 8.5
Negativo
Tubo 4 NaOH 1 mol/LpH = 11
Negativo
Tubo 5 HCl 3 mols/LpH = 1 e aquecido
Negativo
Tubo 6 NaOH 1 mol/LpH = 11 e aquecido
Negativo
Fita de magnésioe HCl concentrado
Testes nostubos
Resíduos concentradosdissolvidos em 5mL
de etanol 70% efiltrado
Solução aquosa alcalina foi filtrada e acidicadacom HCl 3 mols/L pH = 2,adicionou éter sendo
essa solução lavada com água destilada econcentrada até a secura
Adicionou água e aqueceusob agitação e extração dafração insaponificáveis com
éter etílico
Observou-se a presençade material saponificado
Evapou até a secura eadicionou metanol ehidróxido de sódio e
aqueceu até a secura
Adicionou soluçãoéter-clorofórmio 3:1
Adicionou HCl 1 mol/Le a solução aquosaácida foi alcalinizada
NH4OH
Ressuspensão de 3g em50 mL de diclorometano
Extratrato diclorometânico
53
6 RESULTADOS DOS ENSAIOS BIOLÓGICOS.
6.1 Avaliação in vitro da atividade tripanocida dos extratos brutos obtidos de
Aspidosperma macrocarpon Mart.
Visando avaliar atividade tripanocida dos extratos obtidos, foram feitos
ensaios em cada etapa desse trabalho. O ensaio com o extrato diclorometânico
apresentou, em torno de 70% de lise parasitária contra 40% de lise no extrato etanólico
e 20% de lise no extrato hexânico, como mostra a figura 24. Esse resultado direcionou
os fracionamentos para o extrato diclorometânico bem como o biomonitoramento das
frações obtidas.
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Ext. HexânicoExt. DiclorometânicoExt. Etanólico
log dose (µg/mL)
% d
e lis
e
Figura 24 – Gráfico da avaliação in vitro da atividade tripanocida dos extratos brutos hexânico, diclorometânico e etanólico.
54
6.2 Biomonitoramento da atividade tripanocida das frações obtidas do fracionamento do
extrato diclorometânico de Aspidosperma macrocarpon Mart.
O extrato diclorometânico de Aspidosperma macrocarpon Mart. foi o que
apresentou maior porcentagem de lise parasitária. Este extrato foi fracionado (conforme
descrito nos itens 8.1 e 8.2 de material e métodos ver páginas 35 e 36).
Todas as frações resultantes foram avaliadas quanto a possível atividade
tripanocida (biomonitoramento). Os resultados obtidos estão representados na figura
25.
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50
25
50
75
100
Aspilo/z Acetado de etilaAspilo M MetanolAspilo M DiclorometanoAspilo/z hexanoAspilo M Diclorometano/ Acetado de etila
log dose (µM)
% li
se
Figura 25 - Gráfico da avaliação in vitro da atividade tripanocida das frações do extrato diclorometânico.
Observou-se em torno 80% de lise parasitária na dose de 2,1 µM na
fração diclorometano/acetato de etila 1:1.
55
7 RESULTADOS DO FRACIONAMENTO DOS EXTRATOS ATIVOS.
As frações obtidas (conforme descrito no item 8.1 de material e métodos ver
página 35) foram aplicadas em placas cromatográficas de sílica gel 60. Foi observada
no cromatograma (fig. 26) a presença de uma substância, direcionando os trabalhos de
biomonitoramente e fracionamento para a fração diclorometano/acetato de etila 1:1. Figura 26 - Cromatograma das frações diclorometano/acetato
de etila 1:1 e acetato de etila respectivamente obtidas do extrato diclorometânico.
Com o fracionamento em coluna celite à vácuo (descrita no item 8.2 de
material e métodos ver página 36) da fração diclorometano/acetato de etila 1:1 foi
observada a formação de um precipitado branco. O cromatograma dessa substância
está representado a seguir (fig. 27).
56
Figura 27 - Cromatograma do precipitado branco obtido do fracionamento da fração diclorometano/acetato de etila 1:1.
A análise da RMN e da espectroscopia de massa indica a presença no
precipitado de um triterpeno predominando o ácido ursólico. A placa cromatográfica (fig.
28) feita usando o ácido ursólico como padrão confirmam esse resultado.
1 2
Figura 28 – 1. Mistura ácido ursólico + oleanóico (Padrão); 2.
Precipitado branco obtido do fracionamento da fração diclorometano/acetato de etila 1:1
57
8 ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DA SUBSTÂNCIA ISOLADA.
Conforme dados da literatura [32 33], foi possível perceber que a
substância isolada tratava-se de um triterpeno ácido, com esqueleto tipo ursano (fig.
29).
18
734
5
92
6
10
17
14
20
25
21
181311
12
16
19
15
30
29
24
27
22
2826
23
Figura 29 – Esqueleto tipo ursano.
O sinal em δ = 5,20 corresponde ao hidrogênio ligado ao C – 12. Em δ =
4,30 pode ser observado o sinal relativo ao hidrogênio da hidroxila em C – 3. Já o
hidrogênio ligado diretamente em C – 3 está representado pelo sinal em δ = 3,00. O
dupleto em δ = 2,10 correspondente ao hidrogênio alílico ligado à C – 18. Com base
nestes dados foi possível identificar a molécula como sendo o ácido ursólico (figura 30),
o que pode ser confirmado através do espectro de RMN 13C (tabela 03) em comparação
com valores obtidos da literatura [34]. O triterpeno ácido ursólico apresenta atividade
contra a forma tripomastigota do tripanossoma cruzi [35].
58
COOH
OH
18
734
5
92
6
10
17
14
20
25
21
181311
12
16
19
15
30
29
24
27
22
26
23
28
Figura 30 – Estrutura do ácido ursólico. Tabela 03 – Dados dos principais sinais de RMN 13C da substância isolada (DMSO, δ ppm, 100 MHz) e valores de δ da literatura para o ácido ursólico.
Carbonos Substância isolada (DMSO)
Ácido ursólico [34] CDCl3)
C – 3
C – 12
C – 13
C – 18
C – 28
77,2
124,9
138,5
52,7
177.6
78,8
125,5
143,4
52,8
177,7
Através da obtenção de um espectro de massas da substância isolada foi
possível a detecção do pico íon molecular em 455,57, compatível com a fórmula
molecular do ácido ursólico (C30H4803).
Os espectros de RMN1H e 13C e de massas, com os sinais relevantes
para identificação estrutural assinalados, estão dispostos nos anexos 01,02 e 03
respectivamente.
59
60
CONCLUSÃO
Com relação à atividade tripanocida, foi possível constatar que o
extrato bruto diclorometânico apresentou resultados significativos. Entre as frações
desse extrato, a que apresentou maior atividade foi a obtida com acetato de etila e
diclometano (1:1).
Os ensaios farmagnósticos permitiram conhecer qualitativamente o
perfil químico do vegetal. Alguns metabólitos secundários como os taninos
condensados, flavonóides, esteróides livres, quinonas, triterpenos e alcalóides foram
identificados.
O estudo fitoquímico usando o fracionamento biomonitorado permitiu
isolar a provável substância responsável pela atividade. A análise de espectros de
RMN de 1H e 13C e massas permitiu concluir que essa substância é o triterpeno
ácido ursólico.
61
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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63
29 HOSTETTMANN, K.; WOLFENDER, J.-L.; RODRIGUEZ, S. Rapid detection and subsequent isolation of bioactive constituents of crude plant extracts. Planta Med. v.63, n.1, p. 2-10, 1997. 30 MUELAS, S. S; NOGAL, J.J. R.; GÓMEZ, A.B., Setting a Colorimetric method to determine the viability of Trypanosoma cruzi epimastigotes. Parasitol Res., v. 86, p. 999-1002, 2000. 31 HASHIMOTO, Y. Diferenciação de esteróides e triterpenóides pela reação corada. An. Acad. Bras. Ciênc., v. 42 (Sup.), p. 95-96, 1970. 32 SOUZA, M.P.; MATOS, E.O.; MACHADO, M.L.I.; BRAZ FILHO, R.; VENCATO, I.; MASCARENHAS, Y.P.. Triterpenoids from guettes Angelica. Phytochemistry. v.23, p. 2589-2592, 1984. 33 HONGQVAN, D.; YOSHIHISA, I.; MOMOTA, H.; OHMOTO, Y.; TAKI, T.; JIA, Y.; LI, D.. Triterpenoids fron Tripteygium wilfordii. Phytochemistry. v.53, p. 805-810, 2000. 34 MAHATO, S.B.; KUNDU, A.P.. 13C MNR spectra of pentaciclic triterpenoids: a compilation and same salient features (REVIEW). Phytochemistry. v.37, p. 1517-1575, 1994.
35 CUNHA, W.R.; MARTINS, C.; FERREIRA, D.S.; CROTTI, A.E.M.; LOPES, N.P.; ALBUQUERQUE, S.. In Vitro Trypanocidal Activity of Triterpenes from Miconia Species. Planta Med., v. 69, p. 470-472, 2003.
ANEXO 01
PROTON OMSO u jlcl 9
Current Data ParametersNAME .rcOamlEXPNO JPROCNO 1
F2 - ACQulsltion ParametersDate_TimeINSTRUMPR08HOPULPAOGTOSOLVENTNSOSSHHFlORESAORGOWOETE01
2004091016.32spect
5 mm OUL 13Czg30
65536OMSO
162
8278.146 Hz0.126314 Hz
3.9584243 see90.5
60.400 use e6.00 use e
300. O K1.00000000 see
.e" ••••• 'CHANNEL fi ••••••••NUCI IHPI . 25.00 useePL 1 -3.00 caSFOI 400.1324710 MHz
/V':J:
c.CDO:J:(,w
:J:c.CDoI~N
l,..-r-,):J:
:J: g.c. (")CD I
(") ~
t N'
I~!I~(l~(~~1
F2 - Proeess ing parametersSI 32768SF 400.1300008 MHzWDW EMSSO OL8 0.30 HzG8 OPC 1.00
t t--------L0ti5 10 NMA plot parameters
CX 20.00 emCY 12.50 emFI P 11 . 000 ppnFI 4401.43 HzF2P -I. 000 ppmF2 -400.13 HzP?MCM 0.60000 ppm/cmHZCM 240.07800 Hz/emi
r-r-r-r-r-r-r-r-r I I' I I i' i L i i I I j I i i I i I i I i i I I t I \ I i I i I i i t I i i j I i i, i i i i I i I i i i i i i i I i I i·i i i i i i I i i i i I t i I t I 'I' I j i I I i i i i I i i i i i I i i I i i i i i i I i I
ppm 10 8 6 . 4 2 O
64
ANEXO 02
65
C13CPD DMSO u jlcl 9
"""O"""1.l1ruCT1 •...... W"'<DUlceOOCOf'.C\l,....,r--.,......,....- ~ .... -~/ I
~ '" tOUl r-, '"ID ~ Ulo <r ce
iII"""0 o-o~owcoco,.....-m~w •......coo_ru"""~woo~_m~~ru,.... oo~m~MmMN"""m •......wm~~mNmN"""O~C\lW~C\l"""moo mO-Mm~-,.....-m~NOCOW~C\loo"""co~rn~mru~m..... , " .~- mO,.....C\lOO~C\l,.....-ooornrnmmcocowcom_,.....,....w~
n\~;ppo.o.
oIo
o J: oI I
o ...JI. o ....• ...JI.W ~....• co
I IN ...JI. ...JI.co ...JI. N CD U1
w
1N...JI. co ...JI. ......•....• U, N N....•
W.a:o. coU, cn <.o....• N It....• t ....•
t tI
Current Data ParametersNAME ..,cO.olEXPNO 15PAOCNO I
F2 - ACQu 1s 1t ion ParametersO.te_Tlm.INSTAUMPAoBHOPlI..PADGTOSoLVENTNSOSSWHFlORESAOA,OWDETE01011012
•••••••• CHANNELNUClPIPUSfOl
200~09!!6.56
scect5 mm OUL 13C
'0093065535
OMSO15350
423980.814 H,0.355918 H'
1.3664756 sec4597.620.850 usec
6,00 usec300.0 K
2.00000000 sec0.03000000 •• c0.00002000 sec
fi········13C
20.00 usec2.00 dB
100.6227B9B HH,
••••• ". CHANNEL f2 ••••••••CPOPRG2 .,ltz 16NUC2 lHPCP02 120.00 U9.CPL2 -4.00 dBPL12 9.76 dBPL13 15.00 dB51'02 400.1316005 MlJz
F2 - Processlng parametersSI 3276BSF 100.6127793 MIJ,HOW EMSSB OLB 1.00 H,GB OPC 1. 40
JO NMR plot perametersCX 20.00 emCY 12.50 emFIP 215.000 ppmFI 21631.75 H,f2P -5.000 DomF2 -503.06 H,PPHCH li. 00000 pom/cmHZCM 1106.74060 Hz/cm
T I I i I I i I i', I I i I I i i I i I j I Ippm 200 175 150 125 100 75 50 25 O
ANEXO 03
AMOSTRA WILSON AM • 1 • CONE 20 - ESI - NEG 9393201004 - AMOSTRA WILSON AM - 1 - CONE 20 - ESI - NEG 1 (0.503) Sm (SG, 2xO.61)100 253.21
15:42: 16 20-0ct-2004Scan ES-
2.97e6
228.35H
133.08
125 150 175 200 225 250
212.29
%
113.23
31135 455.57. 345.46 l293.30
II ," I, .~m"", "".,""'"".",,,,,,',,,"'""'''''"""""'"""",mJ,275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700
66
Livros Grátis( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download: Baixar livros de AdministraçãoBaixar livros de AgronomiaBaixar livros de ArquiteturaBaixar livros de ArtesBaixar livros de AstronomiaBaixar livros de Biologia GeralBaixar livros de Ciência da ComputaçãoBaixar livros de Ciência da InformaçãoBaixar livros de Ciência PolíticaBaixar livros de Ciências da SaúdeBaixar livros de ComunicaçãoBaixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNEBaixar livros de Defesa civilBaixar livros de DireitoBaixar livros de Direitos humanosBaixar livros de EconomiaBaixar livros de Economia DomésticaBaixar livros de EducaçãoBaixar livros de Educação - TrânsitoBaixar livros de Educação FísicaBaixar livros de Engenharia AeroespacialBaixar livros de FarmáciaBaixar livros de FilosofiaBaixar livros de FísicaBaixar livros de GeociênciasBaixar livros de GeografiaBaixar livros de HistóriaBaixar livros de Línguas
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