View
8
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2014-2015
Verschil in veiligheid en opbouw van antistoffen tussen het gelijktijdig en
enkelvoudig toedienen van vaccins bij gelten
door
Lode VRIELINCK
Promotoren: Prof. dr. D. Maes Onderzoek uitgevoerd in het kader
Prof. dr. E. Cox van de Masterproef
Drs. A. Michiels
© 2015 Vrielinck Lode
Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2014-2015
Verschil in veiligheid en opbouw van antistoffen tussen het gelijktijdig en
enkelvoudig toedienen van vaccins bij gelten
door
Lode VRIELINCK
Promotoren: Prof. dr. D. Maes Onderzoek uitgevoerd in het kader
Prof. dr. E. Cox van de Masterproef
Drs. A. Michiels
© 2015 Vrielinck Lode
VOORWOORD
Graag wil ik starten met een oprecht woord van dank aan enkele personen die geholpen hebben voor
het tot stand brengen van dit onderzoek. Eerst en vooral hartelijk dank aan mijn promotor drs.
Annelies Michiels voor alle hulp tijdens de proef, het verwerken van de resultaten en het nalezen van
het eindwerk. Daarnaast ook dank aan Prof. dr. Dominiek Maes en Prof. dr. Eric Cox voor het
organiseren van de proefopzet en het kritisch nalezen van dit werk. Verder nog een woord van dank
aan Tom Meyns (firma MERIAL), fokbedrijf Maenhout voor het meewerken aan deze proef, en alle
personen die meegeholpen hebben bij het uitvoeren van het praktische werk. Voor steun en advies
kon ik ook altijd terecht mij mijn ouders, vriendin en vrienden.
SAMENVATTING ................................................................................................................................................ p.1
1. INLEIDING. ..................................................................................................................................................... p.2
2. LITERATUURSTUDIE...................................................................................................................................... p.3
2.1 Porcine Circovirus ................................................................................................................................ p.3
2.1.1 Inleiding .................................................................................................................................. p.3
2.1.2 Epidemiologie ........................................................................................................................ p.4
2.1.3 Pathogenese .......................................................................................................................... p.4
2.1.4 Symptomen en letsels ........................................................................................................... p.6
2.1.5 Behandeling en preventie ..................................................................................................... p.9
2.1.6 Vaccineren tegen PCV2 ....................................................................................................... p.10
2.2 Enterotoxigene Escherichia coli ...................................................................................................... p.15
2.2.1 Inleiding ................................................................................................................................ p.15
2.2.2 Epidemiologie ...................................................................................................................... p.16
2.2.3 Pathogenese ........................................................................................................................ p.16
2.2.4 Symptomen en letsels ......................................................................................................... p.18
2.2.5 Behandeling en preventie ................................................................................................... p.18
2.2.6 Vaccineren tegen PCV2 ....................................................................................................... p.20
2.3 Combineren van vaccins .................................................................................................................. p.23
2.4 Werking adjuvans .............................................................................................................................. p.26
2.4.1 Algemene werking ............................................................................................................... p.26
2.4.2 Circovac® .............................................................................................................................. p.30
2.4.3 Neocolipor® .......................................................................................................................... p.31
3 MATERIAAL EN METHODEN ................................................................................................................... p.33
3.1 Doen van de studie ............................................................................................................................ p.33
3.2 Bedrijf van herkomst ......................................................................................................................... p.33
3.3 Proefopzet .......................................................................................................................................... p.33
3.4 De aangewende vaccins .................................................................................................................. p.35
3.4.1 Neocolipor® .......................................................................................................................... p.35
3.4.2 Circovac® .............................................................................................................................. p.35
3.5 Onderzochte parameters .................................................................................................................. p.36
3.5.1 Anti-F4 antistoffentiterbepaling (ELISA) ............................................................................ p.36
3.5.2 Titerbepaling PCV2 (IPMA) ................................................................................................. p.37
3.5.3 Rectale temperatuur ............................................................................................................ p.38
3.5.4 Eetlust ................................................................................................................................... p.38
3.5.5 Lokale huidreacties ............................................................................................................. p.38
3.6 Statistische analyses ......................................................................................................................... p.39
4 RESULTATEN ............................................................................................................................................ p.39
4.1 Antistoffentiter en temperatuur (continue data) .............................................................................. p.39
4.2 Buikvulling en huidscore (binaire data) ............................................................................................ p.43
5 BESPREKING ............................................................................................................................................. p.46
6 REFERENTIES ........................................................................................................................................... p.50
7 BIJLAGEN .................................................................................................................................................. p.58
1
SAMENVATTING
In de praktijk gebeurt het vaak dat verschillende vaccins gelijktijdig worden toegediend. Het is dus van
belang te weten of het al dan niet gelijktijdig toedienen van vaccins invloed heeft op de veiligheid en
de opbouw van antistoffen. Hiervoor werden op een varkensbedrijf 70 gezonde gelten van 17 weken
oud geselecteerd. De gelten werden ad random verdeeld over vier groepen (drie groepen van 20 en
één controlegroep van tien gelten). Ze werden tweemaal gevaccineerd met drie weken tussen: groep
1 kreeg links een injectie met Neocolipor®, groep 2 kreeg links Neocolipor en tegelijk rechts Circovac
®,
groep 3 kreeg enkel rechts Circovac en groep 4 kreeg geen vaccins toegediend (controlegroep). Van
de 70 gelten werd drie keer bloed genomen om de serologische respons op te volgen. Voor PCV2
werden IPMA antistoffen bepaald, voor Escherichia. coli (E. coli) waren dit anti-F4 antistoffen.
Volgende parameters werden op een geblindeerde manier opgevolgd: rectale temperatuur, eetlust
(buikvulling) en huidreactie.
De antistoffentiter (log-waarde) tegen F4 fimbriae van E. coli drie weken na eerste vaccinatie was van
groep één (enkel Neocolipor) 2,24 en van groep twee (Neocolipor + Circovac) 2,79. Drie weken na
tweede vaccinatie was deze waarde voor groep één 2,89 en voor groep twee 3,45. Na simultane
vaccinatie was er een significant hogere antistoffentiter (P<0.05) waar te nemen tegen F4 van E. coli
drie weken na eerste én na de tweede vaccinatie in vergelijking met enkelvoudige toediening van het
vaccin. De antistoffentiter (log-waarde) tegen PCV2 was drie weken na eerste vaccinatie 4,83 voor
groep drie (enkel Circovac) en 4,52 voor groep twee (beide vaccinaties). Drie weken na tweede
vaccinatie was deze waarde voor groep drie 5,40 en voor groep twee 5,36. Er was geen significant
verschil voor zowel eerste als tweede vaccinatie (P<0.05). De temperaturen van groep 1 (Neocolipor)
één dag na eerste vaccinatie, vlak voor tweede vaccinatie en 24h na tweede vaccinatie waren
respectievelijk 39,5°C, 39,3°C, 39,3°C en deze van groep 3 (enkel Circovac) 39,5°C, 39,4°C en
40,0°C. Voor groep 2 die beide vaccinaties simultaan kreeg waren deze temperaturen respectievelijk
39,6°C, 39,3°C en 40,2°C. Er was enkel een significante verhoging in temperatuur 24 uur na tweede
vaccinatie bij groep 2 en 3 in vergelijking met groep 1 (P<0.05). Er werden geen significante
verschillen (P<0.05) gezien in buikvulling na vaccinatie tussen de verschillende groepen. Na
statistische analyse werden ook geen verschillen in huidreactie gezien tussen simultane en
enkelvoudige toediening (P<0.05).
Na gelijktijdige toediening van beide vaccinaties was er dus geen nadeel in opbouw van antistoffen in
vergelijking met een enkelvoudige toediening van dezelfde vaccins en werd er geen verschil in eetlust
en huidreactie gezien.
SLEUTELWOORDEN: SIMULTANE VACCINATIE - E. COLI - PCV2 - ADJUVANS
2
1. INLEIDING
In de varkenshouderij worden zeugen en gelten intensief gevaccineerd om ziekte en productieverlies
zoveel mogelijk te voorkomen. Het gebeurt hierbij regelmatig dat meerdere vaccins tegelijk worden
toegediend om de arbeid te verlichten en om de dieren stress te besparen. Het is dan ook de vraag of
dit een invloed kan hebben op de werkzaamheid ervan. Op de bijsluiter van een vaccin wordt vaak
vermeld dat er geen informatie beschikbaar is over het gelijktijdig gebruik van het vaccin met andere
vaccins of enig ander diergeneesmiddel (o.a. bij Neocolipor en Circovac). Er zijn natuurlijk talrijke
voordelen van simultane vaccinatie. Pijn en stress kunnen gereduceerd worden door de tijd van
vaccineren te beperken, dit komt het dierenwelzijn ten goede. De arbeid voor de varkenshouder wordt
ook verminderd. Men kan zich echter de vraag stellen of er een limiet bestaat in het aantal vaccins dat
tegelijk gegeven kan worden. Simultane vaccinatie zou eventueel immunosuppressie, reacties of
overstimulatie van het immuunstelsel kunnen veroorzaken (Falvo en Horowitz., 1994; Offit et al.,
2002). Anderzijds kan het ook zijn dat werking van het ene vaccin versterkt wordt door het andere
vaccin, hierbij kunnen bijhorende adjuvantia een rol spelen (De Clerck et al., 1989; Altaf et al., 2012).
Correct vaccineren is belangrijk om het gebruik van antibiotica te reduceren, het is dan ook van
cruciaal belang een correct vaccinatieschema te volgen en te weten of er al dan niet interferentie kan
zijn wanneer meerdere vaccins op één tijdstip toegediend worden. In deze studie wordt de combinatie
bestudeerd van twee courant gebruikte vaccins. Circovac wordt gebruikt ter controle van Porcine
Circovirus type 2 (PCV2) infecties. Dit virus kan mee de oorzaak zijn van wegkwijnziekte, vaak te zien
in de batterij of bij het begin van de afmestperiode, maar het kan ook subklinisch aanwezig zijn op een
bedrijf. Neocolipor kan helpen bij de controle van neonatale diarree veroorzaakt door E. coli infecties.
Deze laatste kiem kan voor grote economische verliezen zorgen in de kraamstal.
In deze proef werd onderzocht of het gelijktijdig toedienen van deze vaccins een invloed had op de
veiligheid en de antistoffenopbouw in vergelijking met het enkelvoudig toedienen. Verder werd ook
rekening gehouden met ongewenste neveneffecten, hiervoor werden de parameters temperatuur,
huidreactie en buikvulling opgevolgd.
3
2. LITERATUURSTUDIE
2.1. Porcine Circovirus
2.1.1. Inleiding
Het Porcine circovirus type 2 (PCV2) is tegenwoordig één van de belangrijkste pathogenen in de
varkenshouderij die wereldwijd voor grote economische schade zorgt, het komt dan ook voor op alle
continenten. Het porcine circo virus (PCV) werd voor het eerst beschreven in 1974 als een
contaminant van de PK-15 niercelcultuur (Porcine Kidney-15 cellijn, deze cellijn wordt ook gebruikt
voor de immunoperoxidase monolayer assay (IPMA) test, zie verder). Zeventien jaar later werd in
Canada een nieuw syndroom beschreven veroorzaakt door een variant (PCV2, zie Figuur 1) van het
eerder gekend PCV, het zogenaamde postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). Het
virus wordt ook geassocieerd met het porcine dermatitis en nefropathie syndroom (PDNS) en porcine
respiratoire disease complex (PRDC). Soms spreekt men algemeen ook over porcine circovirus
diseases (PCVD) (Allan en Ellis, 2000; Segales et al., 2013).
PCV2 behoort tot het genus Circovirus van de familie Circoviridae. Het virale genoom dat omgeven is
door een icosahedrale capsid met een diameter van 17±1,3 nm bestaat uit een circulaire,
enkelvoudige DNA-streng (ssDNA). De replicatieve vorm is een intermediaire dubbelstrengig DNA. Er
is geen envelop aanwezig waardoor het PCV2 virus zeer resistent is aan vetoplosbare desinfectantia.
Het virus is ook chemisch en thermisch resistent, hoewel hoge temperaturen de infectiviteit kunnen
doen afnemen (Finsterbusch en Mankertz, 2009; Grau-Roma et al., 2011). De PCV2 genen zijn
geordend in 11 zogenaamde open reading frames (ORF). Drie ervan zorgen voor proteïne-expressie.
Een experimentele infectie met een ORF3-deficiënt PCV2 zou minder pathogeen zijn dan een infectie
met het wilde type (Karuppannan et al., 2009). Er zijn ook meerdere genotypes: genotype PCV2b zou
meer virulent zijn dan PCV2a. PCV2c wordt vooral in Denemarken gezien (Grau-Roma et al. 2011).
Fig.1 Elektronenmicroscopische opname van PCV2
na negatieve kleuring van PK15 celcultuur lysaat
geïnoculeerd met materiaal van een big met PMWS
(uit Allan en Ellis, 2013).
4
2.1.2. Epidemiologie
Het Porcine circovirus is momenteel zodanig verspreid dat bijna alle bedrijven seropositief zijn. In
Nederland werd vastgesteld dat in 2014 85% van de bedrijven vaccineert tegen PCV2, het aantal
bedrijven neemt nog ieder jaar toe (http://www.veearts.nl/2014/meer-vaccinaties-tegen-circo-en-
mycoplasma/). Op geïnfecteerde bedrijven kan bij de biggen een hoge titer antistoffen gevonden
worden. Deze antistoffen zijn afkomstig uit het colostrum. Hoe hoger deze titer, hoe lager de kans op
viremie. Sommige biggen blijven levenslang geïnfecteerd. PCV2 infectie gebeurt vooral bij biggen van
acht tot 16 weken oud, in theorie kan een varken op elke leeftijd geïnfecteerd worden (Grau-Roma et
al., 2009; Grau-Roma et al. 2011). Het aantal biggen met typische klinische symptomen van PMWS in
een toom is meestal laag en tussen de leeftijd van vijf tot twaalf weken oud (Allan en Ellis, 2000).
Er bestaat een horizontale en verticale transmissie en het virus blijft zeer stabiel in de omgeving. Het
virus kan transplacentair en via het sperma overgedragen worden, dit is de verticale route. Wanneer
er direct contact is tussen de biggen kan er eveneens een oronasale overdracht gebeuren, dit wordt
gezien als de belangrijkste oorzaak van infectie. Infectie kan dan gebeuren door mengen van
positieve dieren met naïeve dieren. PCV2 is verder ook aanwezig in andere lichaamssecreties (urine,
feces, ooguitvloei etc.). (Park et al., 2009; Larochelle et al., 2000; Grau-Roma et al. 2011). Een minder
waarschijnlijke vorm van overdracht is via muizen. Het virus kan overgedragen worden tussen muizen
onderling en kan vermeerderen in beperkte mate. De transmissie via lucht is niet duidelijk en het is
niet geweten of dit een belangrijke wijze van verspreiding kan zijn (Patterson en Opriessnig, 2010;
Zimmerman et al., 2012).
2.1.3. Pathogenese
De pathogenese van PMWS is niet helemaal gekend en een vast herhaalbaar ziektemodel is nog
steeds niet gevonden. Wel weet men dat er een combinatie nodig is van PCV2 met al dan niet
infectieuze cofactoren. Immunostimulatie bevordert dan ook de replicatie van het virus. Door de
directe en/of indirecte invloed van PCV2 ontstaat bij PMWS lymfoïde depletie en lymfopenie (Sarli et
al., 2001; Allan et al., 2004). Veel biggen op onze commerciële bedrijven komen ooit in contact met
PCV2 maar enkel een klein deel ervan krijgt PMWS. Vroeger dacht men o.a. aan een co-infectie met
het porcine parvovirus, momenteel denkt men dat ook kiemen zoals het porcine reproductive and
respiratory syndrome virus (PRRSv) en Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyopneumoniae) een rol
kunnen spelen. Zelfs factoren zoals vaccins, adjuvantia, lipopolysachariden (LPS) kunnen mee helpen
PMWS te veroorzaken en sommige spreken zelfs over het bestaan van verschillende sub-genotypes
van PCV2. De meesten zijn er dan ook van overtuigd dat één of andere stimulatie van de
immuunrespons een belangrijke oorzaak is (Darwich en Mateu, 2012).
Voor de replicatie heeft het virus cellen in de S-fase en met een hoge mitotische activiteit nodig. T
cellen (CD4+ en CD8+) en B lymfocyten komen hiervoor in aanmerking. In tegenstelling tot wat men
vroeger dacht kunnen ook macrofagen (naast epitheliale en endotheliale cellen) de replicatie
5
ondersteunen. De hoogste hoeveelheid virus wordt gevonden in het cytoplasma van de monocyten en
macrofagen. In vitro werd aangetoond dat het virus deze cellen kan infecteren en erin persisteren
(zonder actieve replicatie). Ze staan ook in voor het verspreiden van het virus in het lichaam.
Ongeveer één week na de infectie wordt de PCV2 viremie voor het eerst gezien en de virale titer piekt
op 14 tot 21 dagen na infectie. Ondertussen verspreidt het virus zich en is het vooral in de
lymfeknopen terug te vinden. Seroconversie na infectie in het veld gebeurt meestal op zeven tot twaalf
weken leeftijd en antistoffen blijven op zijn minst tot 28 weken leeftijd aanwezig. Het virus kan
uiteindelijk teruggevonden worden in epitheelcellen (zowel van nier als luchtwegen), endotheelcellen,
enterocyten, hepatocyten, gladde spiercellen, lymfocyten etc. (Vincent et al., 2003; Sànchez et al.,
2004).
Apoptose van B-cellen ontstaat na infectie van delende cellen, macrofagen en B lymfocyten. Er
ontstaat histiocyteninfiltratie en lymfocytendepletie van zowel de folliculaire centra als van de
parafolliculaire zones. Algemeen gezien ontstaat dan ook immunosuppressie en verhoogde
gevoeligheid voor andere infecties (Darwich et al., 2004; Kixmöller et al., 2008).
De complexiteit van de pathogenese wordt tenslotte ook aangetoond door verschillende in vitro
studies. Men zag een verandering in productie van cytokines/chemokines van alveolaire macrofagen
in cultuur wanneer PCV2 wordt toegevoegd (Chang et al., 2006). PCV2 kon ook dentritische cellen
verzwakken (Vincent et al., 2007). Een samenvatting van de pathogenese is te vinden in Figuur 2.
6
2.1.4. Symptomen en letsels
De term PMWS wordt gebruikt om het syndroom te beschrijven dat progressief conditieverlies en
letsels in verschillende organen veroorzaakt. Het syndroom wordt in de volksmond ook wel eens
‘wegkwijnen’ genoemd. PCV2 kan een hele reeks klinische manifestaties veroorzaken, echter deze
komen niet steeds allemaal tegelijk en duidelijk voor.
Fig.2 Pathogenese van PMWS veroorzaakt door PCV2 (uit Darwich et al., 2004).
7
PMWS komt zowel endemisch als epidemisch voor. Een verhoogde gevoeligheid voor PMWS hangt
van vele factoren af zoals aanwezigheid van bepaalde genen of co-infecties (zie eerder). Het is
bekend dat het ras Piétrain zorgt voor een reductie van PCV2 en vooral van de pathologische letsels
(Opriessnig et al., 2009). Niet specifieke immunostimulatie zoals vaccinatie (tegen PRRSv of tegen
Escherichia coli (E. coli) speelt ook een rol, zeker met een op olie-gebaseerde adjuvans. Men spreekt
verder nog over Agent X om de onbekende oorzaak aan te duiden, aangezien men via proeven met
enkel en alleen PCV2 inoculatie niet de PMWS-symptomen kon reproduceren. Wel staat vast dat
PCV2 het essentiële infectieuze agens is voor het veroorzaken van PMWS. Het succes na vaccineren
bevestigt dit onrechtstreeks. PCV2 kan dan ook deel uitmaken van het porcine respiratoire disease
complex (PRDC zie verder) (Chae, 2005; Tomas et al., 2008; Grau-Roma et al., 2011).
Bij biggen met PMWS kunnen volgende symptomen gezien worden: bleke huid en icterus,
vermageren en wegkwijnen, dyspnee, diarree (Figuur 3). Bij een acute uitbraak kan de mortaliteit
stijgen tot 10%, bij subklinisch geïnfecteerde dieren is dit lager. Morbiditeit kan van 4% tot 30%
oplopen. PMWS letsels worden vaak eerst in de lymfoïde weefsels gezien. Men ziet eerst vergrote
lymfeknopen (vooral de lies, submandibulaire, mesenteriale en mediastinale lymfeknopen)
(Zimmerman et al., 2012). Dit typische kenmerk is echter niet steeds aanwezig, soms treedt er zelfs
atrofie op bij erge letsels en in een verder stadium van PMWS (Ségales et al.,2004). Necrotiserende
letsels in de lymfeknopen kunnen dan ook gevonden worden. Histopathologisch ziet men letsels in de
lymfoïde weefsels. Er is een lymfocytendepletie. Dit gaat vaak gepaard met multifocale tot diffuse
histiocyten en reuzencel infiltratie. Ook ziet men cyotplasmatische inclusies van PCV2. De longen zijn
vergroot, ze collaberen niet en er is een verhoogde stevigheid (rubberachtig). In het subacute stadium
vindt men een interstitiële pneumonie (Zimmerman et al., 2012). Chronische gevallen kunnen leiden
tot bronchiolitis fibrosa obliterans (Allan en Ellis, 2000). Er is een lymfocytendepletie en histiocyten
infiltratie in het broncho-alveolaire lymfoïde weefsel (BALT). Verder kan ook een vergrote lever
aanwezig zijn (met icterus symptomen), nieren met witte vlekjes, maagulcera, anemie en/of vetatrofie
(Allan en Ellis, 2000). Bij symptomen van PMWS kan ook gedacht worden aan PRRSv, Glässer’s
disease, salmonellose, porcine intestinale adenomatose (PIA),.. Niet-infectieuze oorzaken en fouten
met het algemeen management mogen niet uit het oog verloren worden.
(http://www.merckmanuals.com/vet/generalized_conditions/porcine_circovirus_diseases/overview_of_
porcine_circovirus_diseases.html).
8
Porcine dermatitis en nefropathie syndroom (PDNS) wordt ook geassocieerd met PCV2 infectie.
Meestal is de prevalentie niet meer dan 1%, er is dan eerder sterfte bij biggen ouder dan twaalf
weken. Dit ziektebeeld zou door afzetting van immuuncomplexen in de nieren veroorzaakt worden.
Deze immuuncomplexen ontstaan door massale antistof-antigeen binding en kunnen een
inflammatoire reactie opwekken wanneer ze binden aan glomerulaire capillairen en andere bloedvaten
(Wellenberg et al., 2004). Typische symptomen die gezien worden bij dit syndroom zijn anorexie,
depressie, koorts en necrotiserende vasculitis die de dermale en subcutane huid aantast met
onderhuidse bloedingen tot gevolg. Rode tot paarse maculae of papulae op de achterbenen en/of
perianale regio kunnen aanwezig zijn (Figuur 4). Bij autopsie zien we vergrote nieren met
puntbloedingen, fibrinonecrotiserende glomerulitis met non-purulente interstitiële nefritis (Figuur 5).
Andere pathogenen die PDNS of gelijkaardige letsels kunnen veroorzaken zijn Pasteurella multocida
(P. multocida ), combinaties van PCV2 met PRRSv, vlekziekte, Actinobacillus suis (A. suis),
exsudatieve epidermatitis, Afrikaans of klassieke varkenspest. De nierletsels kunnen ook wijzen op
salmonellose (Chae, 2005).
Fig.3 Varken (links) met PMWS naast klinisch gezond
varken (rechts) (uit
http://www.merial.nl/Dierhouders/Varkens/Pages/circovirus.
aspx).
Fig.4 en 5 Varken (links) met PDNS vaak gelokaliseerd t.h.v. de (achter)poten en oren. Nier (rechts) met puntbloedingen
en witte spots (uit http://www.gezondevarkens.be/content/porcien-circovirus-type-2-geassocieerde-aandoeningen-pcvd).
9
Het Porcine respiratoire disease complex (PRDC) kenmerkt zich door trage groei, hogere
voederconversie, vermageren, koorts, hoesten en dyspnee. Co-infecties kunnen gemakkelijk
pneumonie veroorzaken zoals PRRSv, influenza-virus, P. multocida, Actinobacillus pleuropneumoniae
(A. pleuropneumoniae) en M. hyopneumoniae. PCV2 kan een rol spelen in het PRDC en wordt af en
toe geïsoleerd. Microscopisch kan een broncho-interstitiële pneumonie met peribronchale en
peribronchiolaire fibrose ontstaan. Het is moeilijk aan te tonen dat PCV2 de primaire oorzaak is van
het PRDC, het virus moet aanwezig zijn in de letsels en er mogen geen letsels zijn in de lymfoïde
weefsels (i.t.t. bij PMWS). (Ségales et al., 2004; Chae, 2005).
Er zijn verschillende aanwijzingen dat PCV2 ook voor reproductiestoornissen kan zorgen. Johnson et
al. (2002) hebben dit via een proef met PCV2 inoculatie bewezen: 37 foetussen werden intramusculair
(IM) geïnjecteerd door de baarmoederwand via laparotomie van de zeugen en er werden
abnormaliteiten (mummificatie, doodgeboorte) vastgesteld. Park et al. (2005) hebben 6 drachtige
zeugen 3 weken voor werpen geïnfecteerd: 3 aborteerden en 3 wierpen te vroeg (park et al., 2005).
Anders dan PRRSv die de placenta doorkruist tijdens de late dracht kan PCV2 tijdens de hele dracht
aanslaan (Chae, 2005). Afhankelijk van het tijdstip van infectie ziet men klinisch abortus, mummificatie
en doodgeboorte.
Verder wordt PCV2 ook nog geassocieerd met granulomateuze enteritis (inflammatie en
lymfocytendepletie in de Peyerse platen), exsudatieve epidermitis, necrotiserende lymfadenitis en
congenitale tremor. Bij deze laatste is er echter nog controversie over het feit of PCV2 het oorzakelijk
agens is (Chae, 2005).
2.1.5 Diagnose, behandeling en preventie
Voor het beschikbaar komen van commerciële vaccins, werden problemen met PCV2 vooral onder
handen genomen via aanpassing van het management. Echter door het opkomen van verschillende
vaccins kon het virus beter onder controle gehouden worden. Dit wil niet zeggen dan men verder geen
aandacht aan het management moet geven: co-infecties moeten allereerst vermeden worden,
eventueel door gebruik van vaccins tegen andere agentia. Liefst is er een minimaal contact tussen
verschillende groepen varkens en moeten zieke varkens verwijderd worden. Verder moet men
aandacht schenken aan ontworming, ventilatie en desinfectie. Er dient hierbij rekening gehouden te
worden met het feit dat PCV2 ook via het sperma kan overgedragen worden. Vaak gaat het aantal
geïnfecteerde dieren en hun virale load gepaard met daling van maternale antistoffen. In een
populatie waar het virus aanwezig is worden meeste dieren geïnfecteerd, slechts enkele kunnen
PMWS vertonen. Tegenwoordig ziet men vooral subklinische infecties gepaard gaande met slechtere
productieresultaten (Zimmerman et al., 2012). Aangezien het virus vaak aanwezig is in de omgeving
krijgen de biggen meestal een passieve immuniteit via de maternale antistoffen. Het belang van een
goede colostrumopname mag dus niet onderschat worden. McKeown et al. (2005) toonden aan dat
10
het level maternale antistoffen tegen PCV2 een zeer belangrijke factor in de respons op PCV2.
Hoogst waarschijnlijk is er een positief verband tussen het level antistoffen en de bescherming van de
big tegen het virus. Vanaf zeven weken kunnen deze maternale antistoffen terug dalen.
Om te kunnen spreken van PMWS moeten drie criteria aanwezig zijn:
1) Typische symptomen (groeivertraging, dyspnee, vergrootte lieslymfeknopen of icterus)
2) Karakteristieke histopathologische letsels in de lymfeweefsels
3) Aanwezigheid van PCV2 in deze letsels (lymfeweefsels en andere aangetaste organen)
(Chae, 2012)
De werkzaamheid van vaccins kan ook met deze criteria beoordeeld worden. Een bedrijf waar PCV2
aangetoond is via PCR of serologie zonder klinische symptomen kan men zien als een subklinisch
geïnfecteerd bedrijf. Er zijn een aantal methodes ontwikkeld voor de diagnose van PCVD, in situ
hybridisatie en immunohistochemie worden vaak gebruikt om PCV2 aan te tonen in aangetaste
weefsels. PCV2 kan ook teruggevonden worden in de myocardcel van (gemummificeerde) foetussen
na abortus. Het is ook belangrijk om de hoeveelheid virus te bepalen, o.a. met kwantitatieve PCR (de
hoeveelheid virus aanwezig zou gerelateerd zijn aan de mate van microscopische letsels en zou
hoger zijn bij klinisch geïnfecteerde dieren dan subklinische geïnfecteerde dieren. Voor de grens
tussen PMWS en subklinische infectie wordt 107 DNA kopieën/ml voorgesteld (Olvera et al., 2004)).
Kwalitatieve PCR daarentegen kan niet aangeven of PCV2 de primaire oorzaak is van de problemen.
Serologische testen (IPMA, seroneutralisatie) kan ook uitgevoerd worden (men kan kijken naar de
seroconversie), maar men constateert dat hetzelfde patroon van antistoffen kan voorkomen bij zowel
bedrijven met PMWS problemen als bij bedrijven zonder deze problemen. Wel kan gekeken worden
wanneer maternale antistoffen dalen om vaccinatiestrategie aan te passen (Zimmerman et al., 2012).
Men kan eigenlijk een onderscheid maken tussen individuele diagnose of groepsdiagnose. Deze
laatste moet voldoen aan twee criteria: significante stijging in sterfte na spenen en wegkwijners en
betrouwbare diagnose van PMWS in minstens 1/5 van de biggen post mortem (Grau-roma et al.,
2011).
2.1.6. Vaccinatie tegen PCV
Er is geen twijfel aan het belang van PCV2 en de noodzakelijkheid om hiertegen te vaccineren op
probleembedrijven. Echter klinische symptomen zijn vaak het topje van de ijsberg, subklinische PCV2-
infectie zal meestal ook een negatieve impact hebben op de productieresultaten (Maes, 2012). Pas in
2004 werd het eerste commerciële PCV2 vaccin gebruikt in Frankrijk en Duitsland. Ondertussen zijn
er een viertal vaccins op de markt. Vaccinatie werd eerst ingezet om PMWS te bestrijden, maar het
werkt ook voor andere Porcine circovirus associated diseases (PCVAD). De klinische vorm komt
tegenwoordig minder voor, toch kan vaccinatie een hulp zijn om ook de subklinische vorm onder
controle te houden. Verder zal blijken dat alle commerciële vaccins effectief zijn en productieresultaten
kunnen verbeteren. Verbetering van dagelijkse groei, voederconversie en mortaliteit zijn voordelen na
11
vaccinatie. Uiteindelijk wordt ook het antibioticagebruik gereduceerd als secundaire bacteriële infecties
vermeden kunnen worden en wordt het dierenwelzijn verhoogd (Kixmöller et al., 2008; Grau-roma
2011; Chae, 2012; Segalés et al. 2013).
In 2006, meer dan tien jaar na de identificatie van het virus, was het eerste vaccin CIRCOVAC®
(MERIAL, Lyon, Frankrijk) beschikbaar in bijna heel Europa en Canada. CIRCOVAC is een
geïnactiveerd PCV2 vaccin gebaseerd op een olie-adjuvans (TS61: paraffine olie). Als hulpstof is
thiomersal aanwezig (zie verder). Het vaccin werd eerst gebruikt voor gelten en zeugen, later ook voor
biggen, evenwel aan een lagere dosis. Als primovaccinatie krijgen gelten 2x1 dosis van 2ml met een
interval van drie of vier weken (tweede vaccinatie moet minimum twee weken voor dekken gebeuren).
Dit wordt gevolgd door een boostervaccinatie met één dosis minimum twee weken voor het werpen.
Zeugen krijgen ook 2x1 dosis met drie tot vier weken interval (de tweede vaccinatie minimum twee
weken voor het werpen). Revaccinatie gebeurt elke dracht minimum twee tot vier weken voor het
werpen. Na overdracht van passieve antistoffen door colostrum opname van de big is de duur van de
immuniteit ongeveer vijf weken. Om biggen te vaccineren moeten deze ouder zijn dan drie weken en
dan krijgen ze 1 dosis van 0.5 ml. Bij deze actieve immunisatie van biggen is de aanvang twee weken
na vaccinatie en heeft een duur van ten minste 14 weken. (www.ema.europa.eu). Enkel dit vaccin is
geregistreerd om ook zeugen en gelten te vaccineren i.t.t. de overige vaccins die enkel dienen voor
biggen. Vaccinatie via zeugen bespaart werk voor de varkenshouder i.t.t. vaccinatie van alle biggen.
Uiteraard moet de opname van colostrum voldoende zijn om goede bescherming te bekomen (Chae,
2012).
Verder zijn nog sub-unit vaccins beschikbaar. INGELVAC CIRCOFLEX® (Boehringer Ingelheim), en
PORCILIS PCV® (MSD). Deze zijn gebaseerd op een open reading frame 2 (ORF2 zie eerder)
proteïne. Dit bevat een belangrijk epitoop om een immuunrespons op te wekken. (Chae, 2012).
SUVAXYN PCV® (Zoetis) is een recombinant PCV2 vaccin. Het bevat de genetica van een niet-
pathogene PCV1 maar met het belangrijke ORF2 capsied gen van PCV2. Via dit gen is er expressie
van het ORF2 proteïne zodat een immuunreactie kan ontstaan. Vaccins gebaseerd op het PCV1
genotype werken ook goed tegen PCV2 wegens het bestaan van kruisimmuniteit (Chae, 2012; Fraile
et al., 2012a). Een overzicht van de verschillende vaccins wordt in Tabel 1 weergeven:
12
VACCINS BESTANDDEEL ADJUVANS DIERSOORT DOSIS en
POSOLOGIE
CIRCOVAC® Geïnactiveerd
PCV2
Lichte paraffine
olie
Gelten
Zeugen
Biggen
2x 2ml +
1x2ml IM
2x 2ml +
1x2ml IM
1x 0.5ml IM
INGELVAC
CIRCOFLEX®
Porcine
Circovirus type
2 ORF2
antigeen
Carbomeer Biggen vanaf
twee weken
1x 1ml IM
PORCILIS PCV® Porcine
circovirus type 2
ORF2 antigeen
Dl -α-
tocoferylacetaat
en
lichte paraffine
olie
Biggen vanaf
3 weken OF
biggen vanaf
3 dagen én
op 3 weken
1x of 2x 2ml
IM
SUVAXYN PCV® Inactivated
recombinant
PCV1
expressing the
PCV2 ORF2
protein
Sulfolipo-
cyclodextrin
en
Squalane
Biggen vanaf
3 weken
1x 2ml IM
BIGGEN
Twee belangrijke effecten worden gezien bij immunostimulatie: de aanmaak van neutraliserende
antistoffen (NAs) en IFN-γ. Specifieke NAs tegen PCV2 spelen een hoofdrol in de bescherming tegen
PMWS en worden geïnduceerd door de beschikbare vaccins. Een stijging van NAs gaat gepaard met
een daling van de viremie en met daling van PCVAD onder experimentele omstandigheden. Een
chimeer PCV1/PCV2 vaccin zorgt voor een hogere NA titer vergeleken met subunit vaccins. Er is
geen verschil in NAs tussen een subunit of een geïnactiveerd vaccin. Één enkele dosis zou wel een
lagere NA titer geven dan een dubbele dosis (Meerts et al., 2005; Fort et al., 2007; Fort et al 2009b;
Tabel 1: Verschillende beschikbare vaccins tegen PCV2
13
Fraile et al., 2012a; Chae, 2012). Vaccinatie zorgt ook voor PCV2 specifieke IFN-γ–secreterende
cellen. IFN-γ is een cytokine dat celgemedieerde respons reguleert en zorgt voor differentiatie van
naïeve CD4 T cellen naar T-helper-1 (Th1) cellen. Deze specifieke cellen worden ook gevonden na
natuurlijke infectie. De reductie van PCV2 in het bloed gaat samen met de opkomst van deze Nas en
IFN-γ–secreterende cellen. Deze immuunreacties worden ook gezien als maternale antistoffen nog
aanwezig zijn. De duur van de immuniteit is ongeveer 12-13 weken na een eerste immunisatie (Meerts
et al., 2005; Fort et al., 2009b; Chae, 2012).
De meeste vaccins worden bij biggen gebruikt. De werking van het vaccin wordt beschreven in
verschillende studies. Kixmöller et al. (2008) hebben een proef uitgevoerd met 1519 biggen op een
bedrijf waar PMWS werd vastgesteld. De 3 weken oude biggen werden in twee groepen verdeeld: de
ene groep werd gevaccineerd, de andere kreeg een placebo (injectie met carbomeer adjuvans zonder
PCV2 proteine). Men zag bij de gevaccineerde dieren een verlaagde PCV2 infectiedruk en kortere
duur van de viremie. Verder was er een stijging van het lichaamsgewicht met 4.84 kg, reductie van
53% sterfte en significant minder klinische tekenen van PMWS. Opmerkelijk zag men na PCR
onderzoek van longstaaltjes (longweefsel werden genomen aan de rand van eventuele letsels) een
lager aantal co-infecties met PRRSv en Mycoplasma hyorhinis. Fort et al. (2009b) infecteerde biggen
met enkel PCV2 onder experimentele omstandigheden. Er werd een daling van viremie gezien met
42.0% tot 86.1% na 1 enkele dosis met verschillende vaccins. Bij Fraile et al. (2012a) waren er
gelijkaardige resultaten als bij voorgaande studies: minder klinische symptomen en sterfte en een
hoger gemiddelde dagelijkse groei.
De werkzaamheid van Circovac is ook bewezen door een proef van Heiβenberger et al. (2013).
Biggen van drie weken oud gehuisvest op een bedrijf met PCVD problemen kregen een enkele dosis.
Het effect van vaccineren beoordeelde men op basis van mortaliteit, de aanwezigheid van magere
biggen en de groei. Er was een verbetering van deze parameters. Er was ook een daling van het
specifieke PCV2 DNA (na analyse van sera met qPCR) bij gevaccineerde dieren. Vaccineren was ook
belangrijk om de infectiedruk te doen dalen op populatieniveau. Fraile et al. (2012a) hebben een
significante daling van PCV2 in feces gevonden (naast een daling in serum). Deze daling is belangrijk
om ook de infectiedruk in de stal te doen dalen. Dit werd ook gezien in een proef van Fort et al. (2008)
samen met daling van de uitscheiding via de neus. Een opkomst van viremie vermeed men na
vaccinatie van biggen die besmet werden met 4 verschillende PCV2 isolaten met verschillende
afkomst en genotype.
ZEUGEN
Men kan ook de zeugen vaccineren i.p.v. de biggen. Zo kunnen de biggen een passieve immuniteit
verkrijgen via het opnemen van colostrum. Aangezien veel bedrijven seropositief zijn, worden
antistoffen geproduceerd en via biest overgedragen. Het is evident dat er voldoende opname van
colostrum moet zijn voor een goede bescherming. Het risico op het krijgen van PMWS bij biggen van
zeugen met lage antistoffen (IPMA < of = 1/20) is drie keer hoger vergeleken met biggen van zeugen
met een hoge titer (Pejsak et al., 2010; Grau-Roma et al., 2011). Vaccineren van zeugen kan ook
14
verbeterde reproductieresultaten geven (Kekarainen et al., 2010). Dit werd ook gezien op een bedrijf
met PMWS: na vaccineren (Circovac) van de zeugen zag men minder terugkomers en lager
abortuspercentage vergeleken met de periode van tijdens en voor de uitbraak. Hier waren er ook
gelijkaardige positieve effecten op productieparameters bij de biggen (Pejsak et al., 2010). Na
vaccineren van zeugen was er een verhoogde titer van anti-PCV2 IgG antistoffen in het colostrum.
Groot voordeel hierbij is dat vaccineren van de zeugen minder arbeidsintensief is dan vaccineren van
de biggen. Onder veldomstandigheden was de dagelijkse groei voor spenen bij biggen van
gevaccineerde zeugen groter t.o.v. biggen van niet gevaccineerde zeugen die zelf een actieve
immuunrespons moesten opbouwen (Chae, 2012). Er zou ook overdracht zijn van een maternale
PCV2-specifieke cellulaire immuunrespons van de zeug naar haar nakomelingen (Oh et al., 2012).
Men kan zich afvragen wat nu de beste vaccinatiestrategie kan zijn. In een proef op een bedrijf met
PMWS werden drie vaccinatieprotocollen uitgetest (Circovac): vaccinatie van zeugen, vaccinatie van
biggen en vaccinatie van beide. De productieparameters van de opgevolgde biggen (groei,
voederconversie (VC), mortaliteit en slachtgewicht) waren na vaccinatie, gelijk welk protocol er
aangewend werd, terug even goed of zelfs beter als voor de uitbraak. Dit laatste kan erop wijzen dat
er eerder een subklinische infectie aanwezig was. Na vaccinatie van beide groepen (zeugen en
biggen) was groei het best. Vaccineren van zeugen toonde een lagere mortaliteit vóór het spenen. Er
was geen verschil in voederconversie merkbaar tussen de drie groepen (echter wel een verbetering
vergeleken met tijdens de uitbraak) (Pejsak et al., 2010).
Algemeen kan uit deze verschillende onderzoeken volgende zaken vastgesteld worden: bij bedrijven
waar er een vroege infectie met PCV2 bestaat is vaccineren van zeugen aangeraden, indien er een
latere infectie is, wordt vaccinatie van biggen aangeraden (Chae, 2012). Naast het beslissen welke
vaccinatiestrategie kan gebruikt worden, moet ook nagedacht worden over hoelang men kan
vaccineren. Het is erg moeilijk ervoor te zorgen dat een bedrijf volledig seronegatief wordt én blijft.
Hiervoor moeten, naast vaccineren, grondige inspanningen op vlak van management geleverd
worden. In een proef van Feng et al. (2014) constadeerde men dat er een jaar na de laatste vaccinatie
op een bedrijf terug opflakkering was van PCV2. Hiervoor werd een jaar lang PCV2 ELISA en qPCR
uitgevoerd op bloedstalen van biggen en zeugen. Het aantal positieve bloedstalen waren 8%, 0.9% en
3,5% PCV2 voor, tijdens en na een massavaccinatie respectievelijk. Er moet vermeld worden dat hier
geen extra inspanningen op vlak van bioveiligheid na het stoppen van de vaccinatie werden genomen
(Feng et al, 2014).
In de literatuur is er nog veel discussie over het al dan niet interfereren van maternale antistoffen met
vaccinatie, al dan niet afhankelijk van het gebruikte vaccin. Aangezien veel bedrijven seropositief zijn
geven zeugen antistoffen mee via hun colostrum aan de biggen. Fraile et al. (2012a) hebben
aangetoond dat de aanwezigheid van een hoge maternale immuniteit op het moment van vaccineren
interfereerde met de opbouw van een actieve humorale respons. Echter als men louter keek naar
PCV2-geassocieerde letsels en virus in serum en feces, dan zag men geen effect van deze
interferentie. Ook Fort et al. (2009b) bekwamen gelijkaardige resultaten: aanwezigheid van een hoge
IPMA (immunoperoxidase monolayer assay) titer interfereerde met opbouw van humorale respons.
15
Een proef van Kixmöller et al. (2008) (zie eerder) toont aan dat de reductie in viremie na vaccinatie
van biggen (3 weken oud) niet wordt beïnvloed door de aanwezigheid van maternale antistoffen. De
antistoffentiter werd bepaald op de dag van vaccinatie en zeugen werden ingedeeld in drie groepen
op basis van de hoeveelheid aanwezige antistoffen. Verder werd ook beschreven dat vaccineren zorgt
voor PCV2 specifieke neutraliserende antistoffen, ook al is er aanwezigheid van maternale antistoffen
(Fort et al., 2008). Anderzijds kunnen maternale antistoffen de B-cel respons verhogen via de
complement-cascade door aanwezigheid van antigeen-antistof complexen (Fraile et al., 2012a). De
complement cascade bestaat uit een reeks plasma-eiwitten die met elkaar reageren om infectie te
bestrijden, het is onmisbaar voor de lichaamsbescherming. Bij activatie ontstaat een ketenreactie die
cellen of binnendringende organismen kan verwijderen (vb. via opsonisatie en fagocytose). Het zorgt
verder ook voor controle van de ontstekingsreactie en voor verwijderen van antigeen-antistof
complexen. Vorming van C5b kan via een klassieke en alternatieve manier en leidt tot porie-vorming
in de celmembraan zodat cellyse kan onstaan (Janeway et al., 2001).
2.2. Enterotoxigene Escherichia coli
2.2.1. Inleiding
Neonatale diarree in de kraamstal wordt hoofdzakelijk veroorzaakt door de zogenaamde
enterototoxigene Escherichia coli (ETEC) stammen. Deze vorm van diarree komt meestal voor bij
biggen tussen dag nul en dag vier. Escherichia coli (E. coli), behorende tot de familie van de
Enterobacteriaceae, is een Gram-negatief staafje en is obligaat symbiotisch, facultatief pathogeen.
Escherichia coli (E. coli) stammen worden ingedeeld in verschillende serotypes. Deze indeling gebeurt
op basis van antigenen. Er zijn dan ook verschillende antigenen aanwezig waaronder LPS (O
antigeen), kapsel (K antigeen), flagellen (H antigeen) en fimbriële antigenen (Zutic et al., 2010). Deze
bacterie is gevoelig aan zonlicht, uitdroging en aan de meeste desinfectantia. De kiem kan overleven
in organisch materiaal. E. coli kan ook deel uit maken van de normale darmflora. Naast neonatale
diarree kan ETEC ook diarree veroorzaken bij oudere zuigende biggen en bij gespeende biggen. De
ziekte wordt vooral gezien als het evenwicht tussen maternale immuniteit en infectiedruk verstoord
wordt. Oorzaken van daling van de maternale immuniteit kunnen zijn: porcine hypogalactie syndroom
(PHS,) eersteworp zeugen, laag geboortegewicht van de biggen, infecties met andere kiemen,
overbezetting,.. De infectiedruk zal al snel stijgen wanneer enkele biggen diarree vertonen in het
kraamhok en bij onvoldoende hygiëne. Doordat er ook vaak resistentie tegen E. coli wordt
waargenomen is het belang van een correcte vaccinatie niet te onderschatten (Haesebrouck et al.,
2004; Zimmerman et al., 2012b).
16
2.2.2 Epidemiologie
Via de moederzeug of via de besmette omgeving in het kraamhok komen de pasgeboren biggen
meteen in contact met de kiem, zelfs nog voor ze starten met de opname van colostrum. Zeker bij een
continu systeem en/of een zeer vuile omgeving zijn de kansen op een uitbraak aanzienlijk groot. Bij
klinisch gezonde varkens komt de kiem voor in het distaal deel van de dunne darm en in de dikke
darm, zij zijn dan de besmettingsbron voor hun biggen.
Biggen kunnen ook zelf drager zijn van ETEC stammen in de dikke darm, maar deze kunnen
onderdrukt worden zolang er lactogene immuniteit aanwezig blijft. Na spenen valt deze immuniteit weg
en kan de kiem toch klinische symptomen veroorzaken. Dit is de zogenaamde speendiarree (Nagy en
Fekete, 1999, Nagy en Fekete, 2005; Zimmerman et al., 2012b).
2.2.3. Pathogenese
Opname van de kiem gebeurt peroraal. Wanneer de big de uterus verlaat komt het al meteen terecht
in een gecontamineerde omgeving en wordt E. coli al opgenomen nog voor ze beginnen zuigen. Met
behulp van hun fimbriae hechten de kiemen zich vast aan de enterocyten (zie Figuur 6). Deze
interactie vormt dan ook de eerste stap in de pathogenese. Daarna vermeerderen ze en vormen ze
enterotoxines die de oorzaak zijn van de diarree. De structuur van de mucosa blijft echter wel intact
(i.t.t. virale infecties). ETEC stammen bezitten twee belangrijke virulentiefactoren: adhesiefactoren en
enterotoxines.
Indien de gastheer over bepaalde specifieke bindingsplaatsen bezit kan er een specifieke adhesie
plaatsvinden van de kiem aan deze mucosale epitheelcellen met behulp van fimbriae. De
bindingsplaatsen zijn glycanen (suikers) op eiwitten (glycoproteïnen) of sphingolipiden (glycolipiden)
Fig 6. Aanhechtingsfactoren van ETEC (uit
https://www.pig333.com/e-coli/escherichia-coli-
infections-in-pigs-1-of-2_9414/).
Fig 7. Infectie met E. coli. Waterige inhoud in de dunne darm en
maag gevuld met melk (uit Riising et al., 2005).
17
(Coddens et al., 2009; Melkebeek et al., 2012; Johansson et al.,2014). De meest voorkomende zijn F4
(K88), F5 (K99), F6 (987P) en F41. Het meest komt F4 voor en deze wordt onderverdeeld in F4ab
(K88ab), F4ac (K88ac) en F4ad (K88ad) (Van den Broeck et al., 2000). Sommige stammen
produceren meer dan één van deze adhesines. Het al dan niet voorkomen van receptoren is voor
enkele fimbriae afhankelijk van de leeftijd. Receptoren voor vb. F5 fimbriae komen enkel voor bij zeer
jonge dieren, waardoor F5+ ETEC enkel neonatale diarree veroorzaakt, terwijl receptoren voor F18
nog niet volledig aanwezig zijn voor dag 20 zodat E. coli met F18 fimbriae vaak pas diarree
veroorzaakt na spenen (Coddens et al., 2007). Het is ook voor twee fimbriae genetisch gerelateerd, nl
de F4 en F18 fimbriae: men moet opletten voor heterozygote biggen afkomstig van een gevoelige
beer en een ongevoelige zeug die niet in staat is biest te produceren met specifieke antistoffen voor
de biggen (Sellwood et al., 1975; Bertschinger et al., 1993; Nagy en Fekete, 1999; Nagy en Fekete,
2005; Zimmerman et al., 2012b).
Enterotoxines zijn extracellulaire proteïnes of peptides (exotoxines) aangemaakt door de ETEC
stammen. De mechanismes bestaan niet uit het veroorzaken van pathologische letsels aan de darm,
ze zorgen wel voor functionele veranderingen aan de darm. Men kent twee groepen enterotoxines:
thermolabiele (LT) en thermostabiele (STa, STb en EAST1). LT is een eiwit met hoog moleculair
gewicht dat sterk antigenisch is (mogelijkheid tot vaccin zie verder). Dit exotoxine activeert het
andenylaat cyclase complex t.h.v. de enterocyten waardoor er meer secretie van Cl- en HCO3- en
minder absorptie is van Na+ ionen. Als resultaat verkrijgt men verlies van water. Het STa toxine
activeert het guanylaatcyclase complex waardoor de productie van cyclisch guanosine monofosfaat
gestimuleerd wordt. Dit zorgt voor gelijkaardige effecten als LT (Nagy en Fekete, 1999; Nagy en
Fekete, 2005). STa is minder actief in darmen van oudere biggen (verschil in concentratie van
receptoren), daarenboven moet dit toxine continu aanwezig zijn om een effect uit te oefenen terwijl het
LT toxine, eens het adenylaat cyclase geactiveerd is, er blijvende activatie is totdat de cel sterft (Loos
et al., 2012; Loos et al., 2013). STb binding aan de cel zorgt voor activatie van een pertussis toxin-
gevoelig GTP-binding regulatorisch protein, Gαi3 protein, waardoor er een intracellulaire toename van
calcium optreedt die aanleiding geeft tot secretie van Cl- ionen in het darmlumen. De toename van de
intracellulaire Ca2+-concentratie leidt ook tot productie van serotonine en van prostaglandine E2
(PGE2) met water en electrolieten verlies tot gevolg (Rousset et al., 1998, Nagy en Fekete, 2005). De
thermostabiele enterotoxines kunnen moeilijk in vaccins gebruikt worden aangezien ze een laag
moleculair gewicht hebben en daardoor weinig immunogeen zijn (i.t.t. andere exotoxines
geproduceerd in het bacteriële plasma) (Haesebrouck et al., 2004).
Stammen die enkel neonatale diarree veroorzaken bezitten F5 (K99), F6 (978P) en/of F41 fimbriae.
Ze vormen vooral Sta en koloniseren het ileum en het achterste deel van het jejunum. Ze zijn niet
hemolytisch. Stammen die diarree veroorzaken van geboorte tot spenen bezitten F4 en/of F18 en
produceren LT, Sta, STb, en/of EAST1. Ze koloniseren het jejunum en ileum en kunnen hemolytisch
zijn. Biggen zijn meer gevoelig aan F5 en F6 positieve ETEC tijdens de eerste levensdagen, maar
worden dan geleidelijk resistent (Haesebrouck et al., 2004; Kim et al., 2010).
18
2.2.4. Symptomen en letsels
Al enkele uren na de partus kunnen de symptomen zichtbaar zijn. Morbiditeit (30-80%) en mortaliteit
(tot meer dan 70%) zijn sterk variabel. Sterfte kan waargenomen worden nog voor er sprake is van
diarree. Erge secretie leidt ook tot metabole acidose. Men ziet een waterige, wit-gele diarree en
volgend daarop een dehydratatie van de biggen (zie Figuur 7). Men ziet ook een sterk gewichtsverlies,
verzonken ogen en een blauwe, grijsachtige huid. Anus, vulva en staartpunt kunnen er rood en
ontstoken uitzien door het contact met de faeces. Microscopisch kan men de adhesie van E. coli aan
de epitheliale cellen zien. Bij autopsie ziet men een dilatatie van de dunne darm met waterige inhoud,
gedilateerde maag met onverteerde melk en letsels ten gevolge van de dehydratatie (Nagy en Fekete,
1999; Zimmerman et al., 2012b). Men kan vaak meteen aan ETEC denken enkel op basis van
klinische symptomen en anamnese, met name wanneer de diarree voorkomt vlak na de partus. Na
isolatie van ETEC uit de dunne darm van gestorven biggen of via rectale swab uit levende biggen kan
men tot een diagnose komen. Verdere diagnose kan ook gebeuren via het aantonen van kolonisatie
met histopathologie, via immunohistochemie of indirecte immunofluorescentie. Op autopsie kunnen de
weefsels er gedehydrateerd uitzien, de maag kan opgezet zijn (met onverteerde melk), de dunne darm
is gedilateerd en bevat waterige inhoud. Bij microscopie ziet men adhesies aan het epitheel van
jejunum en ileum (indien het met F4 of F18 fimbriae te maken heeft). Er zijn ook verhoogde aantallen
neutrofielen en macrofagen aanwezig in de lamina propria. Als men de differentiaal diagnose opstelt
kan men denken aan andere bacteriële infecties: Clostridium perfringens type A en C, Clostridium
difficile. Enkele virussen kunnen ook diarree geven: rotavirus en porcine epidemische diarree (PED).
Bij oudere biggen in de kraamstal kan Isospora suis ook vetdiarree veroorzaken. Bacteriële oorzaak
zal eerder resulteren in een basale pH van de faeces i.t.t. een virale oorzaak door verlies van
bicarbonaat. Indien men de kiem kan isoleren dienen ook de adhesiefactoren en enterotoxines
aangetoond te worden. Heden ten dage wordt meer gebruikgemaakt van genotype analyse via DNA
hybridisatie en PCR. Hiermee kunnen ook de virulentiefactoren bepaald worden (Nagy en Fekete,
1999; Nagy en Fekete, 2005; Zimmerman et al., 2012b).
2.2.5. Behandeling en preventie
Belangrijk bij de behandeling is om de dehydratatie tegen te gaan. Men kan overgaan tot parenterale
vochttherapie door een isotonische fysiologische zout- of glucoseoplossing (op lichaamstemperatuur)
subcutaan of intraperitoneaal in te spuiten. Perorale vochttherapie kan via electrolytenoplossing (met
glucose en aminozuren). Er wordt vaak ook gestart met een antimicrobiële behandeling (best na
aanleggen van een antibiogram). Volgens AMCRA worden volgende antimicrobiële middelen
aangeraden:
19
Eerste
keuze
Het is niet aangeraden om de biggen standaard te behandelen op een probleembedrijf
wegens de stijgende resistentie gedurende de laatste jaren. Voorkomen van de ziekte is
de boodschap.
Tweede
keuze colistine, gentamicine, lincomycine + spectinomycine, procaïne benzylpenicilline +
neomycine.
Derde
keuze trimethoprim + sulfonamiden, oxytetracycline, danofloxacine, enrofloxacine,
marbofloxacine.
Men moet de verspreiding tussen verschillende nesten zoveel mogelijk proberen tegen te gaan. Dit
lukt best in een gecompartimenteerde kraamstal. Ook kan men best afzonderlijk werkmateriaal en
kledij voorzien. Goede reiniging en desinfectie van het kraamhok en werken volgens het all-in-all-out
(AIAO) principe. Er moet ook aandacht geschonken worden aan de temperatuur. Lage
omgevingstemperatuur (<25°C) in het kraamhok kan een grote impact hebben. De peristaltiek is
verminderd en passage van bacteriën en beschermende antistoffen is verminderd. Hierdoor stijgt de
concentratie van E. coli in de darm. Verder kan men in theorie ook immunotherapie toepassen. Men
kan monoclonale antistoffen, dierlijk plasma of eierdooier met antistoffen geven ter preventie van de
adhesie (Nagy en Fekete, 2005; Virdi et al., 2013).
Wanneer het evenwicht verstoord wordt tussen infectiedruk en bescherming via passieve immuniteit
verkrijgt men problemen met neonatale diarree. Het is geweten dat zeugen bescherming kunnen
doorgeven aan hun biggen indien ze voldoende antistoffen tegen E. coli aanmaken. De ernst van de
infectie is afhankelijk van de antistoftiter die de zeug kan doorgeven aan haar biggen. Het colostrum
bevat niet-specifieke (bactericide) en specifieke factoren (IgG, IgA). Wanneer de zeugen niet in
contact komen met de kiem worden geen specifieke antistoffen geproduceerd. Antistoffen kunnen
gericht zijn tegen oppervlakteantigenen zoals F4, F5, F6, F18 en F41. Tijdens de eerste levensdagen
is vooral een goede colostrumopname van belang, die de big voorziet van IgG. Er moet een
voldoende opname zijn gedurende de eerste 12-24 uur na de geboorte, voor het sluiten van de
darmbarrièrre. Na deze colostrale immuniteit krijgt de lactogene, lokale immuniteit de bovenhand met
IgA (Nagy en Fekete, 2005; Zimmerman et al., 2012b).
Verder kan het ook helpen om oudere zeugen samen met jongere zeugen te huisvesten zodat deze
laatste in contact komen met de kiemen aanwezig op het bedrijf. In de praktijk brengt men ook vaak
drachtige zeugen in contact met (inhoud van) dunne darmen van biggen met diarree. Er kan een
cultuur bekomen worden door ze in melk te brengen. Men kan echter wel vragen stellen over de
bioveiligheid omdat ook andere kiemen meegekweekt kunnen worden. Daarenboven verhoogt dit het
risico op infectie van de biggen met E. coli met speendiarree tot gevolg. Zo kan speendiarree op een
bedrijf worden onderhouden. De efficiëntie van orale immunisatie werd in 1974 reeds bevestigd via
een proef waarbij een aantal levende E. coli kiemen aan drachtige zeugen gegeven werden. Wanneer
biggen geïnfecteerd werden met de homologe enteropathogene stammen was er een sterke reductie
20
in kliniek i.t.t. niet geïmmuniseerde zeugen (Kohler, 1974). Ook via genetische selectie van biggen die
geen receptoren bezitten voor F4 fimbriae kan men colibacillose bestrijden (Coddens et al., 2008).
2.2.6. Vaccinatie
Het doel is dat zeugen nadat ze gevaccineerd worden tijdens de dracht op het goede tijdstip
maternale immuniteit doorgeven aan hun biggen. Het gevolg van vaccineren is dat de specifieke
antistoffen in het colostrum stijgen en daardoor een bepaald niveau van passieve immuniteit voorzien
wordt ter hoogte van de dunne darm van de big om kolonisatie te voorkomen (Osek et al., 1994).
Meestal wordt met geïnactiveerde vaccins gewerkt. De nieuwere vaccins bevatten gezuiverde
adhesiefactoren en eventueel het LT enterotoxine of bevatten een aantal serotypes met
adhesiefactoren. Primo-vaccinatie bestaat uit twee injecties met drie tot zes weken tussentijd. De
laatste injectie gebeurt twee tot zes weken voor de partus. Deze vaccins hebben vooral als doel het
IgG gehalte in het colostrum te verhogen. Voorwaarde is wel dat er voldoende biest geproduceerd en
opgenomen wordt. Vaccinatie van eersteworpszeugen kan zeker een groot voordeel bieden (Nagy en
Fekete, 2005; Riising et al., 2005). Deze bescherming is minder efficiënt bij oudere biggen en helpen
niet tegen speendiarree. Een infectie met ETEC is een niet-invasieve gastrointestinale infectie
waardoor zeker na spenen de mucosale (lactogene) immuniteit belangrijker is dan systemische
(colostrale) immuniteit. De passieve immuniteit daalt wanneer de big ouder wordt en op het moment
van spenen valt de lactogene immuniteit volledig weg zodat de big gevoelig wordt aan
darmpathogenen. Er is eigenlijk nood aan een oraal vaccin dat zorgt voor een actieve mucosale
immuniteit (Melkebeek et al., 2013).
Parenterale vaccinatie van drachtige zeugen zorgt voor een hogere productie van antistoffen die
geconcentreerd worden in het colostrum. De lokale immuniteit in de darm wordt minder gestimuleerd
zodat er geen echte stijging is van IgA in de melk. Vaccins tegen neonatale diarree zijn dus beperkter
effectief tegen diarree bij oudere, nog zuigende biggen en niet tegen speendiarree. Indien men hier
ook een zekere vorm van bescherming zou willen bereiken moet gezocht worden naar vaccins die de
lokale mucosae kunnen stimuleren (Haesebrouck et al., 2004). Er zijn enkele mogelijkheden wat
betreft gebruik van parenterale vaccinatie. Één daarvan is werken via ISCOM (immune stimulating
complexes). Dit bestaat uit een matrix met enkele membraancomponenten en antigenen (subunits of
fimbriae) in, waardoor een icosahedrische structuur wordt gevormd die doorneen de celmembraan kan
gaan (Morein et al., 1987). Naast parenterale toediening kan men ook werken met zogenaamde in-
feed vaccins die levende of dode bacteriën bevatten. Deze stimuleren het GALT systeem (gut-
associated lymphoid tissue) zodat een belangrijke lokale afweer door middel van IgA voorzien wordt.
Zo kan een lactogene immuniteit bekomen worden voor de eerste 10-14 dagen. Echter het verkrijgen
van een licentie voor deze orale vaccins is vaak een probleem in vele landen en het is vaak moeilijk
om een goede stabiliteit van het antigeen te bekomen (moet passeren langs maag, darmen..). Een
alternatieve vorm is het geven van darminhoud (feedback methode), maar deze methode houdt, zoals
hoger vermeld wel risico’s in (Nagy en Fekete, 1999) en kan speendiarree onderhouden.
21
Er worden pogingen ondernomen om de IgA titer bij zeugen en hun biggen te doen stijgen. Dit kan
gerealiseerd worden na multivalente vaccinatie van drachtige zeugen met o.a. een oraal vaccin dat als
primer en/of booster gegeven wordt (naast de gewone intramusculaire vaccinatie). Men ziet een
stijging van zowel IgA en IgG in het serum van de nakomelingen, zowel de lokale als de systemische
immuniteit werden gestimuleerd. Na infectie met een virulente E. coli stam is er bij de biggen met
verhoogde immuniteit geen verhoogde sterfte of symptomen van diarree (Hur en Lee., 2013).
De werkzaamheid van geïnactiveerde vaccins t.o.v. colibacillose werd ook getest bij een proef met
2472 drachtige zeugen. Er zijn acht verschillende vaccins getest, die allemaal intramusculair gegeven
worden. Effect van vaccinatie wordt aangetoond via percentage biggen met diarree, percentage
sterfte, gemiddeld gewicht op spenen en algemene gezondheidstatus. Alle vaccins hebben een
positief effect, echter er zijn ook verschillen op te merken. De beste resultaten worden gezien bij de
nakomelingen na vaccinatie van de drachtige moederzeug met een vaccin dat gezuiverde K88, K99,
987P fimbriae en de B subeenheid van het LT enterotoxine bevat (de B subeenheid heeft echter geen
werking als adjuvant i.t.t. het volledige toxine (Norton et al., 2012)). De combinatie van een
antitoxische en antifimbriale immuniteit werken synergistisch. Bij een groep wordt er ook een verschil
waargenomen in het percentage van biggen met diarree van twee groepen biggen: de ene groep
afkomstig van zeugen gevaccineerd met een dosis van 2ml heeft veel meer diarree dan een andere
groep afkomstig van zeugen gevaccineerd met hetzelfde vaccin, echter met een dosis van 4ml (Osek
et al., 1994).
Verschillende proeven bewijzen reeds het succes van vaccinatie. Oorspronkelijk werd eerst
gebruikgemaakt van vaccins met een cultuur van ETEC stammen van een aantal o-serogroepen (bij
Gram-negatieve bacteriën bestaat de buitenste membraan vooral uit lipopolysacchariden die uit drie
bestanddelen bestaan: Lipid A, een oligosaccharide-kern en polysaccharide O-antigenen (Yanhong et
al., 2015)). Na toevoeging van fimbriae (via hitte-shock laten deze de cel los en na centrifugatie
bekomt men de fimbriae) zag men dat het vaccin nog effectiever werd. Zelfs enkel en alleen fimbriae
kunnen reeds bescherming induceren (Riising et al., 2005). In 1973 werd ook al het effect van
vaccinatie via gebruik van F4 fimbriae succesvol aangetoond. Via de biest worden antistoffen dan
doorgegeven. Ze geven echter alleen bescherming ter hoogte van de darm bij zogende biggen, deze
bescherming verdwijnt dan ook bij het spenen. De goede antigenische eigenschap van fimbriae wordt
verklaard door het feit dat ze bestaan uit goed presenteerbare proteïnes aan het bacteriële oppervlak
waar het immuunsysteem goed kan op reageren. Fimbriae zijn noodzakelijk voor de belangrijke
adhesie-stap bij kolonisatie van de darm (Woon en Bunn, 1993). Ondertussen weten we dat de
polymere natuur van de fimbriae en hun stabiele structuur belangrijk zijn voor hun immunogeniciteit.
Niet alle fimbriae zijn immers goed antigenen (Van den Broeck et al., 2000; Melkebeek et al., 2013).
In een proef wordt de werkzaamheid van het vaccin Neocolipor bekeken via opvolgen van
lichaamsgewicht (op dag 1, 7, 14, 21), mortaliteit en percentage biggen met diarree. In de
onbehandelde groep worden meer biggen met diarree op dag één gezien en een hogere mortaliteit
gedurende de eerste levensweek, vergeleken met de behandelingsgroep. Hierbij werden enkel biggen
van eersteworpszeugen opgenomen in de proef. (Michelle-Fong et al., 2013). Een vaccin gebaseerd
22
op gewijzigde ETEC virulentiefactoren F4ac, F4ab, F5, F6 en LT werd getest bij een groep van elf
jonge zeugen. Er is een controlegroep (met een lage/seronegatieve level van antistoffen) aanwezig.
Het percentage biggen van gevaccineerde zeugen die geen klinische symptomen vertonen is 66,7-
87,5% i.t.t. amper 0,0-28,0% van de biggen van niet-gevaccineerde zeugen (Riising et al., 2005).
Zoals eerder vermeld kunnen ETEC stammen meer dan één type fimbriae-antigenen uitdrukken.
Runnels et al. (1987) hebben nagekeken of een vaccin met o.a. antigeen F41 bescherming bood
tegen stammen die K99+ produceerden al dan niet samen met de productie van F41+. Dit was niet
het geval. F41+ vaccinatie bood alleen bescherming tegen stammen die enkel F41 antigeen
aanmaken.
Er zijn twee belangrijke vaccins op de markt om neonatale diarree te voorkomen: Neocolipor
(MERIALl) en Porcilis Porcoli DF® (MSD Animal Health). Het zijn geïnactiveerde vaccins die
gezuiverde adhesiefactoren of een beperkt aantal E.coli-serotypes met de adhesiefactoren bevatten
met eventueel ook het LT-enterotoxine. Na vaccinatie van drachtige zeugen met Neocolipor verkrijgen
de biggen een passieve immuniteit door opname van colostrum met adhesine specifieke antistoffen.
Via neutralisatie wordt kolonisatie van de kiem aan het ileum voorkomen, deze worden dan verder
geëlimineerd via de normale peristaltiek nog vóór er toxines gevormd worden. Neocolipor bestaat uit
het geïnactiveerde E. coli met volgende adhesiefactoren: F4ab, F4ac, F4ad, F5, F6, F41. De injectie
gebeurt IM en het adjuvans bestaat uit thiomersal en Aluminiumhydroxide. Primovaccinatie gebeurt 2x
met een dosis van 2ml, de eerste op 5-7 weken, de tweede 2 weken voor werpen. Hervaccinatie
gebeurt 2 weken voor iedere worp. Porcilis Porcoli DF bestaat uit E. coli adhesines: F4ab, F4ac, F5,
F6 en ook het LT toxine. Zeugen/gelten krijgen 2x1 dosis (2ml) zes tot acht weken voor de worp,
gevolgd door een tweede vaccinatie vier weken later. Revaccinatie bestaat uit 1 dosis twee tot vier
weken voor werpen.
Er bestaan ook twee combinatievaccins (geïnactiveerde subunit vaccins) tegen E. coli met Clostridium
perfringens en/of Clostridium novyi (PORCILIS COLICLOS en SUISENG . Een overzicht van de
verschillende vaccins wordt weergegeven in Tabel 2 (http://www.cbip-vet.be).
23
VACCINS
BESTANDDEEL
ADJUVANS
DIERSOORT
DOSIS en POSOLOGIE
NEOCOLIPOR®
Geïnactiveerd E.
coli
(adhesiefactoren
F4, F5, F6, F41
Thiomersal
Al(OH)3
Zeugen 2 x 2 ml, 1ste vac 5-7
w, 2de vac 2 w voor
werpen.
Revac: 1 x 2 ml 2 w
voor werpen
PORCILIS
PORCOLI DF®
E. coli adhesine
(F4ab, F4ac, F5,
F6, LT toxoid
dl-alfa-tocopherol
acetaat
Zeugen 2 x 2 ml, 1ste vac 6 tot
8 w voor werpen, 2de
vac 4 w later.
Revac:1 x 2 ml, 2-4 w
voor werpen.
PORCILIS
COLICLOS®
E. coli (F4ab,
F4ac, F5, F6, LT
toxoïd),
Clostridium
Perfringens C
beta toxoïd
dl-alfa-tocopherol
acetaat
Zeugen Primair: 1 dosis 6-8 w
voor het werpen, 2de
dosis na 4 weken.
Revaccinatie: 1 dosis 2-
4 w voor het werpen
SUISENG®
E. coli fimbriaal
adhesine (F4ab,
F4ac, F5, F6,
LT-
enterotoxoïd),
Toxoïd van
Clostridium
perfringens C en
van Clostridium
novyi
aluminiumhydroxide,
ginseng-extract
Zeugen Primovac
Su: 2 x 1 dosis (2 ml)
op 6 w en 3 w voor de
worp
Revac:
Su: 1 dosis (2
ml)/dracht 3 w voor de
worp
2.3. Combineren van vaccins
De serologische respons na het combineren van vaccins werd tot dusver nog maar beperkt
onderzocht. Vaak gebeurt onderzoek via trial and error om tot een bepaalde conclusie te komen. Het
is dan ook moeilijk om verschillende combinaties te vergelijken met elkaar en er moet opgelet worden
bij het extrapoleren van bepaalde resultaten. Toch is het belangrijk te weten hoe veilig het is bepaalde
vaccins te combineren, temeer omdat dit in praktijk veelvuldig voorkomt. De capaciteit van het
immuunstelsel is niet oneindig en er kunnen ook nevenreacties ontstaan. Koorts kan abortus
Tabel 2: Verschillende beschikbare vaccins tegen neonatale diarree
24
induceren wat zeker niet gewenst is. Resultaten kunnen ook afhangen van het bijhorende adjuvans.
De vraag is dan ook welke rol dit adjuvans heeft in het opwekken van de immuunrespons. In de
literatuur is er hier en daar een proef te vinden die de effectiviteit van simultane vaccinaties bekijkt.
Vaak gaat het hier over bepaalde combinaties die vaak toegepast worden in de praktijk. Resultaten bij
andere diersoorten kunnen eventueel ook gebruikt worden om tot bepaalde inzichten te komen.
Kristensen et al. (2004) hebben de antistoffenrespons onderzocht na vaccinatie tegen 3
ademhalingspathogenen: Mycoplasma hyopneumoniae, Pasteurella multocida en Actinobacillus
pleuropneumoniae. In deze proef werden drachtige zeugen gevaccineerd. Er is een duidelijk verschil
bij zeugen en hun nakomelingen qua antistoffen in vergelijking met de niet gevaccineerde
controlegroep. In deze proef werd ook naar de antistoffen gekeken bij de nakomelingen die via
passieve immuniteit worden doorgegeven. Daarbij komend hebben ze gekeken naar het verschil in
antistoffenopbouw tussen enkele of simultane vaccinatie: er werd geen verschil waargenomen op het
tijdstip van werpen bij de zeugen en in het serum van de 3-weken-oude nakomelingen. Verder werd
ook gelet op andere zaken zoals daling van de eetlust, verhoogde temperatuur, abortus, urticaria,
zwelling en roodheid. Vier zeugen hadden een afwijkende voedselopname maar die kwamen niet uit
één specifieke groep, één zeug had een lokale zwelling. Twaalf uur na de eerste vaccinatie was het
aantal zeugen met koorts (cutoff 38.7°C) hoger in de simultane groep dan in de groepen die het
vaccin apart kregen. Er was geen verschil in aantal levend geboren biggen tussen de groepen.
In een andere klinische studie werd de veiligheid en efficiëntie van een simultane vaccinatie getest bij
biggen. De biggen werden verdeeld in drie groepen: een controle groep (geen vaccinatie), een groep
die enkel Porcilis M. Hyo® kreeg en een derde groep die zowel Porcilis PRRS
® als Porcilis M. Hyo
kreeg. Er werd gekeken naar de lokale reacties, temperatuur, voedselopname en algemene
gezondheid als parameters voor de veiligheid, hier was geen significant verschil waargenomen tussen
de groepen die een vaccin kregen (Pommier et al.). Drexler et al. (2010) hebben de gecombineerde
PRRSv en M. hyopneumoniae vaccinatie onderzocht bij biggen t.o.v. het toedienen van 1 van beide
vaccins (er werd gebruikgemaakt van een levend gewijzigd PRRS vaccin gebaseerd op de Europese
stam). Hiervoor werd o.a. de viremie gemeten na infectie met M. hyopneumoniae of PRRSv. Er was
geen verschil op vlak van aantal eenheden virus tussen de gevaccineerde groepen (wel meer virus bij
controle groep). Men kan dus concluderen dar er geen interferentie of nadelige effecten zijn wanneer
de twee vaccins samen gegeven worden.
Een andere studie vergeleek de gelijktijdige toediening van twee vaccins tegen M. hyopneumoniae en
PCV2 met de aparte toediening van beide producten bij zuigende biggen. 598 biggen werden in vijf
groepen verdeeld. Het vaccinatieschema is terug te vinden in Tabel 3. De M. hyopneumoniae en de
PCV2 antistoffentiter waren significant hoger in de gevaccineerde groepen. Eén big van groep A en
één van groep C vertoonden een lokale reactie. Na vaccinatie met M. hyopneumoniae en PCV2 werd
een positief effect gezien op de algemene gezondheidsstatus én simultane of gelijktijdige vaccinatie
had geen negatieve gevolgen. (Herbich et al., 2013).
25
Een andere studie over simultaan gebruik werd uitgevoerd op een groep van 1000 biggen verdeeld in
5 groepen en iedere big was, of niet gevaccineerd, of wel gevaccineerd tegen M. hyopneumoniae
en/of PRRSv. Er werd gekeken naar lokale reacties, morbiditeit, dagelijkse groei, mortalitieit.
Antistoffen werden onderzocht met ELISA. Het simultaan gebruik is hier ook even veilig en compatibel
als de enkelvoudige toediening (Stricker et al., 2013).
Zes weken oude biggen worden in een andere proef gevaccineerd tegen Mond- en klauwzeer
(geïnactiveerd, trivalent met een toegevoegd adjuvans), en/of tegen Klassieke Varkenspest (levend
vaccin). De antistoffenrespons tegen Mond- en klauwzeer werd niet beïnvloed als deze samen met
Klassieke Varkenspest werd gegeven. Men zag zelfs een hogere antistoffenrespons tegen Klassieke
Varkenspest bij de simultane vaccinatie t.o.v. de enkele toediening. Het saponine als adjuvans was
waarschijnlijk de oorzaak hiervan. Saponine (aanwezig in het Mond- en klauwzeervirus vaccin)
stimuleert de niet-specifieke immuunstimulatie en zou ook de B-cel respons versterken (De Clerck et
al., 1989). Ook bij konijnen werden simultane vaccinatieproeven uitgevoerd en daar concludeerde
men ook dat een bivalent vaccin (tegen Hemorhagische septicemie (Pasteurella multocida en Mond-
en Klauwzeer) een betere antistoffenrespons gaf en langer persisteerde dan monovalente vaccinatie.
Eiwitten van het Mond- en klauwzeervirus worden verwerkt door antigeen presenterende cellen en
stimuleren Th-cellen die dan cytokines produceren. Hoewel deze cytokines antigeen specifiek zijn is
hun werking echter niet specifiek, zodat deze cytokines ook de respons stimuleren van
Lipopolysacharide (LPS)-gestimuleerde-B-cellen (LPS afkomstig van Pasteurella multocida). Als
gevolg hiervan is er een langere en hogere antistoffenproductie. De cytokines geproduceerd na
contact met Mond- en klauwzeervirus stimuleren zowel de humorale als de cellulaire respons (Altaf et
al., 2012).
Er zijn talrijke proeven gebeurd bij andere diersoorten. Bij kalveren werd een simultane vaccinatie
uitgevoerd met een polyvalent vaccin (bevat P. multocida en Mannheimia haemolytica en heeft als
adjuvans Al(OH)3) en een bivalent Mond- en klauwzeer vaccin (met adjuvans Al(OH)3). Er werden
bloedstalen genomen om humorale immuniteit te bepalen. De initiële en maximale respons bij
enkelvoudige of simultane toediening bleef gelijk. De cellulaire immuniteit tegen Mond- en klauwzeer
werd ook bekeken en er werden opnieuw geen verschillen waargenomen (Elham et al., 2008). Een
andere proef met rundvee beschrijft een simultane vaccinatie met een vaccin tegen Mond- en
Tabel 3. Vaccinatieschema (uit Herbich et al., 2013)
26
klauwzeer en een vaccin tegen hemorragische septicemie (beide geïnactiveerde vaccins). De
serologische respons werd op 0, 21 en 35 dagen gemeten en er waren geen verschillen gezien tussen
samen of apart toedienen van vaccins. Verder werden ook geen overige neveneffecten gezien na
simultane vaccinatie (Joseph et al., 1984). Bij de mens wordt ook onderzoek gedaan naar reacties op
vaccineren. Via een studie onderzocht men het verschil van lokale en algemene lichaamsreacties op 1
of meerdere vaccins. Het percentage lokale reacties steeg van 45% naar 78% bij één respectievelijk
meerdere vaccins. Het percentage algemene reacties steeg van 25% naar 70% bij meer dan vier
vaccinaties (Falvo en Horowitz., 1994).
2.4. Werking adjuvans
2.4.1. Algemene werking
Adjuvantia zijn cruciale en onmisbare componenten in vaccins. Bij geïnactiveerde vaccins bepalen zij
vaak het verschil tussen het wel of niet opbouwen van een effectieve immuniteit. Het is dan ook geen
toeval dat het woord van het Latijnse adjuvare komt, wat helpen betekent. Ze verhogen de efficiëntie
van het vaccin en is er minder antigeen nodig waardoor het vaccin goedkoper kan geproduceerd
worden. Sommige stimuleren enkel bepaalde delen van het immuunstelsel, zodat het gebruik van
verschillende adjuvantia samen voor een bredere stimulatie zorgen. Er moet verder nog onderzoek
gebeuren om tot nieuwe inzichten te komen vb. omtrent het combineren ervan. Men kan namelijk vaak
enkel met ‘trial en error’ tot bepaalde conclusies komen (Levast et al., 2014).
Naïeve T-cellen kunnen, i.t.t. geheugen en effector-lymfocyten, moeilijk bewegen in niet-lymfoïd
weefsel. Het adjuvans kan ervoor zorgen dat het antigeen naar de drainerende lymfeknoop gebracht
wordt. Men kan de werking van een toegevoegd adjuvans eigenlijk vergelijken met dentritische cellen,
die soms als natuurlijke adjuvantia worden aangeduid. Onrijpe dendritische cellen zitten klaar in de
weefsels om antigeen op te nemen en te presenteren aan en naïeve T-cellen te activeren. Een aantal
adjuvantia veroorzaken ook necrose van spiercellen en intramusculair oedeem, geassocieerd met een
influx van neutrofielen. De immuunrespons zou gerelateerd zijn aan deze veroorzaakte
weefselschade. Dit werd o.a. gezien bij adjuvantia die aluminiumhydroxide (Al(OH)3) en minerale olie
bevatten (bespreking zie 2.4.2 en 2.4.3). De rol van de geactiveerde inerleukines wordt weergegeven
in Figuur 8. Inflammatoire cytokines afkomstig van macrofagen of andere immuuncellen t.h.v. de
injectieplaats hebben een cruciale rol in het opwekken van een primaire immuunrespons. Bij ISCOMs
ziet men dan weer geen effect van toediening van het adjuvans en kort na injectie wordt dit zelfs niet
meer teruggevonden. Als men vit D3 of tocopherol gebruikt zijn er ook geen lokale effecten waar te
nemen (Cox et al., 2006). De werking van een adjuvans moet opgesplitst worden in verschillende
eigenschappen die verder besproken worden, enkele voorbeelden zijn terug te vinden zijn in Tabel 4.
27
De werking van de verschillende adjuvantia kan men ruwweg indelen in 5 categorieën:
immunoregulatie, presentatie, targeting, depot-effect en inductie van cytotoxische T cellen. Elk
adjuvans heeft zijn eigen specifieke werking (zie Tabel 4),
Door het stimuleren van bepaalde cytokines kan men de immuunrespons gaan beïnvloeden, maar ook
via down-regulatie van bepaalde andere cytokines. Na binding van CD4+ met een antigeen-
presenterende cel (met MHCII) verkrijgt men een T-Helper-1 (Th1) cel (celgemedieerd
immuunrespons, geassocieerd met o.a. Il-2, TNFα, TNFβ en γ-IFN) of een T-Helper-2 (Th2) cel
(humorale immuunrespons, geassocieerd met Il-4,5,6,13) (Cox en Coulter, 1997). Naast Th1 en Th2
zijn er nog tal van andere T-helper cellen. Er is nog sprake van Th3 cellen die betrokken zijn bij
mucosale immuniteit (Iwasaki, 2007). Th9 cellen maken Il-9 (rol bij wormbesmetting) (Schmitt et al.,
2014). Ontstaan van Th17 na vaccinatie zorgt voor een onstekingsreactie (productie van o.a. Il-17 en
Fig 8. Invloed van interleukines na vaccinatie (uit http://www.invivogen.com/review-vaccine-adjuvants).
28
belangrijk voor mucosale immuniteit (Bielinska et al., 2010)). Een adjuvans bepaalt ook, naast het
verhogen van de immuunrespons, het isotype van IgG en de mate van de CD4+-celgemedieerde
immuunrespons. Dit is uiteraard geen zwart-wit situatie, toch zijn er adjuvantia met een sterke invloed
in één bepaalde richting. Aluminium-zouten zijn hierbij een goed voorbeeld, deze zorgen voor meer
dan 90% voor een Th2 respons. Bacteriële endotoxines en derivaten zorgen dan weer meer voor een
Th1 respons.
De antigeen-presentatie houdt in dat de volledigheid van het antigeen bewaard blijft en dat de
presentatie gebeurt aan de geschikte cellen. Bepaalde epitopen worden dus effectiever aan deze
cellen gepresenteerd. Er zijn 3 soorten interacties. De eerste is met de antigeen-presenterende cellen
(langerhans-cellen, dendritische cellen en macrofagen). Na opname van het antigeen en presentatie
via het major histocompatibility complex II (MHCII) kan er een binding ontstaan met CD4+ T cellen. De
tweede interactie bestaat uit het antigeen en de B-cel. De herkenning tussen beide gebeurt via
oppervlakte-antistoffen en het antigeen. Via endocytose wordt antigeen opgenomen, verwerkt in het
endolysosoom en de bekomen peptides worden opnieuw gepresenteerd op het oppervlakte m.b.v.
MHCII. Finaal kan een T-helper cel zo zorgen dat de B-cel een plasmacel wordt om antistoffen te
produceren. De laatste interactie verloopt via folliculaire dendritische cellen die zorgen voor een
reservoir van het antigeen. Wanneer peptides van een antigeen via MHCI worden blootgesteld aan
het oppervlakte kan een krachtige cytotoxische T-cel respons ontstaan. Het aanwezige adjuvans kan
hierbij helpen via interactie met celmembranen zodat antigeen in het cytosol opgenomen kan worden
voor verdere verwerking. De cytotoxische T-cellen (afkomstig van CD8 cellen) kunnen dan na binding
aan hun doelwitcel apoptose induceren van deze laatste (Cox en Coulter, 1997). Een overzicht van de
antigeenpresentatie en de rol van cytokines wordt weergeven in Figuur 8.
Targeting houdt in dat een adjuvans het antigeen kan leveren aan de immuun-effectorcellen, meestal
via antigeen-presenterende cellen (APC). Zonder dit mechanisme gaat veel antigeen verloren via
protease degradatie of via de lever. Dit kan vb. via vorming van aggregaten die makkelijker
opneembaar zijn of via verzadiging van Kupffercellen in de lever zodat deze het antigeen niet
verwijderen (Cox en Coulter, 1997).
Het depot-effect kan kort of lang zijn. Aluminiumzouten zorgen voor een kort depot-effect. Het
antigeen wordt gedurende kortere tijd ter plekke vast gehouden zodat er geen clearance door de lever
kan gebeuren. Een lang depot-effect wordt gezien bij synthetische polymeren zoals het absorbeerbare
polylactide coglycolide. Olie-in-water adjuvantia daarentegen hebben een minder goed depot-effect
(Cox en Coulter, 1997).
29
Adjuvans Immunomodulatie Targeting Presentatie CTL stimulatie Depot
Aluminium zouten
sterke Th2, IgE + - - + ST(a)
W/o emulsie zwakke Th1 en Th2
- - - of +++ (b) +++ ST
O/w emulsie Zwakke Th1 en Th2
+ +++ - -
Er gebeuren veel experimenten om na te gaan welk adjuvans nu bij welk vaccin past. Vaak kent men
de volledige werking van een adjuvans niet zodat dit moet uitgetest worden. De invloed op
antistofproductie en spierirritatie van drie adjuvantia (paraffine olie, Al(OH)3 en een op lecithine-
gebaseerd olie) met een bacterin voor bescherming tegen Actinobacillus pleuropneumoniae werden
met elkaar vergeleken. Met een interval van 30 dagen werden 432 biggen tweemaal gevaccineerd.
Bacterins met Al(OH)3 of met op 5% lecithine gebaseerde olie als adjuvans resulteerden in het minste
weefselirritatie. Bacterins met paraffine olie of met op meer dan 20% lecithine gebaseerde olie
veroorzaken meer weefselschade (er werd zelfs af en toe een granuloom of abces waargenomen).
Niet onbelangrijk is ook dat de biggen die een bacterin krijgen met Al(OH)3 adjuvans een lagere
antistoffen titer hebben dan de groepen biggen die een bacterin krijgen met paraffine olie of met een
op lecithine gebaseerde olie (Straw et al., 1991).
Men kreeg gelijkaardige resultaten in een andere studie met een subunit vaccin tegen Actinobacillus
pleuropneumoniae. Verschillende adjuvantia werden getest. Minerale olie (Marcol-52) zorgde voor de
opbouw van een effectieve immuniteit, maar bij bepaalde varkens traden weefselreacties op. Gebruik
van Al(OH)3 resulteert in een lagere antistoffenrespons (Willson et al., 1995). In een proef bij schapen
werd ook de werking van verschillende adjuvantia getest. Hierbij ziet men dat na het gebruik van een
Quil A formulatie er hogere concentraties van IgM, IgG1 en IgG2 worden gezien dan bij Al(OH)3
(Rothel et al., 1998). Een proef eveneens bij schapen uitgevoerd onderzocht het effect van het soort
adjuvans met een Mond- en klauwzeer vaccinatie. Men ziet dat Montanide ISA206 (olie adjuvans) een
hogere en langere immuniteit gaf dan Al(OH)3 (Selim et al., 2010).
Tabel 4 Karakteristieken van enkele adjuvantia (uit Cox and Coulter, 1997).
ST(a), korte termijn (<2 week); (b) Goede CTL respons enkel voor uitwendig toegediende eiwitten
30
2.4.2. CIRCOVAC®
Circovac bevat ondermeer thiomersal, dit is een organische mercurial stof die in vaccins gebruikt
wordt. Thiomersal valt in het lichaam uiteen in ethylkwik en natriumthiosalicylaat. Het gebruik ervan is
omstreden en reeds vaak verboden. Er kunnen na blootstelling ook overgevoeligheidsreacties
ontstaan (http://www.fda.gov). Thiomersal wordt gebruikt om contaminatie van bacteriën, en
schimmels te voorkomen.Het is algemeen bekend dat ethylkwik en methylkwik nefro- en neurotoxisch
kan zijn, weliswaar in hogere dosis dan in het vaccin. (Hessel, 2003; Weisser et al., 2004). Verder
bevat het vaccin geïnactiveerd porcine circovirus type 2 (PCV2) in een olieachtig adjuvans. TS6, het
hoofdadjuvans van Circovac is een olie in water (O/W) emulsie die lichte-minerale olie (paraffine olie)
bevat. Het is een mineraalolie die geen dierlijke vetten bevat en bestaat uit organische
koolwaterstoffen met actieve paraffine-contaminanten. Algemeen gezien zullen olie adjuvantia het
antigeen beschermen tegen neutralisatie door humorale factoren of andere cellen die lichaamsvreemd
materiaal meteen vernietigen. Een deel van de minerale emulsie blijft aanwezig op de plaats van
injectie, een deel draineert echter wel snel naar de regionale lymfeklieren. Het nodige antigeen wordt
via deze minerale olie, dat optreedt als een beschermlaag, getransporteerd in het lymfesysteem en
Fig.10. Essentiële stappen van de werking van een adjuvans na vaccinatie.
(a) Na opname en transport is er presentatie door dendritische cellen in drainerende lymfeknoop. (b) Depot-effect. (c)
Activatie Pattern Recognition Receptors, zorgen voor cytokinevrijlating door aangeboren immuuncellen. (d) “Danger
signals” van beschadigd weefsel zorgen voor upregulatie van co-stimulerende molecules van APC. (e) Binding aan
Naïve T helper cel. (a), (b), (d) wordt door Al(OH)3 geïnduceerd. Olie-emulsies zorgen vooral voor (b) en (d). (uit Schijns,
2000).
31
stimuleert de antigeenproductie. Macrofagen spelen ook een rol in dit transportproces (Bijlsuiter
EMEA; Davenport en Arbor, 1961).
Olie in water (O/W) emulsies worden goed verdragen en tonen een lage viscositeit, ze induceren
echter wel een immuunrespons van korte duur. Ze worden geformuleerd met een kleine hoeveelheid
olie verspreid in de waterige fase. O/W emulsies zijn microdruppels van olie gestabiliseerd door
surfactants in een continue waterige fase. Ze zorgen voor een uitstekende antigeenpresentatie (in
tegenstelling tot Al-zouten) en voor matige targeting. De oliedruppels van een O/W emulsie associëren
minimaal met het antigeen. Een water in olie emulsie (W/O) resulteert echter in een hogere
immuunrespons dan O/W. Een W/O emulsie zorgt voor een depot-effect terwijl een O/W emulsie
eerder resulteert in een snelle verspreiding van het antigeen naar de drainerende lymfeknopen. Er is
interactie met de antigeenpresenterende cellen op de plaats van injectie en een betere efficiënte van
de antigeenpresentatie aan de T-cellen (Harold en Stills, 2005; Jansen et al., 2006). Een ander
typisch O/W adjuvans is MF59-adjuvans (dat o.a. squaleen olie druppels bevat, squaleen is een
precursor van cholesterol en andere steroïde hormonen). Er wordt verondersteld dat MF59 werkt via
chemokine immuunstimulatie om cellen aan te trekken uit de bloedbaan naar de plaats van injectie.
Ook het aantal antigeenpresenterende cellen worden hierdoor verhoogd. Wanneer afzonderlijke
componenten van MF59 worden toegediend bekomt men niet dezelfde effecten als wanneer men
gebruikmaakt van het gehele MF59-olie in water adjuvans (Calabro et al., 2013).
2.4.3. NEOCOLIPOR®
Aluminium componenten in vaccins, o.a. in NEOCOLIPOR, kunnen de opname door
antigeenpresenterende cellen stimuleren door te zorgen dat de concentratie antigeen ter hoogte van
de injectieplaats verhoogd wordt. Door de precipitatie en via elektrostatische krachten met het
antigeen wordt de eliminatie uitgesteld waardoor men een klein depot-effect verkrijgt. Het depot-effect
wordt in sommige studies echter in twijfel getrokken, sommige vermelden dat er een relatief snelle
opklaring gebeurt (Hogenesch, 2002). Na de eventuele depot-vorming en vorming van een
ontstekingsreactie t.h.v. de plaats van injectie is er een opname van het antigeen door
antigeenpresenterende cellen zoals macrofagen, dendritische cellen en B-cellen (Lambrecht et al.,
2009). Verder beïnvloeden ze de immuunrespons door directe en indirecte stimulatie van dendritische
cellen, chemokines en complementactivatie. Ze zijn echter niet in staat de belangrijke celgemedieerde
en cytotoxische T-cel respons te activeren. Effectieve bescherming tegen een brede waaier van
pathogenen vereist een Th1 en/of Th2 (humorale) immuunrespons. Het feit dat aluminiumhydroxide
amper het Th1 (celgemedieerd) type activeert heeft als gevolg dat men extra substanties kan
toevoegen voor een nog betere immuunstimulatie. Aluminiumbevattende vaccins kunnen dan ook
sterker gemaakt worden na toevoeging van co-adjuvantia. Aluminium bevattende adjuvantia
verdwijnen relatief snel, met een piekstijging in antistoffen drie weken na injectie (Harold en Stills,
2005).
32
Het begin van de immuunrespons gebeurt in de lymfeknopen die de plaats van vaccinatie draineren.
De dendritische cellen zorgen ervoor (via endocytose, pinocytose en fagocytose) dat antigeen de
lymfeknoop kan bereiken. Ze zorgen ook voor presentatie en activatie van naïeve antigeen-specifieke
T cellen. De activatie van deze cellen gebeurt niet op de plaats van injectie, wel in de drainerende
lymfeknopen. Al(OH)3 zou ook de expressie van MHII en andere verschillende co-stimulatoire
moleculen stimuleren op monocyten. Vele monocyten differentiëren dan ook in dendritische cellen.
Verder zorgt de injectie ook direct voor necrose, wat de dendritische cellen activeert. Dendritische
cellen helpen de CD4+ cellen om zich te vormen tot Th1 of Th2 cellen (Hogenesch, 2002).
De T-helper 2 immuunstimulatie waar Al(OH)3 voor zorgt is een antistof-gemedieerde respons met de
typische expressie van IL-4, IL-5 en IL-13 door de T-helper 2 cellen. (Hogenesch, 2002). Stimulatie
van de complementcascade door Al-adjuvantia is belangrijk voor o.a. de vorming van B-cellen. Verder
vond men dat co-administratie van IL-12 mét Al(OH)3 en antigeen bij muizen resulteerde in een
hogere antigeen-specifieke antistoffenrespons in vergelijking met alleen Al(OH)3 en het antigeen (Cox
en Coulter, 1997; Hogenesch, 2002). Al(OH)3 zorgt ook voor het opwekken van IL-1 (Schijns, 2000).
IL-1 is vaak een onmisbare factor voor de immuunrespons, afhankelijk van het species, met
bijhorende ontstekingsreactie. Het activeert de T-cellen, stimuleert verdere productie van cytokines en
in samenwerking met andere interleukines is er B-cel proliferatie. IL-1 heeft een belangrijke rol in de
niet-specifieke immuunrespons op weefselbeschadiging (er is effect op hepatocyten, endotheliale
cellen, fibroblasten enz.), IL-1β kan verder ook synthese induceren van cyclooxygenase-2 (COX-2),
type 2 fosfolipase A, Prastaglandine-E2, trombocyten-activerende factor en stikstofoxide. Hieruit kan
koort, hypotensie en vasodilatatie ontstaan. (Dinarello, 2009).
Aluminium heeft ook enkele nadelen: naast het feit dat er geen celgemedieerde of cytotoxische T-
celrespons is, is er bij bepaalde soorten antigeen een onvoldoende werking en is er soms een
tendens om IgE te produceren (deze laatste is soms de oorzaak van allergie). Door de afwezigheid
van de T-helper type 1 immuunrespons is het adjuvans minder goed bij gebruik in vaccins tegen tal
van virussen, intracellulaire bacteriën en enkele parasieten. Aluminium-adjuvantia worden reeds lang
gebruikt, echter het volledige mechanisme is lang niet gekend geweest en nog steeds niet alles is
geweten (Hogenesch, 2002). Wanneer een antigen met aluminium ingespoten wordt, worden cellen
van het aangeboren immuunsysteem aangetrokken na vrijlating van chemokines en cytokines door de
spiercellen. Bij weefselbeschadiging zou er ook een lokale vrijzetting zijn van urinezuur uit necrotische
cellen. Urinezuurkristallen zouden op hun beurt dan NALP3 inflammasoom (nucleotide-binding
oligomerization domain receptor, NOD-like receptor) activeren, dat een rol speelt in inflammatoire
proccessen. Na aankomst van de monocyten nemen deze het antigeen op en presenteren dit via
MHCI en MHCII op weg weg naar de drainerende lymfeknoop. Eenmaal in de lymfeknoop gaan de
rijpe dentritische cellen reageren met antigeen-specifieke T cellen die dan differentiëren in Th effector
cellen (Lambrecht et al., 2009).
33
3. MATERIAAL EN METHODES
3.1. Doel van de studie
Het doel van de studie is om te weten of het al dan niet gelijktijdig toedienen van vaccins invloed heeft
op de veiligheid en de opbouw van antistoffen. De studie werd goedgekeurd door de ethische
commissie van de faculteiten Diergeneeskunde en Bio-ingenieurswetenschappen, nummer 2014/117.
3.2. Bedrijf
Een varkensbedrijf werd uitgekozen waar 70 gezonde gelten geselecteerd werden voor de proef. Op
het bedrijf waren naast de opfokgelten nog melkkoeien aanwezig. Jonge fokgelten werden opgezet en
verkocht als fokzeug op een leeftijd van 220 dagen oud en 120-130 kg. De gelten waren afkomstig
van één ander bedrijf, gespecialiseerd in het kweken van fokzeugen, met een vier-wekensysteem. Op
het bedrijf werden strikte hygiënemaatregelen genomen. Er was eigen bedrijfskledij voorzien en
bezoekers werden gevraagd zich vooraf te douchen voor het betreden van de stal. Werkmateriaal
bleef in de stal aanwezig. Er was een speciaal krengenhuisje voorzien voor kadavers. De stal bestond
uit een tiental afdelingen met 180-200 dieren in elke afdeling. De gelten waren gehuisvest conform de
Europese richtlijnen en normen voor huisvestiging. Ze zaten per 14 in een hok waar voldoende
hokverrijking aanwezig was zoals kettingen en buizen. Er werd droogvoeder gegeven via
combibakken. Naast de voederbak was het drinkwater ter beschikking. De eerste vijf weken na opzet
kregen de gelten een commercieel biggenmeel, daarna werd overgeschakeld naar een specifiek
opfokmeel. Er was water ad libitum beschikbaar, het werd gezuiverd via lavastenen en bestond uit
regenwater dat gecombineerd werd met boorputwater. De dieren werden gehouden op een volrooster
en er werd gewerkt met kanaalventilatie, het bedrijf werkte ook met een luchtwasser. De gelten
hadden naast een Sanitel-nummer een tweede, goed leesbaar bedrijfsnummer.
3.3. Proefopzet
De gelten kregen geen vaccinaties als big en tijdens de proef werden geen andere vaccins
toegediend. Na spenen kregen de biggen ZnO in het speenvoeder en amoxicilline gedurende 2-3
weken. Na opzet in de varkensstal kregen de gelten levamisole toegediend via het drinkwater om de
vier-vijf weken. Voor de proef waren de gelten in dezelfde afdeling gehuisvest en opgesplitst in hokken
van 14 gelten. Hieruit volgde dat de gelten hetzelfde voeder en drinkwater krijgen. Ook zaken zoals
ventilatie, onderstaande mestkelder, lichtintensiteit, temperatuur, betreden van de afdeling door de
verzorger, waren hetzelfde voor de geselecteerde gelten. In één afdeling werden vijf hokken gekozen,
deze hokken waren in het midden van de afdeling zodat interferentie van binnenkomend zonlicht of
tocht via de deur werd voorkomen.
34
Voor de start van de proef werden binnen één hok telkens 14 gelten van 17 weken oud ad random
verdeeld in vier groepen via markering. Een overzicht van de vaccinatiegroepen is te zien in Tabel 5.
De gelten kregen volgende vaccinaties, telkens intramusculair (IM) in de nek (behalve de negatieve
controle groep):
- Groep 1, V1: kreeg een vaccinatie IM links tegen E. coli (Neocolipor). Gelten werden
gemarkeerd met blauw.
- Groep 2, V1+V2: Kreeg zowel een vaccinatie IM links tegen E. coli (Neocolipor) als een
vaccinatie IM rechts tegen PCV2 (Circovac). Gelten werden gemarkeerd met groen.
- Groep 3, V2: kregen een vaccinatie IM rechts tegen PCV2 (Circovac). Gelten werden
gemarkeerd met rood.
- Groep 4, C: kreeg geen vaccinatie en dient als controlegroep. Gelten werden gemarkeerd met
zwart.
Groep Vaccinatie Bloedname
Leeftijd 17w 20w 17w 20w 23w
1) V1 (n=20)
V1
V1
X
X
X
2) V1+V2 (n=20)
V1+V2
V1+V2
X
X
X
3) V2 (n=20)
V2
V2
X
X
X
4) Controle (n=10)
-
-
X
X
X
De gelten werden volgens dit protocol tweemaal gevaccineerd met drie weken tussentijd. De groepen
werden uiteraard behouden. Van de 70 gelten werd in totaal drie maal bloed genomen (210
bloedstalen in totaal) om de titer antistoffen tegen F4 en PCV2 te bepalen (Tabel 4). De bloedafname
gebeurde telkens net voor de geplande vaccinatie, met telkens drie weken tussentijd. De laatste
bloedafname was drie weken na de tweede vaccinatie. Voor het fixeren van de gelten werd een strop
van het eigen bedrijf gebruikt. Er werd gewerkt met 10 ml spuitjes (Terumo, 10 ml, Leuven, België)
met roze naald (Terumo, 18G, 50 mm, Leuven, België). Voor iedere gelt werd een nieuw spuitje met
nieuwe naald genomen. Het bloed werd opgevangen in serumbuizen (Vacutest serum, 9 ml, Kima,
Azergrande, Italië). De bloedstalen werden gecentrifugeerd bij 2000 rpm, gedurende een half uur. Het
serum werd bewaard in steriele eppendorfs (Safe-Lock Tubes 1.5 ml, Eppendorf®, Hamburg,
Duitsland) bij -20°C tot alle bloedstalen genomen waren. Stollingstijd van het bloed was ongeveer acht
uur.
Tabel (5): Overzicht van de verschillende vaccinatiegroepen tijdens de studie.
V1: Neocolipor®. V2: Circovac®. n= aantal dieren. X: bloedname.
35
3.4. De aangewende vaccins
3.4.1. NEOCOLIPOR®
Het vaccin Neocolipor bevat geïnactiveerde stammen van E. coli met bepaalde aanhechtingsfactoren.
Vaccinatie met Neocolipor kan een lichte verhoging van de lichaamstemperatuur van het dier
veroorzaken (minder dan 1,5°C gedurende een maximumduur van 24 uur). Wachttijd is nul dagen. Het
vaccin moet bewaard en getransporteerd worden aan een temperatuur tussen 2ºC en 8ºC. Het vaccin
mag niet in de diepvriezer bewaard worden en het moet beschermd worden tegen licht. Houdbaarheid
na het aanbreken van de injectieflacon is drie uur. Per dosis van 2 ml zijn volgende bestanddelen
aanwezig (1 SA.U: Hoeveelheid, voldoende om in cavia’s een agglutinatie-antilichaamtiter van 1 log
10 te verkrijgen) (http://bijsluiters.fagg-afmps.be/DownloadLeafletServlet?id=124861).
- E. coli aanhechtingsfactor F4 (F4ab, F4ac, F4ad), tenminste 2,1 SA.U
- E. coli aanhechtingsfactor F5, tenminste 1,7 SA.U
- E. coli aanhechtingsfactor F6, tenminste 1,4 SA.U
- E. coli aanhechtingsfactor F41, tenminste 1,7 SA.U
- Aluminium (als hydroxide) adjuvans: 1,4 mg.
3.4.2. CIRCOVAC®
Elke ml Circovac bevat als werkzaam bestanddeel 1,8 log10
Elisa Eenheden geïnactiveerd porcine
circovirus type 2. Als hulpstof bevat het vaccin 0,10mg thiomersal en als adjuvans 247 tot 250,5 mg
lichte paraffine olie.
Vaccinatie kan in uitzonderlijke gevallen een overgevoeligheidsreactie veroorzaken. Milde en
voorbijgaande lokale reacties kunnen optreden, deze bestaat vooral uit zwelling (tot gemiddeld 2 cm2)
en roodheid (tot gemiddeld 3 cm2), en in sommige gevallen oedeem (tot gemiddeld 17 cm
2). Deze
reacties verdwijnen spontaan na gemiddeld vier dagen. Post-mortem onderzoek van de injectieplaats
bij zeugen toont soms milde laesies, alsook necrose of fibrose. Binnen twee dagen volgend op de
injectie kan een gemiddelde verhoging van de rectale temperatuur (tot 1,4 °C) optreden. In zeldzame
gevallen is er een verhoging van de lichaamstemperatuur met meer dan 2,5 °C, die minder dan 24 uur
aanhoudt en kan een lichte apathie of een vermindering in eetlust opgemerkt worden die eveneens
verdwijnt. Zelden komt een voorbijgaande lichte apathie of een vermindering van eetlust voor.
Uitzonderlijk kan een abortus optreden na vaccinatie (www.ema.europa.eu). Het vaccin moet bewaard
en getransporteerd worden bij 2°C-8°C, tevens ook beschermen tegen licht en binnen drie uur na het
vermengen gebruiken. Wachttijd is nul dagen.
36
3.5. Onderzochte parameters
3.5.1. Anti-F4 antistoffentiterbepaling (ELISA)
De antistoffen tegen E. coli werden bepaald in het Laboratorium voor Immunologie van de faculteit
Diergeneeskunde te Merelbeke.
De serumstalen werden 1/15 verdund in het eerste cupje (kolom 1) en verder ½ uitverdund tot kolom
11, in kolom 12 werd enkel verdunningsvloeistof gedaan. De polysorp 96-well plaat werd gecoat met
α-F4 Mab (anti-F4 Monoklonaal Antibody), 1µg/ml en 100µl/cupje. De ongecoate cupjes werden
gecoat met met Bovine Serum Albumine (BSA) 1µg/ml. Na deze stap werd de plaat twee uur
geïncubeerd bij 37°C. De cupjes werden vervolgens geblokkeerd met 250 µl blokvloeistof
(Fosfaatbuffer PBS + 0,2% Tween®80 + 3% Bovine serum albumin BSA). Deze vloeistof werd aan alle
welletjes van de plaat toegevoegd. Na incubatie ‘s nachts in een koele kamer werd 3x gewassen met
wasvloeistof fosfaat gebufferde zoutoplossing + 0,2% Tween®20 (PBS + 0,2% TW20). In elk cupje
werd 100 µl toegevoegd van een F4 fimbriae oplossing (afkomstig van de F4 positieve bacterie Gis26)
aan een concentratie van 25 µg/ml. Deze fimbriae werden verdund tot deze 25 µg/ml oplossing in
verdunningsvloeistof bereikt (dit is PBS+ TW20 +3%BSA). Na 1 uur incubatie bij 37°C werd opnieuw
driemaal gewassen met wasvloeistof (PBS + 0,2% TW20). Als conjugaat werd een α-pig IgG H+L
HRP (horse radish peroxidase gelabeled secundair antibody) gebruikt aan een verdunning van 1/5000
en 100 µl per cupje. Na één uur incubatie bij 37°C werd opnieuw driemaal gewassen met wasvloeistof
(PBS + 0,2% TW20). Na toevoeging van 50µl ABTS per cupje (2,2'-Azinobis (3-ethylbenzothiazoline-
6-sulfonic acid)-diammonium salt, een wateroplosbaar peroxidase substraat dat ervoor zorgt dat
eindproduct gemeten kan worden via groene kleurreactie) werd vervolgens 30 min geïncubeerd bij
37°C. Na 15 en 30 minuten werd de absorbantie van de lichtstraal gemeten met de spectrofotometer
bij 405 nm (OD of optische densiteit).
Alle ruwe data werden vervolgens bekeken in vergelijking met een berekende cut-off waarde: de
bekomen titer is de laagste waarde van de serumstalen die nog boven deze cut-off waarde uitkomt.
De cut-off waarde werd bekomen door het gemiddelde van het negatief serum van de verschillende
platen te nemen + 3x de standaard deviatie van deze negatieve stalen. Het negatief serum was
afkomstig van een varken waarvan geweten is dat de antistoffentiter laag was. Er werd eveneens een
positieve controle gebruikt: dit is serum van een varken met gekende hoge antistoftiter in bloed.
Tevens werden ook een tweetal ongecoate cupjes meegenomen om te zien of er een niet-specifieke
binding was doorgegaan.
37
3.5.2. Titerbepaling PCV2 (IPMA)
De PCV2 antistoffen werden bepaald in het laboratorium voor virologie van de faculteit
Diergeneeskunde te Merelbeke via Indirecte immunoperoxidase monolayer assay.
Eerst werd 100 µl paraformaldehyde (4%) in de droge platen gebracht met als doel de cellen te
fixeren. Hier werd gebruikgemaakt van de PK15 niercellijn. Na tien minuten werden de platen
afgeklopt en twee keer gewassen met een fosfaatbuffer (wPBS). Daarna volgde opnieuw een
fixatiestap met 100 µl methanol en waterstofperoxide (H2O2) (per 30ml methanol voegt men 1 ml
H2O2toe). Methanol werd gebruikt om de cellen te openen om zo de antistoffen te kunnen opnemen.
Na deze stap werden de platen opnieuw afgeklopt en tweemaal gewassen met wPBS. Vooraf werden
er twaalf verdunningen gemaakt van het serum. De eerste verdunning (1/10) bestaat uit 10 µl serum
met 90µl van een verdunningsbuffer (bestaande uit 89 ml zoute PBS, tien ml negatief geitenserum en
één ml zeepoplossing Tween). De volgende verdunning bestaat uit 25µl van de 1/10 verdunning met
75 µl verdunningsbuffer. Op deze manier werd doorgegaan voor de hele verdunningsreeks.
Nu werden deze primaire antistoffen toegevoegd (telkens 50 µl) bij de eerder genoemde cellen. Men
begon eerst met het toevoegen van de hoogste verdunningen (met minst aantal antistoffen) en
eindigde bij de verdunningen met de hoogste concentratie aan antistoffen. Deze werden gedurende
één uur op 37°C bewaard. Daarna werden de platen afgeklopt en gewassen met wPBS en Tween 80.
Na vijf minuten werden de secundaire antistoffen toegevoegd. Deze antistoffen, peroxidase-
geconjugeerde geit-anti-varken IgG’s (1:500), werden gebonden op de primaire antistoffen. Eén uur
later werden de platen afgeklopt en 2x gewassen met wPBS met Tween 80 bij 37°C. Tenslotte moest
de reactie zichtbaar gemaakt worden. Dit gebeurde door toevoeging van een 50 µl substraat dat
bestaat uit Na-acetaat buffer, AEC (0,080g 3-amino-9-ethylcabazole + 20 ml dimethylformamide) en
H2O2. Tenslotte werd het substraat na 20 minuten afgeklopt en werd 100 µl acetaat buffer toegevoegd
om de reactie te stoppen. Als er een reactie was, dan was er een rode kleurreactie ontstaan. Onder
Fig.11 Overzicht cupjes anti-F4 ELISA met verschillende verdunningen , positeve controle en negatief serum
38
een microscoop werden de platen bekeken en men ging op zoek naar de verdunning die geen
kleurreactie meer gaf. De verdunning net voor deze voorgenoemde bepaalde dan de antistoffentiter
van het serum (laatste kleurreactie te zien bij de 8ste
verdunning = titer van 163840).
3.5.3. Rectale temperatuur
Op 0 uur en op 24 uur na elke vaccinatie werd de rectale temperatuur van ieder varken gemeten. De
temperatuur werd gemeten met geijkte digitale thermometers.
3.5.4. Eetlust
Om een idee te hebben over de invloed van de vaccinatie op de eetlust van de varkens werd op 0 uur
en 24 uur na elke vaccinatie de buikvulling van ieder individueel varken visueel beoordeeld. Een score
van 0 werd gegeven wanneer de buik weinig was gevuld. Een score van 1 werd toegekend wanneer
een goede buikvulling werd gezien. Een score van 2 werd gegeven wanneer een zeer goede
buikvulling werd gezien.
3.5.5. Lokale huidreacties
Deze huidreacties werden ingedeeld volgens een 4-score schaal (afwezig, mild, matig, ernstig):
telkens op 0 uur, 1 uur, 6 uur, 24 uur en 72 uur na de eerste én tweede vaccinatie. Ook vlak voor de
derde bloedafname werd de huidscore bepaald (dag 42 na eerste vaccinatie). Deze scores waren
gebaseerd op een studie van Wilson et al. (1995) en de palpatie en observatie gebeurde telkens door
dezelfde persoon. Score 0 is een indicator voor normaal weefsel, score 1 werd gegeven aan letsels
met verdikking van 1-4cm³ met al dan niet verkleuring, score 2 werd gegeven aan letsels van 5-10 cm³
met al dan niet verkleuring, score 4 betekende een abces of nodulair letsel. Deze bovengenoemde
parameters (rectale temperatuur, eetlust, lokale huidreacties) werden telkens opgevolgd door dezelfde
persoon. Deze persoon was verschillend van de persoon die de vaccins toediende. Bijgevolg verliep
de studie blind.
Fig.12 Uitslag IPMA test PCV2 met rode kleurreactie (21/10/2014)
39
3.6. Statistische analyses
De onafhankelijke variabele was de parameter ‘groep’. Als onbekende variabelen of uitkomstvariabele
werden de temperatuur en de antistoffentiter op de verschillende tijdspunten als hoofdparameters
aangeduid. Daarnaast werden ook de huidscores en eetlustscore op de verschillende tijdspunten na
vaccineren en/of bloedafname tot de uitkomstvariabelen gerekend. Allereerst werden de
beschrijvende waarden van de data bekeken (Microsoft Excel, 2010). Vervolgens werd overgegaan
naar de statistische testen. De continue data (temperatuur en antistoffen titer) werden geanalyseerd
door middel van one way ANOVA. De data van de antistoffentiters werden log-getransformeerd om
normaal verdeelde data te verkrijgen. Om een ANOVA uit te voeren moet er homogeniteit zijn van
varianties. Dit werd bekeken door “levene statistic” (>0,01). Om groepen met elkaar te kunnen
vergelijken werd een “post-hoc test” uitgevoerd. Hier werd gekozen voor Scheffé, zodat alle groepen
onderling met elkaar konden vergeleken werden. Wanneer P < 0,05 was er een significant verschil
tussen twee groepen. Voor de parameter “temperatuur 2e vaccinatie op 24h” werd gebruikgemaakt
van een non-parametrische statistiek (hier: Kruskal-Wallis) omdat de voorwaarde voor het uitvoeren
van ANOVA niet voldaan was (Levene statistic <0,01). De parameters buikvulling en huidscore
werden getransformeerd naar binaire data (0 of 1). Voor buikvulling bleef 0 de score 0 behouden en 1
of 2 kreeg de score 1. Voor de parameter huidscore bleef score 0, 0 behouden en 1, 2 of 3 kreeg
score 1. De data werd geanalyseerd met logistische regressie. De analyses van de continue data
werden uitgevoerd in SPSS 22.0 (IBM SPSS Statistics for Windows, Version 22.0. Armonk, NY: IBM
Corp). De analyses van de binaire data werden uitgevoerd met R studio versie 3.1.2 (Boston,
Massachusetts).
4. RESULTATEN
4.1. Antistoffentiter en temperatuur (continue data)
ANTISTOFFENTITER TEGEN F4
Tijdens de eerste bloedafname op 17 weken werden geen significante verschillen in antistoffentiter
tussen de groepen waargenomen. Bij alle groepen kon men hierna een stijging waarnemen van de
antistoffentiter tegen F4 uitgezonderd bij de controlegroep die niet gevaccineerd werd. Groep 2
(combinatie van Neocolipor en Circovac) vertoonde een significant hogere titer in vergelijking met
groep 1 (enkel Neocolipor) en de overige groepen op 20 en op 23 weken leeftijd. Een vreemde
vaststelling was de antistoffentiter in groep 3 op 20 en op 23 weken. Deze groep kreeg enkel
Circovac, echter er werden toch antistoffen tegen F4 waargenomen. De antistoffentiter van groep 1
(Neocolipor) was enkel numeriek hoger in vergelijking met groep 3 (Circovac) op 20 weken en was
zelfs numeriek lager in vergelijking met groep 3 op 23 weken. Deze bovenstaande gegevens worden
40
geïllustreerd in Figuur 13 en weergegeven in Tabel 6.1. De non-log getransformeerde data kunnen
geraadpleegd worden in Tabel 7.
ANTISTOFFENTITER TEGEN PCV2
Tijdens de eerste bloedafname vertoonden de groepen geen significante verschillen in de
antistoffentiter tegen PCV2. Wanneer er gekeken werd naar de antistoffentiter gericht tegen PCV2
was er een stijging waar te nemen bij alle groepen, echter eveneens bij de negatieve controlegroep,
alhoewel de titer steeds significant het laagst bleef in de controlegroep op 20 weken. Op 23 weken
vond men de laagste antistoffentiter tegen PCV2 in de controlegroep, echter enkel met groep 3
(Circovac) was er een significant verschil. De antistoffentiter van groep 3 (Circovac) was telkens hoger
dan deze van groep 2 (Neocolipor+Circovac) op 20 en 23 weken, echter dit verschil was niet
statistisch significant op 20 en 23 weken. De log waarden van de antistoffentiter tegen PCV2 worden
geïllustreerd in Figuur 14 en weergegeven in Tabel 6.1. De non-log getransformeerde data kunnen
geraadpleegd worden in Tabel 7.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4 lo
g-w
aard
e a
nti
-F4
an
tist
off
en
tite
r
Leeftijd (weken)
Groep 1
Groep 2
Groep 3
Groep 4
17 20 23
Fig.13 Log-waarde antistoffentiter tegen de F4 fimbriae van E.coli
Eerste vaccinatie (bloedafname) op de leeftijd van 17 weken. Tweede vaccinatie (bloedafname) op de leeftijd van 20 weken.
Derde bloedafname vond plaats op de leeftijd van 23 weken.
Groep 1: vaccinatie met Neocolipor, groep 2: vaccinatie met Neocolipor en Circovac, groep 3: vaccinatie met Circovac en
groep 4: controle groep, geen vaccinatie
Verschillende letters wijzen op een statistisch verschil (P<0.05) tussen de groepen
41
Groep Log F4
17 w
Log F4
20 w
Log F4
23 w
Log PCV2
17 w
Log PCV2
20 w
Log PCV2
23 w
1 1,59±0,38a
2,24±0,64a 2,89±0,31a 2,05±0,51a 4,01±1,05a 5,00±0,53ab
2 1,71±0,42a
2,79±0,57b 3,45±0,28b 2,41±0,90a 4,52±0,79ab 5,36±0,33ab
3 1,77±0,33a
2,10±0,53ac 2,95±0,39a 2,44±0,79a 4,83±0,61b 5,40±0,57a
4 1,93±0,30a
1,51±0,44c 1,.57±0,29c 2,38±0,64a 3,05±0,71c 4,85±0,42b
Wanneer de data van de temperaturen op 0 uur na de eerste vaccinatie werden bekeken (17 weken
leeftijd), zag men enkele significante verschillen tussen de groepen. Vervolgens zag men 24 uur na de
eerste vaccinatie en 0 uur na de tweede vaccinatie geen significante verschillen optreden tussen de
verschillende groepen. Op 24 uur na de tweede vaccinatie (20 weken) ziet men dat in de groepen die
Circovac kregen (groep 2: Circovac + Neocolipor en groep 3: Circovac) de temperatuur significant
hoger was in vergelijking met de andere twee groepen. Tussen groep 2 en groep 3 was er echter
geen significant verschil zichtbaar. Deze bovenstaande gegevens worden geïllustreerd in Figuur 15 en
weergegeven in Tabel 6.
0
1
2
3
4
5
6
loga
ritm
e v
an a
nti
sto
ffe
nti
ter
te
gen
PC
V2
Leeftijd (weken)
Groep 1
Groep 2
Groep 3
Groep 4
17 20 23
Fig.14 Logaritmische waarden van de antistoffentiter tegen PCV2 bij 70 gelten (4 groepen):
Eerste vaccinatie (bloedafname) op de leeftijd van 17 weken. Tweede vaccinatie (bloedafname) op de leeftijd van 20
weken. Derde bloedafname vond plaats op de leeftijd van 23 weken.
Groep 1: vaccinatie met Neocolipor, groep 2: vaccinatie met Neocolipor en circovac, groep 3: vaccinatie met Circovac en
groep 4: controle groep, geen vaccinatie
Verschillende letters wijzen op een statistisch verschil (P<0.05) tussen de groepen
Tabel (6.1): Overzichtstabel serum titers tegen F4 van E. coli en PCV2 van de vier groepen op
verschillende leeftijd
Verschillende superscripts in een kolom wijzen op een statistisch verschil (P<0.05) tussen de groepen Log F4: logaritme van de antistoffentiter gemeten tegen de F4 fimbriae van E. coli ± de standaard deviatie Log PCV2: logaritme van de antistoffentiter gemeten tegen PCV2 W: weken,T°: temperatuur, H: uur Groep: de verschillende groepen die deelnamen aan de studie. Groep 1: vaccinatie met Neocolipor, groep 2: vaccinatie met Neocolipor en Circovac, groep 3: vaccinatie met Circovac, groep 4: controlegroep, geen vaccinatie.
42
Groep T (°C)
17 w
0h
T (°C)
17 w
24h
T (°C)
20 w
0h
T (°C)
20 w
24h
1 40,0 ±0,25ab 39,5± 0,24a 39,3± 0,20a 39,3± 0,22a
2 40,2± 0,22a 39,6± 0,24a 39,3± 0,22a 40,2± 0,83b
3 39,8± 0,29b 39,5± 0,25a 39,4± 0,24a 40,0± 0,68b
4 39,6± 0,22c 39,4± 0,21a 39,3± 0,31a 39,2± 0,25a
38,6
38,8
39,0
39,2
39,4
39,6
39,8
40,0
40,2
40,4
0 24 0 24
Tem
pe
ratu
ur
(°C
)
Uur na vaccinatie
Groep 1
Groep 2
Groep 3
Groep 4
Fig.15 De lichaamstemperaturen op 0 en 24 uur na beide vaccinatiedagen
Groep 1: vaccinatie tegen Neocolipor, groep 2: vaccinatie tegen Neocolipor en circovac, groep 3: vaccinatie
tegen Circovac en groep 4: controle groep, geen vaccinatie
Verschillende letters wijzen op een statistisch verschil (P<0.05) tussen de groepen
Tabel (6.2): Overzichtstabel temperatuur in °C 0h en 24h na vaccinatie
Verschillende superscripts in een kolom wijzen op een statistisch verschil (P<0.05) tussen de groepen
T: temperatuur, h: uur, W: weken leeftijd
Groep: de verschillende groepen die deelnamen aan de studie. Groep 1: vaccinatie met Neocolipor, groep 2: vaccinatie met
Neocolipor en Circovac, groep 3: vaccinatie met Circovac, groep 4: controlegroep, geen vaccinatie.
43
Groep Titer F4
17 w Titer F4
20 w Titer F4
23 w Titer PCV2
17 w
Titer PCV2
20 w
Titer PCV2
23 w
1 59 ± 68 422 ± 581 972 ± 620 220 ± 254 68650 ±
149214 171520 ±
177420 2 81 ± 102 1181 ± 1289 3456 ± 2360 3262 ± 9393 92296 ±
146394 305152 ±
236784 3 76 ± 55 272 ± 456 1314 ± 1245 2818 ± 9252 145651 ±
190874 901120 ±
2392218 4 99 ± 39 51 ± 50 44 ± 22 1204 ± 3179 2992 ± 3955 99328 ±
68616
4.2. Buikvulling en huidscore (binaire data)
Er werden geen significante verschillen aangetroffen tussen de verschillende groepen op 0 en 24 uur
na beide vaccinatiedagen op respectievelijk 17 en 20 weken. Dus alle groepen vertoonden een goede
buikvulling na vaccinatie. De beschrijvende waarden kunnen teruggevonden worden in Tabel 8. Voor
de β0, β1 en odds ratio’s wordt verwezen naar bijlage 2 aangezien geen significante verschillen terug
te vinden waren.
Groep 17 w
0 h
17 w
24 h
20 w
0 h
20 w
24 h
1 90 100 100 100
2 100 95 100 90
3 90 95 100 90
4 90 100 100 100
Tabel (7): Overzichtstabel non-logaritmisch getransformeerde titer tegen F4 van E. coli en PCV2 van de vier groepen op verschillende leeftijd
F4: antistoffentiter gemeten tegen de F4 fimbriae van E. coli ± de standaard deviatie van de log titer
PCV2: antistoffentiter gemeten tegen PCV2
W: weken leeftijd
Groep: de verschillende groepen die deelnamen aan de studie. Groep 1: vaccinatie met Neocolipor, groep 2: vaccinatie met
Neocolipor en Circovac, groep 3: vaccinatie met Circovac, groep 4: controlegroep, geen vaccinatie.
W: weken leeftijd
H: uur na vaccinatie
Een buikvulling score werd gegeven als volgt: 0 voor varkens met ongevulde buik, 1 voor varkens met goedgevulde buik op 0
h en 24 h na de eerste vaccinatie en de tweede vaccinatie. Groep: de verschillende groepen die deelnamen aan de studie.
Groep 1: vaccinatie met Neocolipor, groep 2: vaccinatie met Neocolipor en Circovac, groep 3: vaccinatie met Circovac, groep
4: controlegroep, geen vaccinatie.
Tabel (8): Overzichtstabel beschrijvende waarden voor buikvulling (%)
44
Bij de controlegroep werden geen reacties links waargenomen. Bij groep 3 (die enkel rechts Circovac
kreeg) werd 1 uur na eerste vaccinatie en vlak voor tweede vaccinatie bij 5% van de gelten een
huidreactie waargenomen. Na vaccinatie links met Neocolipor werd 1h, 6h na eerste vaccinatie en 6h,
24h na tweede vaccinatie een huidreactie waargenomen bij 35-50% van de gelten. Wanneer de gelten
een simultane vaccinatie kregen zowel links als rechts werd 1h, 6h, 24h, 72h na eerste vaccinatie en
1h, 24h na tweede vaccinatie een huidreactie waargenomen bij 10-25% van de gelten. Bij dezelfde
groep hadden 60% van de gelten een huidreactie 6h na tweede vaccinatie. De huidscores rechts
werden ook bekeken. Bij de controlegroep werd enkel 1h na vaccinatie een huidreactie waargenomen
bij 10% van de gelten, de overige tijdstippen was dit steeds 0. Bij de groep die links de vaccinatie
kreeg werden geen huidreacties gezien. Verder werd bij de groep die langs beide kanten een
vaccinatie kreeg 1h, 72h na eerste vaccinatie en 1h na tweede vaccinatie bij 15-20% van de gelten
een reactie waargenomen. Op 6h, 24h na eerste vaccinatie en 72h na tweede vaccinatie werden
huidreacties gezien bij 50-60% van de gelten. Het hoogste percentage huidreacties zag men 6h en
24h na de tweede vaccinatie (85-90%). Tenslotte was er bij groep 3 1h, 72h na eerste vaccinatie en
1h na tweede vaccinatie een reactie te zien bij 5-20% van de dieren. 6h, 24h na eerste vaccinatie en
6h, 24h en 72h na tweede vaccinatie was er bij 40-70% van de gelten eveneens een reactie waar te
nemen. Resultaten van de huidscores zijn terug te vinden in Tabel 9 (links) en Tabel 10 (rechts).
Eerste vaccinatie
Tweede vaccinatie
Groep 17 w 0h
17 w 1h
17 w 6h
17 w 24h
17 w 72h
20 w 0h
20 w 1h
20 w 6h
20 w 24h
20 w 72h
23 w 0h
1 0 40 50 5 5 0 5 45 35 10 0
2 0 20 20 15 10 0 15 60 25 5 0
3 0 5 0 0 0 5 0 0 0 0 0
4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Tabel 9: Huidscore (%) links in de vier groepen op verschillende tijdstippen na vaccinatie
Een huidscore werd gegeven als volgt: 0 voor geen huidletsel, 1 voor de aanwezigheid van een huidletsel (roodheid,
verhevenheid, papel,..). Deze score werd uitgevoerd op de dag van de eerste vaccinatie en tweede vaccinatie op
respectievelijk16 weken (w) en telkens op 19 w op 0, 1, 6, 24 en 72 h na vaccinatie.
Groep: de verschillende groepen die deelnamen aan de studie. Groep 1: vaccinatie met Neocolipor, groep 2: vaccinatie met
Neocolipor en Circovac, groep 3: vaccinatie met Circovac, groep 4: controlegroep, geen vaccinatie.
W: weken leeftijd
H: uur na vaccinatie
45
Eerste vaccinatie
Tweede vaccinatie
Groep 17 w 0h
17 w 1h
17 w 6h
17 w 24h
17 w 72h
20 w 0h
20 w 1h
20 w 6h
20 w 24h
20 w 72h
23 w 0h
1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
2 0 20 50 50 15 0 20 85 90 60 5
3 0 20 40 50 15 0 10 65 70 55 5
4 0 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Wat betreft de resultaten van de statistische analyse van de huidscores werden ook hier geen
significante verschillen gezien. De reden voor de discrepantie tussen de beschrijvende waarden en
het niet optreden van significante verschillen tussen de groepen is de zeer hoge standaarddeviatie die
voor veel parameters bekomen wordt. In Bijlage 1 kan de tabel met de uitkomsten van de logistische
regressie geraadpleegd worden.
Tabel 10: Huidscore (%) rechts in de vier groepen op verschillende tijdstippen na vaccinatie
Een huidscore werd gegeven als volgt: 0 voor geen huidletsel, 1 voor de aanwezigheid van een huidletsel (roodheid,
verhevenheid, papel,..). Deze score werd uitgevoerd op de dag van de eerste vaccinatie en tweede vaccinatie op
respectievelijk16 weken (w) en telkens op 19 w op 0, 1, 6, 24 en 72 h na vaccinatie.
Groep: de verschillende groepen die deelnamen aan de studie. Groep 1: vaccinatie met Neocolipor, groep 2: vaccinatie
met Neocolipor en Circovac, groep 3: vaccinatie met Circovac, groep 4: controlegroep, geen vaccinatie.
W: weken leeftijd
H: uur na vaccinatie
46
5. BESPREKING
In de praktijk komt het courant voor dat verschillende vaccins samen gegeven worden omwille van
verschillende redenen. Het doel van deze studie was om na te gaan of hieraan nadelen verbonden
waren op vlak van veiligheid en meer specifiek of er interferentie was op vlak van de
antistoffenopbouw van twee bepaalde vaccins (met verschillend adjuvans) die simultaan gegeven
werden links en recht. Er werd ook rekening gehouden met eventuele neveneffecten. Hiervoor werd
onderzocht of de rectale temperatuur al dan niet stijgt na gelijktijdige toediening. In deze proef werden
verder ook buikvulling (parameter voor eetlust) en huidreactie geregistreerd. Alle parameters werden
blind bepaald. Er werd gebruikgemaakt van twee vaccins die vaak voorkomen in de praktijk:
Neocolipor (ter preventie van neonatale diarree) en Circovac (bescherming tegen infecties met PCV2).
De werkzaamheid van beide vaccins werd reeds voldoende bewezen.
Een proefopzet met de combinatie Circovac en Neocolipor werd bij ons weten nog niet eerder
uitgevoerd. Om te weten of er interferentie kan zijn is het belangrijk om de serologische respons op te
volgen aangezien dit ons een idee heeft over de mate van bescherming. Vele studies bewezen reeds
dat er geen nadeel was in antistoffenrespons wanneer meerdere vaccins samen gegeven werden. Het
is belangrijk te kijken hoe de vaccins gegeven worden, er kan een verschil zijn als deze op
verschillende plaatsen of samen op dezelfde plaats gegeven worden. Bij de meeste onderzochte
studies werden deze op verschillende plaatsen gegeven. Bij de proef van Kristensen et al. (2004) was
er geen nadeel in serologische respons wanneer drie vaccins samen gegeven werden. Er waren ook
geen nadelige effecten vastgesteld bij tal van andere studies (Herbich et al., 2013; Stricker et al.,
2013; De Clerck et al., 1989). Bij andere diersoorten werden ook gelijkaardige studies uitgevoerd met
opnieuw het resultaat dat er geen nadeel was in opbouw van antistoffen (Joseph et al., 1984; Elham
et al., 2008; Altaf et al., 2012). Natuurlijk moet men kritisch blijven en zijn niet alle resultaten zomaar
extrapoleerbaar naar andere situaties. Sommige combinaties kunnen niet vergeleken worden met
andere omwille van vb. verschillende adjuvantia aanwezig in het vaccin, een andere
gezondheidsstatus op het bedrijf enz. In deze proef werd de tweede vaccinatie (booster) aan dezelfde
zijde gegeven, echter in de praktijk zal dit vaak niet het geval zijn.
In deze studie werden de antistoffen opgevolgd tegen zowel E. coli als PCV2. Er werd geen nadeel
vastgesteld voor het opbouwen van antistoffen na de simultane vaccinatie t.o.v. enkelvoudige
toediening. Hoogstwaarschijnlijk was er dus geen interferentie in de opbouw van antistoffen tussen
beide vaccins. Het was zelfs zo dat er na simultane vaccinatie een significant hogere titer waar te
nemen was tegen E. coli drie weken na de eerste én na tweede vaccinatie in vergelijking met
enkelvoudige toediening van het vaccin. Bij vaccinatie met Circovac was de gemiddelde titer tegen
PCV2 na simultane vaccinatie lager dan na enkelvoudige toediening maar dit verschil was niet
significant. Dit komt waarschijnlijk door een tweetal varkens uit groep drie (enkelvoudige vaccinatie
tegen PCV2) die een extreem hoge titer hadden ontwikkeld tegen PCV2 en die het gemiddelde naar
boven trokken. Tijdens de proef is er hoogstwaarschijnlijk een veldinfectie geweest met PCV2. Uit de
resultaten bleek namelijk dat er een stijging was van antistoffen tegen PCV2 drie weken na de tweede
47
vaccinatie bij zowel de controlegroep als de groep die enkel een vaccin tegen E. coli kregen.
Nochtans werden de hygiënische voorschriften in acht genomen, maar dat neemt niet weg dat PCV2
vaak circuleert op de bedrijven. Op veel bedrijven kunnen antistoffen tegen PCV2 waargenomen
worden (Grau-Roma et al. 2011). Een gelijkaardig fenomeen werd vastgesteld bij de titer tegen E. coli.
Drie weken na de tweede vaccinatie was er een stijging van anti-F4 te zien bij de groep 3 die enkel
een vaccin tegen Circovac had gekregen, het verschil in titer was significant t.o.v. de controlegroep.
Door het vele contact tussen de onderzoekers en de varkens kan het zijn dat E. coli via mest meer
verspreid werd tijdens de proef. Immers voor het bepalen voor de huidreacties was er veel contact met
de varkens.
De groep die de combinatie van beide vaccinaties kreeg in deze proef had een significant hogere titer
tegen E. coli drie weken na eerste en na tweede vaccinatie dan de groep die een enkelvoudige
vaccinatie had gekregen. Dit resultaat werd ook vastgesteld in een gelijkaardige proefopzet waar
gevaccineerd werd tegen Mond- en klauwzeer en tegen Klassieke varkenspest. In deze laatste studie
werd gesuggereerd dat het adjuvans saponine, aanwezig in het Mond- en klauwzeervirus vaccin, de
oorzaak zou zijn van een hogere antistoffentiter tegen Klassieke Varkenspest (De Clerck et al., 1989).
Saponine kan zowel de celgemedieerde als humorale immuunrespons stimuleren zodat er een
bredere respons ontstaat, ook tegen Klassieke Varkenspest. Bij andere diersoorten werd ook soms
een hogere antistoffentiter gezien na simultane vaccinatie. Bij konijnen zag men dat eiwitten uit het
vaccin tegen Mond- en klauwzeer virus ervoor zorgden dat Th-cellen cytokines produceerden waarvan
hun werking niet specifiek was. Daardoor werden de door LPS (aanwezig in het andere vaccin)
geactiveerde B-cellen extra gestimuleerd waardoor hogere antistoffen opgebouwd werden die langer
aanwezig bleven (zie eerder) (Altaf et al., 2012).
Het vaccin Neocolipor bevat als adjuvans Al(OH)3. Dit adjuvans is weinig in staat de belangrijke
celgemedieerde (Th1) of cytotoxische T-cel respons te activeren. Effectieve bescherming tegen een
brede waaier van kiemen vereist een Th1 (T-Helper-1) en/of Th2 (humorale) immuunrespons (Harold
en Stills, 2005). In de literatuur zijn verschillende proeven te vinden bij varkens waar de werkzaamheid
van het adjuvans Al(OH)3 getest werd, over het algemeen werd een minder goede werking gezien in
vergelijking met andere adjuvantia (paraffine olie, minerale olie) gebruikt in de desbetreffende studies
(Straw et al., 1991; Willson et al., 1995). Gelijkaardige resultaten werden gezien bij andere diersoorten
(Rothel et al., 1998; Selim et al., 2010). Het vaccin Circovac bevat als adjuvans paraffine olie, het is
een olie-in-water emulsie (o/w). Bij enkele studies werd dit adjuvans vergeleken met Al(OH)3. Hier
kwam men vaak tot de vaststelling dat paraffine olie een relatief betere adjuvans-werking had (o.a.
een betere antigeenpresentatie). Een nadeel was dat er soms meer weefselreactie was. Dit weet men
aan de olie (Straw et al., 1991; Spickler en Roth, 2003; Calabro et al., 2013). Olie-in-water emulsies
worden over het algemeen goed verdragen en induceren een relatief kortere immuunrespons. Bij het
gebruik van o/w emulsie ziet men dat er een aantrekking en interactie is met antigeenpresenterende
cellen ter hoogte van de injectieplaats. Wanneer er drainage gebeurt naar de bijhorende lymfeknoop
verhoogt de efficiëntie van de antigeenpresentatie aan de aanwezige T-cellen. De o/w emulsie zou
ook type I interferon kunnen opwekken, een belangrijk cytokine in het immuunsysteem (Jansen et al.,
48
2006). Hoewel de nadruk bij o/w emulsie meer ligt op stimulatie van de Th2 cellen, kon men bij
Circovac ook opbouw van een celgemedieerde immuniteit aantonen. Hierdoor kan ook een bredere
immuunrespons ontstaan. (Charreyre et al., 2011). Het is bewezen dat Circovac resulteert in stimulatie
van neutraliserende antistoffen en interferon-γ-secreterende cellen. Deze laatste cellen spelen ook
een belangrijke rol in de celgemedieerde immuunrespons (Won Seo et al., 2014).
Al deze voorgaande gegevens zouden kunnen verklaren waarom er na simultane vaccinatie een
sterkere opbouw is van antistoffen tegen E. coli en dat er een bredere stimulatie is van het
immuunstelsel na simultane vaccinatie. Men kan zeggen dat de werking van Neocolipor mogelijk
versterkt wordt door (het aanwezig adjuvans in) Circovac. Het is mogelijk dat dit olie-adjuvans een
sterker stimulans is voor o.a. antigeen presenterende cellen dan het adjuvans Al(OH)3, met als gevolg
dat het vaccin Neocolipor hiervan ‘profiteert’. Daarbij komt dat Circovac ook de belangrijke
celgemedieerde immuniteit meer kan stimuleren i.t.t. Neocolipor.
Het is ook belangrijk om eventuele nevenwerkingen te onderzoeken. In een studie bij de mens met
toediening van verschillende vaccins werden meer neveneffecten en algemene klachten
waargenomen. Bij de proef van Kristensen et al. (2004) werd twaalf uur na eerste vaccinatie een
significant hogere temperatuur waargenomen in de groep die drie vaccins simultaan kreeg t.o.v. de
groepen die maar 1 vaccin kreeg. Het belang van lichaamstemperatuur als reactie op het vaccin mag
niet onderschat worden. Hoge temperaturen kunnen bij drachtige zeugen zorgen voor abortus, maar
kunnen algemeen ook zorgen voor lagere voederopname en mindere prestaties. Er zijn enkele
significante verschillen in temperatuur waargenomen in de meting vlak voor eerste vaccinatie. Dit kan
veroorzaakt worden door een stressreactie als gevolg van het eerste contact tussen de onderzoekers
en de varkens. De dag na eerste vaccinatie (24h) en vlak voor de tweede vaccinatie (0h) werden geen
significante temperatuurverschillen meer waargenomen tussen de verschillende groepen, dit kan te
wijten zijn aan het optreden van gewenning bij de gelten t.o.v. de onderzoekers zodat minder stress
ontstaat. Na de tweede vaccinatie (24h) hadden groep twee en drie (die beide Circovac kregen) een
hogere temperatuur dan groep één (die enkel Neocolipor kreeg) en de controlegroep vier. De bijsluiter
van Circovac vermeldt inderdaad dat er een tijdelijke verhoging kan optreden na vaccinatie. Dat er een
significant verhoogde temperatuur was na simultane vaccinatie met Circovac en Neocolipor in
vergelijking met enkelvoudige toediening van Neocolipor 24 uur na tweede vaccinatie (40,2 ± 0.83°C
versus 39,3 ± 0.22°C) mag dus ook niet uit het oog verloren worden. Als parameter voor
nevenreacties werd ook de buikvulling opgevolgd, hier werden geen significante verschillen
waargenomen. Op vlak van huidreacties werden ook geen significante verschillen gezien.
Oorspronkelijk werd een score gegeven van nul tot en met drie naar gelang de ernst van de letsels,
echter de scores twee en drie kwamen zelden voor. Voor de statistische verwerking van de gegevens
werden de niet binomiale data omgevormd naar binomiale data zodat hier gewerkt werd met score nul
en één.
Naast de eventuele verworven neveneffecten kunnen er andere nadelen gezien worden na simultane
toediening. Teveel vaccins op korte tijd zou het immuunsysteem misschien kunnen “overbelasten”.
Echter bij kinderen zag men dat het immuunsysteem een enorme capaciteit heeft om te reageren op
49
verschillende vaccins. Het zou zelfs zo zijn dat via verschillende vaccinaties er net een bescherming
optreedt om verzwakking van het immuunsysteem tegen te gaan (Offit et al., 2002). Andere grote
voordelen van simultane vaccinatie is dat de arbeidstijd van vaccineren, eventuele pijn en stress bij de
dieren gereduceerd worden. Tegenwoordig bestaat er ook een systeem om via één toediening twee
verschillende vaccins te geven via twee naalden op 1 spuit (Serena®, La Veterinaria Strumenti,
VIGODARZERE, Italië). Na inspuiting bereiken de antigenen echter dezelfde drainerende lymfeknoop
zodat de respons anders kan zijn in vergelijking met enkelvoudige toediening. Een studie die het effect
van het simultaan toedienen van meer dan twee vaccins nagaat zou eveneens interessant zijn. Het
kan ook interessant zijn om te onderzoeken of de duur van de serologische respons beïnvloed wordt
na simultane vaccinatie. Het is belangrijk voor de sector dat er verder onderzoek gebeurt naar
veiligheid en werkzaamheid bij het gelijktijdig toedienen van verschillende vaccins.
In dit onderzoek werd geen nadeel vastgesteld in de opbouw van antistoffen bij gelijktijdige toediening
van twee vaccins in vergelijking met enkelvoudige toediening. Na simultane vaccinatie was er zelfs
een significant hogere antistoffentiter (P<0.05) waar te nemen tegen F4 van E. coli drie weken na
eerste én na de tweede vaccinatie in vergelijking met enkelvoudige toediening. Er werd geen
significant verschil in eetlust en huidreactie waargenomen. Er was enkel een significant verhoogde
rectale temperatuur 24uur na tweede vaccinatie bij gelijktijdige toediening van Circovac en Neocolipor
in vergelijking met enkelvoudige toediening van Neocolipor.
50
6. REFERENTIES
Allan G.M., Ellis, J.A. (2000). Porcine circoviruses: a review. Journal of Veterinary Diagnostic
Investigation 12, 3–14.
Allan G. M., McNeilly F., Ellis J., Krakowka S., Bøtner A., McCullough K., Nauwynck H., Kennedy S.,
Meehan B., Charreyre C. (2004).PMWS: Experimental model and co-infections. Veterinary
Microbiology, 98, 165-168.
Altaf I., Siddique M., Muhammad K., Irshad M., Khan M. Z., Anjum A. A., Kamran M. (2012). Antibody
response of rabbits to combined hemorrhagic septicemia and foot & mouth disease virus vaccine. The
Journal of Animal & Plant Sciences, 22, 501-504.
Bertschinger H.U, Stamm M, Voegeli P. (1993). Inheritance of resistance to oedema disease in pigs:
Experiments with Escherichia coli strain expressing fimbriae F107. Veterinary Microbiology 35, 79-89.
Bielinska A.U., Gerber M., Blanco L.P., Makidon P.E., Janczak K.W., Beer M., Swanson B., Baker J.R.
(2010). Induction of Th17 cellular immunity with a novel nanoemulsion adjuvant. Critical Reviews in
Immunology 30, 189–199.
Calabro S., Tritto E., Pezzotti A., Taccone M., Muzzi A., Bertholet S., De Gregorio E., O’Hagan D.T.,
Baudner B., Seubert A. (2013). The adjuvant effect of MF59 is due to the oil-in-water emulsion
formulation, none of the individual components induce a comparable adjuvant effect. Vaccine 31,
3363-3369.
Chae, C. (2005). A review of porcine circovirus 2-associated syndromes and diseases. The Veterinary
Journal 169, 326–336.
Chae C. (2012). Commercial porcine circovirus type 2 vaccines: Efficacy and clinical application. The
Veterinary Journal 194,151–7.
Chang H.W., Jeng C.R., Lin T.L., Liu J.J., Chiou M.T., Tsai Y.C., Chia M.Y., Jan T.R., Pang
V.F.(2006). Immunopathological effects of porcine circovirus type 2 (PCV2) on swine alveolar
macrophages by in vitro inoculation. Veterinary Immunology and Immunopathology 110, 207–219.
Charreyre C., Joisel F., Chapat L., El Garch H., Juillard V., Andreoni C., Maurin-Bernaud L., Chevalier
M., Goutebroze S., Too H. (2011). Some updates on pig immunology and immune responses to
CIRCOVAC®, an inactivated vaccine against Porcine Circovirus Type 2 (PCV2). 5th Asian Pig
Veterinary Society congress, Pattaya, Thailand, 2011.
Coddens A., Diswell M., Angstrom J., Breimer M.E., Goddeeris B.M., Cox E., Teneberg S. (2009).
Recognition of blood group ABH type 1 determinants by the FedF adhesin of F18- fimbriated
Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry 284 (15), 9714-9726.
Coddens A., Verdonck F., Mulinge M., Goyvaerts E., Miry C., Goddeeris B., Duchateau L., Cox E.
(2008). The possibility of positive selection for both F18+ Escherichia coli and stress resistant pigs
opens new perspectives for pig breeding. Veterinary Microbiology 126, 210-215.
Coddens A., Verdonck F., Tiels P., Rasschaert K., Goddeeris B.M., Cox E. (2007). The age-
dependent expression of the F18+ E. coli receptor on porcine gut epithelial cells is positively
correlated with the presence of histo-blood group antigens. Veterinary Microbiology 122, 332–341.
51
Cox E., Verdonck F., Vanrompay D., Goddeeris B. (2006). Adjuvants modulating mucosal immune
responses or directing systemic responses towards the mucosa. Veterinary research 37, 511-539.
Cox J.C., Coulter A.R. (1997). Adjuvants: a classification and review of their modes of action. Vaccine
15, 248-56.
Darwich L., Segales J., Mateu E. (2004). Pathogenesis of postweaning multisystemic wasting
syndrome caused by porcine circovirus 2: an immune riddle. Archives of Virology 149, 857– 874.
Darwich L., Mateu E. (2012). Immunology of porcine circovirus type 2 (PCV2). Virus Research 164,
61-67.
Davenport F.M., Arbor A. (1961). Applied immunology of mineral oil adjuvants. The Journal of Allergy
32, 177-189.
De Clercq K., Koenen F., Strobbe R., Debecq J. (1989). Simultaneous vaccination of piglets against
foot-and-mouth disease and classical swine fever. Veterinary Microbiology 20, 215-221.
Dinarello C.A. (2009). Immunological and Inflammatory Functions of the Interleukin-1 Family. Annual
Review of Immunology 27, 519-550.
Drexler C.S., Witvliet M.H., Raes M., van de Laar M., Eggen A.A., Thacker E.L. (2010). Efficacy of
combined porcine reproductive and respiratory syndrome virus and Mycoplasma hyopneumoniae
vaccination in piglets. The Veterinary Record. 166, 70–74.
Elham, Youssef A., Abeer, Mansour E. (2008). Simultaneous vaccination of cattle with polyvalent
pneumonic pasteurollosis vaccine and bivalent FMD vaccine (O & A). SCVMJ, XIII (2), 543-553.
Falvo C., Horowitz H. (1994). Adverse reactions associated with simultaneous administration of
multiple vaccines to travelers. Journal of General Internal Medicine 9, 255-260.
Feng H., Blanco G., Segalés J., Sibila M. (2014). Can Porcine circovirus type 2 (PCV2) infection be
eradicated by mass vaccination? Veterinary Microbiology 172, 92-99.
Finsterbusch T., Mankertz A. (2009). Porcine circoviruses-small but powerful. Virus Research. 143,
177–183.
Fort M., Olvera A., Sibila M., Segalés J., Mateu E. (2007). Detection of neutralizing antibodies in
postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS)-affected and non-PMWS-affected pigs.
Veterinary Microbiology 125, 244–255.
Fort M., Sibila M., Allepuz A., Mateu E., Roerink F., Segalés J. (2008) Porcine circovirus type 2
(PCV2) vaccination of conventional pigs prevents viremia against PCV2 isolates of different genotypes
and geographic origins. Vaccine 26, 1063–1071.
Fort M., Sibila M., Perez-Martin E., Nofrarias M., Mateu E., Segalés J. (2009b). One dose of a porcine
circovirus 2 (PCV2) sub-unit vaccine administered to 3-week-old conventional piglets elicits cell-
mediated immunity and significantly reduces PCV2 viremia in an experimental model. Vaccine 27,
4031–4037.
Fraile L., Grau-Roma L., Sarasola P., Sinovas N., Nofrarias M., Lopez-Jimenez R., Lopez-Soria S.,
Silbila M., Segalés J. (2012a). Inactivated PCV2 one shot vaccine applied in 3-week-old piglets:
52
Improvement of production parameters and interaction with maternally derived immunity. Vaccine 30,
1986-1992.
Garcia A., De Sanctis J.B. (2013). An overview of adjuvant formulations and delivery systems. Acta
Pathologica, Microbiologica et Immunologica Scandinavica 1-11.
Grau-Roma L., Hjulsager C.K., Sibila M., Kristensen C.S., Lopez-Soria S., Enøe C., Casal J., Botner
A., Nofrarías M., Bille-Hansen V., Fraile L., Bækbo P., Segalés J., Larsen L.E. (2009). Infection,
excretion and seroconversion dynamics of porcine circovirus type 2 (PCV2) in pigs from post-weaning
multisystemic wasting syndrome (PMWS) affected farms in Spain and Denmark. Veterinary
Microbiology. 135, 272-282.
Grau-Roma L., Fraile L., Segalés J. (2011). Recent advances in the epidemiology, diagnosis and
control of diseases caused by porcine circovirus type 2. The Veterinary Journal 187, 23–32.
Haesebrouck F., Pasmans F., ChiersK. , Maes D., Ducatelle R., Decostere A. (2004). Efficacy of
vaccines against bacterial diseases in swine: what can we expect. Veterinary Microbiology, 100, 255–
268.
Halsey N.A. (2001) Combination Vaccines: Defining and Addressing Current Safety Concerns Clinical
Infectious Diseases 33(Suppl 4), S312–8.
Harold F., Stills Jr. (2005). Adjuvants and Antibody Production: Dispelling the myths associated with
Freund’s complete and other adjuvants. ILAR Journal 46, 280-293.
Heißenberger B., Weissenbacher-Lang C., Hennig-Pauka I., Ritzmann M., Ladinig A. (2013). Efficacy
of vaccination of 3-week-old piglets with Circovac® against porcine circovirus diseases (PCVD). Trials
in Vaccinology 2,1–9.
Herbich E., Heissenberger B., Ladinig A., Griessler A., Ritzmann M., Weissenbacher-Lang C., Hennig-
Pauka I. (2013). Field trial on the simultaneous vaccination against porcine circovirus type 2 (PCV2)
and Mycoplasma hyopneumoniae. Tierärztliche Praxis Großtiere 5, 279-288.
Hogenesch H. (2002). Mechanisms of stimulation of the immune response by aluminum adjuvants.
Vaccine 20, S34–S39.
Hur J., Lee J.H. (2013). Protection against neonatal Escherichia coli diarrhea by vaccination of sows
with a novel multivalent vaccine candidate expressing E. coli adhesins associated with neonatal pig
colibacillosis. Research in Veterinary Science 94, 198-204.
Iwasaki A. (2007). Mucosal Dendritic Cells. Annual Review of Immunology 25, 381-418.
Janeway C.A., Travers P., Walport M., Shlomchik M.J. (2001).The complement system and innate
immunity. Immunobiology 5th edition, chapter 2.
Jansen T., Hofmans M.P.M., Theelen M.J.G., Manders F., Schijns V.E.J.C. (2006). Structure- and oil
type-based efficacy of emulsion adjuvants. Vaccine 24, 5400–5405.
Johansson M.M., Coddens A., Benktander J., Cox E., Teneberg S. (2014). Porcine intestinal
glycosphingolipids recognized by F6-fimbriated enterotoxigenic Escherichia coli. Microbial
Pathogenesis 76, 51-60.
53
Johnson C.S., Joo H.S., Direksin C., Yoon K.J., Choi Y.K. (2002). Experimental in utero inoculation of
late-term swine foetuses with porcine circovirus type 2. Journal of veterinary diagnostic investigation
14, 507–512.
Joseph P.G., Hedger R.S. (1984). Serological response of cattle to simultaneous vaccinations against
foot-and-mouth disease and haemorrhagic septicaemia. The veterinary record 114, 494-496.
Karuppannan K. A., Jong M. H., Lee S., Zhu Y., Selvaraj M., Lau J., Jia Q., Kwang J. (2009).
Attenuation of porcine circovirus 2 in SPF piglets by abrogation of ORF3 function. Virology 383, 338–
347.
Kekarainen T., Montoya M., Dominguez J., Mateu E., Segalés J. (2008) Porcine circovirus type 2
(PCV2) viral components immunomodulate recall antigen responses. Veterinary Immunology and
Immunopathology 124, 41-49.
Kim J.Y., Kim J.H., Hur J., Lee J.H. (2010). Isolation of Escherichia coli from piglets in South Korea
with diarrhea and characteristics of the virulence genes. The Canadian Journal of Veterinary Research
71, 59-64.
Kixmöller M., Ritzmann M., Eddicks M., Saalmuller A., Elbers K., Fachinger V. (2008). Reduction of
PMWS-associated clinical signs and co-infections by vaccination against PCV2. Vaccine 26, 3443–
3451.
Kohler E. M. (1974) Protection of pigs against neonatal enteric colibacillosis with colostrum and milk
from orally infected sows. American Journal of Veterinary Research 35, 331–338.
Kristensen C. S., Andreasen M., Ersbøll A. K., Nielsen J. P. (2004). Antibody response in sows and
piglets following vaccination against Mycoplasma hyoopneumoniae, toxigenic Pasteurella multocida,
and Actinobacillus pleuropneumoniae. Canadian Journal of Veterinary Research 68, 66-70.
Lambrecht B.N., Kool M., Willart M. AM., Hammad H. (2009). Mechanism of action of clinically
approved adjuvants. Current opinion in immunology 21, 23–29.
Larochelle R., Bielanski A., Muller P., Magar R. (2000). PCR detection and evidence of shedding of
porcine circovirus type 2 in boar semen. Journal of Clinical Microbiology 38, 4629–4632.
Levast B., Awate S., Babiuk L., Mutwiri G., Gerdts V. , Sylvia V. D., Littel H. (2014). Vaccine
Potentiation by Combination Adjuvants. Vaccines 2, 297-322.
Loos M., Geens M., Schauvliege S., Gasthuys F., van der Meulen J., Dubreuil J.D., Goddeeris B.M.,
Niewold T., Cox E. (2012). Role of heat-stable enterotoxins in the induction of early immune
responses in piglets after infection with enterotoxigenic Escherichia coli. Plos One 7, e 41041.
Loos M., Hellemans A., Cox E. (2013). Optimization of a small intestinal segment perfusion model for
heat-stable enterotoxin A induced secretion in pigs. Veterinary immunology and immunopathology
152, 82-86.
Maes D. (2012). Subclinical porcine circovirus infection: What lies beneath. The Veterinary Journal
194, 9-9.
McKeown N.E., Opriessnig T., Thomas P., Guenette D.K., Elvinger F., Fenaux M., Halbur P.G., Meng
X.J. (2005). Effects of porcine circovirus type 2 (PCV2) maternal antibodies on experimental infection
of piglets with PCV2. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 12, 1347–1351.
54
Meerts P., Van Gucht S., Cox E., Vandebosch A., Nauwynck H.J. (2005). Correlation between type of
adaptive immune response against porcine circovirus type 2 and level of virus replication. Viral
Immunology 18, 333-341.
Melkebeek V., Goddeeris B.M., Cox E. (2013). ETEC vaccination in pigs. Veterinary Immunology and
Immunopathology 152, 37–42.
Melkebeek V., Rasschaert K., Bellot P., Tilleman K., Favoreel H., Deforce D., De Geest B.G.,
Goddeeris B.M., Cox E. (2012). Targeting aminopeptidase N, a new identified receptor for F4ac
fimbriae, enhances the intestinal mucosal immune response. Mucosal Immunolgy 5, 635-645.
Michelle-Fong W.C., Choo P.Y., Ong B.L., Tee C.Y., Lee J.W., Ooi P.T. (2013). Effects of Escherichia
Coli vaccination in gilts on piglet performance in a farm in Perak. Jurnal Veterinar Malaysia 25, 7-10.
Moon H.W., Bunn T.O. (1993). Vaccines for preventing enterotoxigenic Escherichia coli infections in
farm animals. Vaccine 11, 213-220.
Morein B., Löugren K., Höglund S., Sundquist B. (1987). The ISCOM: An immunopotentiating
complex. Immunology Today 8, 333-338.
Nagy B., Fekete P.Zs. (1999). Enterotoxigenic Escherichia coli in farm animals. Veterinary Research
30, 259-284.
Nagy B., Fekete P.Zs. (2005). Enterotoxigenic Escherichia coli in veterinary medicine. International
Journal of Medical Microbiology 295, 443-454.
Norton E. B., Lawson L. B., Mahdi Z., Freytag L. C., Clements J. D. (2012). The A Subunit of
Escherichia coli Heat-Labile Enterotoxin Functions as a Mucosal Adjuvant and Promotes IgG2a, IgA,
and Th17 Responses to Vaccine Antigens. Infection and Immunity 80, 2426-2435.
Offit P.A., Quarles J., Gerber M.A., Hackett C.J., Marcuse E.K., Kollman T.R., Gellin B.G., Landry S.
(2002). Addressing Parents’ Concerns: Do Multiple Vaccines Overwhelm or Weaken the Infant’s
Immune System? Pediatrics 109-124.
Oh Y., Won Seo H., Han K., Park C., Chae C. (2012). Protective effect of the maternally derived
porcine circovirus type 2 (PCV2)-specific cellular immune response in piglets by dam vaccination
against PCV2 challenge. Journal of General Virology 93, 1556–1562.
Olvera A., Sibila M., Calsamiglia M., Segalés J., Domingo M. (2004). Comparison of porcine circovirus
type 2 load in serum quantified by a real time PCR in postweaning multisystemic wasting syndrome
and porcine dermatitis and nephropathy syndrome naturally affected pigs. Journal of Virological
Methods 117, 75–80.
Opriessnig, T., Patterson, A.R., Madson, D.M., Pal, N., Rothschild, M., Kuhar, D., Lunney, J.K., Juhan,
N.M., Meng, X.J., Halbur, P.G. (2009). Difference in severity of porcine circovirus type two-induced
pathological lesions between Landrace and Pietrain pigs. Journal of Animal Science 87, 1582– 1590.
Osek J., Truszczyński M., Tarasiuk K., Pejsak Z. (1994). Evaluation of different vaccines to control of
pig colibacillosis under large-scale farm conditions. Comparitive Immunology, Microbiology and
Infectious Diseases 18, 1-8.
55
Park J.S., Ha Y., Kwon B., Cho K.D., Lee B.H. Chae C. (2009). Detection of porcine circovirus 2 in
mammary and other tissues from experimentally infected sows. Journal of Comparative Pathology
140, 208–211.
Park J.S., Kim J., Ha Y., Jung K., Choi C., Lim J.K., Kim S.H., Chae C. (2005). Birth abnormalities in
pregnant sows infected intranasally with porcine circovirus 2. Journal of Comparative Pathology 132
(2-3),139-44.
Patterson A.R., Opriessnig T. (2010). Epidemiology and horizontal transmission of porcine circovirus
type 2 (PCV2). Animal health research reviews 11(2), 217-34.
Pejsak Z., Podgo´rska K., Truszczyn´ ski M., Karbowiak P., Stadejek T. (2010) Efficency of different
protocols of vaccination against porcine circovirus type 2 (PCV2) in a farm affected by postweaning
multisystemic wasting syndrome (PMWS). Comparitive Immunology, Microbiology and Infectious
Diseases. 33, e1–e5.
Pommier P., Keïta A., Pagot E., Smeets J. A field trial in France to assess the safety and the efficacy
against Mycoplasma Hyopneumoniae of simultaneous use of Porcilis PRRS and Porcilis M. Hyo in
piglets. Intervet Satellite Proceedings and Abstracts of the 5th International Symposium on Emerging
and Re-Emerging Pig Diseases 62 – 63.
Riising H.J., Murmans M., Witvliet M. (2005). Protection Against Neonatal Escherichia coli Diarrhoea
in Pigs by Vaccination of Sows with a New Vaccine that Contains Purifed EnterotoxicE. coli Virulence
Factors F4ac, F4ab, F5, F6 Fimbial Antigens and Het-labile E. coli Enterotoxin (LT) Toxoid. J. Vet.
Med. B. 52, 296-300.
Rothel J.S., Corner L.A., Lightowlers M.W., Seow H.F., McWaters P., Entrican G., Wood P.R. (1998).
Antibody and cytokine responses in efferent lymph following vaccination with different adjuvants.
Veterinary Immunology and Immunopathology 63, 167-183.
Rousset E., Harel J., Dubreuil D.J. (1998). Sulfatide from the Pig Jejunum Brush Border Epithelial Cell
Surface Is Involved in Binding of Escherichia coli Enterotoxin b. Infection and Immunity 66, 5650-5658.
Runnels P.L., Moseley S.L., Moon H.W. (1987). F41 pili as protective antigens of enterotoxigenic
Escherichia coli that produce F41, K99, or both pilus antigens. Infection and Immunity 55, 555.
Sanchez R. E., Jr., Meerts P., Nauwynck H.J., Ellis J. A., Pensaert M. B. (2004). Characteristics of
porcine circovirus–2 replication in lymphoid organs of pigs inoculated in late gestation or postnatally
and possible relation to clinical and pathological outcome of infection. Journal of veterinary diagnostic
investigation 16, 175–18.
Sarli G., Mandrioli L., Laurenti M., Laurenti M., Sidoli L., Cerati C., Rolla G., Marcato P.S. (2001)
Immunohistochemical characterisation of the lymph node reaction in pig post-weaning multisystemic
wasting syndrome (PMWS). Veterinary Immunology and Immunopathology 83, 53–67.
Schijns V. EJC (2000). Immunological concepts of vaccine adjuvant activitiy. Current opinion in
immunology 12, 456-463.
Segalés J. (2012). Porcine circovirus type 2 (PCV2) infections: Clinical signs, pathology and laboratory
diagnosis. Virus Research 164, 10– 19.
Segalés J., Kekarainen T., Cortey M. (2013). The natural history of porcine circovirus type 2: from an
inoffensive virus to a devastating swine disease? Veterinary Microbiology 165,13–20.
56
Segales J., Rosell C., Domingo M. (2004) Pathological findings associated with naturally acquired
porcine circovirus type 2 associated disease. Veterinary Microbiology 98, 2137–149.
Selim A.M.A., Abouzeid N.Z., Aggour A.M., Sobhy N.M. (2010) Comparative study for immune efficacy
of two different adjuvants bivalent FMD Vaccines in Sheep. Journal of American Science 6, 1292-
1298.
Sellwood R., Gibbons R.A., Jones G.W., Rutter J.M.(1975). Adhesion of enteropathogenic Escherichia
coli to pig intestinal brush borders: the existence of two pig phenotypes. Journal of medical
microbiology 8, 405-411.
Schmitt E., Klein M., Bopp T. (2014). Th9 cells, new players in adaptive immunity. Trends in
Immunology 35, 61-68.
Spickler A.R., Roth J.A. (2003). Adjuvants in Veterinary Vaccines: Modes of Action and Adverse Effects. Journal of Veterinary Internal Medicine 17, 273–281.
Straw B.E., Shin S., Callihan D., Petersen M. (1991). Antibody production and
tissue irritation in swine vaccinated with Actinobacillus bacterins containing various adjuvants. Journal
of the American Veterinary Medical Association 196, 600-604.
Stricker T.M., Weissenbacher-Lang C., Ritzmann M., Ladinig A. (2013). A study to assess the
compatibility of simultaneous use of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (EU-type)
vaccine and Mycoplasma hyopneumoniae vaccine under field conditions. Berliner und Münchener
Tierärtzliche Wochenschrift 126, 189-196.
Tomas A., Fernandes L.T., Valero O., Segales J. (2008). A meta-analysis on experimental infections
with porcine circovirus type 2 (PCV2). Veterinary Microbiology 132, 260–273.
Van den Broeck W., Cox E., Oudegab B., Goddeeris B.M. (2000) The F4 fimbrial antigen of
Escherichia coli and its receptors. Veterinary Microbiology 71, 223-244.
Vincent I.E., Carrasco C.P., Herrmann B., Meehan B.M., Allan G.M., Summerfield A., McCullough K.C.
(2003). Dendritic cells harbor infectious porcine circovirus type 2 in the absence of apparent cell
modulation or replication of the virus. Journal of Virology 77, 13288-13300.
Vincent I.E., Balmelli C., Meehan B., Allan G., Summerfield A., McCullough K.C. (2007). Silencing of
natural interferon producing cell activation by porcine circovirus type 2 DNA. Immunology 120, 47–56.
Virdi V., Coddens A., De Buck S., Millet S., Goddeeris B.M., Cox E., De Greve H., Depicker A. (2013).
Orally fed seeds producing designer IgAs protect weaned piglets against enterotoxigenic Escherichia
coli infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 110, 11809-11814.
Wellenberg G.J., Stockhofe-Zurwieden N., de Jong M.F., Boersma W.J., Elbers A.R. (2004).
Excessive porcine circovirus type 2 antibody titres may trigger the development of porcine dermatitis
and nephropathy syndrome: a case-control study. Veterinary Microbiology 99, 203–214.
Willson P.J., Rossi-Campos A. Potter A.A. (1995). Tissue reaction and immunity in swine immunized
with Actinobacillus pleuropneumoniae vaccines. Can. J. Vet. Res. 59, 299-305.
57
Wognarkpet S., Pfeiffer D.U., Morris R.S., Fenwick S.G. (1999a). An on-farm study of the
epidemiology of Actinobacillus pleuropneumoniae infection in pigs as part of a vaccine efficacy trial.
Preventive Veterinary Medicine 39,1–11.
Won Seo H., Han K., Park C., Chae C. (2014). Clinical, virological, immunological and
pathological evaluation of four porcine circovirus type 2 vaccines. The Veterinary Journal 200, 65-70.
Yanhong L., Xianghe Y., Chitrita D., Pina M. F., David S. N., Robert W. L., Wei W., Liliana L., Lauren
B., Diana R., Magaly T., Narasimha H., Jianghong M. (2015). Escherichia coli O-Antigen Gene
Clusters of Serogroups O62, O68, O131, O140, O142, and O163: DNA Sequences and Similarity
between O62 and O68, and PCR-Based Serogrouping. Biosensors 5, 51-68.
Zimmerman J. J., Karriker L. A., Ramirez A., Schwartz K. J. en Stevenson G. W. (2012). Chapter 26:
Porcine Circoviruses. 405-417.
Zimmerman J. J., Karriker L. A., Ramirez A., Schwartz K. J. en Stevenson G. W. (2012b). Chapter 53:
Colibacillosis. 723-749.
Zutic J., Asanin J., Misic D., Dobrila D.J., Milic N., Asanin R., Stojanovic D., Zutic M. (2010). Isolation
of ETEC strains from piglets with diarrhea in the neonatal period and their typization based on somatic
and fimbrial antigens. Acta Veterinaria 60, 497-506.
http://bijsluiters.fagg-afmps.be/DownloadLeafletServlet?id=124861, 8/10/2014
www.cbip-vet.be/nl/texts/NSUOOOL1BL2o.php#Neonatale, 25/12/2014
www.ema.europa.eu/docs/nl_NL/document_library/EPAR_-
_Product_Information/veterinary/000114/WC500061517.pdf, 20/12/2014
http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/SafetyAvailability/VaccineSafety/UCM096228
www.invivogen.com/review-vaccine-adjuvants, 29/03/2015
www.merckmanuals.com/vet/generalized_conditions/porcine_circovirus_diseases/overview_of_porcin
e_circovirus_diseases.html, 21/03/2015
www.veearts.nl/2014/meer-vaccinaties-tegen-circo-en-mycoplasma/, 21/03/2015
IBM Corp. Released 2013. IBM SPSS Statistics for Windows, Version 22.0. Armonk, NY: IBM Corp.
58
7. Bijlagen
Onafhankelijke variabele (x)
β 0 (intercept) β 1 ± SE OR P-waarde
L.huid.1e.vac. 0.h.binair
-2.657e+01 ± 7.963e+04
2 - 1 4.061e-14 ± 1.126e+05 1 1
3 - 1 4.061e-14 ± 1.126e+05 1 1
4 - 1 4.061e-14 ± 1.379e+05 1 1
3 - 2 3.787e-29 ± 1.126e+05 1 1
4 - 2 1.136e-28 ± 1.379e+05 1 1
4 - 3 7.573e-29 ± 1.379e+05 1 1
L.huid.1e.vac.
1.h.binair
-0.4055 ±
0.4564
2 - 1 -0.9808 ± 0.7217 0,375011 0.4670
3 - 1 -2.5390 ± 1.1229 0,078945 0.0812
4 - 1 -18.1606 ± 2062.6395 1,3E-08 1.0000
3 - 2 -1.5581 ± 1.1684 0,210536 0.4837
4 - 2 -17.1798 ± 2062.6395 3,46E-08 1.0000
4 - 3 -15.6216 ± 2062.6397 1,64E-07
1.0000
L.huid.1e.vac.
6.h.binair
-2.404e-15 ±
4.472e-01
2 - 1 -1.386e+00 ± 7.159e-01 0,250074 0.166
3 - 1 -1.957e+01 ± 2.405e+03 3,17E-09 1.000
4 - 1 -1.957e+01 ± 3.401e+03 3,17E-09 1.000
3 - 2 -1.818e+01 ± 2.405e+03 1,27E-08 1.000
4 - 2 -1.818e+01 ± 3.401e+03 1,27E-08 1.000
4 - 3 -7.763e-12 ± 4.165e+03 1
1.000
L.huid.1e.vac.
24.h.binair
-2.944 ± 1.026
2 - 1 1.210e+00 ± 1.202e+00 3,353485 0.696
3 - 1 -1.762e+01 ± 3.965e+03 2,23E-08 1.000
4 - 1 -1.762e+01 ± 5.607e+03 2,23E-08 1.000
3 - 2 -1.883e+01 ± 3.965e+03 6,64E-09 1.000
Bijlage 1: uitkomsten van de logistische regressie voor de huidscores
59
4 - 2 -1.883e+01 ± 5.607e+03 6,64E-09 1.000
4 - 3 -3.165e-12 ± 6.867e+03 1
1.000
L.huid.1e.vac.
72.h.binair
-2.9444 ±
1.0260
2 - 1 7.472e-01 ± 1.268e+00 2,111081 0.919
3 - 1 -1.762e+01 ± 3.965e+03 2,23E-08 1
4 - 1 -1.762e+01 ± 5.607e+03 2,23E-08 1
3 - 2 -1.837e+01 ± 3.965e+03 1,05E-08 1
4 - 2 -1.837e+01 ± 5.607e+03 1,05E-08 1
4 - 3 1.243e-13 ± 6.867e+03 1
1
R.huid.1e.vac.
0h.binair
-2.657e+01 ±
7.963e+04
2 - 1 4.061e-14 ± 1.126e+05 1 1
3 - 1 4.061e-14 ± 1.126e+05 1 1
4 - 1 4.061e-14 ± 1.379e+05 1 1
3 - 2 3.787e-29 ± 1.126e+05 1 1
4 - 2 1.136e-28 ± 1.379e+05 1 1
4 - 3 7.573e-29 ± 1.379e+05 1 1
R.huid.1e.vac.
1h.binair
-19.57 ±
2404.67
2 - 1 1.818e+01 ± 2.405e+03 78609255 1.000
3 - 1 1.818e+01 ± 2.405e+03 78609255 1.000
4 - 1 1.737e+01 ± 2.405e+03 34969961 1.000
3 - 2 1.066e-14 ± 7.906e-01 1 1.000
4 - 2 -8.109e-01 ± 1.193e+00 0,444458 0.885
4 - 3 -8.109e-01 ± 1.193e+00 0,444458
0.885
R.huid.1e.vac.
6.h.binair
-1.957e+01 ±
2.405e+03
2 - 1 1.957e+01 ± 2.405e+03 3,16E+08 1.000
3 - 1 1.916e+01 ± 2.405e+03 2,09E+08 1.000
4 - 1 -2.718e-11 ± 4.165e+03 1 1.000
3 - 2 -4.055e-01 ± 6.390e-01 0,666643 0.901
4 - 2 -1.957e+01 ± 3.401e+03 3,17E-09 1.000
4 - 3
-1.916e+01 ± 3.401e+03 4,77E-09
1.000
60
R.huid.1e.vac.
24.h.binair
-1.957e+01 ±
2.405e+03
2 - 1 1.957e+01 ± 2.405e+03 7,078061 1
3 - 1 1.957e+01 ± 2.405e+03 3,16E+08 1
4 - 1 -3.399e-11 ± 4.165e+03 1 1
3 - 2 2.487e-14 ± 6.325e-01 1 1
4 - 2 -1.957e+01 ± 3.401e+03 3,17E-09 1
4 - 3 -1.957e+01 ± 3.401e+03 3,17E-09
1
R.huid.1e.vac.
72.h.binair
-1.957e+01 ±
2.405e+03
2 - 1 1.783e+01 ± 2.405e+03 55395006 1
3 - 1 1.783e+01 ± 2.405e+03 5,947673 1
4 - 1 3.032e-12 ± 4.165e+03 1 1
3 - 2 -7.105e-15 ± 8.856e-01 1 1
4 - 2 -1.783e+01 ± 3.401e+03 1,81E-08 1
4 - 3 -1.783e+01 ± 3.401e+03 1,81E-08
1
L.huid.2evac.
0.h.binair
-2.157e+01 ±
6.537e+03
2 - 1 1.343e-11 ± 9.244e+03 1 1
3 - 1 1.862e+01 ± 6.537e+03 1,22E+08 1
4 - 1 1.350e-11 ± 1.132e+04 1 1
3 - 2 1.862e+01 ± 6.537e+03 1,22E+08 1
4 - 2 7.203e-14 ± 1.132e+04 1 1
4 - 3 -1.862e+01 ± 9.244e+03 8,19E-09
1
L.huid.2evac.
1.h.binair
-2.944 ± 1.026
2 - 1 1.210e+00 ± 1.202e+00 3,353485 0.696
3 - 1 -1.762e+01 ± 3.965e+03 2,23E-08 1
4 - 1 -1.762e+01 ± 5.607e+03 2,23E-08 1
3 - 2 -1.883e+01 ± 3.965e+03 6,64E-09 1
4 - 2 -1.883e+01 ± 5.607e+03 6,64E-09 1
4 - 3 -3.485e-12 ± 6.867e+03 1
1
L.huid.2evac.
6.h.binair
-0.2007 ±
0.4495
2 - 1 6.061e-01 ± 6.406e-01 1,833268 0.735
3 - 1 -1.937e+01 ± 2.405e+03 3,87E-09 1
61
4 - 1 -1.937e+01 ± 3.401e+03 3,87E-09 1
3 - 2 -1.997e+01 ± 2.405e+03 2,12E-09 1
4 - 2 -1.997e+01 ± 3.401e+03 2,12E-09 1
4 - 3 6.235e-12 ± 4.165e+03 1
1
L.huid.2evac.
24.h.binair
-0.6190 ±
0.4688
2 - 1 -4.796e-01 ± 6.975e-01 0,619031 0.878
3 - 1 -1.895e+01 ± 2.405e+03 5,89E-09 1
4 - 1 -1.895e+01 ± 3.401e+03 5,89E-09 1
3 - 2 -1.847e+01 ± 2.405e+03 9,52E-09 1
4 - 2 -1.847e+01 ± 3.401e+03 9,52E-09 1
4 - 3 8.352e-12 ± 4.165e+03 1
1
L.huid.2evac.
72.h.binair
-2.1972 ±
0.7454
2 - 1 -7.472e-01 ± 1.268e+00 0,473691 0.919
3 - 1 -1.837e+01 ± 3.965e+03 1,05E-08 1
4 - 1 -1.837e+01 ± 5.607e+03 1,05E-08 1
3 - 2 -1.762e+01 ± 3.965e+03 2,23E-08 1
4 - 2 -1.762e+01 ± 5.607e+03 2,23E-08 1
4 - 3 -6.416e-12 ± 6.867e+03 1
1
R.huid.2e.vac.
0.h.binair
-2.657e+01 ±
7.963e+04
2 - 1 4.061e-14 ± 1.126e+05 1 1
3 - 1 4.061e-14 ± 1.126e+05 1 1
4 - 1 4.061e-14 ± 1.379e+05 1 1
3 - 2 3.787e-29 ± 1.126e+05 1 1
4 - 2 1.136e-28 ± 1.379e+05 1 1
4 - 3 7.573e-29 ± 1.379e+05 1 1
R.huid.2evac.
1.h.binair
-1.957e+01 ±
2.405e+03
2 - 1 1.818e+01 ± 2.405e+03 78609255 1.000
3 - 1 1.737e+01 ± 2.405e+03 34969961 1.000
4 - 1 1.130e-11 ± 4.165e+03 1 1.000
3 - 2 -8.109e-01 ± 9.317e-01 0,444458 0.781
4 - 2 -1.818e+01 ± 3.401e+03 1,27E-08 1.000
4 – 3
-1.737e+01 ± 3.401e+03 2,86E-08
1.000
62
R.huid.2evac.
6.h.binair
-1.957e+01 ±
2.405e+03
2 - 1 2.130e+01 ± 2.405e+03 1,78E+09 1.000
3 - 1 2.019e+01 ± 2.405e+03 5,87E+08 1.000
4 - 1 -2.597e-11 ± 4.165e+03 1 1.000
3 - 2 -1.116e+00 ± 7.823e-01 0,327588 0.418
4 - 2 -2.130e+01 ± 3.401e+03 5,62E-10 1.000
4 - 3 -2.019e+01 ± 3.401e+03 1,7E-09
1.000
R.huid.2evac.
24.h.binair
-1.957e+01 ±
2.405e+03
2 - 1 2.176e+01 ± 2.405e+03 2,82E+09 1.000
3 - 1 2.041e+01 ± 2.405e+03 7,31E+08 1.000
4 - 1 4.309e-11 ± 4.165e+03 1 1.000
3 - 2 -1.350e+00 ± 8.909e-01 0,25924 0.364
4 - 2 -2.176e+01 ± 3.401e+03 3,55E-10 1.000
4 - 3 -2.041e+01 ± 3.401e+03 0
1.000
R.huid.2evac.
72.h.binair
-1.957e+01 ±
2.405e+03
2 - 1 1.997e+01 ± 2.405e+03 4,71E+08 1.000
3 - 1 1.977e+01 ± 2.405e+03 3,85E+08 1.000
4 - 1 -5.665e-12 ± 4.165e+03 1 1.000
3 - 2 -2.048e-01 ± 6.406e-01 0,81481 0.986
4 - 2 -1.997e+01 ± 3.401e+03 2,12E-09 1.000
4 - 3 -1.977e+01 ± 3.401e+03 2,59E-09
1.000
L.3e.bloedn.
22.12.14.binair
-2.657e+01 ±
7.963e+04
2 - 1 4.061e-14 ± 1.126e+05 1 1
3 - 1 4.061e-14 ± 1.126e+05 1 1
4 - 1 4.061e-14 ± 1.379e+05 1 1
3 - 2 3.787e-29 ± 1.126e+05 1 1
4 - 2 1.136e-28 ± 1.379e+05 1 1
4 - 3 7.573e-29 ± 1.379e+05 1 1
R.3e.bloedn.
22.12.14.binair
-2.057e+01 ±
3.965e+03
2 - 1 1.762e+01 ± 3.965e+03 44902319 1
3 - 1 1.762e+01 ± 3.965e+03 44902319 1
4 - 1 2.890e-11 ± 6.867e+03 1 1
63
3 - 2 1.066e-14 ± 1.451e+00 1 1
4 - 2 -1.762e+01 ± 5.607e+03 2,23E-08 1
4 - 3 -1.762e+01 ± 5.607e+03 2,23E-08
1
Onafhankelijke
variabele (x)
β 0 (intercept) β 1 ± SE OR P-waarde
buikvulling1evac
0h.binair
2.197e+00 ±
7.454e-01
2 - 1 1.737e+01 ± 2.405e+03 34969961 1
3 - 1 -3.328e-15 ± 1.054e+00 1 1
4 - 1 -2.293e-15 ± 1.291e+00 1 1
3 - 2 -1.737e+01 ± 2.405e+03 2,86E-08 1
4 - 2 -1.737e+01 ± 2.405e+03 2,86E-08 1
4 - 3 1.035e-15 ± 1.291e+00 1 1
Buikvulling.1e.vac.
24h.binair
2.057e+01 ±
3.965e+03
2 - 1 -1.762e+01 ± 3.965e+03 2,23E-08 1
3 - 1 -1.762e+01 ± 3.965e+03 2,23E-08 1
4 - 1 1.832e-08 ± 6.867e+03 1 1
3 - 2 2.132e-14 ± 1.451e+00 1 1
4 - 2 1.762e+01 ± 5.607e+03 44902319 1
4 - 3 1.762e+01 ± 5.607e+03 44902319
1
Buikvulling.2e.vac.
0.h.binair
2.657e+01 ±
7.963e+04
2 - 1 4.411e-06 ± 1.126e+05 1,000004 1
3 - 1 4.411e-06 ± 1.126e+05 1,000004 1
4 - 1 4.411e-06 ± 1.379e+05 1,000004 1
3 - 2 3.388e-21 ± 1.126e+05 1 1
4 - 2 2.541e-21 ± 1.379e+05 1 1
4 - 3 -8.470e-22 ± 1.379e+05 1 1
Buikvulling.2e.vac.
24h.binair
2.057e+01 ±
3.965e+03
2 - 1 -1.837e+01 ± 3.965e+03 1,05E-08 1
Onafhankelijke variabele = groepen. Groep 1: vaccinatie tegen Neocolipor®, groep 2: vaccinatie tegen Neocolipor® en
circovac®, groep 3: vaccinatie tegen Circovac® en groep 4: controle groep, geen vaccinatie
OR = EXP (β 1) = odds ratio P-waarde = overschrijdingskans
Bijlage 2: uitkomsten van de logistische regressie voor buikvulling
64
3 - 1 -1.837e+01 ± 3.965e+03 1,05E-08 1
4 - 1 -2.961e-09 ± 6.867e+03 1 1
3 - 2 1.066e-14 ± 1.054e+00 1 1
4 - 2 1.837e+01 ± 5.607e+03 95058210 1
4 - 3 1.837e+01 ± 5.607e+03 95058210 1
Onafhankelijke variabele = groepen. Groep 1: vaccinatie tegen Neocolipor®, groep 2: vaccinatie tegen Neocolipor® en
circovac®, groep 3: vaccinatie tegen Circovac® en groep 4: controle groep, geen vaccinatie
OR = EXP (β 1) = odds ratio P-waarde = overschrijdingskans
Recommended