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Universidade Técnica de Lisboa
Instituto Superior Técnico
Engenharia Biomédica2009/2010
Novas formas de produção de vacinas
Paula Antunesnº 64407
João Tiago n.º64408
Motivação e objectivos
Comparação dos vários métodos de produção de vacinas da gripe:
-Produção em ovos-Produção com cultura de células-Produção de hematoglutinina (HA) em células de insecto infectadas com baculovírus.
Produção de hematoglutininas (HA):
-DNA recombinado-BEVS – Baculovirus expression vector systems-Monitorização da produção de rHA
substância derivada, ou quimicamente semelhante, a um agente infeccioso
particular causador de doença
Reconhecida por Sistema
imunitário
como se tivesse realmente sido infectado pelo agente
reage
1ª vez - lenta e inespecífica, memorização
2ª vez – rápida e específica
Princípio base da vacinação
Não contem o agente com capacidade para se multiplicar rapidamente e causar doença,
-dos antecedentes de estimulação do sistema imunitário do indivíduo vacinado
-da genética subjacente às características do sistema imunitário
-do seu estado geral de saúde
Reacção individual a uma vacina depende sempre:
Vivas atenuadas
Inactivadas/inertes
Recombinadas geneticamenteTipos de
vacinas
- Camada mais externa do virusglicoproteína;- ligar o vírus ao receptor da célula hospedeira- Promove a aglutinação de glóbulos vermelhos às células a que se liga por reconhecimento do ácido siálico
- ajudar o vírus a deixar a célula invadida.- reconhece e remove o ácido siálico.- existem 9. N1 e N2 em humanos
Vírus da gripe – Influenza vírus
Este vírus ataca as células das vias respiratórias e é altamente contagioso.
Método dos ovos – 6 a 9 meses
Desvantagens:- Milhões de ovos- Necessidade de seleccionar as estirpes que apresentam alta taxa de crescimento em ovos- Cada ovo produz 2-3 doses de vacina injectável- Contra indicada para pessoas alérgicas a ovos
Seed virus
Métodos de produção de vacinas da gripe
Método por cultura de células – 4 ou 6 semanas a menos que nos ovos
Desvantagem:- Continua a haver uma selecção das estirpes que consigam sobreviver num substrato de células específicas
Meio de crescimento do vírus
• Células derivadas de células tumorais de fígado
• Meio de culturaMultiplicação de virus
• Células multiplicam-se• Vírus adicionado• Faz copias de si mesmo
• Sai para infectar mais células
proteínas superficiais
- solução de crescimento
- fragmentos das células (quimicamente
inactivados) e divididos em partes
-RNA -proteínas estruturais
Removidos
Vantagens:- Os vírus não têm que se adaptar ao crescimento em ovos.- Fácil controlo do suporte de vida.
Método de DNA recombinante
BEVS – Baculovirus expression vector systems
Reservatório onde há células de insecto num
fermento(bioreactor).
recolhidas através de centrifugação
purificada
Baculovirus passa a produzir HA igual ao das produzidas pelo vírus da
gripe.
Método de produção e purificação de HA
Workshop “New Cells
for New Vaccines II”, Wilmington,
2007
Método de DNA recombinante (rDNA)
Ocorre quando fragmentos de código genético de dois ou mais organismos diferentes são ligados in vitro.
Obtém-se DNA recombinante
Encaixa-se o fragmento de DNA de interesse no DNA do baculovírus
Enzimas de restrição (cortam o material genético em pontos definidos e conhecidos)
Plasmídeo (material genético secundário) Plasmídeo
Cromossoma
Quebra por enzima de restrição
Vector recombinante
Fragmento de DNA – gene de HA completo, do vírus da gripe
Plasmídeo – DNA do baculovirus
BEVS – Baculovirus expression vector systems
Infecção de células de insecto com baculovirus recombinante
Produção e purificação de rHA de interesseBaculovirus recombinante
Apto para produzir as HA recombinantes de interesse
Método de DNA recombinante
Alteração duma parte do código genético destas células
McPherson, 2008
Linha de células de insecto
- expressSF+- Fenótipo e características genotipicas únicas- Estáveis até 50 passagens- São infectadas usando uma baixa quantidade de baculovirus-Master Cell Bank (MCB)- Não tumorogénicas
Baculovirus:- Gama de hospedeiros restrita (Lepidopteran –
traças e borboletas)- Encontra-se nos vegetais
verdes (couve)- Seguro para os humanos
Bae et al., 2005
Monitorização do processo de infecção e da expressão de HA
Hemadsorção
Durante a fermentação das células de insecto são contadas as células que têm 3 ou mais GV à superfície.
Análise celular
Amostras recolhidas a cada intervalo de tempo
Analisador de células automático avalia a densidade e viabilidade celular
SRID Single Radial ImunodiffusionDifusão de rHA em gel de agarose. Anel de precipitação com diâmetro proporcional à concentração de HA
Tempo de colheitaDeterminação do
tempo óptimo de colheita do rHA das células de insecto.
Células não infectadas com baculovirus
Células nfectadas com baculovirus que contem genes de HÁ do virus de gripe A/New Caledonia/20/99 (H1N1)
Células não infectadas com baculovirus que não contem genes de HA.
-O rHA é altamente purificado e não contem proteínas de ovo – segura para pessoas alérgicas a ovo
- Produção mais rápida de vacinas
- Não é usado o vírus da gripe vivo. Passos de inactivação desnecessários.
- Não há necessidade de selecção de estirpes. Existe uma correspondência perfeita entre a HA da estirpe e da vacina. - Produção de rHA em células de insecto foi testada clinicamente e obteve resultados de segurança excelente (ICH document).
Vantagens
-Bae K, Choi J, Jang Y, Ahn S, Hur B (2009). Innovative vaccine production technologies: the evolution and value of vaccine production technologies. Arch Pharm Res.
-McPherson, Clifton E (2008). Development of a novel recombinat influenza vaccine in insect cells. Biologicals.
- Wang K, Holtz KM, Anderson K, Chubet R, Mahmoud W, Cox MM (2006). Expression and purification of an influenza hemagglutinin - one step closer to a recombinant protein-based influenza vaccine. Vaccine.
Referências Bibliográficas
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