TÉCNICAS MOLECULARES UTILIZADAS EN EL DIAGNÓSTICO GENÉTICO I. Mapas de restricción. Marcadores...

TÉCNICAS MOLECULARES UTILIZADAS EN

EL DIAGNÓSTICO GENÉTICO I. Mapas de

restricción. Marcadores moleculares: RFLP,

SSLP, VNTR (minisatélites y microsatélites),

SNP. Secuenciación. Hibridación. Obtención

de sondas. Transferencia Northern y

Southern. ADNc. PCR. Microarray.

• FRAGMENTACIÓN DEL ADN

• CLONACIÓN

• AMPLIFICACIÓN DEL ADN

• SECUENCIACIÓN DEL ADN

• HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS

TÉCNICAS DE GENÉTICA MOLECULAR

FRAGMENTACIÓN DEL ADN

CLONACIÓN EN PROCARIOTAS

Aislar y multiplicar en tubo de ensayo un

determinado gen o, en general, un trozo de

ADN

CLONACIÓN DEL ADN

ADN donante

Vector recombinante con el inserto 1 o 2

RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS: El plásmido que contiene el gen de la

proteína de interés también contiene un gen de resistencia a un

antibiótico

BACTERIAS “COLOREADAS”: El gen de nuestra proteína se inserta

en el plásmido interrumpiendo al gen de una enzima que produce

color azul

IDENTIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS RECOMBINANTES

ELECTROFORESIS

ELECTROFORESIS

ELECTROFORESIS

TIPOS DE GELES

•POLIACRILAMINA: para fragmentos de ADN

menores de 500 nucleótidos

•AGAROSA: para fragmentos de ADN mayores

de 500 nucleótidos

•CAMPO PULSANTE (agarosa): fragmentos

grandes de ADN, incluso cromosomas

completos

MAPAS DE RESTRICCIÓN

MAPAS DE RESTRICCIÓN

PCR: Reacción en cadena de la polimerasa

* Método Químico de Maxam y Gilbert

* Método Enzimático de Sanger

SECUENCIACIÓN DE UN

FRAGMENTO PURIFICADO DE ADN

MÉTODO ENZIMÁTICO DE SANGER

Secuenciador

Automático (+700 nt)

A C G T

Autorradiografía

(300 nt)

ACGT

MÉTODO ENZIMÁTICO DE SANGER

• Síntesis in vitro de ADN en presencia de

nucleótidos trifosfato terminadores de cadena

CROMATOGRAMA DE SECUENCIA

MÉTODO QUÍMICO DE MAXAM Y GILBERT

HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

La hibridación se produce

sólomente entre cadenas

complementarias

HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

SONDA: secuencia conocida de ADN o de

ARN que es complementaria a la secuencia

de interés y que se apareará con ella; se

utiliza para localizar secuencias específicas

de ADN

• Marcaje de fragmentos de ADN:

• sondas altamente marcadas

• sondas marcadas en 5´

• Tipo de marcaje:

• radiactivo: p32

• químico: fosfatasa alcalina, biotina, etc.

SONDAS

Marcaje de fragmento de DNA (Obtención de sondas):

Sondas altamente marcadas o marcadas en 5´. Marcaje radiactivo o químico.

Marcaje de fragmento de DNA (Obtención de sondas):

Sondas altamente marcadas o marcadas en 5´. Marcaje radiactivo o químico.

Altamente Marcadas Marcadas en 5´Altamente Marcadas Marcadas en 5´SONDAS

ADNc

Hibridación “in situ”En un corte histológico para detectar la expresión de un gen concreto. Localiza los ARNm en las posiciones precisas que ocupan en las células o tejidos

Hibridación “in situ” con fluorescenciaFISH

SOUTHERN BLOT

Microarrays

MARCADOR MOLECULAR

SNP (polimorfismo de un solo nucleótido): sustitución de un nucleótido por otro

SSLP (polimorfismos en la longitud de secuencias simples): variación en el tamaño del fragmento por inserción/deleción

VNRT (número variable de repeticiones en tándem):

Minisatétiles (centrómeros y telómeros)

Microsatétiles (distribuidos por todo el genoma)

Sitio de heterocigosidad de ADN, no asociado necesariamente a una variación fenotípica, que se utiliza como una etiqueta de un locus cromosómico particular

LOS POLIMORFISMOS SE COMPORTAN COMO ALELOS

(dos alelos por individuo)

RFLP (polimorfismo en la longitud de los fragmentos

de restricción):

Método para la detección de los distintos

polimorfismos, mediante la utilización de enzimas de

restricción

DETECCIÓN DE SNPs MEDIANTE RFLP

ER ER

ER ERER

2, 21, 21, 1

SNP

1

2

DETECCIÓN DE SNPs MEDIANTE RFLP

ER ERER

ERER ERERERER ER

SNP

2, 21, 21, 11

2

PADRE MADRE

HIJO

Padre Madre Hijo

DETECCIÓN DE VNTR MEDIANTE RFLP

11

22

11 22ER ER

ER ER

ER ER

ER ER

VNTR-microsatélites (2-5 pb)