Seminario LES

Daniela Marín Rivera Leidy Hincapie Medicine student

III SemesterMolecular Biology

INTRODUCTION

Ultraviolet B

Improvement

Induces autoreactivity, and the cells promote antibody production

DNMT1

Hipometilation

CD4

Inflamation

Autoinmune disease

: autoantibodies

"loss of self-tolerance"

DNA methylation

is an epigenetic

process

directly to prevent binding of transcription factors.

indirectly promoting structure 'closed'

chromatin.

the enzyme DNMT1 is involved in the establishment and regulation of methylation of specific cytokines from fabric patterns

DNA have ("CpG islands"), which are recognized by the enzyme DNA methyltransferase, which during DNA replication carbon 5 methylated cytosine of thenewly synthesized strand, thus maintaining the methylated state memory daughterDNA molecule

Gen DNMT1

In this study was important because it manages to have action on the stem cell to ensure in all sequences of dna methylation

They were able to identify that inhibir this factor which is the more important during the

metilation , to occurs a hypomethylationwhich leads to an improvement in patients

with LES

• DNMT1-• Hipometilacion ihbibitingthe DNMT1

• CD4+ T cell itssometing to UVB

• LES

Autoinmune

disease

AffectingOF CD4+ T

CELLS

The mostimportant

in metilation

Thehipometil

ationenhances

the LES

General objective

the objective of this study was to obtain the CD4 + and expose them ultraviolet rays and watch dose occurs a change in DNA methylation and that causes about patients with this reduction brings them taking into account the time of exposure dose and the improvement in symptoms, and if to obtain the result you can be beneficial to the patient and be able to include as a white effective therapeutic.

MATERIALES Y METODOS

Sujetos

Aislamiento y cultivo

EDTA

20 ml

Ficoll hypaque Aislamiento usando perlas magneticas

-Citometria : 95%

Rango entre 290-320 nm pico de 310 nm

Irradiada con PBS conMg2+/Ca2+

A distancia de 40cm Dosis de 20, 40 or 80 mJ/cm2. .

se agregó el medio de cultivo de células

t humanas yfueron cultivadas

para dosificación de 24 h.

Exposición UVB

La metilación del ADN global fue evaluada por las células con tinción

anticuerpo monoclonal específico contra 5-

methylcytidine

Células CD4 fueron lavadas con (SAFT-bsa)

Luego se fijo con paraformaldehido.

seguido portinción con cabra

anti-ratón igGconjugado con

fluoresceína

Se neutralizaron y se incubaron con anti-5 -methylcytidineanticuerpo

Análisis por citometría de flujo

Amplificación del RNA

Síntesis de su cDNA

Con transcriptasa inversa

Varios ciclos de DNA

convencional

Determina expresión de genes,

diferentes tejidos

Transcripción reversa se realizó utilizando el kit de rt-pcrprimescript

QRT-pcr fue realizada en sistema de tiempo real usando sybrpremezcla ex taq

amplificación se inició en el 95c durante 30 s como el primerpaso

seguido por 40 ciclos sucessivos de pcr: 95 c durante 5 s, a60 8c para 20 s.

Los primer de takara bio fueron: DNMT1 forward: 50-GCACCTCATTTGCCGAATACA-30; reverse: 5’-TCTCCTGCATCAGCCCAAATA-3’ b-actin forward: 5’-ACCCAGATCATGTTTGAGACC-3’reverse: 5’-AGGGCATACCCCTCGTAGA-3’

Western Blot

Proteínas

Separación por

electroforesis

SDS- PAGE

Única medida con Kdal

las membranas fueron sondeadascon dnmt1 anti igG de conejo anticuerpo oconejo anti-glyceraldehyde-3-fosfato deshidrogenasa (gapdh)

bandas de proteínas fueron detectadasutilizando el kit de brisa occidental densitométrica

Análisis de la banda de la proteína se realizó utilizando software imagej

Se hace para determinar la actividad catalítica de la enzima DNMT1

RESULTADOS

Regulación a la baja de la expresión de RNAm deDNMT1 contribuye a la hipometilación del ADN anivel global en las células TCD4 de pacientes con LES.

• Los resultados mostraron que el nivel de metilación delADN en las células T DC4 en pacientes con LES fuesignificativamente menor que el del grupo control.

RESULTADOS

Líneas roja punteadas control con isotopo, Línea azulcontrol de pacientes sanos y línea amarilla pacientescon LES.

RESULTADOS

UVB mejoro la hipometilación del ADN de maneradependiente de la dosis en las células T CD4 enpacientes con LES.

• Exposición de las cell T CD4 a O, 20, 40,60 mJ/cm².

• Diferencia en el nivel de metilación del ADN entre >20 mJ/cm² y 0 mJ/cm².

• Nivel de metilación del ADN es < para las células tratadas con 40 y 80 mJ/cm².

RESULTADOS

La metilación de las células T CD4 en pacientes conLES fue sensible a la exposición de UVB de forma dosisdependiente.

• No diferencia significativa entre 20, 40, 80 mJ/cm². En los controles sanos .

• Nivel de metilación del ADN se redujo en las células después de 40 y 80 mJ/cm².

• A 20 mJ/cm². no alcanzo significación estadística.

RESULTADOS

RESULTADOS

UVB no afecta la expresión de DNMT1 y proteínas enlas células T CD4 en paciente con LES.

• Se investigo el efecto de la exposición a UVB en laexpresión de DNMT1 y proteínas.

• Resultados No hay cambios significativos = laexpresión no se afecta con UVB.

RESULTADOS

RESULTADOS

• Los niveles de expresión de DNMT1 no mostraronuna diferencia.

• Se encontró expresión de DNMT1 en las células TCD4 después de diferentes dosis de exposición aUVB.

DISCUSSION

RESEARCHER COMMENT AGREE DISAGREE

Kastan Found that DNA methylationlevel was decreased after UVBexposure by studying in aphage DNA model.

x

Zhu We showed the level of globalDNA methylation in CD4+ Tcells from SLE patients wassignificantly lower than thatfrom the control group, whichindicated CD4+ T cells DNAhypomethylation was crucialfor the development of SLE.

x

DISCUSSION

RESEARCHER COMMENT AGREE DISAGREE

Wang The data showed global DNAmethylation level wassignificantly decreased in CD4+ Tcells from SLE patients after 40and 80 mJ/cm2 UVB exposurewhereas no significantdifference was found after 20mJ/cm2 UVB exposure.

x

DISCUSSION

RESEARCHER COMMENT AGREE DISAGREE

Wang The data showed global DNAmethylation level wassignificantly decreased in CD4+ Tcells from SLE patients after 40and 80 mJ/cm2 UVB exposurewhereas no significantdifference was found after 20mJ/cm2 UVB exposure.

x

CONCLUSION

• DNMT1 expression level is significantlypositive in SLE patients.

• The down regulation of DNMT1 mRNAexpression contributes to DNAhypomethylation.

• This project is very important for newtherapeutics targets.

• UVB DNA hypomethylation improve but aredose dependent.

MAPA