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HPLC 2 10/96 1
Cromatografía de alta presión: esquema
Reservoriodesolventes
Bomba
Medidor depresión
Inyector
ColumnaDetector
Desecho
Registrador
Sistema de datoso integrador
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PROPIEDADES DE LA FASE MÓVIL
• Disuelve la muestra
• k' de 2-10
• Alta pureza
• Costo, viscosidad, toxicidad, punto de ebullición
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SISTEMAS DE SOLVENTES TÍPICOS
•FASE NORMAL – hexano, cloruro de metileno, cloroformo, metanol, acetonitrilo
•FASE REVERSA - metanol/agua,acetonitrilo/agua
•INTERCAMBIO IÓNICO - buffer acuoso
•PERMEACIÓN EN GEL - tetrahidrofurano,tolueno, cloroformo
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RAZONES PARA FILTRAR
FUGAPARTÍCULA
VÁLVULA CHECK
PARTÍCULA
ARAÑAZOS
PISTÓN
BOMBA
• Filtrar el disolvente es esencial en HPLC!
HPLC 2 10/96 7
REQUISITOS DE LAS BOMBAS
1. Químicamente inerte
2. Alta presión (5,000 PSI)
3. Flujos (0.5 - 10 ml/min)
4. Libre de pulsos o amortiguada
5. Reproducibilidad de flujo <1.0%
6. Gradiente, cambio rápido de disolvente
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Materiales de construcción /compatibilidad con disolventes• Completamente resistentes:
Teflón, Rubí, Zafiro, Cerámica, Tefzel, Kalrez, Fluoraz
• Resistencia limitada:Acero Inox. 316 – Cloruros acuosos ácidosPEEK – Ácidos nítrico o sulfúrico conc.Kel-F – disoluciones de THF, hidrocarburoshalogenados Acetal – Ácidos o bases fuertes
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TIPOS DE BOMBAS
• Pistón reciprocante (las más comunes)
• Pistón reciprocante de doble cabeza
• Bombas de jeringa (más empleadas en SFC y micro HPLC)
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Bombas de pistón reciprocante
Reservorioexterno
Motor
ValvulasCheck
Pistón
Cámarahidráulica
Cam
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Bombas de pistón reciprocante de doble cabeza
• Mejor estabilidad de flujo que las de una cabeza...• ...produce una línea base más estable
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VALVULAS CHECK DE HPLC
Válvula de bola de salida
Válvula de bola de entrada
Pistón
A la columna
Del reservorio
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BOMBAS DE PISTÓN RECIPROCANTE
VENTAJAS
• Baratas
• 6000 psi
• Reservorio externo
• Diseño mecánico simple
LIMITACIONES
• Ruído de pulso
• Mantenimiento, sello de las válvulas
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20
16
12
8
4
0
0 1 2 3 4 5 6 7
20
16
12
8
4
0
0 1 2 3 4 5 6 7
% S
olve
nte
B
% S
olve
nte
BTIEMPOTIEMPO
ELUCIÓN ISOCRÁTICA vs. GRADIENTE
• En HPLC Isocrático, la composición de la fase móvil permanece igual durante el análisis
• En HPLC Gradiente, la fuerza de la fase móvil se incrementa con el tiempo de análisis.
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1
2
34 5
6
7
0 20 40 60 80 min 0 20 40 60 80 min
1
2
3
4 5
6
7
COMPARACIÓN DE ELUCIÓN ISOCRÁTICAY GRADIENTE
ELUCIÓN ISOCRÁTICA ELUCIÓN GRADIENTE
BIFENILOS CLORADOS
50% Metanol50% Agua
20% MeOH / 80% H2Oa
75% MeOH / 25% H2O
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FORMACIÓN DE GRADIENTES A ALTA PRESIÓN
Bomba
Bomba
Programador
A
BBomba
Programador
Bomba40:60 90:10
0.4 ml/min
0.6 ml/min
0.9 ml/min
0.1 ml/min
CámaraMezclado
De 40%A - 60%B a 90%A - 10%B
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FORMACIÓN DE GRADIENTES A BAJA PRESIÓN
A B C
Reservorios de disolventes
Programador Válvula Multipuertos
Cámara deMezclado
A LA BOMBA DE HPLC
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OPERACIÓN VÁLVULA DE INYECCIÓN
CARGA INYECCIÓN
DE LA BOMBA
A LA COLUMNA
RIZO DEMUESTRA
JERINGA
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ARREGLO DE PRE-COLUMNA Y GUARDA-COLUMNA
VÁLVULADE
MUESTREO
GUARDA-COLUMNA
COLUMNAANALÍTICA
DETECTOR
PRECOLUMNA
BOMBA
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CONEXIONES PARA HPLC
UPCHURCHWATERS
SWAGELOK
PARKER
VALCO
RHEODYNE
"X"
Distance "X" is critical i n obtaininga low-volume, leak-free seal...
...and varies greatly from onemanufacturer to another.
1. "X" is too long: leaks inevitable2. "X" is too short: adds to extracolumn volume
1. 2.
.130
.090
.090
.090
.080
.170
WATERS UPCHURCH PARKER
WATERS UPCHURCH PARKER
SWAGELOK VALCO RHEODYNE
.320 .250 .210
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CONSTRUCCIÓN DE COLUMNASDEL
INYECTOR2 m FRITADO
POROSO
• LARGO: 3, 5, 10, 15, 25, cm• I.D.: 4 or 4.6 mm• ACERO INOXIDABLE• partículas 3, 5, 10 m
AL DETECTOR
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LC ANALÍTICA vs. LC SEMI-PREP
MUESTRA :0.1 mg in 10 µl 50 mg in 2 ml
COLUMNA :4.6 x 150 mm 10 x 250 mm
FLUJO :1 ml/min 10 ml/min
DETECTOR :Alta sensibilidad, PDA Baja sensibilidad, RI
ANALÍTICA SEMI-PREPARATIVA
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CONTROL DE TEMPERATURA EN HPLC
• TERMOSTATADO DE COLUMNA – Áreas de pico y tiempos de retención más reproducibles.
• CALENTAMIENTO DE COLUMNA :
1. Menor viscosidad, menos presión.
2. Menor coleo de pico, desorción más rápida.
3. Usualmente menor selectividad.
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DETECTORES DE HPLCDETECCIÓN ULTRAVIOLETA (UV) • Longitud de onda fija• Longitud de onda variable • Arreglo de diodos
INDICE DE REFRACCIÓN
FLUORESCENCIA
ELECTROQUÍMICA
MS / FTIR / Conductividad/MS
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SISTEMAS DE DATOS
INTEGRADORES. Fácil de usar
. Precio moderado
COMPUTADORA. Flexible, poderosa
. Cara
1.235
1.235
1.235
1.235
1.235
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CROMATOGRAMA DE INTEGRADOR
RUN# 523 FEB 16, 1994 02:44:11 SAMPLE# 2AREA% RT AREA TYPE WIDTH AREA% 1.235 22353 VB .060 .16530 1.679 10700 BB .105 .07913 3.197 1761694 PV .095 13.02755 3.289 821053 VB .077 6.07160 4.315 690054 BB .120 5.10288 5.540 639889 BB .157 4.73191 6.235 31558 BB .196 .23337 11.075 9545536 BB .338 70.58825
TOTAL AREA=1.3523E+07MUL FACTOR=1.0000E+00
* RUN# 523 FEB 16, 1994 02:44:11
START
1.2351.679
3.1973.289
4.315
5.5406.235
11.075
STOP
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VALORES TÍPICOS PARA HPLCCOMPONENTE VALOR TÍPICO INTERVALOEMPAQUE
Tamaño partícula 10 y 5 m 3 - 10 mTamaño de poro 80 y 100 Å 60-120 Å, hasta 4,000 Å
COLUMNADiámetro Int. 4.6 mm 2 - 5 mmLargo 15 y 25 cm 3 - 30 cm
BOMBAPresión 1500 psi 800 - 5000 psiFlujo Volumétrico 1 ml/min 0.5 - 2 ml/minFlujo lineal 0.1 cm/sec 0.05 - 0.2 cm/sec
MUESTRAVolumen 20 l 2 - 100 l Concentración 0.1 % 1 ppm - 1 %
DETECTORVolumen de celda 5 l 2-15 l to 200 l Constante de tiempo 50 msec 25 msec - 1 sec
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