View
216
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
LGN 5799 - SEMINÁRIOS EMGENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS
Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas
Departamento de GenéticaAvenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: 13400-970 - Piracicaba - São Paulo - Brasil
Telefone: (0xx19) 3429-4250 / 4125 / 4126 - Fax: (0xx19) 3433-6706 - http://www.genetica.esalq.usp.br/semina.php
BIOTECNOLOGIA FLORESTAL – APLICAÇÕES E PERSPECTIVAS
Pós-graduanda: Juliana Erika de Carvalho TeixeiraOrientador: Prof. Dr. Luís Eduardo Aranha Camargo
SUMÁRIO
1. Introdução
2. Propagação in vitro
- Micropropagação
- Biorreatores e Propagação Fotoautotrófica in vitro
3. Marcadores Moleculares
- Aplicações Operacionais
- SAM
4. Transgenia
5. Genômica
INTRODUÇÃO
Importância do Setor Florestal
Fonte: www.sbs.org.br – FAO, 2007
OS DEZ PAÍSES COM MAIS PLANTAÇÕES FLORESTAIS
INTRODUÇÃO - Importância do Setor Florestal
www.sbs.org.br
PLANTAÇÕES DE EUCALIPTO – PRINCIPAIS PAÍSES
MAIORES EXPORTADORES DE PRODUTOS FLORESTAIS (2000)
Fonte: www.sbs.org.br
INTRODUÇÃO - Importância do Setor Florestal
INTRODUÇÃO - Importância do Setor Florestal
CARACTERIZAÇÃO DA ATIVIDADE FLORESTAL BRASILEIRA
DADOS SÓCIO-ECONÔMICOS 2006 – “eucaliptocultura apresenta uma significativa e crescente participação no desenvolvimento socio-econômico nacional”
• PIB Florestal = US$ 21 bilhões (4% do PIB Nacional)
– Celulose e papel: US$ 7,5 bilhões (BR 7° maior produtor e 11° fabricantes papel)
– Siderurgia a carvão vegetal: US$ 4,2 bilhões
– Madeira e móveis: US$ 9,3 bilhões
• Exportações = US$ 5,4 bilhões (10% do total)
• Impostos Recolhidos = US$ 2 bilhões
• Consumo de madeira (Nativas + Plantadas) = 300 milhões m3/ano
• Empregos Diretos + Indiretos = 2 milhões (total)
INTRODUÇÃO - Importância do Setor Florestal
Nossa indústria de base florestal é muito competitiva !
• Florestas altamente eficientes, produtivas e competitivas, plantadas com base em um
adequado nível de sustentabilidade;
•Madeira de baixo custo;
• Qualidade e homogeneidade da madeira;
• Fábricas de tecnologia estado-da-arte e de classe mundial;
• Recursos humanos qualificados;
• Excelente gestão da qualidade de produto, meio ambiente e da responsabilidade social corporativa
(ISO 9000, ISO 14000, OHSAS 18000, SA, etc..)
• Sustentabilidade ambiental e certificação florestal do manejo e da cadeia de custódia;
• Intenso desenvolvimento científico e tecnológico através de muitas pesquisas;
• Contínuo crescimento do setor industrial, com novas adições de capacidade e modernizações das
fábricas existentes;
• Gestão eficaz, eficiente e competitiva;
• Competição a nível mundial nos mais exigentes mercados.
Fonte: Foelkel, 2007.
INTRODUÇÃO - Importância do Setor Florestal
www.sbs.org.br
Plantio Clonal: um dos responsáveis pelo sucesso!
Apagão florestal:
BR - Déficit de madeira: 225 milhões de m3/ano
INTRODUÇÃO – Biotecnologia Florestal
Biotecnologia tecnologia que ajudará a superar este desafio!
... compreensão dos processos moleculares fundamentais nas árvores, enquanto organismos individuais, bem como sua domesticação e utilização comercial ...
Biotecnologia FlorestalGenética Molecular
Genética Populações
Genética Quantitativa
Propagação Clonal
Melhoramento
Silvicultura
INTRODUÇÃO – Biotecnologia Florestal
Biotecnologia Florestal:
� Propagação in vitro
� Marcadores Moleculares
� Transgenia
� Genômica
PROPAGAÇÃO IN VITRO
Primeiros trabalhos de micropropagação no BR – Déc. 50 e laboratórios: 1970 - 1980
Micropropagação e enxertia in vitro: maior interesse científico e econômico
Na área florestal: micropropagação é a técnica mais difundida e com aplicações comprovadas
Aplicações da Propagação in vitro na área florestal:
• conservação de germoplasma in vitro
• multiplicação de clones superiores – aceleração do programa de melhoramento
• limpeza clonal
• base para outras técnicas biotecnológicas – transformação genética
PROPAGAÇÃO IN VITRO - Aplicações
Fases Micropropagação:
• Seleção do explante e obtenção de culturas livres de contaminantes - Inoculação
• Multiplicação e Alongamento dos propágulos vegetativos
• Enraizamento (in vitro ou ex vitro)
• Aclimatização na condição ex vitro das plantas obtidas in vitro
PROPAGAÇÃO IN VITRO – AplicaçõesProliferação de Gemas Axilares
Seleção dos Explantes
Enraizamento e Aclimatização
Via Organogênese
Via Embriogenêse Somática Fonte: Xavier, et al., 2007 Fonte: Xavier, et al., 2007
Fonte: Xavier, et al., 2007
PROPAGAÇÃO IN VITRO - Aplicações
Eucalipto:
• Micropropagação por proliferação de gemas axilares
• Enraizamento ex vitro
• Produção de mudas para formação de mini-jardins clonais
Micropropagação Enraizamento Mini-jardim clonal
PROPAGAÇÃO IN VITRO - Perspectivas
Micropropagação tradicional: meio semi-sólido, grande número de pequenos recipientes e muita mão-de-obra, várias câmaras de fluxo laminar, grandes
autoclaves e espaço de cultivo
Propagação em larga escala mediante propagação in vitro, em quantidade e qualidade
Inovações têm sido propostas:
• Uso de recipientes de cultivo alternativo
• Equipamentos para produção de mudas em larga escala – Biorreatores
• Automação das operações dos sistemas de cultura de tecidos
• Manipulação do ambiente in vitro com a propagação fotoautotrófica
PROPAGAÇÃO IN VITRO - Perspectivas
BIORREATORES:
• Tecnologia mais proeminente na redução de custos de mão-de-obra,
permitindo multiplicação de plantas em larga escala
• Por usar meio líquido, permite maior produtividade e eficiência da
propagação
• Primeiro relato: 1981 em Begonia
• 2005: surgiram os primeiros biorreatores para micropropagação
comercial em espécies arbóreas
PROPAGAÇÃO IN VITRO - Perspectivas
Fonte: Penchel, et al., 2007
Tipos de Biorreatores, classificados pelo tipo de agitação e pela construção do frasco
PROPAGAÇÃO IN VITRO - Perspectivas
RITA
TRI
3R
Princípio de funcionamento:
- Compartimento superior: suporte e flutuação do material vegetal
- Compartimento inferior: estocagem de meio de cultura
- Conjunto de válvulas: controla a transferência do meio de cultura
PROPAGAÇÃO IN VITRO - Perspectivas
Impacto da utilização de Biorreatores
Fonte: Penchel, et al., 2007
PROPAGAÇÃO IN VITRO - Perspectivas
Micropropagação em Condições Fotoautotróficas
Propagação in vitro convencional: heterotrófica
• Perda da competência fotossintética e desordens fisiológicas
• Etapa de aclimatização a condição ex vitro
O que pode melhorar a competência FS e permitir rustificação in vitro?
• Reduzir ou eliminar Sacarose
• Uso de luz alternativa, luz natural
• [ CO2]
• ↓ [ O2]
PROPAGAÇÃO IN VITRO - Perspectivas
Micropropagação em Condições Fotoautotróficas
Uso de frascos maiores
Menor risco de contaminação
Automação!!
MARCADORES MOLECULARES
� Aplicações Operacionais
Análise de DNA para fins de identificação individual e estudos de parentesco
• MM vem sendo utilizados em florestas desde os anos 80 – primeiros mapas
• Tipos: RFLP
RAPD
AFLP
SSR
SNPs
TRAP
DArT
• herança co-dominante
• multi-alélicos
• análise simples e econômica
• transferíveis dentro e entre espécies
MARCADORES MOLECULARES - Aplicações
• Controle de Qualidade do Processo de Multiplicação: Certificação Genética
� Evitar mistura principalmente em jardim clonal
� Garantir que o clone selecionado pelo programa de melhoramento seja corretamente multiplicado e plantado
Principais aplicações:
1. Identificação e Discriminação de Clones-elite
MARCADORES MOLECULARES - Aplicações
Método Padrão para identificação de clones:
• SSR em sistemas multiplex com 6 a 12 locos
analisados em seqüenciador automático
Parcerias com universidades ou
empresas de genotipagem
• Gel de agarose 3% com locos polimórficos Dados Tese Juliana Teixeira
MARCADORES MOLECULARES - Aplicações
Exemplo:
Análise de identidade de 4 clones com 12 locos
Grattapaglia, 2007
MARCADORES MOLECULARES - Aplicações
2. Determinação da paternidade em cruzamentos controlados
• Identificação de contaminantes na progênie (auto-fecundação e filhos ilegítimos)
Por que certificar os descendentes de um cruzamento?
- Estimar corretamente os parâmetros genéticos que são ferramentas utilizadas pelos melhoristas na seleção de genótipos superiores !!
- Correta identificação de marcadores de DNA que possivelmente poderiam ser utilizados na construção de mapas genéticos e no Melhoramento Assistido por Marcadores !!
MARCADORES MOLECULARES - Aplicações
Mãe
Pai
Autofecundação
Filho ilegítimo
Dados Tese Juliana Teixeira
Filho 1
Filho 2
Filho 3
Filho 4
Filho 5
Filho 6
MARCADORES MOLECULARES - Aplicações
3. Proteção de Cultivares
Consenso: Material genético é um dos principais componentes do sucesso
empreendimento florestal – ativo essencial para a manutenção e o crescimento
da competitividade de uma indústria de base florestal
Conjunto de 36 marcadores morfológicos – estabilidade e pouca influência ambiental, em dois ciclos
MARCADORES MOLECULARES - Aplicações
MM: atendem com perfeição aos requerimentos do teste de DHE adotado na proteção intelectual de uma nova variedade
• Muitos clones elites selecionados dentro da mesma família: difícil separá-los usando os descritores morfológicos!!
BR: Lei de Proteção de cultivares n° 9.456, sancionada em 1997
2002 – publicação das instruções para os ensaios de DHE
MM: descritores complementares e facultativos
10 a 15 marcadores
MARCADORES MOLECULARES - Aplicações
4. Caracterização de Coleções de Germoplasmas e Populações de Melhoramento
• Direcionar rotas de coleta de sementes: maior variabilidade dentro de
famílias – sementes de uma única árvores por ponto de coleta representam
grande parte da variabilidade daquela população – coleta de sementes de uma
ou poucas árvores, porém de um grande número de locais diferentes
• Planejamento de pomar de sementes com genótipos mais divergentes
• Gerenciar variabilidade genética em populações de melhoramento
MARCADORES MOLECULARES - Perspectivas
� Perspectivas – SAM
• Nenhum MM publicado para ser usado na SAM – aplicação operacional da SAM
em árvores ainda é uma promessa!!
• Vários mapas publicados (RAPD, AFLP, SSR), com diversos QTLs mapeados
Resistência a ferrugem
MARCADORES MOLECULARES – Perspectivas
Vários mapas para Qualidade da Madeira
Grattapaglia, et al., 1992
Novaes, 2006
MARCADORES MOLECULARES – Perspectivas
Porque não temos MM para serem usados na SAM?
• Domesticação recente, pouco conhecimento sobre herança dos caracteres
• Impossibilidade ou grande dificuldade em obter linhagens
• Poucas características herança simples
• Poucos pesquisadores
• MM mapeados atualmente são dominantes e/ou aleatórios
Novas perspectivas...
• Mapeamento de genes candidatos
• Mapeamento de Associação
• QTLs de expressão (eQTLs)
MARCADORES MOLECULARES – Perspectivas Mapeamento de Associação
Grattapaglia, 2007
DESAFIOS• Desconhecimento da extensão do desequilíbrio de ligação (espécie e/ou população específica)• Whole genome scan ou genes candidatos??• Quantos e quais SNPs genotipar ? Como genotipar ?• Definição de quais genes candidatos devem ser analisados• Seleção de populações adequadas para análise
MARCADORES MOLECULARES – Perspectivas
QTLs de expressão gênica - Identificação de genes por trás de QTLs usandoabordagem combinada mapeamento genético e expressão em microarranjos
Grattapaglia, 2007
Transgenia – Transgenese Florestal
• Transformação genética: ferramenta indispensável aos estudos de biologia
molecular e pesquisa em genômica funcional
• Além de avaliar a função de genes em plantas, tem permitido a geração de
cultivares com características superiores
Vantagem: redução do tempo necessário para introdução de novas
características de interesse em clones superiores
• Populus, eucalipto e coníferas – agrobactérias é mais eficiente
• Populus: planta modelo para estudos de genética molecular em sps florestais
• Principal obstáculo: regeneração de plantas transformadas
• FOCO: QUALIDADE DA MADEIRA
TRANSGENIA – Aplicações
Classes de genes transformados:
1. Redução ou alteração do ciclo reprodutivo
LFY de arabidopsis em Populus: Flores, frutos e sementes férteis em 7 meses – redução de 8 anos
2. Modificação da arquitetura vegetal
Genes reguladores da síntese de fitohormonios:
TRP (triptofano sintase): maior formação de brotos, número e comprimento
de raízes, número de folhas e área foliar
Ugt (UDP-glicose-transferase): duplicação da taxa de multiplicação de raízes
Ácido-giberélico-20-oxidase: crescimento vertical mais acelerado, folhas e
fibras mais largas e aumento da biomassa
TRANSGENIA – Aplicações 3. Manipulação dos teores de lignina e celulose
• COMT e CCoAOMT: fenótipos indesejáveis, baixa S:G• CAD: redução 45% lignina, aumento 15% celulose, crescimento mais rápido de caules
e raízes
4. Resistência a pragas e doenças
• Inibidores de proteases e proteinases, quitinases, bacteriosinas, bacteriopsinas, glutationa sintase e oxalato oxidase
5. Tolerância a herbicidas e estresses abióticos
• CP4/EPSPS, GOX: tolerância a glifosato• ahas: tolerância a imidazolinonas• bar: glifosato amônio• Glutamina sintase: R déficit hídrico• Fitocromo A: R frio• Glutationa sintase e glutationa redutase: R metais tóxicos e a ozônio
TRANSGENIA – Aplicações Eucalipto:
Literatura: vários trabalhos descrevendo geração de calos, tecidos ou órgãos
geneticamente transformados, porém sem comprovação de que plantas
completas foram regeneradas
Diferentes grupos de pesquisas do setor privado: protocolos bem estabelecidos de transformação e regeneração: SEGREDO INDUSTRIAL
TRANSGENIA – Perspectivas
� Perspectivas
• Maioria dos trabalhos já realizados: aplicações industriais – aumento produção e qualidade da madeira
• Futuro próximo: agregar valores de relevância ambiental – recuperação de áreas ou ecossistemas degradadas
Criação da Castanheira americana resistente à requeima da castanheira e a outras doenças, para recuperação futura do ecossistema florestal dos Appalaches, destruído em razão desta doença
GENÔMICA – Aplicações
GENÔMICA
• Final do séc. XX: início da era genômica
• Genomas completo de várias espécies tem sido seqüenciados – plataformas e metodologias de sequenciamento em larga escala
GENÔMICA – Aplicações
Populus – árvore modelo:
• Tamanho relativamente pequeno do genoma (~ 485 Mb)Similar ao tamanho do genoma de arroz40 vezes menor que Pinus taeda
• Crescimento rápido podendo atingir maturidade reprodutiva em 4-6 anos e fenótipos de interesse em 1-3 anos
• Alta diversidade fenotípica e existência de híbridos inter-específicosFacilita o mapeamento genéticoGrande pool gênico
• Facilidade de propagação vegetativa e transformaçãogenética
Fundamental para o estudo da função gênica
GENÔMICA – Aplicações
Iniciado em 2002 pelo International Populus Genome Consortium e coordenado pelo Dr. Gerald Tuskan (ORNL)• Maior parte do seqüenciamento realizado no JGI (Joint Genome Institute)• Foram geradas 4,2 x 109 bases fornecendo uma cobertura de 7,5 vezes do genoma
Entretanto o genoma não pode ser totalmente finalizado...- Aproximadamente 410 Mb (~ 85%) bases puderam ser montadas em
2.447 regiões contíguas distribuídas pelos 19 grupos de ligação- Alto grau de heterozigose que geraram diversos segmentos
haplotípicos (variantes alélicas)- Grande incidência de segmentos duplicados e abundância de
transposons- Limitações na técnica de seqüenciamento e montagem
GENÔMICA – Aplicações
O que descobrimos...
• Apenas uma pequena porcentagem de genes em Populus não possui um homólogo em Arabidopsis (Sterky et al., 2004)
• A maioria das famílias gênicas em Arabidopsis possuem correspondentes emPopulus. Em termos proporcionais algumas famílias possuem mais elementos em Populus do que em Arabidopsis
1. Genes associados com resistência à doenças (família NB-ARC)2. Genes envolvidos no desenvolvimento meristemático3. Transportadores de metabólitos e nutrientes
• A análise do genoma de Populus revelou que diversos segmentos estão duplicadosAproximadamente 8,000 genes foram identificados como tendo duas cópias (genes parálogos)
GENÔMICA – Aplicações
Iniciativas genômicas em outras espécies florestais
Coníferas:
• Para gimnospermas em geral a principal dificuldade é o tamanho do genoma
15 Gb em média, ~ 5 vezes maior que o genoma humano!
• Muitos elementos repetitivos no genoma
• Com a tecnologia atual de seqüenciamento as perspectivas para a obtenção
do genoma completo de qualquer conífera são remotas
• Apesar disso as ESTs fornecem informações valiosas sobre a expressão
gênica e na busca por marcadores moleculares (SSR e SNP)
• Projetos Dendrome e Arborea – estudos genômicos auxiliando melhoramento
GENÔMICA – Aplicações
Eucalyptus
• Diferentemente das coníferas, o tamanho do genoma para o gênero Eucalyptus
varia de 370 a 700 Mb
• Possui diversas vantagens como o Populus: Crescimento rápido, várias
possibilidades de híbridos interespecíficos, grande variabilidade genética
• Principal desvantagem : Transformação genética não totalmente dominada, o
que impede a realização de estudos funcionais
• Diversos projetos de seqüenciamento de ESTs foram realizados para
Eucalyptus. A maioria com participação de empresas privadas - Não disponíveis
publicamente
Agrigenesis (Nova Zelândia) - 183.000 ESTs a partir de 20 bibliotecas de cDNA
de E. grandis. Somente 951 depositadas no Genbank
GENÔMICA – Aplicações
1. Geração de um plataforma de informações e recursos genômicos
2. Estabelecimento de uma rede de populações experimentais para pesquisa genômica
3. Mapeamento, identificação e determinação de função de genes envolvidos na formação da madeira e resistência a doenças
4. Estabelecimento das bases para iniciativas empresariais visando a incorporação de tecnologias genômicas nos programas de melhoramento
O Brasil tem uma posição de destaque no cenário mundial em relação à genômica de Eucalyptus. Existem duas iniciativas distintas:
• Forests: Focado na descoberta de genes. Geração de 123.889 ESTs de E. grandis
• Genolyptus: Principal objetivo é estudar as bases genéticas de características de interesse econômico em Eucalyptus.
GENÔMICA – Aplicações
Era Pós-Genômica...
• transcrissômica, proteômica, metabolômica
• Foco: Qualidade da Madeira...
• Estudos comparando transcritos e proteínas de diferentes tecidos: folha, casca, xilema, etc..
Complementar dados de expressão com proteômica, metabolômica
Conclusões: Não há alta correlação qualitativa ou quantitativa entre os RNAme as proteínas extraídos de um mesmo tecido.
Presença de RNAm de um determinado gene não é indicativo de atividade da proteína equivalente na célula.
GENÔMICA – Aplicações
� Principais contribuições e perspectivas:
• Melhor compreensão da função dos genes, permitindo maior entendimento da relação entre um gene e um fenótipo bem como um entendimento mais global das relações complexas entre variação genética e variação fenotípica;
• Fornecimento de genes candidatos para estudos de associação, mapeamento e transgênicos;
• Novas plataformas de genotipagem e sequenciamento: sequenciar toda a população a ser mapeada!!
Conclusões
• Somente com a união de diferentes ferramentas de biotecnologia será possível obter informações sobre o controle dos complexos eventos moleculares...
• Genômica + melhoramento: compreensão das relações complexas entre variabilidade genética e diversidade fenotípica;
• Setor florestal investe em estudos relacionados a biotecnologia e aplica as principais tecnologias desenvolvidas;
Recommended