Prof a Leila Larisa Medeiros Marques Contagem de coliformes totais e coliformes termotolerantes em...

Profa Leila Larisa Medeiros Marques

Contagem de coliformes totais e coliformes termotolerantes em

alimentos

DefiniçãoCOLIFORMES TOTAIS: grupo de bactérias

constituído por bacilos gram-negativos, aeróbios ou anaeróbios facultativos, não formadores de esporos, oxidase-negativos, capazes de crescer na presença de sais biliares e que fermentam a lactose com produção de aldeído, ácido e gás a 35ºC em 24-48 horas. O grupo inclui os seguintes gêneros: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella.

COLIFORMES FECAIS OU COLIFORMES TERMOTOLERANTES: são coliformes capazes de se desenvolver e fermentar a lactose com produção de ácido e gás à temperatura de 44,5 ± 0,2°C em 24 horas. O principal componente deste grupo é Escherichia coli, sendo que alguns coliformes do gênero Klebsiella e Citrobacter também apresentam essa capacidade.

Definição

Coliformes- significado em alimentosTotais: Utilizado para avaliar as condições

higiênicas, sendo que altas contagens significam contaminação pós-processamento, limpezas e sanificações deficientes, tratamento térmicos ineficientes ou multiplicação durante o processamento ou estocagem.

Termotolerantes: empregado como indicador de contaminação fecal, ou seja, de condições higiênico-sanitárias, visto presumir-se que a população deste grupo é constituída de uma alta proporção de E. coli, que tem seu habitat no trato intestinal do homem e de outro animais. Além de indicar possibilidade de presença de outros patógenos entéricos.

TécnicasTécnicas

» Plaqueamento (sólido): aplica-se a amostras de matérias-primas, alimentos e rações, devendo ser utilizada quando o limite máximo tolerado ≥ 100 UFC/g ou mL.

»NMP (líquido) em alimentos: aplica-se a amostras de matérias-primas e alimentos, devendo ser utilizada quando o limite máximo tolerado for inferior a 100 UFC/g ou mL.

»NMP (líquido) em água e gelo: Aplica-se a amostras de água e de gelo usados em estabelecimentos produtores de alimentos. O valor é obtido em NMP/100mL.

Pesquisa de coliformes: método em placas.Amostra: açúcar cristal, morango, coxinha e

hambúrguer

Ágar cristal violeta (VRBA) sais biliares e cristal violeta que inibem Gram+; Vermelho neutro (indicador)- revela a fermentação da lactose.

Bile bovina e corante verde brilhante que inibem Gram+.

Sais biliares – inibem Gram+; Mistura de fosfatos– impedem a acidificação do meio.

Eosina e azul de metileno são corantes inibidores de Gram +. Com a fermentação da lactose e produção de ácido, ocorre precipitação desses corantes que fornecem o brilho verde metálico característico da E. coli.

Caldo verde brilhante bile 2% lactose

Caldo EC

Ágar eosina azul de metileno (EMB)

45C°/24 a 48h

Plaqueamento sobrecamada

Prova confirmativa para coliformes totais

Prova presuntivapara coliformes totais

Prova confirmativa para coliformes termotolerantes

Em posição invertida

Cada colônia para um caldo verde brilhante

Para cada tubo positivo no caldo verde brilhante passar para um tubo de caldo EC

Selecionar 3 colônias típicas e 3 atípicas para investigar

15 mL

Caracterização da E. coli

De cada tubo EC positivo

Técnica de esgotamento – por estrias

Expressão dos resultadosR =(C x c x d)/r R = Resultado C = número de colônias contadas c = número de colônias confirmadas r = número de colônias repicadas d = diluição utilizada

Resultado final= Rt (colônias típicas) + Ra (colônias atípicas)

Exemplo de resultado finalDiluição 10-2 = 30 colônias contadas, das quais 20 eram típicas e 10

atípicas.

Para confirmação, foram repicadas 5 colônias de cada tipo. Quatro colônias típicas e duas atípicas apresentaram resultado positivo nos

testes confirmativos. Aplicando-se a fórmula, teremos para colônias típicas: RT = 20 x 4 x 100/5 = 1.600

Aplicando-se a fórmula, teremos para colônias atípicas: RA = 10 x 2 x 100/5 = 400

O resultado final será igual à soma das colônias típicas e atípicas confirmadas:

Resultado final = RT + RA = 1600 + 400 = 2000 = 2,0 x 103 UFC/g ou mL.

Exemplo de resultado finalDiluição 10-2 = 30 colônias contadas, das quais 20 eram típicas e 10

atípicas.

Para confirmação, foram repicadas 5 colônias de cada tipo. Quatro colônias típicas e duas atípicas apresentaram resultado positivo nos

testes confirmativos. Aplicando-se a fórmula, teremos para colônias típicas: RT = ?

Aplicando-se a fórmula, teremos para colônias atípicas: RA = ?

O resultado final será igual à soma das colônias típicas e atípicas confirmadas:

Resultado final = RT + RA = ????????????? UFC/g ou mL.

Exercício1. Na placa de VRBA e diluição 10-2 = 20 colônias contadas,

das quais 15 eram típicas e 5 atípicas; Para confirmação, foram repicadas 3 colônias de cada tipo para tubos verde brilhante e depois para tubos EC;

2. Todos os tubos de caldo verde brilhante repicados deram positivos para a confirmação de coliformes totais;

3. Para confirmação de coliformes termotolerantes, obtiveram-se dos 3 tubos repicados de colônias típicas, 2 positivos; e das 3 atípicas repicadas, 1 positiva.

4. Na pesquisa de E. coli, dos 3 tubos EC repicados (tanto de típicas quanto atípicas), 1 placa EMB típico deu positivo e 1 atípico positivo.

Diante destes resultados, pergunta-se:

 1. Qual o valor para coliformes a 35°C?

 2. Qual o valor para coliformes a 45°C?

3. Qual o valor de E. coli/mL?

Pesquisa de coliformes: Número mais provável (NMP)

Amostra: leite em pó, leite pasteurizado, água, açúcar refinado

NMPTécnica do número mais provável ou técnica dos

tubos múltiplos- estimativa da quantidade de Mo presentes na amostra;

Pelo número de tubos positivos em cada uma das diluições empregada determina-se o Número Mais Provável por grama de produto, tendo como base a tabela estatística de Hoskins para três, cinco ou dez tubos;

Por esta técnica pode-se obter informações sobre a população presuntiva de coliformes (teste presuntivo), sobre a população real de coliformes (teste confirmativo) e sobre a população de coliformes de origem fecal (coliformes termotolerantes)

NMPa) Teste presuntivo para coliformes totais–

visa detectar a presença de microrganismos fermentadores de lactose. Meio utilizado: lauril sulfato triptose. Princípio: turvamento e produção de gás, evidenciado pelo tubo de Durham.

b) Teste confirmativo para coliformes totais-meio caldo verde brilhante lactose Bile 2%. Princípio: turvamento e produção de gás por bactérias gram negativas, características do grupo coliforme.

c)Teste confirmativo para coliformes termotolerantes- utilização do meio de cultura seletivo “Caldo EC” e incubação em 44-45ºC. Princípio: turvamento e produção de gás, evidenciado pelo tubo de Durham.

c) Teste completo para pesquisa de E. coli - provas bioquímicas.

Poder tamponante

Inibe Gram+

Inibem Gram+

Inibe Gram+

NMP – série 3 tubos

Para cada EC+, um EMB

2 colônias caract. de cada EMB em tubo de AN

NMP – série 3 tubos (leite)

Para cada EC+, um EMB

2 colônias caract. de cada EMB em tubo de AN

De cada tubo AN

Exemplo

10-1

10-2

10-3

Tubos positivos

3

3

1

Em todos os tubos e Em todos os tubos e placas de TODAS as placas de TODAS as etapas, identificar o etapas, identificar o número da equipenúmero da equipe, o , o nome da amostra nome da amostra e o e o mais importante a mais importante a DILUIÇÃO que está ou DILUIÇÃO que está ou a DILUIÇÃO a DILUIÇÃO precedente !!!!!precedente !!!!!

Combinação tubos positivos 3:3:1 = 460 UFC/g ou mL, com 95% probabilidade de estar entre 90 e 2000 UFC/g ou mL

A tabela a ser consultada deverá ser a que oferece resultados de NMP para inóculos de 0,1, 0,01 e 0,001 g ou mL.

OBS: Para obter o NMP/g ou mL, para séries de 3 tubos, com inóculos de 1,0, 0,1 e 0,01 g ou mL, e respectivos intervalos de confiança 95%, dividir por 10 os valores da Tabela 1 correspondente ao arranjo de tubos positivos obtido na análise.

NMP- água e gelo

Quando o limite de aceitação for <2,0/100mL, usar série de 5 tubos.

Quando o limite de aceitação for <1,0/100mL, usar série de 10 tubos.

Caracterização da E. coli

De cada tubo EC positivo

Técnica de esgotamento – por estrias

Padrões microbiólógicosProduto Tolerânc

ia para amostra indicativa – Coliformes Totais ou a 35°C

Tolerância para amostra indicativa – Coliformes Termotolerantes ou a 45°C

Legislação Técnica a ser utilizada

Água para consumo humano

Ausência em 100mL

Ausência em 100mL

Portaria 518, 2004

NMP – série de 10 tubos

Leite pasteurizado C

4NMP/mL 2NMP/mL IN 51, 2002 NMP – série de 3 tubos- amostra pura

Leite em pó - 10NMP/g RDC 12, 2001

NMP – série 3 tubos- amostra diluída

Açúcar cristal - 102UFC/g RDC 12, 2001

Plaqueamento

Fonte: MADIGAN; MARTINKO; PARKER, 2004

1. Prova do Indol;2. Vermelho de metila-VM;3. Voges-Proskauer-VP;4. Citrato.

Testes bioquímicos para coliformes- identificação da E.

coli

1. Prova do IndolTriptofano triptofanase Indol + ácido pirúvico +

amônia desaminação

+ p-dimetilaminobenzaldeído +HCl + álcool (reativo de Kovacs)

Composto quinoidal (vermelho)CH2 do anel pirrólico da molécula do indol + o aldeído em meio ácido=

quinona

2. Vermelho de metila-VM

ácido láctico ácido acéticoGlicose fermentação ácido fórmico ácido mista ácido succínico

ácido etílicoINDICADOR:Vermelho de metila – escala de 4,4 a 6,0.pH 4,4 cor vermelha - prova positivapH 6,0 cor amarela (acetoína) - prova

negativa

3. Voges-Proskauer-VP Glicose

2 ác. pirúvico

descarboxilação

Acetilmetilcarbinol + ∝-naftol +KOH 40% Diacetila

(acetoína)

Diacetila + núcleo guanidina do ∝-naftol condensação Composto Vermelho

OBS .: cor cobre é resultado negativo

Agente oxidante

Catalisador

Fermentação butilenoglicol

4. Citrato

ciclo de KrebsCitrato citratase ciclo da fermentação do citrato

Citrato piruvato + CO2

CO2 + sódio carbonato de sódio

Amônia como

fonte de N

pH alto

Indicador de pH: azul de bromotimol

pH 8,4=coloração azul-da-prússiapH 6,9= coloração verdepH 6,0= coloração amarela;

Próxima semana: prova prática de bolores e leveduras1. Imprimir roteiro de prova;2. Estudar o roteiro, dúvidas tirar no horário

de PA;3. Cuidar com técnica e diluição.4. Trazer os materiais abaixo para prova:

Equipe 1

Equipe 2 Equipe 3 Equipe 4

AMOSTRASQueijo ralado

Geléia (a granel

de preferência)

Papinha infantil de

fruta

Doce de abobóra a

granel

Legislação Port. 357/97

RDC 12, 2001RDC 12,

2001

RDC 12, 2001

Padrão microbiológi

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