Nucleic acid amplification technology methods used in blood donor screening

Preview:

Citation preview

������ ������

�� ��� ���� ��� ��������� ������ ��� ������� ���� �� � ���

����� ����������� �� ����! ��� "� �� #�����$� ���������� � � ����� ���� ���� �� � ���� �� ������ ��� ��� ����� ��� � �����

��� � ��� !�� �"� ��������� �� �� �� � � #��� ��� $�� ������ � ��� %�� � � �� $�� �������� ��&� �� ���������� � !�'�����

��� � �� � ���� �� � ��� �� �� �� ���� ��� �#� ��#

#������� �� � '� ��� () * � +,,+

#��% �&'(

)�������� ��� � ��� ���� � ��� ���� ����� ���*��� ��+��� ���������� ��������� � ������� ��� ��������� �������������,����������� ���������� -���. �+�� ��� ����/ �������� 0�1�+��$ ����� ������� � ������ ���1������ ����� ����� �������� ��� ��� ��+� ������ ���������� � ���� ����� ���*���$ *��1� �� ��� 2����,������+� 1����1 �����3 �� ���������� ��� ��������,��+� 1����1 ����� ��� ��������� � +���� -0��. 1����������� �� �+����� 45 ���� ��� ������,������������6��� ������������ -����. -)�������� �� ���$ 7889.��� 1�� ������� �� �����:����� � 99 ���� ��� �����,���������� ���� -#������ �� ���$ 788;< )� ��� =#������$ 7888.� 0�������� # +���� -0#�. ��� ��������������������� +���� -0��. ��+� 1����1 ������ �������:����� � ;8 ��� 55 ����$ ��������+� � -)���������� ���$ 7889.� ����� �� +��� ��������� �� �������� 1�������+�� � ��� �� � ��� �������� ���� ������ �� ���1����1 ����� �� ��������� ��+� ���� ����������-�� ������ �� ���$ 7888< ��� �� ���$ 5>>>.� ����$�+�� 1��� ���������� ���� ����� ��������� ����� ��������� ���������� ���* -#���� �� ���$ 7885< �� ����$7885< #���� �� ���$ 788?�.� ���� ���* ��� �� ����������� ����� ����� �� ����� 1����1 ����� ��������� 1���+��� ���*�� ��������� ����� �� ������ -% ������ =#����$ 5>>>.� ��� ������� ���* �� 0��,������+���������� ����� ���������� 1��� ������� ���� ����� ��������� 1�� ��������� �� �� 7 �� 7>/ >>> ����������� ��� ') -)�������� �� ���$ 7889.$ 7 �� 5>> >>> ����,����� �� ������ -%������ �� ���$ 7884. ��� 7 ��5;> >>> ��������� �� '% -)���� = @ ������$ 7884.����*� �� 0�� ������������ �� ��������,������+�� ��� ������������ �� ��+� ����� ��������� ��� �� ���

����� �� 7 ��� 7A5�� ��� �����$ 1������ ��� ���* ���:������ �� 0#� ���������� � ��� �� ������$ �� �������� �� 7 �� 7>> >>>$ �1��� �� ��� ��� ����� 1����1����� ��������� ��� ��+� ������ �� ��������� #������� ������� -0#���. -)�������� �� ���$ 7889<% ������ = #����$ 5>>>.���� � ������� ����� ��+����,������������� �� ����,

��� ����� �������� -��,���. ������ �� ����� ���� ������ ����,����������� ��������� ����� ���1�� ����0�� �� ��� � �� �������� �� � ���� �� �� �+������� 7>A75 ���� ����� ��������� -#���� �� ���$ 788?�.�)������ �� ���� �� ���� �������� �������� �� ����,���* ������� ���������� 0�� �� �� ����� 77 ��������� ���������$ 1������ 0#� (� ��� � ��� ���������� ���� 5>A/> ���� ����� ��������� -)���������� ���$ 7889.� ��� ���� -�����:����� � ;>���. ����������� ��� 0�� 1����1 ����� �� ��� �+�� ���� ����� ������� ��������� ���� ��� ��� ���� ��� ��������������� ��� -��. ��������� �� ������ 1�� � ��+���� �������� ������� ��� ���� +����$ � ���������� �������� �� �����B���� �:�������� 1��� ���������+� ������������ �� �� ��������� �� ���� ���� ��� ���� +��������� �� ���� ���1��� ��� �:������ ������ �� �����,���� ��� ��� �������� �� �������� � +���� �� ������������ � ���$ �+�� 1�� �� ����� ���� � �������+��� ������� ���� ������ �� *��1� �� ��� 2�� ���������3$ ��� �� �1��� �� ��� ��� � ��� ������� �� ���+���� �� ������ ������ ���� �� ���� ����� ��� �+��$ ����� �� �������� ������������� �� ��� +������ ��� � ��� ������� ������ �+������ ���� 0��,7��������� ������� �� �� ����� ���� ��� ������������� � ��� ���� � ����� �� ��� ���,�� �� ��������� �� ��������� ��� ��� �� ���������� -"������� ���$ 7888.� �����B���� �$ � ������ �� ���������� ��� �� �� � �� ���� ��� � � ��� ��� ����������1����1 -1���� ������ �� ��� ���� �� �:������.$���� ������ ��� ��� �� �� � �� � ��� ��� ����������1����1 ������ ���� �� ������� �� � ��� ������� 0�1�+��$���� ��� 1� ��B���� +��� ���� �������+��� �� �������$

��������������C ��� �� ����$ (��������� �� ���� ���$ ����

@��� ��� '��+������ �� ��� "����� )���� $ ��� ��������

���������$ D9 � �+� ��� )�����$ ����� �7� DE@$ '%�

�,��� C ��� ������F�� �����*

����� � ��� � �$ 5>>5$ ��$ 558A5D5

� 5>>5 # ��*1� )������ 558

��� ������ � ��� ������� �� ����+���� ���� �� ���������� ����,��� � -)����� �� �� ���$ 5>>>.���� ��� �� �� ��� � ��� ��������� 1�� �����

����� � ���������� ����� ������� �� @��� ��� (����������������� -@(�. �� ��+��� ����� �� 0����������� ���� ���� ���� ��� ��� �� �� �����+������������ ��� �� ����������� �� �� 2 ��������3������������ �� #�:��� 0�� ������ �����������-�(�$ 788D.� #�:��� 1������1 �������� ������� ���*�� �� @������� 5/$ 788D� ��� �����������1�� ���� ����� �� ������� 0�� �� ��� 1�� 0����������,������+� - �������$ 7889.� ��� ��* ���������� �� ��� #�:��� ��� � ������ � ����������� �:��� ��� ��� ��+� �������� ��� �������������� 0�� ������ �������������� "��� �������������������� ��+� +������ +��� ������+����� �����$ ������ �� +��� ��������� ���������$ �� ����� �����������$1���� ��� ����� � �� ���������� ��+� ���� +���������� �� 0�� ��� 0��,7 ��� ,5< ��1�+��$ ��� ��� ������+����� ������� ��� �� �������� ���� �� �������� ��� ��� ��� �� ����� ������ ���������� ������� �� ��� ') @(�3� ������ �� #�� �����

�+� ������ ��� �������� -�#��. �� ����� ��� ���B�������� ���� � �������� �������� ������������1������ � +���� ������+����� ��������� ���� � �������� ��� ��� �������� �� 0�� �� ������ �� �������� �������� ���� ����� ���������$ ��� ����������������� ��� ����������� "������� ��������-��"�.$ �� �1�� ���� �� 788; 1��� � ����� ��� ���0�� �� ������� �� ��� � ���� ��� ������������������� ��� �������� ������������ 1������ ������ �� � +���� ������+����� ��������� -��"�$ 788;.����� ��"� �:������ ���� ����� ��� �� ��� �� ������ � � ����,����+�� �������� ��������$ �������+����������� ��� �������� '���� ���� E� � 7$ 7888-��"�$ 7884.� ��� ��"� ����� ��� ��B����� ��� ����� � ��� ������ �� 7>> ��� � 0�� �� &�����6�����-�0&. ������������ ����� ��� �� � ���� -�'��7.<��� �� ����� �� �� ���������� +� �� ���� ������ �������� ������+�� ���� �������+��� ��B�������� �� ���� ����� ����� ���� �� ���� ��� ������������� ����� ��� $1���� ��� ������� ��������� �� � ���� ����������0�1�+��$ ��"� ������ � ����������� ���������� �� ����,��� � ������ ��� ����� ���������������� �� ����$ �� �+��� � ���� 1������ ���� � �+������� �� ������������������ �$ ��� ��+� ������ �� �������+� ��

������� ��� ��B����� ���� � ��+� ������ �� �����,������ ���������� ��� �0& �������� ��� 0�� ��1�� ����� ����� �� 788? ����� � �� �������+� ����� ������� ��� ������� ��� �� ����� ��������� ������� � 1������������� �� ��� ������ ��������� ��� #�� ����� )�������� ��� ������ -�#)�$ '%. -)� ������� ���$ 7888.� ��� �0& 0�� �� ������������

�������� -���� 89G?8>. �������� � ����� �6�� ����,������� �� 0�� �������� 7 �� 7>> >>> �'��7� �������������� ���� ��� ���� ���1� �� �� �B��+� ��� �������:����� � 5A9 ������ �B��+� ����$ ��������� ����� ����� ���� -)� ����� �� ���$ 5>>>.� ��� �0&������������ ��������� ��+� ��1 � �� ���� �����, ����� ��� 0��,7 �� -0� ��� �� ���$ 5>>7.$ 0#�(� -)� ����� �� ���$ 5>>7. ��� ���+�+���� #78(� -)� ����� �� ���$ 5>>5.���� ��B�������� ������ �� ��"� �� 7884 ��� ���

��+��� ��� ����������� �� �� � �� ����������� 0�1,�+��$ � ���� ��� ������������� ��� � �� ����+�������� ��� ���� ��������� ���� 1���� �� � �� ������,���� 1�� � �� ����������� ���� ��+� ���� �� ������ �������� �+�� �� ������ � ���� �������� ��� ��� �� , � �� ���������� �� ��� ����� �� ��� �� ���� ��� �� �� ���� ��������� ��+� ����� ��� ��� ���������� ��������� ���������� ��� �� � �� �������������� ��� ����������� -���� �����=������*$ 5>>5.� ������� ������� � �� � ��� ������� 1����� ��� ��������'���� ��� �� ������� �� � ��� ���������� ����� ����$ 1���� �� ���� ��� ��� ��� ��� ���������-���. �� ������ �� 7884 -���$ 7884.� ���� ��B������ ��� �� ��� ��� �� ���������� �� ��+� � +� ��������+� �� ���� ��� 0�� �� ������ �� ������� � �� ������ ���� ��� �������+��� �� ��� ���� ���� ������ �B��+� ��� �� ;>>> �'��7 ��� ��������� ��������� ���� �� ��� � ���� ���� �� ��� ��� �� �������������$ ��� �� ����� �� ��� ������+� �������� ���� ����*�� ���� �������$ ���� �� ���� � ��� �� 7>> � �������� ��$ ��� ����� �������+��� ���� �� �� ����;> �'��7� ��� ') @(� ������� ��� �� ������� ��������� -������ ������� ���������. ��� ������������ �� ������ � ���� �� 5>>7$ ��� ������� � ������� ������ ��� ����,��� ��������� �� 1�� � � �����+� ���� �� ������ ��� ������� �� ��� � 5>>5����������� �$ @(� ������ � ����� ����������������$ ���������� ���� �� ������ ��� 0����� 0�� �� 1� �� �������� 9������ ����� ������ ������� �� ���� �������� ���������� ����� ����,���� ��������� ������� �������+��� ��B��������� ���B�� ��� ������ �:���������� �� ���� �� �� �������������� ����� ����������� �� ����� ��������� ��� �� ���������� �� ��+� ����� ���� �� ���� �������

�� "��0&()

��� +������ �� ������� ��+� ����� ����� �� ���,���C -7. ���� � �����������$ ��� ����� +��� ������,������� ��� ��� ��� ���� �:��������< -5. ��� ����������� ��� ������ (� �� ��< ��� -/. ��������� �� ������ ����� �������� ��� +������ �:�������� ������������� � ��+� � +��� ���� ���� �� 1���� ��� ����������� �� ��� +���� �� ��������� ��� ��� ��� ��� ����

5/> %& �& -��� �� �& %& $ ���

� 5>>5 # ��*1� )������ ��$ ����� � ��� � �$ ��$ 558A5D5

�� ������ ��� +��� ��� ��� ���� �� ���� ���������� ���������� ������� �� �������� �� ��������B�����,�������� ����� ������� ������� �� ���,�������� ������� �� ��� ��� ����� �� �� ��� ������ ���&��� ��� ��� ��� ���� �� �������� �� ���� 1��$ ��� ���� ������ ��� ����� ���������� ��� 1����� �1����� ��� ��� ��� ���� �� ������������ ���� �� �1� ��������� ��� ��������� �� ��� �� ��� ��+��� ����������� 1� �� ��������� ����� ������ �$ ����� 1� ���,����� �� �� � �� ���,�� � ��� ��������� �� ��� ��������� ��� ���� ��B�����$ ���� ��� ��� ��������� �� 7> ����1�� ������ �� +��� ��� ��� ���� �� ��� �������� ���,� �� ��� ��� ����� ��B������ ��� ���� �� ���������� � +������ �� ������� ��� ����� ���$ ����� ����,������ �� � ��������� ������ ������ ��� ��H����� ��������� ������� ��� ��� ������� � ���� � ������*� �� +������ ��������� ������ ��� 1�� � ������ ��� ����� 0�� �� ��������� �� � ��� �������������� ��� ��������� �� �1�

%��.'���� ���� � ��� ������

��� 1�� ��� ����� ��� ��������� ������ ��+������� �� ��� ��� ���� +������ � ��� 1��� � ���� ��������B�� -@��� 7.� ��� ��� �� ���� �� ��� ��� ���(� ��B������ �� +������ ������ � -&� �� ���$ 7844<��6� �� ���$ 7844.< ��1�+��$ ��� ��� ��������� ���� +������ ���� �� 0��$ � �� ���� ���� �� ������ �������� ���� �������� (� -�(�. ��B�����- ����� �� ���$ 788>.� ������ (� �� �(��� ��� �� ��� ��������� ���� ���� � ������� ��������� ��� �������� ��:���� �� ������ 8D ��$ ������ ����������� �� ���� ������� �� � �1 ���������� ������ ������ �������$ ���� �������� �� ��� ������ ��������$ �� ���� �� ���� �� ��� ���� �,��������(� �� ��� ��� ��� ����������� �� ���� ������ ����� ������� ��� ������ �:������� �� � ���������� �(� �� �������$ ������� � ����+�� ���� � ������������ �+�� �� ��� ��� � ������� � � �/ �� � � -��/�� ������� A "� �� = @� ����$ 784?.� �1� ����������� ������� �� ��� ����� ��� ��������� ���������� ���� �� ���� ��� ���� �������� ��B����� �� ��������� (�� #� ��� ��� ��� ����������� ���1���������������$ ������ ����� ��� ��� �:������� �����/> ����� �� ����$ � ������� ���� 7>8,�� � ��� ����������� ��� ������ ��B����� ��� �� �����+��� ��� ��� �������B������ -��� �����. ��� �� �������� �� � ������ ��������� ���� �� +���� �6����� 1��� �������� ��������� �� ������� �� �� �� ����� ��B�����,�������������� ��� �� 1��� ���������+� �� ����� �������������� �� 1��� ��6���� 1���� ��� ���� ��� �� ��� �������� ���� ���������� ��������������� "� ��� �� )������$ ���� -� ��������$ ��$

')�.$ 1���� ��������� ��� ������ �� ��� ����

����� �� 7887$ ��� ��+� ���� ��������� ������ ������ ��������� ��� �� B������������� �� ��+��� +�������� ��������� � ��� ������� ��� �� �$ � ���� ������� � ���� -I���� �� ���$ 788/< ���� ��* �� ���$ 788?< ��*�� �� ���$ 7884< ��� �� ���$ 7884< )�� �� ���$7884.� ���� ����� �� ����� � �� ��������� �� ��1 ��7A7>> �� ��� �� �� ������ (� �� �� �� ������������ ���� � +� ���$ ��� ���� ���� ���������� ������ �� ������+�� ��B������ �� ��� �� ����+��� ����� �� ������ ��� ��������� �� ���� *��1�+�������� ��� �+��� ����� ����� ��� ��� ����������������� �� ����� ������ ����� ���� 5 �� D ���� ��������� ��� ��������� ��� ��������� ����������-�����. ��+� ���� �� ����� �� ������� � �������� ���� �� ��� ') ��� 1�� �1��� ��� ����������� �� ��� �� ���� �� ���� � ��� ������-��� �� �1.� )�+��� ���� ��������� �������������+� ��+� ���� ��,����� ���,����� �� ��������������� 1���� ��� ������� � ���� �� ��� � ���� �����,��� 1���� ����� �� �� ���� � ��� �� ���� �� ��� ��� � �� �������� �� ��� ������� �

���� #��� ��

�� ��� ��� ���� 0�� ��� 0�� ����� -I���� �� ���$788/.$ � ���� ���� �� ��� ����� �� � ���� �� ��������������� ��� ���������� �� � ��������� ������������� �� ���� ��� +��� �� �� ���������� �� ��� ������������ &��� ��� ��� ��� ���� �� �� �����$ �� �� �������,����� 1��� ���������� ��� ����������� ���� � �� ��$1���� �� ���� 1����� ��� ����������� �� ���������� ����� �� ������� ������ -��. �� ����� 1��� ��� ���� �� ������ ���� �� �� �� � �� �� ����������1��� ��� ���� ������,������� ����� �� ��� 0����B�����$ ���������� � ������� �� ���� �� ����� ���1��� � �������� ������� ������$ 1���� �� �������6���� ��� �� ����� �� ��� ��������� ����� -������������� ���$ 7884�.� ��� ������ +��� ��� �� ��B������ ������ ����� �� ��,��� ����� ����������� ����� �������� � � �� ������� -���� �� . A ���� ��6��� ����������� �� ����+��� �� ��� �������� �� ���������-"���� = � ����$ 7887.$ � �1��� ���� ��� �� ������ ����� �� ����� 1����� � ���� � ����� &�� �� ���������� �� ������� ���� �� ���� � ��� ��������� ����� ����� ��������� ��� ��� ���� ������ 1� �����,��� ��� ��� ����� ���� ���+���� ��������� �1����� ��� ��� �� ����� -������ ���� ���������. �� ������ �������� �� ����� ,0,� ����� ��� -' . �� ��������� �������� ��: -���� �� ���$ 788>.< ' 1� ������� ���:��������,���������� ��� ���� ��� ��������� ���+���� ���������$ ���� ���+������ �����,�+����������������(����� ��� ��������� ���������$ ��� ������� ����

������� �� ��� +��� ��� �� ��� ����� ���� �� �����

0#� ������ '�� �� ����� � 5/7

� 5>>5 # ��*1� )������ ��$ ����� � ��� � �$ ��$ 558A5D5

��B������ ������ ���� ��� 1� � �� � 89,1� �����,1� � ��� -"��.� �� �+����A����������� ����:��������H����� �� �����$ 1���� ����� �� ��� ������ �� ������ ����$ ��� ��� ����������� ����:����� �� ���������� ��� �������� �� �������� ����:��� ��� /$/�$;$;�,���������� ���6����� -�"#.� �� ��� �������� ���������� ����:���$ ����������� ����:����� ���� ������� �:������� �� �"# �� ���� � �� ����� ���� �:���� �������� �� ������� �� ��� �������� �� �� ����������$ ��� ��� ������ ������� �� D;> �� �� �������� ��� ��������������������� ��� ��������� ��� ��������� ����� �� ��� 0��

��� 0�� ��� ���� ������ ��� �� ��������� �������� ����� ��� ���� ��� ���� -(�(������� �� ���$7889.� ���� ���������� �������� �1� ������ ��� ��

� ��*�$ � ��:�� ����������� ������� � ��*$ � 1���������� ��� � ������������������ ��� ������������� � ���� � ����� 1���� �� ���� �� �������� ��� �������� ��������� ��� ������� ����� �� ������ ������������ ����� �� ���� ���� ��� �� ������ �6�� ��� ������$ 1�� �� ��� ���� �� ����� 1��������� �������+��� �� ��� ������� +������� �� ��� ��� ����

0�� ��� 0�� ������ �� B����� �� ;> �'��7 -8;���������� ����.$ ��� ����� �� �B�� ��������� �� *��1�0�� �������� ���0�� ��������� 7A; -�� �� ���$ 5>>>.�

���� #��� �����

��� ����� ��� �)����� 0�� +5�>$ 0��,7 +7�; ���0#� ������ ��� B�� �����+� ����� ��� 0�� ��� 0��,7

(1) Double-stranded DNA target

(2) Temperature is raised to 94 °C to denaturestrands

(3) Temperature is lowered to around 50–60°Cto allow primers to bind

(4) Temperature is raised to 72°C – optimal forstrand extension by polymeraseTaq

(5) The process is then repeated, giving a twofold amplification per cycle

Key:

Taq polymeraseTaqTarget

Primer

Taq

Taq

���� �� �� ������� ����� �������� -���.�

5/5 %& �& -��� �� �& %& $ ���

� 5>>5 # ��*1� )������ ��$ ����� � ��� � �$ ��$ 558A5D5

�� ��� 0#� (� �� � ����� ����� ������ ������� �� �� ��� 0�� ��� ���� +5�> ��� ��� 0��,7"������ +7�; ������ -����������� �� ���$ 7884�.$ ������ �������� ��������� � ��� � ��� ��������� ���,������ ����� ��� ��������� � ����� ���� � �� ����� ������ ����������� �� ��� �)����� 1��� ���� 1���� ���� ��� � �� 5D ��������� ����� � +� ������ ��� ,��� ��������� ����� �� ��������� ������� ��� �����+��� �� ��� ���� �� ��� ������������� � ������+�5D,�������� ������� ��� �� ���� +�� �� ����� ����������� ��������� ��� � �� ��: ��������� ����$ ��� ����������� ��� ��: ����+���� ��������� -�(�. �� � ������+���������� ��� � ��� ����� ��� �1� ����� ���� ����������� ����������C ��� "� ������ ���������$���� ��� ������� ������� ��� ��������� � ������� �$ ��� ��� )������� ���� ���������$ ���� ���������� ����+���� ����� ���� ��� ��� "� ��������������� ��� ��� � ����,����� �������������� ������������ �� �� �� ��� +��� ������ �� ���� ��� ���� ������� +��� ����� ��� ���� � ����������� ����������� �������� � 1��� 0��$ 0��,7 ��� 0#� -)�� �� ���$7888.$ ��� ����� ��B���� ��������� ��� ��������� ������������ *��� �� ��� ����� �� ��� �� ��� �:� ������ ����� �������+����� �� ��� ��� �)����� ������ ���5; �'��7 ��� 0�� +5�> -)�� �� ���$ 7888< )���� ���$ 5>>>. ��� 5; ��������7 ��� 0��,7 +7�;-)�� �� ���$ 7888< I��� �� ���$ 7888.� )�+��� ��������+� ������� ��� ��� �)����� ����� �� ������� ����� ����� � ���� ��� � 1��� �������� � ���+�� �������� �������+���� ����� ������������� ��+� +������� � �������������� ���� �� ����������� +��� ���,��� �� ���� ���� ����� +� ����$ ��� �� ������ ����������������� ���� �� �� ��� ���������� �����$ �� ��� ����������� � �+�� �� � ��������� �:�������� �������-J����� �� �� �)��� �:��������.�

����.� �� %��

����� ��� � �� ��+� ���� � ������ ��� ��� �����$�����,����� ��������� �� ��� ����� ��������$ �� ������� ��������� �� ��� ��� �������� ����� ��������B"�� ���$ ��� ������ �� ����� �� ��� ������� ��� ���*,����� ����� ��� 1��� � ��������� ������ -���� ���$ 788/.� �1� � ��������� ���� -� ��������� ���� � ���������. ��� ����:�� �� ���� � ������ ������������ � ������ ��� �1� ���� ��� �������� �� ��������$ ��������� -���������� ��� B�������. ���������� 2�:����� �����3 ������ �� ��� � ��������� -�����������.� 0�1�+��$ �� ��� ����� ����� � �� � ��������B����� -������ ��� ������� ������ �� �� ��� ����.$�� �� �����B���� � � ��+�� �� ��� ;��/�,�:���� ��������+��� �� ��B (� �� ������� ������ ���-0� ��� �� ���$ 7887.� �� ��� �������$ ��� ���� �����,���$ 1���� � �1� �� �������� �� �������� ��� ��������

�� ���������� �� ��� �������� ���� ������� �� �� ��,� � � ��������� ���� ��� �+�� �� � �� ���������$ ������,��� � ��� �� ������ ��� �� ���� �� ������ �����������B������ �� � ���� � �� ��� �: ��������� ����� ������ ��� #��������� -@����� ����$ ��$ ')�. ��+����� ��+� ���� ����������� ���� ������ ����� �� ��� �� ��������� ��� ��������� ���� ������� �� �����+������ �� ����� ������� �� ���� ��� ��������� ������������ �� ��� ��� ���� ��� �� � ������������ ����� �� � � ���� ����$ ������6��� ��� ������� ����� ������������� �� ����� ���� �� �� ��� ������� +�������� �� �� *������ ��� -*���. ��� � ������ ��+� ���� 1���� �� ����� �� ��� ������� ������� �������� ������� �� ����� ����� ���� -��� ���� ������ ��� �������� ����. ���� ��� ���� �,��������(� ���� ������ ���� ������ ���� ��� ��� �-0������ �� ���$ 788/.� ���� ���� �� �� �:�������� ����������� � ���������� �� ��� ����$ 1���� ���� � ���� ������� ��������� ��� ��� �� ��������� ����� ����� ��B"�� ��� *��� ������ ��� ����������� �� � ��� ��������� ��+� ���� ��+� ������� ��� ������� �� ��+��� ���������$ ��� � �� ���������� ��� ,���� ��� ������ �� ����� ��+� �������� ����� �� ������� �( �� ����������

������ �� .'���� ���� � ��� ������

�������������,�������� ��� ��������� -�"�. ������ ��� ���� ��B�����,����� ��� ��������� -�)#�.��� ���� �� ������B��� ��+� +��� � ���,����$ �������,�� ��� ��������� �������� ���� ��� �6�� � ������������� � �� �� ��� �� ������������� �� ��� ����� ����� ������� �� �������� �� ��� ���� ����������B����� �� ��� ������ ��������$ ������� ���������� �������� ��B����� ��� �� �� �� ����������� ������ �� �� �(� ���� �� �� �� �1�� ������ ���������$ 1���� �������� ��� ������ �������� ��� ������� �(� ��������� �� �������$ � ��,���� � ���������� ��� �: �(�� �� �� ����������� ����� �� ��� �������� ��B����� ��� �������������������� ��$ 1���� ���+�� �� � ������ ��� �������������6�����$ ������ �� � ������ ��� � �� �(����������$ �� ����������� ��� ������,�������(� ����������

��#

��� �"� 0��G0�� ����� 1�� ��+� ���� �� ��,�����$ ���� -)�� (����$ ��$ ')�. -"�(������ �� ���$7884. ��� �� ����������� �� ��� ���� ��:�" 0��,7G0�� ����� �� ������ ����������� -�����+� �$��$ ')�.� ���� ����� ���� �������� ����������� �,�������� � ���,������� �� �:����� 0�� ��� 0��,7�� ���� ;>> � �� � ����< �� �� �� � �� ��� ����

0#� ������ '�� �� ����� � 5//

� 5>>5 # ��*1� )������ ��$ ����� � ��� � �$ ��$ 558A5D5

�� ��� �� ��� ����� ������ ������ ���� � �� ���,�� � ��� ��������� �� �����+�� ����� ��������� ���������� ����� ��� �������3� �������� �"������� ���� �� ���� ������$ �� � �1� ��6����$ ��+����������������� ��� �� �� �������$ ��� ����� �� ����������� ��:���� -@��� 5.� ��� ������ ��B������ ��������� �� ��+���� ������������� �� ������� � ����,��������� ���� �:� ��� ������������� ���� �: �� ������ ��*� �������� �� ����������� �� ��� ��B�����$��� ��� ������� ������� ����,���� ����� �� ������������ �� ��� ����� ������� �� �����+�� �� ������,�6����� ���������� ����� -0��. ������ ��� -���� ��� ���$ 7848.$ 1������ ������ ��� �� 1��� ��������������� ��� ����� �� ��� ��� ��������� ��������� � �� ��,

���� ������� �� ���� ����� �� ����������� � ����� ������ ��� ���������� 1��� ��� ���������6�� �����$��� ����� ����������� �� ��� �������6�� ����� ���������� �� �1��� ��� �������� �� ����:��� ���� *� �� ��� �������� *������� ������ ���1��� ��� �����,����� ������ �� ��� ������ ��� �� ������ �� ������ �������� � ����� � ��� �� ���� ��� ��� �������������� � ����� � �1� �� ���� 1��$ ��� ������ ����� ��� �� ������������� �� ��� ���� ���� -� ����� ���$ 7889.� � 1��� ����� �� ��������� �� ��� ������ �������� �������� +���� � ��� ��B�����$ ������6��������,�+�� �������������� ��,����� ��� ��� ��������� ������� ������

����������� ��+� ��+� ���� � ����,���������

(1) A primer with a T7 promoter sequenceattached anneals to the RNA template

(2) This primes cDNA synthesis using reversetranscriptase enzyme

(3) RNA is then degraded with RNAse Hactivity of the reverse transcriptase to leave asingle strand of DNA which includes the T7promoter sequence

(4) A second primer is annealed, and secondstrand cDNA is created

(5) Double-stranded DNA containing the T7promoter

(6) The T7 RNA polymerase enzyme generates100–1000 RNA copies from the DNAtemplate which go through the process again

RNAPrimerT7 promotercDNA

Reversetranscriptase

T7 RNApolymerase

RT

pol

Key:

RT

RT

RT

pol

���� �� �������������,�������� ��� ��������� -�"�.�

5/D %& �& -��� �� �& %& $ ���

� 5>>5 # ��*1� )������ ��$ ����� � ��� � �$ ��$ 558A5D5

������ -"������. ��� ���������� �"� 1���� ��������� � ����� ��� ���� �� ����,��� � ��������� ������ ��� ���� �� ��� �� ����� � ���� ���� �� ����� ') ��� � ������ �� ����� ���������� ���� ����������� 1� ������� �� �� 7>> ���� �� -��� � �� �(�.��� ������ � ��� ���$ ��� ��*�� ��� �������������:����� � D � �� ���� ���� )��� �� ��� ������ ��������� 1��� 2�� ��� �:3 0��,7G0�� ��������< �����,�+� ���� �� ��� ���� ���� +�� ����� ���������������"� �������� ���� ��������� � ������ ���� +���� 1����������� � �������+��� �� ��� �� ��� �: ����� ��� ���, ����� �������+����� �� ��� 0��G0��,7 �� ��� �: ������ �������������� �"� ������ ��+� ���� ����������� 1��� ����� �� 0�� ��� 0�� ���������$ 1������������ �� 7>> ��������7 �� � ���� �� 8>� ��������� -����� �� ���$ 5>>5< ����� �� ���$ 5>>5.� ��������� ������ 1�� ������ � �����+�� �� ��� ') ������������ ������ �(� �� ��� � �� �� �� 79 ���� ������ ����� �� � �� �����+�� �� @�����$ ������ �� ���������� � � �� � ��������� �"� ������ -������.�� ������� � ����� ��+� ������ �� ��,����� 1������ �������� ��� �( ���������� � 2���� �:3 ����� ������� ���� ��������� �� 0#� (� �� �������� �� 0����� 0�� �� �� � �� �� ��+� �������

0#�$#

� ���� �� ��������� ��� ��������� ������$ �)#�$�� �������� �� &������ ��*��*� -#�:�� $ ��� �����, ����. -�������$ 7887< %��+��� �� ���$ 7887.� �)#�*��� ��� �+�� �� � ��� 0��,7 ��� �"� ��� ��� � ���+�� �� � �� � ����� *�� ���� ��� �� ������� �� �����+������ �� ��� ���� -(����� �� ���$ 5>>5.� �)#� ����� ���� ��� � ��� ���������$ ��� ��� �:�������� ����,�� ��� 1���� ���� ��� ���������� �� � ������������������������� ��� �� ��� ������ �� -#��� �� ���$ 788>.��� �� ��������� 1��� �� �)��� �:������� -+�� #�� �� ���$ 7884.� ���� �:�������� ������ ��� ���� ������ � ��� ���+���� �� ��+��� ��������� ��� ��,�����,��+� ���� �� ������� ��������� �� �1$ �� �� �,)��� �:������� 1� �:����� ��� (� �� �� ������ �� 5� ���� � +� ���$ 1���� ��� ���� �� ������ � +������ �� ��� ��������� ��� ��������� ��������

! ���� ��� �����

����� ����� �������� -��. ���� �1� ����� �� ���������� �������� �� ���� ����� ���� �������6� ��H������� ���� ����� �� ���� ������ �� ��� ������ ��� ��� ������B����� -@��� /.� ���� ����� ���� �� ���� H������������� �� ��� ���* ������ ��������� �� (� �����-�� = �� ���$ 7848.� ����� ������������$ ������� ���� �,�������� ������ ��B����� ��� ��� ������������ ��� ��� �� � ���� ��� ��� ����� ��� �� �������

����� ����� '���� � ���������� � (� �����$ ����������� ��� �� ��� �� �� �� ��� �� �������� ���������� ��� ������� ��� ������$ �����+��� �:�����,��� ��� ��������� -#�����$ 7887.� ������ �����,������ -������ ���*$ �$ ')�. ������� � ���*����� ������ ��� ������� � �������� � ��� 0� ���� ������� ����� �� ��������� ���������� ��� �:��� ����$ ��� �� ������� �� �� ��� ���� ��� ����������� � ���,����� ����������

$������ �0# � ��� ���� � ��� �����

��� �������� (� -�(�. ������B�� -@��� D. 1����+� ���� �� ������ ����������� -�����+� �$ ��$')�.$ ��� ���� ������ ��� �� ��1 �1��� ��� ���*������ #���� ����������� -�����+� �$ ��$ ')�.� ����(� ������ ��� ����� �� ��� ������� � �� ��� ���,��� ��� ����� ���� ����� �� (� ������ ���������� ��������� �� ������ �� ���1��* �� ���������� ������ ������ ������$ ������ ���� ��� ��� ����������� ��� ������ ��� ��� ���� -'����$ 788?.� ��� ��������+� +�� � ������ �� �������6������ �� ������ �������������� �� ��� ��B����� �� �������� -���� ��� 0�� ��������� /8 ������� ����� �� ��� �� �� ��B������.� ������� �� ��� ������ �������� ������� �� ��� �������� ��� �� �� � ������� � ������,�������� ������ ���$1������ ��� ������ ��� ����� �� ������ �� 1� �� ��� �(� ��� ����� �� ��� �� ��� �(� ��� ����� ��� ������� � ��������6�� ���������$ ���������� D;������ �� � ��B����� ���� ��� ���� � ��� �� �������� H��� ��� ���� �� � ��B����� ���� ����� �� ������������� "� ��� � ������ �� �(� ��� ������ �������� �� ��� �����A������ ���� �: �� ��� ������ ����� ����������� �� �� 74>> ��� �� -� *� ��� ��������,���. ������ �� ���� ������ ��B������ � ����� ����,������ ���������$ ���:�����$ �� ���� �� �������� �+���� � ���� ����� ���� �� B��������� 1��� ��� ��� ��� ����������� ��� �������+��� �� �(� ������ �������� � �1�� ���� ���� ��� �� �����+�� �� ��������� ��������� ������� -#���� �� ���$ 7889.� �����,B���� �$ ��+� ������ �� �(� ������� ��� �������������� �� ��� �� ��������� �� ��� ����� �����������������

')� &@ �&""����� �� #&&()����� "��0&()

��� ') @(� ��� ������ � ������� ��� ����� ') ������� ��� �� ��������� ������� ��� ����� �� �� ������� 1�� �� ��,����� ���� � ��� ��� ��� ��������� ��+� ���� �� � ��� ������������ ��������� ������� ��������� - �$ �� ���� ��$ ��$')�.� ��� � ����� �� �����+�� �:� ���+� � ���

0#� ������ '�� �� ����� � 5/;

� 5>>5 # ��*1� )������ ��$ ����� � ��� � �$ ��$ 558A5D5

��������� ;75 ������ ��� � �� ������ �� ����+����� ���� �������� ��� �������������� ��� ������ ������� �� ����� ��������� �� ��� �������G������ �"� ������$ 1���� �� ������� ��� ������������ � �� �� �� 79 ���� �� ���� ������ �� 1�� �� ��� ��� � ��� ���������� �������� ��� ��� ������������� -@(�$ 5>>5.� @(� ������ ���� ��� ����� ���� ���� ��� 0��,7 �� � ��� ���*� 1� � �1 ������������������ �� ��� ������+����� �5D ������� �������� ��,�����G������ �"� ��� �����

��� �)����� ����� ������� -��� ���� �� ����� @(���+����������� �1 (�+��� -�(. �:�������$ 1��� � ������ ��� ������� ������� �� ��� ���� ���� ��+��11�� ����� 1������. ��������� ���+� ��� 1��� � ������ ��� ') ��� 0�� ��� 0��,7 �� ���������� ��������� ������ �� � �� ���� �:� ���+� � �� ������ ��$

1������ ��� ����� ��� �)����� ����� �� ���� �:� �,��+� � �� ������ -)������ �� ���$ 5>>>.� #��� ���������� ��� �� �������� ���� ��� ��� �"� ����� ������� � �� 79 ��������� -5D ��������� �� ������ ��.���� �� � ����� ������ ������� ���� � ���������-����� ���� ���$ "��������$ )1��6�� ���.� �������� ��� �)����� ����� �� ���� �� ������ ��� � ��5D ���� �� ���� �� �� ��������� �B��� ���� ���1��*������� -0��� ��� �������$ ����$ �$ ')�.�

"&(�@�����&) "�(� �& ��"��0&()

��� �1� ��H�� ��������� � �+�� �� � �� ������,��� ������ ��������� ���+� ��� ��� �� � ��������� ��

(1) Double-stranded DNA target

(2) Temperature is raised to 94 °C to denaturestrands

(3) Temperature is lowered to allow primers to bind

(4) Nick repair activity of DNA ligase allowsligation of primers

(5) The process is then repeated giving a two foldamplification per cycle

Key:

Target

PrimerDNA ligaseLig

Lig

Lig

���� �� ����� ����� �������� -��.�

5/9 %& �& -��� �� �& %& $ ���

� 5>>5 # ��*1� )������ ��$ ����� � ��� � �$ ��$ 558A5D5

�������$ 1���� ��� �� � ��� ���+���� �� ��+��� ����,����� ������ ��� 1�� � �� ��+� �� ����� �1� ����������� �� ��������� � �+�� �� � �������� �����+������ �� ����� �������� �� ��,����� �� �������� ���� ����� ��� ������ ����� �1� ����� �����������,����< ��1�+��$ ��� �����+������ �� ���� ��� � ������+���� ����������� ����� ������� �������+� � ����������� ������������� ������ +��$ 1��� ��� �����,B����� �� ����� ��������� � ��� ��� �� +� ������� ������� ������

&�� �� ��� ����� ���� ������ �� �� ��������� 1�� ��� � ��� ���* �� ������ -���� �� ���$ 7888.� �� ����������$ ��� ��� ���� 1�� �:������� ���� ��� � �� 89��������� ����� ��� J����� )��� �� ��� ������� ����:������� ��� ��� ���� 1�� ������ ��� 0�� �� �������� ����� ����� ��� ���� 0�� +7�> ����� ������������+�� 0#� ��� 0��,7 1��� ��� ����� ����� ��,�����,��+� ���� ���� ��� ���� ����� ��� ������ � ���������� ��B"�� ����� ��� ��������� �� 0��,7 -(�������� ���$ 5>>7< ���� �� ���$ 5>>5�< ���� �� ���$ 5>>5�.�

���� �� #������� (� ����� ��� ����������

0#� ������ '�� �� ����� � 5/?

� 5>>5 # ��*1� )������ ��$ ����� � ��� � �$ ��$ 558A5D5

��� ����� ��� ���� 0�� +5�> �� ������ � ������ �������� �� ������� ��� ��� ��������� ������������ ����� �� ���� ����� ��� �� ��������� �������� �&#�) ��� ���� -(�(������� �� ���$ 7889.$ ������ ����� �:�������� ��������� ��� �� ��� ���� ����������� ��� ��� ���� �:�������� ���������� ��������� �������������� &�� ��������� ��� ��� �����:�������� ������ ���� �� ��+��� �������� �� �� �,)��� �:������� -+�� #�� �� ���$ 7884. 1���� � �1���� ���������� �� ��� #��� ��� ��� �:�������������� �� ��� �)#� ����� -#��� �� ���$ 788>.���� �� �)��� �:������� 1� �:����� (� �� ������ �� �� 5� ���� � +� ��� �� ���������� ������ ������� 7> ���������� �� � ����$ ��*��� �����:�,���� � D;��� ��� ���� ��� ����� �� �)������������ 1�� ���� �� �# �� � ���������� ��� �������� �:�������� ������ �� ����� 0�� ��� ����+7�> ��� ��������� �� � ���� ��� � ��� ��������������'���� ����� ������� ��+� � 8;� ���,����� �� D?A4>��������7$ 1���� ����������� � 54, �� 44,�� ������+����� �+�� ��� ����� ������ -� �� �� ���$7884.����� �� �)��� �:������� ������ �� ��1 ����

�� ����������� 1��� ��� ����� 0�� ��� ����+5�> ����� �� ������ ������� � ���$ �� ��� � ��D4 ���������$ ��� 0�� �� ���� ����������� �� �������� ����$ � �1��� ��� �� ���� �� � ��� � � ������������� �� ��� ����� �� ��� �� ���� � -#� ��� ���$ 5>>>< ���H���� �� ���$ 5>>7.� ��� �������� 8;��������+��� �� ���� ������ �� 4 �'��7� ��� ��������� �� ��� ����� ���� ��� ������ � ���� ��������� ��� ��� ��� 0�� ��� ���� +5�> 1��� 0����� �)����� +5�> �����$ ��� ��� 0��,7 ��� �)�����+7�; ����� �� ��1 � �� ���� �� ����������� 1����� �)��� �:������� 1��� � �������+��� �� ������/> ��������7 -E�������� �� ���$ 5>>5.� ��� �� �)����:������� ��� ����� 0�� ��� ���� +5�> ���������������� ��� � �� ���� ���� �� ������ � ��� ���0�� �� �� � � ��� ���* �� ������ 1���� �8;� �������+��� 1�� �������� �� /> �'��7 -��������� ���$ 7884< ������� �� ���$ 7888< ������� �� ���$5>>>.��� ��� )������� ������ # ��� ����������� )��+���$

��� �� �)��� �:������� 1�� ������ � ���� �� ������,����� 1��� �� ��,����� ��� ��� ��������� � ������������ ��� 0�� �� ��� )������� ������ # �������������� )��+��� -E��+�� �� ���$ 5>>>. 1��� � 8;��������+��� �� ?�/ �'��7� "��� ������ �$ � ��������,��� �� ��� �: ��� 0�� ��� 0��,7 ��� ������������� �� ��� ���� ����� 1��� �� 0��,7 �������+,��� �� 5D �'��7 -� � ��� �� ���$ 5>>7.� ���� ��������1 ���� ��� ,���� � ���������� ��������� �� ���������,����� �������� ����� ��� ������� �� -�����(����������$ #��� $ )1��6�� ���.�

��� �� �)��� �:������� ��� ���� ���� �� ������,����� 1��� ��B"�� ��,��� �� ��� ����� ??>>-��� ��� #��������$ @����� ����$ ��$ ')�. ��� �����,���� �� 0���� �� ������� � ��� �� � ����� � ������* -0����� �� ���$ 5>>7.� ���� ������ ���� �� ��� ���B"�� ������ �������� ��� ��������� ��������� ��0�� ��� ��� � �������� ���� ����������� ��� 0�� ����,����� 7A; ��� � �������+��� �� 5> �'��7� ��B"������� � �� ���� �� ��� E������� ��� �����$ 1�� ��� ����������� �:�������� ������ - �,K. ��� � �� ����� ��E����� ����� ??>> �� ���� ���� �� ������ 0#� (�$0�� �� ��� 0��,7 ��$ ��� �� ��$ ��*��� ��������� ���� � ���������� ��� ����������� �� ��� �,K���� � ����������� ������� ��� ��� ���)" ??>> ��� �,�������� ��� ��������� ������ �� ������ �"����"�K ����� ������$ ��� �� �� � �� �������� ���� �� ���89 ���� �� ��� ������ � �� ������ D�� ��� ���������������+��� �� ���� ������ �� /> ��������7 ��� 0#�$?? �'��7 ��� 0�� ��� D5 ��������7 ��� 0��,7-"��� �� ���$ 5>>7.��� '%$ ��� ������ # ��� )��+��� -#). ���� ��

��������� ��������� ������ ��� 0�� 1���� ������� J����� #������� 89>D ��� �:�������� ��� ����&#�) ��� �)����� 0�� ����� ��� ��� ������������ ���������� ��� #������� 89>D -J�����$ 0� ���$ ������. �� � ������� ���� � ��������� 1���� �� �� ��� �:����� (� ��� �� ���� 89 � ���� ���� �� ������� 5�;�� � ������� ������ ����� ��� � ���� ������� ��� ���� �� ��� ��*��$ �� ���� � �������� ���,� � ����������� ��� �� ������ �� ����� ������������� �������� � �������� ���� � ����*���� ��� ���������� �������� � �� ��� ���� �� ������� ���� �� ����������� ��� �� ���������� +����� ������ � ��� ����������� ������ � ��� 1��� 89 �� ���� ������������ ��� �����: �� ���� ��� ��� ����� �� ��� #) ������$��� #������� �� � �� ���� �� ������� ��� ��� ���� ������� �,����� �� ��� ����� ��� ���� ��� ����$ �� ��������� ������ �� ������������ ���� �� ��� �� � ����,����� '���� ���� ������$ � 8;� ����� �������+��� ���0�� �� �� 75�4 �'��7 ��� �� �����+�� - ������ ���$ 5>>5.�

�&�')�&)

�� ��� ��� ��1 �����$ �� � ��� ��������� ���������� ��� ��������� �� � ���,����� +������ ��+� ������������� � ��� ������� �� � ��� ���*� ��� � ������+���� ������ ��� 1�� � -���� ����� = ������*$5>>5.� "��� ��������� ��1 �� � �� ���� � ��� ���,������� ��� ����������� ���� ��+� � +� �� ������+��� ���� ��� 0�� �� ���$ �� ���� ���������$����� +������ �� 1� -���� 0��$ 0#�$ ���+�+����#78$ 0��.� ������� �� ���� ������� ������ �

5/4 %& �& -��� �� �& %& $ ���

� 5>>5 # ��*1� )������ ��$ ����� � ��� � �$ ��$ 558A5D5

������ ��� �� ���������$ 1��� ��� ��6�� ����������� 79 �� 89 ���������� �� �������$ ��� ��,����� ���������� �� ������� ��� 1��� � ����$ �� ���� � �1������� �������+���$ � �:��� ��� ��� ����������$ ����� �� �1�� ����� ���� ��� ��������� �������$ 1������� ��� ���������� ���� �� �������� #� ������������������ �:�������� �������$ ���� �� �� �)����� #�������$ 1��� ��������� ��� ��������� ������������ �������$ ���� �� ��� �&#�) ��� ����$��� �)����� �� ��B"�� ������$ �� � ����������� ������� ��+� ���� ��+� ���� ��� +� ������ ����� � ��� ���+���� �� ��+��� ���������� @� � ����,����� ��������� �� ������� ��� ����� ��+� ��,����$ ��� �� 1� �� � �� � ������ �� ���� ������� ��� �������� �� ��������� ������ �� 2� ��*��:3 ���� ������ ���� �� �� ������ ��� �+� +��$�� �� �*� � ���� ����� 1� �� � ���������� ���� ��� ���� �( ��$ �� 1� �� ������������� �� ����������������� ��� ��������� +������ ��� ����� ������������ ����� ��������� ��� �������� -#���� =(���$ 5>>>.&�������$ ���� ��������� �$ ��� �:������� �� �� ����,�� ��� �� ������� � ��� ���* ��������� ���� � � �1��� ����� ������������ �� ��������� ��� ��H�� ��1��������� ���� ��� ������ �� ��� ������$ ���+������ ������� ���� �� �� ��� ����������� 0�� �������� ������������ 5 ������� ��� -������� ���$ 5>>5.�

��@�����)

���� �$ �E�$ 0������$ ����$ �����$ ���� = � ���$ ���

-7848. ����� ������� ��+� +��� ����������,�����, ��� ��

(� ������� �� ��� ���� ����$ �$ 7;44A7;8D�

#�����$ @� -7887. ������ ������� ��������� ��� (� ��� �,

�������� ����� � ���� ���������� � ������ %����� ��

� ��� 0�� �� #������ � �� ���� � ��� � ��� ������

� #��� ��$ $ 748A78/�

#������$ E�"�$ @������$ #�$ ���� �$ �$ � ��$"�$ ������$ (�$

(�����$ E� = ��$ )��� -788;. �����+�� ��������� �� ����,

0�� �� ����,����������� ��������� �� � �����,����������

��)�� �1 ��� �$ �$ 7;A74�

#� �$ "�$ 0�����1$ "���$ ������$ )���$ #���$ �� =

������*$ 0��� -5>>>. �+� ������ �� ��������� ��,

�:�������� ������ ��� ��� � B�� �����+� 0�� ����� ���

�������+��� ��� ��������� �� 0�� �� �� ��� ,���������

�������� ����� � $ ��$ ;?;A;?8�

#���$ ��$ )� $ ��E�$ )� �����$ "�"�$ E�����$ ���$

��������,+�� (� ��$ ��"� = +�� ���$ �E� -788>. �����

��� ���� � ������ ��� ������������ �� ��� ��� ������

* ��� � �� ��� � ��' ���$ �$ D8;A;>/�

#����$ "��� = (���$ ��I� -5>>>. �� ��� � ��� ������C

1��� �� ��� ��������L ����� � $ ��$ 77;?A779>�

#����$ "���$ &����*� �*�$ ����$ "�� ��$ E���$ ��$ ��0�$

0������$ (�$ 0�����$ )�$ )����$ (�0�$ 0�����$ "�$

0����$ �� = )����$ (�&� -7889. @������ ��� �������

����� ���������������� +���� ���� 7 ������������ ��

� ��� ������������ ����������� )����� )���� ����� ���

* ��� � ����� � � ������$ � �$ 59A//�

#����$"���$ ��1� $ #�(�$ �1��*�$ "�$ &����*� �*�$ ���� =

"�� ��$ E��� -788?�. 0�� �� ��� �� ��������

�� �������+������ ����������� ����������$ ��� ����� �����

1��� ����� �� ��� ��� ����� � $ � $ )DD/A)DD/�

#����$ "���$ )������$ )�� = % ������$ )�0� -788?�.

�+� +��� ��� �������� �� ��� ��� ���� ��� ��������� ������

��� ���+������ �� +��� ������������ �� � ��� ����������

��� ����+���+��� ��C #��� ��� � � ���� ��� $ ��� �

$�� ����� � ��� � � -��� �������$ �.$ �$ 75/A7?9�

�������� ����������� �� # ��� #��*�$ #�������$ "(�

#����$"���$�� ���$ E���$ E������$��$��� ��$�=�+���$��)�

-7885. ������ �� �������� ���� ��� ��� ������� �� �����,

���� �� ��������� � +���� ��� ����� � $ ��$ D5>AD5;�

�������$ "�(�$ %������$ %� =%�����*$ #� -5>>>. ��� �����

���� �� 0�� �������+������ ����� / ����� �� 0����

��������� �� #����,������������ ����� � $ ��$

7D55A7D5/�

�������$ "�)�$ %������$ %�$ 0��6$ ��$ ��6$ ��$ ���*���$ )�$

���$ #�$ )��1����$ �� = %�����* #� -7888. �:���������

�� 0��,�� ��������� ����� �� �� ������ �� � ��

���������� �� ��� ����� ��� ����� # ��� �����������

)��+��� �� #����,������������ $ �� ����$ � $ 547A54D�

�������$ "�)�$ %������$ %� = %�����*$ #� -7884. "���,

��� ��������� �� ��� ��� ���� ������� ��� ��������� #

+����$ ��������� � +����$ ��� 0��C ��� ������� ���� ���

����� � $ �$ 8>;A8>?�

�(� -788D. &������* �� 0�������� � ���������� 1��� �����,

+����� ������� ��� �� �������������� A '����� )�����$

&������ 788/AE��� 788D� ��' � �� �� ����� ��

���2�� �����$ ��$ ;>;A;>8�

������� ���$ "��� -5>>5. �������� ���������� ������C ��

���� ���� � ���* �� ��� ������ �� ���������� � ��� ���

� ��� ��������L �� ��� ����� � � ������$ ��$ ?8?A4>;�

� � ���$ ��$ (�+��$ ��$ �����$ �$ �����$ ��$ E��+��$ �"�$

0� ���$ 0� = )�������$ �� -5>>7. (�+� ������ �� �� ��,

� �:�� ��� ��� ���� ������� ��� ����� ����������������

+���� ���� 7 ��� ��������� � +����� �1 ��� �$ �$

8/A7>7�

�������$ E� -7887. �� ��� ���� ��B�����,����� ��� �����,

����� 0�� ��$ ��$ 87A85�

��"� -788;. ���������� �� ������� ��� ���C ��� ��� ����

��� ��������� ����� ��� 0�� �� ���������� ��������,

������� ��"�G#��G598G8;�

��"� -7884. ��� ������������ �� ��� ��� ���� ��� �����,

���� ������ ��� -��. ��� ��� ��������� �� ��������� �

+���� �� �� � ���� ��� �� ��"�G#��G/8>G8?�

���H����$ 0���$ "� �H�$ "�0�$ #��$ 0�E�$ �������$ ����$

(�� ��� $ ��� = � ��$ ��� -5>>7. �� ������� �� ���

�� �)��� �:������� �� ����������� 1��� ��� ���������

� +���� ����� ��� ���� 5�> ����� �� ���� �����������

�� ��� ����� ���� ��� �6��� ��� ��� ���� ��� ���������

������ ��� ��� � ��� ���������� �1 ��� �$ �$

75A5>�

0#� ������ '�� �� ����� � 5/8

� 5>>5 # ��*1� )������ ��$ ����� � ��� � �$ ��$ 558A5D5

(�����$ #�$ +��$ ���� = )� �*���$ �� -5>>5. ���������������

��� ��� �������� �� ��� ��� ���� ��B�����,����� ��� ���,

������ -�)#�.� ���� ��� $ �������$ ��$ 79/A7?8�

(�(�������$ �$ ��*$ 0�$ %���� $ ��$ ��������$ ��$

����� ��$ ��$ ��1�$ M� � = �����������$ "� -7889.

�&#�) �"���&�C �� � ��������� �� ��� (�

��� ��������� ��� ��������� ������ ��� ������� ����������

���� �� ��� ���� ����$ ��$ 787;A785/�

(������$ ��$ )�������$ �� = ����$ ��%� -5>>7. ��B"��

;�,��� ���� ����� ���������������� +���� ���� 7 �������� 1��� �����,���*���� ���������+� ������� ������

��� ����,���������� � ��� ����� ���������� * ��� �

�� ��� � ��' ���$ ��$ D/>5AD/>4�

���� �����$ ���� = ������*$ 0��� -5>>5. ��� ���������� ��

����� ��������� ��� ���������� ������ ����������� ��

� ��� �� ��� ��� ���� ������ ��� -������������ @����.�

�1 ��� �$ �$ 4?A777�

@(� -5>>5. @(� �����+�� ����� ��� ��� ���� ���� -��.

������ �� ������ 1�� � � ��� ������ ��� ���������� 1���

����� ���������������� +���� -0��. ��� ��������� �

+���� -0��.� ��# ���2 %����$ �>5A�7/�

�����$ E���$ ������$ ��)�$ #�����$ "�$ ��*�$ ��$

�6�����*$ E���$ �����$ ��$ ���*��$ (�$ #������$ E���$

���������$ "� = � ������$ )� -788>. (�������� ��

��������� � +��� ��B������ �� � ��� ��������� �� 2������3

�� ������� ����� �������� ��� ���������� �� �������+����

!����$ ��$ 7D78A7D55�

��*��$ �$ ����$ E�$ ���������$ ��$ �� ����$ "�$

�������$ ��$ ����� ��$ "� = �� ����$ � -7884. � �����

�+� ������ ��� ��� �������� �� ��� ��� ���� 0#� "���,

��� ����$ � B���������+� 0#� (� ��� ������ * ��� �

� ��� ��� ������$ �$ 7;;A79;�

�������$ ��(� -7889. �������� ��� �������� ��������� �

+���� ��������� �� ��� ������� � ��$ � -)��� � #.$ /A4�

����$ ����$ )���$ ��"�$ %����,)��������$ @�$ �+�$ ��"�$

�� ��$ �� = ������$ ��)� -5>>5. ��������� ��������� ��

� ��� ��������� ��� 0�������� � ����� �� ����� ���

J����� #������� 89>D ��� ��� ����� �&#�) 0��

��� ���� ������ �1 ��� �$ �$ 798A7?9�

0�����$ 0�$ ���$ E�$ 0���1��$ (�$% ����$ 0� =%�������$ 0�

-5>>7. � ��+� ��,��� ��� �� ��� � ��� ����� 0��

�� ��������� �� � ��� ���������� ����� � $ ��$

77>>A77>9�

0������$ ��$ @��* ��$ ��$ (� �����$ � = ������$ ��

-788/. %������ ��� ��� ����C ��� ,���� ���������� ��

(� ��� ��������� ���������� $ ������� 30�4

5�26$ ��$ 7>59A7>/>�

0� ���$ ��"�$ ��������$��(�$������$��= � ����$(�0�

-7887. (�������� �� �������� �� ������� ����� ��������

������� �� ��� �6��� ��� ;�,,,,/� �:���� ���� ����+��� ��������� �B������� (� �� �������� %����� �� � ���

0�� �� #������ � �� ���� � ��� � ��� ������ �

#��� ��$ $ ?5?9A?54>�

0� ���$ 0�$ (�+��$ ��$ 0����$ ��$ 0�1 ���$ �� = � ��$ �

-5>>7. �� ������������ �� �������+� ����� �� ����� ���

��� 7�� ������������ �������� ��� 0��,7 �� ��� ��� ��

��� ��� ����,����� ������B���� * ��� � � ��� ���

������$ ��$ 7D7A7;>�

E��+��$ �$ � � ���$ ��$ )�������$ ��$ (�1$ #�$ "����$ "�$

E�����$ ��$ ���1��$ �� =I��$ ��� -5>>>. )�������� � ���

��������� ��� ��������� � +���� �� �� ������� �����

�������� N �����O� �1 ��� �$ $ ;?A;4�

E��������$ E�"�$ )H����$ "���$ �������$ 0���"�$ +��

(����� ��$ ����E�$ +�� ��� ��� $ ���$ ������*$ 0���$

"� �H�$ "�0�E�$ �������$ ���0�$ �������$ ������ =

� ��$ ��� -5>>5. �� ������� �� ��� �� �)��� �:�������

�������� 1��� ��� ��� �)����� 0�� +7�; ��� 0��

+5�> ���� ��� ��� ������� �� �� ������� ����������

����� � $ ��$ ?85A?8?�

%��+���$ ��$ +�� ����$ #�$ +�� )���H�$ (�$ )���**��*$ ��$

(���*�$ "�$ ���������$ 0�$ "� �*$ �$ )��*�����$ �� =

���$ �� -7887. �)#� ��������� ��6������ �� +����

��� ��� ���� ��� ��������� ������6�� ��� ��� ��������� ��

0��,7 ���������� * ��� � � ��� ��� ������$ �$

5?/A549�

% ������$ )�0� = #����$ "��� -5>>>. ��� ���*� ��

�����������,����������� ���������C ������ ���������� ���

����������� ���� ���� $� �� ���7� $��� %���� �� 8

��������& �� ��� 9��������$ ��$ 9/7A9D8�

%������$ %�$ �������$ "�$ (��� ��$ ��$ %���1���$ "� =

%�����*$ #� -7884. ��������� ���* �� ������������ ��

��������� � +���� �� � ��� ������������ �1 ��� �$

�$ 57/A579�

��6� $ (�$ �����$ @�$ )����*�$ E�E�$ "��*$ (�0�$ #������$ ��

= ������$ E�� -7844. (�������� �� ��������� # +����

��B������ �� ����� �� ����� �� +���� ��6������ ��� ���,

������� * ��� � � ��� ��� ������$ ��$ 55?A5/?�

��$ � �$ ����� $ ���� = # ���$ �� -788/. � � ��

�������������� �� ���*,����� ����� ��� 1��� � ���������

������� 0 ��� � #� �� ��������$ ��$ /?97A/?99�

��$ )���$ ������$ ��$ ��$ �$ ����1$ E�$ I���$ E�J�$

)�+����$ )�$ ���*����$ %� = �����������$ "� -5>>>.

�����+�� +������ 5�> B�� �����+� ��� B���������+�

�"���&� ��+���� �������������,��� ����� ��� ���������

� +���� ��C �� �������� �� ������������ �����$

�������� �������� ������+���$ ��� ����������� ���������,

������� * ��� � �� ��� � ��' ���$ �$ D7?7AD7?8�

� ��$ ���$ �������$ 0���"�$ +�� (����� ��$ ����E� =

J����$ �� ��� -7884. J�� ��� ���������� �� ��������� �

+���� ��� ��� ���� ��� ��������� ������� A �� ������������

����������� ������ �� � ������� � � ����� � �.

��� : $ �$ 7>5A77>�

���$ ����$ �������$ %���$ #��1�$ ��"�$ (������$ ��$

����$ )�I�$ ����$ )�I�$ ��$ I�)�$ ���$ (�$ � ����$ E�$

��� ��$ #�$ ������� ���$ "���$ #����$ "���$ @� *�$ ��"�

= %� ���$ "�� -5>>>. @�� ��� �� ������� 0��,7 ����� ��

� ���� ��+� +��� ������������ 1��� ����������+������

� ��� ���������� ������ ��� ���������� 1����1 �������

* ��� � ��� #��� �� ��� ��� #��� �� $ ��$

57>A57D�

�����$ E�"�$ � *��$ E�"�$"���6$��$������$��$ #��� �*$��$

(��*���$ E�$ � ����,��� ��$%�$ ��������$%�$%� *$(���$

5D> %& �& -��� �� �& %& $ ���

� 5>>5 # ��*1� )������ ��$ ����� � ��� � �$ ��$ 558A5D5

"����$ ��� = ��������$ �� -5>>5. )������+� ��������� ��

������� +������� �� 0��,7 ��� 0�� 1��� �� 0��,7G0��

����� ����� �� �������������,�������� ��� ����������

* ��� � � ��� ��� ������$ ���$ 7/8A7;;�

���$ ��"�$ (��1$ �$ "����$ ��$ E�*��,"�"� ��$ (�$

�������$ �� = %��$ )�I� -7884. (�������� �� �������� �,

+���� �� � ���� ��� ������������ � ��� ��������� ����

����� ���������������� +����,�������� �������� �� ���

�"���&� �"� ����� * ��� � �� ��� � ��' ���$

��$ 5D/DA5D/4�

����$ "���$ #��������$ "�)� = 0��� ��$ E�� -788>.

'�� �� ����� (� � ����� ��� �� ������ �����,�+��

������������� �� �� ������� ����� ���������� -��$ ��$

75;A754�

"�(������$ )�0�$ ��������$ ��$ I���$ I�$ %� *$ (���$

#� ����$ �� = "����$ � -7884. 0��� ���������� �����

��� ��� ���� ������� �� �������� ��������� �� �����

���������������� +���� -0��. ��� ��������� ���� �

+���� -0��.� �� � ������� � � ����� � ���� : $

�$ 79DA798�

"���$ J�$ ����$ ��$ ����������$ ��$ �������*���$ )�$

)���*�$ "�$ @���$ ��$ �����$ �$ �����*����$ ��$

� ��*�$ (�$ I�1���$ 0�$ )�*�*���$ I�$ 0�����$ �� =

�������$ �� -5>>7. ��������� �� ��� �: ����� ������

��� ���� ������� ��������� �� ��������� # +���� (�$

��������� � +���� ��$ ��� ����� ����������������

+���� ���� 7 ��� * ��� � �� ��� � ��' ���$ ��$

58/?A58D;�

"� ��$ %�#� = @� ����$ @��� -784?. )������� ��������� ��

(� �� +���� +�� � �� �������,���� �6�� ����� ���������

������ ;:�����$ �$ //;A/;>�

"�����$ %�%�$ 0������$ (���$ ��������$ E���$ ����$ %���$

#����$ "���$ � ���$ E��� = � ���$ 0�E� -7888. ����������

��� 0��,���������� 1����1 ������ �� ��� �������6��

���� C �+������ �� ������� ���� +��� ��� ��� ���� �������

��� ���+��� � ���,����� ������������� ����� � $ ��$

944A98/�

"����$ ���� = � ����$ (�0� -7887. ��+���� �������������

��� (� ��� ��������� �� � ������� ��������� ��

(� �� �������� $ ���� ����$ ��$ ?997A?999�

� ���$ ���$ ����*�$ ��#�$ "������$ �� = #��*��$ "�"�

-7889. )��� ������� ��������� �� �� ��� � ��� ��� ����

������� �� � ����������� ������� $ ���� ����$ �$

4D58A4D/4�

&�$��I�$%1�*$ )�$"����� $ )���$"��*$(�0�$ )����*�$ E�E�$

%����$ E���$ @������$ ��$ ������ �$ (� = )����������$ �

-7844. (� ��� ��������� ��� ������ ��������� �� 0��,7

�� (� �� ��������� � ��� ������� ��� �� �� �� ���$

���$ 58;A58?�

��� -7884. ���� �� �� ��� ������ � �� �� ������ ���

��������� ���* �� 0�������� #$ �$ ��� 0�� �� ����������

�� ���*�� ��� �� ������������� $ ����:� ���$ �$

/4/;A/4/9�

�����������$ "�$ ���*����$ %�$ 0�����$ )�$ )�+����$ )�$

)��$ ��$ I���$ E�J� = )������$ E� -7884�. �����+��

�&#�) �"���&� -�". +��� ������ �� � ����� ���

������� ��������� �� +������ �� � ��� �� � �����

�� � ������� � � ����� � ���� : $ �$ 7;/A7;8�

�����������$ "�$ ����$ M�$ �����$ )�I�$ (�#��+� �$ (� =

)������$ E��� -7884�. �� ������� ������ ��� �������

���������� ���C ������$ ����������$ ��� ������ �� � �����

������������ * ��� � �� ��� � ��' ���$ ��$

787A78?�

����$��%�$ �����$"�$ #���$ )�$ (������$ ��$ ��������$ ��$

)�����$ ��$ 0�����$ (� = )�������$ �� -5>>5�. I�� � �� 0��

��� 0��,7 �� ����� ��������� �� /�9 �� ��� � ���

��������� �� ������ ������� ����� � $ ��$ 495A494�

����$ ��%�$ �����$ "�$ ��������$ (�$ (������$ ��$ #���$ )�$

)�����$��$��������$��$ 0�����$ (� = )�������$ �� -5>>5�.

�� ��� ���� ������� -��. ��� ��������� # +���� ���

����,0#� ������� �������� � ��� ������� ����� � $ ��$

498A4?;�

����$ ��%�$ �����$ "� = )�������$ �� -7888. @������ ���

��� �������� �� ������� ��� ��������� �� � ��� ����,

����� ��� ��������� � +����$ ��������� # +����$ ��� 0��,7 ��

� � ���,���* �������� !����$ ��$ /;8A/9/�

)� �����$ E�$ �� ���$��$ � ��$�$(�1���$ ��$0�������$%�

= 0���� �� -5>>7. �� ������������ �� �������+� �����

�� ����� ��� � ��� � 0�� �� &�����6����� ������������

�������� ��� ��������� # +���� (� ��� ��� ���� ��� �,

�������� ������B���� �1 ��� �$ �$ 9/A?7�

)� �����$ E�$ 0����$ ��$ � ��$ �$ ������$ �$ �� ���$ "� =

I�$ "� -5>>>. �� �������� �� 0�� 1��*��� �������� ���

�� ������ ������� ��� 0�� ������������ ��������� ���

�� �������+� )���� ����� �1 ��� �$ $ 57?A55D�

)� �����$ E�$ � ��$ � = 0����$ �� -7888. ����� ������� ��

��� ����� ������������ �������� ��� ��� ��� ���� ��� �,

�������� ������ ��� -��. ������ ��� 0�� ��� �0&

�� �������+� )���� ����� �1 ��� �$ �$ 7D8A7;4�

)� �����$ E�$ � ��$ �$ I�$ "��� = 0����$ �� -5>>5. �����,

������� �� ��� ����� ��� � 0�� �� &�����6����� �����,

������� �������� ��� ����� ���+�+���� #78 (� ��� ���

���� ��� ��������� ������B���� �1 ��� �$ �$ 5DA/7�

)��������$ �#�$ #����$"���$ % ������$ )�0� =%��� ��6$ E�E�

-7889. ��� ���* �� �����������,����������� +��� �����,

������ ��� �����+���� �������� ��� (���� )����� ���

0�4 ;���� * ��� � ��� � �$ ���$ 794;A798>�

)����� ��$ �� �$ �������$ �$ E�����$ ����$ �� ���$ ����$

�� ���$ ��0� = )�������$ )� -5>>>. 0�������� � +����

������������ �� � � ��� �������� ������+� �� ��� ��� ����

��� ��������� ����� ��� +��� �� N �����O� !����$ �$

D7AD5�

)����$ �� = @ ������$ �� -7884. ������������ �� ��� ���

���� ��� ��������� ������� �� � ���� ��� � A ��� ��������

��� �� ���������� � ��� ���+���� �� � ������� � �

����� � ���� : $ �$ 8DA8?�

)� ���$ %� = #������$ E� -7888. ��� ���*� �� ���������

������������ �� � ��� ����������� �� ��� ���� * ���

� �� ��� %������$ �$ D>;AD>4�

)������$ )��$ ��� ����$ )� = )�����$ (�"� -5>>>. �� �� ���

'����� )����� ��� �������� � ��� ���� �� ����� � $

��$ 779;A7794�

0#� ������ '�� �� ����� � 5D7

� 5>>5 # ��*1� )������ ��$ ����� � ��� � �$ ��$ 558A5D5

)��$ ��$ E���*��$ 0�$ I��$ )�$"����6�$"�$������*�$ "�0�$

��6�6��6��$ �� = (�����$ ���� -5>>>. �:�������� 1���

��� ���������� ���������� $ �� ��� ������� :�.

� $ ���$ 47A87�

)��$ ��$ %�$ E�$ E���*��$ 0�$ %��$ E���$ #����� �$ (�$

0�����$ )�$ �����������$ "� = )������$ E� -7884. ' ���,

�������+� ��+���� �������������,��� ����� ��� B�����������

�� ����� ���������������� +���� ���� 7 �� ��

� ����� * ��� � �� ��� � ��' ���$ ��$ 589DA5898�

)��$ ��$ )��� ���$ ��$ E���*��$ 0�$ %�$ E�$ ����$ E�$

�����������$ "� = )������$ E� -7888. )��� �������

�:�������� �� ��������� � +���� -0��.$ ��������� # +����$

��� 0��,7 ���� � ���� ��� ��������� �� 0�� �� ��

� ��+���� �������������,�� ������� ����� �������� �����

�������� ��� ��������� ��� �� ����� �� ������� � ����

����� � $ ��$ 7777A7778�

'����$ "�)� -788?. )�������� ��� ����������6����� ��

�������� (� -�(�. ��� ��� ������ ��� B���������+�

��������� �� �"�$ 0#�$ 0��$ ��� 0��� �� ���

���� ����$ ��$ ?5;A?59�

+�� #�� $ ��$ �������$ 0�$ � ��$ ��$ �����$"�$ �� ���$"�$

"� ����$ ��$ ����$ �� = &��������$ �� -7884. ���

�� �)��� -�". �:������� ��� ��������� ��� ��� ����

��� ������ �� � ������� � � ����� � ���� : $ �$

7D?A7;7�

�����$ E�"�$ )����$ %�$ %����$ ��$ ����$ )�$ @���$ ��$

"�(������$ )�$ ��������$ ��$ ��� ����$ )�$ �����$ ��$

� ����$ (�$ E��*���$ E�#�$ ��������$ ��$ )������$ )� =

"����$ � -5>>5. � ����� ����������� ��� �������+��� �� �

� ��� ��������� ����� ��� ��������� �� 0��,7 ��� 0��

��� ����� � $ ��$ 4?9A44;�

���� ��*$ 0�$ M���H��$ 0��$ �������$ 0���$ +�� ��� ��� $ ���$

���������$ "�$ � ��$ ���$ ���*� $ �� = ������*$ 0���

-788?. �+� ������ �� � ��1 0��,�G�� �� ������� �����

��������� �1 ��� �$ �$ 7DDA7D?�

�� ������$ �"�$ �1�$ )�$ �+�$ ��"�$ �����$ 0�$

)� ���$ %�$ "�� � ���$ (�#�$ )*��� $ �� = #������$ E���

-7888. )������ ��6���� �� ����������� -)0&�. ��������+�C

��� ���� �� ��� ����� �1� ����� �������� $�*$ ���$ 79A78�

�� ����$ "�E� -7885. ��+����� �� ��� ��� ����,�����

��������� �������� �� ��� � ��' ��� ��� �4�$ $

/?>A/49�

��$ (�I� = �� ���$ ��#� -7848. ��� ������� ��� �,

�������� �������� -��. A ��� ��������� �� ��������

(� ��B������ ����� ��B������ ������ �� ���� ���,

��������� �������� -�� ��$ �$ ;9>A;98�

I���$ I�$ ������*�$ "�0�$ "����6�$ "�$ (���$ )�$ K�$ (�$

�����$ "�$ I��$ )� = )��$ �� -7888. �����������

��������������� �� ��� ��� �)����� 0��,7 ����$ �� �����

�������� ��� ��������� � ���� ����,��� �� $ �� ����$ � $

/7;A/5/�

I����$ %�%�$ ������*$ ��"� = "����$ ���� -788/. (����,

���� �� ��������� � +���� �� �� � �������� ��+����

�������������,�� ������� ����� �������� ������ * ���

� �� ��� � ��' ���$ ��$ 445A449�

5D5 %& �& -��� �� �& %& $ ���

� 5>>5 # ��*1� )������ ��$ ����� � ��� � �$ ��$ 558A5D5

Recommended