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Métodos de purificación de enzimasenzimas

Enzimas de productos marinosDr. José Luis Cárdenas López

Purificación de Proteínas

• Es un arte (las proteínas tienen personalidad irritable)

• Requiere conocimiento de la proteína– De qué célula proviene– De qué célula proviene– Qué parte de la célula– Qué hace

• Muy importante– Tamaño– Composición

Estrategia

• Mover de un organismo a proteína pura en los menos pasos posibles con la mínimapérdida de actividad (medible en un ensayo)ensayo)– Tiempo y temperatura son factores

Protocolos para Purificación de Proteinas

• Altamente específicos para cada caso• Usar un enfoque común

– Fraccionar el extracto crudo de tal manera que la proteína de interés se vaya al que la proteína de interés se vaya al precipitado o al sobrenadante

– Seguir el progreso con un ensayo funcional

Lactato Deshidrogenasa

• NADH + H+ + Piruvato �=�NAD+ + Lactato• La fuente obvia para la enzima es el tejido

muscular (corazón o esquelético, son isómeros)• Se ensayaría la habilidad de convertir piruvato a

lactatolactato

Comenzar con tejido intacto• Romper el tejido

– Licuadora, homogenizador

• Remover contaminantes– Centrifugación

• Precipitar/concentrar– Sulfato de Amonio

• Remover sales– diálisis

• Purificar– Cromatografía

• Analizar– Actividad, peso molecular, cantidad de proteína

Pp Sulfato de Amonio

• Amplio rango de aplicaciones• Se basa en que las proteínas pierden

solubilidad al incrementarse la concentración de salsal– Es característico para cada proteína particular– Resulta en una purificación partial de las proteínas

con características similares de solubilidad– Se debe determinar empíricamente la [sulf amonio]

que precipita la proteína de interés

• Produce “cortes de sal”

Salting in / Salting out

• Salting IN• A bajas concentraciones,

la sal añadida, normalmente incrementa la solubilidad de macromoléculas

• Salting OUT• A altas concentraciones

la sal añadida baja la solubilidad de las macromoléculas poreque compite por el solvente macromoléculas

cargadas porque la sal incrementa las interacciones carga-carga

• Por lo que las bajas [sal] previenen agregación y por lo tanto la precipitación y “salida”

compite por el solvente (H2O) necesario para solvatar las macromoléculas

• Por lo que las altas [sal] remueven la esfera de solvatación de las proteínas y “salen” de solución

Cosmótropo vs. Caótropo

• Sulfato de Amonio• Incrementar conc

causa a las proteinas precipitar de manera

• Urea• Incrementar conc

desnaturaliza las proteinas; cuando precipitar de manera

estable• Ion cosmotrópico =

ion estabilizante

proteinas; cuando finalmente precipitan, es de manera aleatoria y agregadas

• Ion Caotrópico = ion desnaturalizante

Diálisis

• Paso de solutos a través de una membrana semi-permeable

• Los poros en la membrana de diálisis son de cierto tamaño (controlable)

• La proteina se queda; el agua, las sales, los • La proteina se queda; el agua, las sales, los fragmentos de proteína y otras moléculas que sean menores que el poro salen

Cromatografía de Columna

Disponibles en cualquier volumen

Filtración en Gel

Principios de la filtración en gel (malla molecular )

106 Da3x105 Da105 Da

1. Aplicar una mezcla de proteínas a la columna de filtración en gel (Sepharose,

Sephacryl, etc)

2. Colectar fracciones,tipicamente 120 en

una columna de 1.5x100 cm No cambiar composición del buffer

3. Macromoléculas mas grandes eluyen primero

(mayor radio de Stoke)

4. Determinar proteina en

5. Estimar peso molecular aproximadode las proteínas desconocidas o de

los complejos proteicos con estándares de calibración de peso molecular conocido y la formula:

Kav = Ve -VoVt - Vo

Ve – volumen de eluciónVo – volumen vacíoVt – volumen total

105 Da104 Da

4. Determinar proteina en la fracción eluída con

un ensayo adecuado

Kav

Log Peso Mol.

Intercambio Iónico

Chromatografía de afinidad

Usar Adenosina-5’-monofosfato-5’-monofosfatoEsto es parte del NAD+. La LDH se unirá. Liberar la LDH añadiendo NADH

NAD+

AMP

Afinidad

• Recordar: NADH es un co-sustrato para lactato dehidrogenasa.

• Usar AMP-Sepharose: AMP está unido covalentemente al gel de afinidad, no pasará a través del filtrotravés del filtro

• LDH se unirá al AMP porque parece la mitad del NADH.

• Por lo que la LDH se queda inmovilizada en la columna hasta que se le añada NADH que se une más fuertemente que la LDH.

gráfica

Actividad

A280

NADH

Concentración de Proteína

• Lowry • A280

• Bradford• BCA• BCA• Starcher

Muy importante: proteína en solución, no absoluta

Lowry

• Paper más citado en biología• Ensayo colorimétrico• Proteínas se acomplejan con Cu2+ en solución

alcalina (rx de Biuret) y son inestables en el reactivo Folin Ciocalteureactivo Folin Ciocalteu

• Muchos interferentes (detergentes, HEPES, BME, agentes reductores)

• Más tardado que otros, pero es ensayo barato

A280

• Usa absorbancia intrínseca• Detecta residuos aromáticos

– Enlaces de resonancia

• Depende de la estructura de la proteina, • Depende de la estructura de la proteina, estado nativo y composición de AA

• Regla muy general: 1 mg/mL de BSA= valor de DO 1

Bradford

– Cuando la proteína se une a azul de commassie G 250 la Amax del colorante cambia de 465nm a 595nm

– Muy rápido (2 min), poca variación entre proteínas, tiene algunos interferentes como detergentes (triton X, SDS)

– Hay micrométodos (hasta .01 µg )– Hay micrométodos (hasta .01 µg )

BCA (Ácido bicinchonínico)

– Modificación de Lowry: ensayo breve (10 min),mayor sensibilidad (0.5 µg) y consistencia, resiste presencia de detergentes

– Proteínas se acomplejan con Cu2+ en solución alcalina, los iones del complejo se reducen a Cu+, que forman el color violeta con el BCAque forman el color violeta con el BCA

Starcher

• Es mas reciente (2001)• Proteína soluble e insoluble• Muy sensible, aunque muchos pasos• Poco afectada por diferencias entre • Poco afectada por diferencias entre

proteína (gelatina…..)• 2 pasos (rx ya muy antiguas y conocidas):

– hidrólisis (24 horas en HCl)– Rx con ninhidrina

Típico diagrama de flujo Ground sirloin(or alternative LDH source)

Place in blender, add buffer,homogenize

Initial meat suspension

Centrifuge

(save 1 ml)

Discard precipitate

Llevar contabilidad de todo (volumenes, gramos, etc)para cálculos de rendimientos, etc.

Ammonium sulfate precipitation, Centrifuge

Precipitate

Supernate

Step 2b

Remove dialysate,Store at -20oC

Cleared meat extract

(save 1 ml)precipitate

(save 1 ml)

Step 1

Discard remainder

Resuspend in buffer

Add PMSF,Dialyze

Step 2a

(save 1 ml)

Ejemplo de cromatograma

A280 V0

contaminant protein

LDH

A280 V0

fraction (tube) number (approximate only)

NADH added

0

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Cómo saber qué tan pura es la proteína

Tabla de Purificación (1ra parte)Volumen total

(ml)

V0 unidades por

ml

V0 unidades

TotalesUnidades

remanentes o

Rendimiento

(% del total)

Concentración

de Proteina

(mg/ml)

Proteína neta

(mg)

Actividad

específica

(V0/mg

proteina)

Step A B C D E F G

1. EC 100 mL 20 U 16 mg/mL 100 x 16 = 1600 mg

2. 10 mL 180 U 8 mg/mL 10 x 8 = 80 2. (NH4)2SO4

10 mL 180 U 8 mg/mL 10 x 8 = 80 mg

3. diálisis/ solucióninyectada a la columna

12 mL 140 U 7 mg/ mL 12x7= 84 mg

4. tuboscolectadosde la columnaafinidad

3 mL 200 U 1.3 mg/mL 1.3 x 3= 3.9 mg

Columna C = (Columna A)(Columna B)Columna F = (Columna A)(Columna E)Columna G = Columna C/Columna F = Columna B / Columna EColumna D = Columna C/primer valor en Columna C

Cómo saber qué tan pura es la proteína

Tabla de Purificación (1ra parte)Volumen total

(ml)

V0 unidades por

ml

V0 unidades

TotalesUnidades

remanentes o

Rendimiento

(% del total)

Concentración

de Proteina

(mg/ml)

Proteína neta

(mg)

Actividad

específica

(V0/mg

proteina)

Step A B C D E F G

1. EC 100 mL 20 U 100 x 20= 2000 U

100 % (2000/2000) x100

16 mg/mL 100 x 16 = 1600 mg

2000 U/ 1600 = 1.25 U/mg

2. (NH4)2SO4

10 mL 180 U 10 x 180 = 1800 U

(1800/2000)x100 = 90 %

8 mg/mL 10 x 8 = 80 mg

1800/80= 22.5 U/mg

3. diálisis/ solucióninyectada a la columna

12 mL 140 U 12 x 140= 1680 U (1680/2000)x

100= 84%

7 mg/ mL 12x7= 84 mg

1680/84= 20 U/mg

4. tuboscolectadosde la columnaafinidad

3 mL 200 U 3 x 200= 600 U (200/2000) x 100 =10%

1.3 mg/mL 1.3 x 3= 3.9 mg

600/3.9 = 154 U/mL

Columna C = (Columna A)(Columna B)Columna F = (Columna A)(Columna E)Columna G = Columna C/Columna F = Columna B / Columna EColumna D = Columna C/primer valor en Columna C

Tabla de Purificación (2da parte)

Total de actividad

(unidades)

Rendimiento(%)

Actividadespecifica

(V0/mg proteina)

Purificación(X)

Paso A B C D

1. EC 100 x 20= 2000 U

2000 U/ 1600 = 1.25 U/mg

2. (NH4)2SO4 10 x 180 = 1800 1800/80= 22.5 2. (NH4)2SO4 10 x 180 = 1800 U

1800/80= 22.5 U/mg

3. diálisis/

solución

inyectada a la

columna

12 x 140= 1680 U

1680/84= 20 U/mg

4. tubos

colectados de la

columna afinidad

3 x 200= 600 U 600/3.9 = 154 U/mL

Tabla de Purificación (2da parte)

Total de actividad

(unidades)

Rendimiento(%)

Actividadespecifica

(V0/mg proteina)

Purificación(X)

Paso A B C D

1. EC 100 x 20= 2000 U

100 % (2000/2000) x100

2000 U/ 1600 = 1.25 U/mg 1

x1002. (NH4)2SO4 10 x 180 = 1800

U(1800/2000)x100 = 90 %

1800/80= 22.5 U/mg 18

3. diálisis/

solución

inyectada a la

columna

12 x 140= 1680 U (1680/2000)x

100= 84%

1680/84= 20 U/mg

16

4. tubos

colectados de la

columna afinidad

3 x 200= 600 U (200/2000) x 100 =10%

600/3.9 = 154 U/mL 123

• En el directorio compartido de la computadora JOSELUISC pueden encontrar los manuales de GE (antes Pharmacia) de purificación de proteínas

¿Cómo verifico que efectivamente mi proteína está pura?

Separación de proteína usando SDS-PAGE(Laemmli systema)

Stackinggel

Resolvinggel

1. Aplicar muestra de proteina/colorante a los pozos del gel

2. Correr la electroforesis hasta que el colorante llegue al final del gel

3. Remover el gel delaparato y teñir las proteinas

SDS PAGE del proceso de purificación

1. Extracto crudo2. Precipitado con SA3. Intercambio Iónico3. Intercambio Iónico4. Filtración en gel 5. Afinidad

10 microgramos en cada carril

Por enfoque isoeléctrico

La proteína tiene una carga neta, al colocarla en un gradiente de pH, la proteína viaja hasta donde se descarga (pI)Luego se tiñe y da un patrón característico

Ejemplo

SDS PAGE (electroforesis)

¿Suficiente?

3 10

IEF (enfoque isoeléctrico)

¿Suficiente?

electroforesis de dos dimensiones

Pes

o m

olec

ular

Enfoque isoelectrico

Pes

o m

olec

ular

Pes

o m

olec

ular

Enfoque isoelectrico

Pes

o m

olec

ular

EXIEXITO

Pes

o m

olec

ular

ÉXITO

Enfoque isoelectrico

Pes

o m

olec

ular

Ese es el enfoque tradicional…proteína por

proteína…proteína…

Estudiar una a la vez…funciona…aunque

tardado…tesis doctoral…

Que tal si las estudiamos desde el punto de vista de la

PROTEÓMICA (o la PROTEÓMICA (o la metabolómica…)

ES decir, en conjunto…

• Tomar esa proteína del gel• Hidrolizarla (tripsina, una opción)• Secuenciar los péptidos (Sanger)• Buscar en las bases de datos péptidos

similares que coincidansimilares que coincidan• % similitudes• Identificar• Ver diferencias (secuencia, pesos

moleculares, etc)

Herramientas de bioinformática

• http://www.expasy.org/tools/

• http://prowl.rockefeller.edu/Secuencia: Secuencia: AFSTTGAMEG QQFRKTGKLV

SLSEQNLVDC SRPEGNEGCN GGLMDQAFQY IQDNAGLDTE ESYPYVGTDE DPCHYKPEFS AANETGFVDI PSGKEHAMMK AVAAVGPVSV AIDAGHESFQ FYESGIYYEK ECSSEELDHG VLVVGYGFEG EDVDGKKYWI VKNSWSEKWG DKGYIYMAKD RKNHCGIATA SSYPLV

• Probar peptide cutter• Probar peptide mass• Otros

• Gran cantidad de información en muy poco tiempo

Ventajas? Desventajas?