View
214
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
Mercoledi 17 Novembre
Mercoledi 24 Novembre
Aula GOLGI
Ore 15,00 - 16,00
Esercitazioni di Biochimica
Regolazione dell’Espressione Genica
Puo’ essere regolata in una delle seguenti sei fasi:
DNA RNAtranscript
mRNA mRNA
inactivemRNA
protein
inactiveprotein
NUCLEUS CYTOSOL
trascrizione Maturazione trasporto traduzione
degradazione
controllo dell’attivita’
Erythrocytes White blood cells
Mol
ecul
ar m
ass
kDa
10
200
pH pH4 410 10
Different cell types contain different proteins
Mol
ecul
ar m
ass
kD
a
10
200
Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis
Hb Hb
• Perche’ l’emoglobina e’ presente ad alti livelli negli eritrociti e assente nei globuli bianchi ?
• Hb e Hb sono I polipeptidi che insieme all’eme formano l’emoglobina dell’adulto
• Concentriamoci sulla -globina .
• Se la regolazione coinvolge la sua sintesi allora dovremo studiare le cellule che la producono, gli eritroblasti.
Differenziamento degli eritrociti
Il differenziamento delle cellule del sangue nel midollo
spinale
Myeloid stem cells
(Precursor cells)
Erythroblasts
(Fanno l’emoglobina)
White blood cells except lymphocytes
(non contengono emoglobina)
Erythrocytes
(contengono l’emoglobina)
Regulation of globin synthesis
White blood cells Erythroblasts
DNA
globin mRNA
globin Protein
Gene presente Gene presente
Proteina quasi completamente
assente
Proteina presente
? ?
Regulation of globin synthesis
White blood cells Erythroblasts
DNA
globin mRNA
Globin Protein
Gene presente Gene presente
Proteina quasi completamente
assente
Proteina presente
Quasi assentepresente in grandi
Quantita’
Meccanismi che Potrebbero portare ad un aumento dell’mRNA di Hb
negli eritrociti1. globin mRNA e’ trascritto negli eritrociti e nei globuli bianchi
ma in questi ultimi :
• Non e’ processato e poi e’ degradato• Processato ma rapidamente degradato
2. globin mRNA e’ trascritto negli eritrociti ma non nei globuli bianchi
• Un modo di misurare SOLO la velocita’ di trascrizione e’ :
RUN-OFF TRANSCRIPTION
• Nucei ISOLATI, continuano a sintetizzare l’RNA
(run-off RNA), ma non iniziano nuove molecole di
RNA
• I nuclei sono incubati con ATP radioattivo.
• I run-off RNA sono isolati, separati e identificati.
• Un forte segnale significa che al momento dell’isolamento dei nuclei la cellula stava producendo molto RNA.
Run-off transcription
5’
5’
5’
5’
5’
Nessun nuovo inizio
Nessun nuovo inizio
Run-off transcription in vitro
precursori RadioactiviResult of hybridisation
globin
Run-off transcripts from Eritroblasti
Run-off transcripts from Gobuli Bianchi
Positive control,actin
Positive control, actin
globin
filterfilter
L’esperimento ci dice :
Negli eritroblasti il gene della globina e’ trascritto molto velocemente
Nei globuli bianchi la sua velocita’ di trascrizione e’ bassissima
globin
globin
Quindi la globina e’ presente solo negli eritroblasti perche’ qualche cosa influenza la
trascrizione del suo gene.
Controllo del livello di ferro nella cellula
• Il ferro e’ un nutriente essenziale
• La cellula lo usa per : citocromi, emoglobina e molti enzimi.
• Il ferro in eccesso e’ causa di formazione di radicali liberi
• Quindi il livello di ferro deve essere controllato accuratamente.
Fe 2+
Sangue
Fe 3+
Transferrin(trasporto)
Transferrinreceptor (ingresso)
Ferritin (Stoccaggio)
Regolazione di proteine trasportatrici/immagazzinamento del
ferro
• Quando il ferro e’ in eccesso la cellula deve diminuire il livello del recettore e aumentare quello della ferritina.
• La cellula ottiene questo mediante regolazione della traduzione,• Cosi la risposta e’ piu’ rapida
Controllo della Traduzione
1. Repressione - es. Iron Response Element della ferritina2. Stabilizzazione- es. IRE del recettore della transferrina
Ferritina - Lega il Ferro e lo conservaRecettore della Transferrina (TFR)- trasporta il ferro nella cellula
Se il Ferro e’ nella cellula - Si Ferritina, No TFRSe non c’e’ Ferro - Si TFR, No Ferritina
Come viene regolato tutto questo?
M
Coding region
AUG
Fe
m7G
Iron Response Element
IRE-BP (cytosolic aconitase)
Fe
M
Fe
Ferritin mRNA
Coding region
AUG
1. Repressione :-Ferro, ferritina NO
2. Attivazione:+ Ferro, ferritina SI
M
Coding region
AUG
m7G
Iron Response Element
IRE-BP (cytosolic aconitase)
Fe
M
Fe
TFR mRNA
Coding region
AUG
1. Stabilizzazione:- Ferro, TFR SI
2. Degradazione:+ Ferro, TFR NO
Coding region
AUG
m7G
Iron Response Element
IRE-BP (cytosolic aconitase)
TFR mRNA
Coding region
AUG
1. Stabilizzazione:- Ferro, TFR SI
2. Degradazione:+ Ferro, TFR NOFe
RNAse
Il ferro previene il legame di una proteina di 90 kDa ad uno o piu’ Iron Response Elements.
•Recettore della Transferrina.
Stem loop al 3’. La presenza dello stem loop causa la degradazione dell’mRNA
Ferritina
Stem loop al 5’. La presenza della proteina sullo stem loop causa il blocco della traduzione.
Purificazione degliIntermedi dellatraduzione
CICLOEXIMMIDE: interferisce conLa reazione della peptidil transferasi(arresto dei ribosomi 80S sull’AUG)
GMP-PNP (Analogo del GTP pero’Non-idrolizzabile): GTP richiesto perL’unione della subunita’ 60S al complesso40S/mRNA
CAP analogo:inibisce il legame della40S all’mRNA
CENTRIFUGAZIONE IN GRADIENTE DI DENSITA’
WT-IRE: IRE come e’ nella Ferritina
C-IRE: IRE con una delezione
Componenti del ComplessoChe lega il CAP
NOTA BENE: all’inizio della traduzione il legame della 40S all’mRNA richiedeIl legame del “CAP binding Complex” al cappuccio dell’mRNA
NOTA: Il legame della 40S al CAP dell’mRNA richiede l’interazione di elF3 (che e’ legatoAlla 40S) con elF4 (legato al CAP)
Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH- + OH°
La presenza di acqua ossigenata o ossido nitrico rende attiva IRP-1 (che e’ la IRE bindingProtein piu’ abbondante) che quindi causa un aumento del recettore della transferrina
Il ferro viene rimosso dal sangue e non genera radicali liberi!
DMT1
DMT2
Quindi DMT1 e’l’unico regolabiledal Ferro
DMT2DMT1
Se non e’ presente abbastanza FeNella cellula del Duodeno vieneIndotta la sintesi di DMT1
Recommended