MEDII DE CULTURA

MEDII DE CULTURA

CATEDRA DE MICROBIOLOGIELP 4

• Cultivarea bacteriilor in microbiologia clinica are drept scop:

izolarea bacteriilor din prelevatele patologice

identificarea bacteriilor

testari pentru initierea si monitorizarea terapiei antimicrobiene.

• Prelevatele patologice odata receptionate si triate calitativ, microbiologul trebuie sa hotarasca:

mediile de cultura si metodele indicate pentru izolare

atmosfera, temperatura si intervalul de timp, necesare pentru izolarea tuturor microorganismelor cu semnificatie clinica din prelevatul examinat

izolatele cu semnificatie clinica, algoritmul si stadiul pana la care conduce identificarea acestora

daca antibiograma este indicata si care din rezultatele ei se impun communicate.

• Mediile de cultura sunt folosite pentru cultivarea bacteriilor.

• Ele se comercializeaza ca atare, sub forma liofilizata, gelificata sau gata turnate in placi Petri sau pot fi manufacturate in multe laboratoare.

• Ingredientul de baza al mediilor de cultura este geloza sau agar – agar.

• agar-agarul (numit și geloză) este un produs organic, hidro - coloidal ce se întâlnește într-o serie de alge marine – alge rosii (agarofite), din care este extras cu ajutorul apei fierbinți.

• se prezintă sub formă de fâșii semitransparente de culoare cafenie-gălbuie.

• conține: 70–80% polizaharide, 10–20% apă și 1,5–4% substanțe minerale.

• este format din resturi galactozidice esterificate la C6 cu o grupare sulfonică.

• are o putere de gelificare foarte mare.

• Agarul este folosit la prepararea mediilor de cultura pentru ca asigura suprafata solida pe care cresc bacteriile si fungii.

• Cresterea bacteriilor nu distruge structura gelului deoarece cele mai multe bacterii sunt incapabile sa utilizeze agarul pentru metabolism.

• Agarul este comercializat sub forma de pulbere, care in amestec cu apa si incalzit la 100 °C ramane lichid, iar pe masura ce se raceste la 40 °C se gelifica.

• Mediul cu agar este un mediu relativ inert.

• Alte ingrediente, nutrienti, factori de crestere, indicatori de pH sunt adaugati in mediul cu agaroza.

MEDII DE CULTURACLASIFICARE

• Din punct de vedere a starii de agregare: medii lichide

medii solide

medii semisolide

MEDII DE CULTURACLASIFICARE

• Medii lichide – bulioane

Au utilizare restransa: izolarea din prelevate necontaminate (ex.

sange, exsudate din seroase, aspiratii din colectii purulente profunde, biopsii tisulare prin ac

MEDII DE CULTURAMedii lichide

• Izolarea in medii lichide:Avantaje:

cea mai sensibila metoda de izolare in vitro (cultura poate fi initiata de un numar redus de bacterii, volumul prelevatului insamantat poate fi crescut)

neutralizeaza prin dilutie factori antimicrobieni din prelevatul examinat

MEDII DE CULTURACLASIFICARE

Mediile solide pot fi:

neselective

diferentiale

selective

MEDII DE CULTURAMEDII SOLIDE

• Medii neselective: agarul imbogatit cu 5% sange de berbec –

mediul neselectiv cel mai folosit pentru insamantarea prelevatelor necontaminate si a unora din cele contaminate

Ex.: - exsudate din caile respiratorii si din cavitatile conecte - exsudat conjunctival - puroi

MEDII DE CULTURAMEDII SOLIDE

• Medii diferentiale – contin substratul pentru o anumita enzima sau citotoxina bacteriana si un indicator de pH

Ex.: - geloza – sange: diferentiaza bacteriile hemolitice de cele nehemolitice

- medii lactozate, cu variati indicatori de pH, diferentiaza enterobacteriile care fermenteaza lactoza (lactozo – pozitive) de cele care nu fermenteaza lactoza (lactozo – negative)

MEDII DE CULTURAMEDII SOLIDE

• Medii selective – contin substante care inhiba dezvoltarea bacteriilor de contaminare a prelevatelor.

• Exista o diversitate de medii selective.

MEDII DE CULTURAMEDII SOLIDE SELECTIVE

• Pentru izolarea enterobacteriaceelor din prelevate contaminate exista medii cu trei niveluri de selectivitate: slab selective: - mediul Mac Conkey (agenti

inhibitori: saruri biliare si cristal violet) - mediul EMB (Levin) (agenti

inhibitori: eozina Y si albastru de metilen) Inhiba bacteriile Gram (+).

MEDII DE CULTURAMEDII SOLIDE SELECTIVE

moderat selective: - mediul Salmonella – Shigella

- mediul ADCL (Agar Dezoxicholat Citrat Lactoza)

- mediul Hektoen - mediul XLD - mediul Istrati – Meitert Agenti inhibitori: saruri biliare si verde briliant Inhiba bacteriile Gram (+) si o parte din bacilii

Gram (-) comensali.

MEDII DE CULTURAMEDII SOLIDE SELECTIVE

medii inalt selective: - mediu Wilson – BlairAgent inhibitor: verde briliantInhiba o gama larga de bacterii pentru a facilita izolarea salmonelelor.

MEDII DE CULTURAMEDII SOLIDE SELECTIVE

• Agarul – sange poate fi facut selectiv pentru izolarea unor patogeni pretentiosi nutritiv prin adaos de antibiotice: colimicina si acidul nalidixic: inhiba dezvoltarea bacteriilor Gram (–) si favorizeaza dezvoltarea celor Gram (+) bacitracina: inhiba dezvoltarea bacteriilor Gram (+) si favorizeaza izolarea hemofililor kanamicina si vancomicina: favorizeaza izolarea bacililor Gram (-) anaerobi etc.

MEDII DE CULTURA

• MEDII DE IMBOGATIRE: - medii lichide, care prin anumite substante inhibitoare prelungesc faza de lag a bacteriilor de contaminare, fara a intarzia insa intrarea anumitor patogeni in faza exponentiala.

Ex.: bulion cu selenit acid de Na.: preincubarea materiilor fecale 18 h. la 37°C in acest mediu, favorizeaza izolarea salmonelelor.

INCUBAREA CULTURILOR

- temperatura: 37°C – majoritatea bacteriilor 20 - 30°C – unele bacterii (Yersinia enterocolitica, Y. pseudotuberculosis, Listeria monocytogenes) 42°C – altele: Campylobacter jejuni / coliSe foloseste pentru incubare termostatul.

INCUBAREA CULTURILOR

• Atmosfera: in prezenta O2 – bacterii aerobe si facultativ

anaerobe in mediu cu 5 – 10 % CO2 – bacterii

carboxifile in mediu cu O2 (5 – 7 %), CO2 (8 – 10%), N2

(85%) – bacterii microaerofile

INCUBAREA CULTURILOR in mediu anaerob: Procedee chimice: bulioane cu ingrediente reducatoare (acid thioglicolic

sau thioglicolat de Na. tehnica OTT: incinta etansa in care O2 este

indepartat prin reactia cu pirogalolul in mediu alcalin.Procedee biologice: procedeul Tarozzi: utilizeaza tuburi cu bulion nutritiv in

care agent reducator sunt fragmente de organe proaspete de animal prelevate aseptic (ficat, rinichi)

CARACTERE DE CULTURA

• Exigente de cultivare• Intervalul necesar pentru obtinerea culturii• Aspectul si consistenta coloniilor• Modificari ale mediului• Mirosul degajat de cultura

Aceste caractere orienteaza identificarea izolatelor!

CARACTERE DE CULTURA Exigente de cultivare

• Bacterii nepretentioase

• Bacterii cu anumite exigente nutritive:- Strict aerobe- Strict anaerobe- Facultativ anaerobe- Microaerofile- Carboxifile

CARACTERE DE CULTURAIntervalul necesar pentru aparitia

culturii

• Microorganisme cu crestere rapida: cultura apare dupa 18 – 24 h. (frecvent peste noapte)

• Microorganisme cu crestere lenta: necesita zile sau saptamani pentru aparitia culturii

CARACTERE DE CULTURAMorfologia coloniilor

1. Dimensiune: mm. colonii mici (Ø < 1 mm.) colonii mijlocii (Ø ~ 1 mm.) microcolonii (vizibile numai cu stereomicroscopul) colonii mari (Ø > 2 mm.)

2. Forma: punctiforme circulare neregulate (“in harta geografica”) filamentoase dendritice lenticulare

CARACTERE DE CULTURAMorfologia coloniilor

3. Relieful: plane aplatizate convexe bombate acuminate pulvinate ombilicate

CARACTERE DE CULTURAMorfologia coloniilor

4. Marginile: intregi ondulate lobate zimtate filamentoase cu valuri succesive de invadare a mediului

CARACTERE DE CULTURASuprafata coloniilor

• Neteda, umeda, lucioasa – forma de cultura S – conditionata de hidrofilia si incarcatura electronegativa a structurilor microbiene de invelis

• Mata, uscata, rugoasa – forma de cultura R a microorganismelor cu hidrofilie si incarcatura electronegativa reduse

CARACTERE DE CULTURASuprafata coloniilor

• Alte aspecte: - suprafata papilata - cu striuri radiare - zbarcita - catifelata - pufoasa - lanoasa - prafoasa

CARACTERE DE CULTURADensitatea optica

Colonii: • transparente• semitransparente• opace

CARACTERE DE CULTURA

• Irizatii ale suprafetei unor colonii: pot fi surprinse anumite unghiuri de iluminare

• Culoarea coloniilor: - alba- galbena- aurie- neagra,

in functie de varietatea pigmentilor produsi sau a virajului de culoare a unor indicatori introdusi in mediu.

CARACTERE DE CULTURA

• Modificari ale mediului din jurul coloniilor: pot fi produse de citotoxine, enzime sau pigmenti difuzibili. Hemoliza pe agar – sange Reactii pe medii diferentiale zaharate Reactii pe mediul cu galbenus de ou Pigmentogeneza

CARACTERE DE CULTURAHemoliza pe agar - sange

• alfa: zona de inverzire a mediului cu numeroase hematii intacte din cauza hemolizei partiale

• beta: zona complet clara, incolora, din cauza hemolizei complete

• alfa – prim: halou de hemoliza incompleta cu inverzire, imediat inconjurat cu o zona de hemoliza clara, completa

• gamma: absenta hemolizei• cald – rece: zona clara de hemoliza completa (aparuta

dupa incubare la 37°C) inconjurata cu o zona de hemoliza mai putin clara, dar fara modificare de culoare a mediului (aparuta dupa incubarea in continuare la frigider)

CARACTERE DE CULTURAReactii pe medii diferentiale

zaharate

• Virajul de culoare a mediului• Culoarea coloniilor in functie de indicatorii

de pH• Fermentarea / Nefermentarea substratului

CARACTERE DE CULTURAReactii pe medii cu galbenus de ou

• Lecitinaza: precipitat opac in jurul coloniilor

• Lipaza: film circular cu irizatie perlata in imediata vecinatate a coloniilor

• Proteoliza: clarificarea mediului din jurul coloniilor

CARACTERE DE CULTURAPigmentogeneza

• Pigmenti hidrosolubili difuzeaza si coloreaza progresiv mediul:- fluoresceina- piocianina- melanina

CARACTERE DE CULTURAMirosul degajat de cultura

• Pseudomonas aeruginosa: aroma asemanatoare florilor de iasomie

• Proteus: socolata arsa• Clostridii: putri, fecaloid, de corn ars• Prevotella melaninogenica: acru• Nocardiile si streptomicetele: de subsol

mucegait

CARACTERE DE CULTURAConsistenta coloniilor

• untoasa• mucoasa – filanta• “albusului de ou bine batut spuma”• friabila• cretoasa• pasloasa• pieloasa

CARACTERE DE CULTURAAderenta la mediu

• neaderente (antrenate de ansa aluneca pe suprafata mediului)

• putin aderente• aderente• incastrate in mediu