View
9
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
Maapähkinää (Arachis hypogaea) ja kudzua (Pueraria lobata)nystyröivien kiinalaisten Bradyrhizobium-kantojen geneettinen
diversiteetti ja sukulaisuus.
Iiris Mattila
Mikrobiologian pro gradu –työ
Soveltavan kemian ja mikrobiologian laitos
Helsingin yliopisto
Maaliskuu 2007
HELSINGIN YLIOPISTO HELSINGFORS UNIVERSITET UNIVERSITY OF HELSINKI
Tiedekunta/Osasto Fakultet/Sektion Faculty
Maatalous- metsätieteellinen tiedekuntaLaitos Institution Department
Soveltavan kemian ja mikrobiologian laitosTekijä Författare AuthorIiris MattilaTyön nimi Arbetets titel TitleKiinalaista maapähkinää (Arachis hypogaea) ja kudzua (Pueraria lobata) nystyröivien Bradyrhizobium-kantojen sukulaisuus ja geneettinen diversiteetti.Oppiaine Läroämne SubjectMikrobiologiaTyön laji Arbetets art Levelpro gradu –työ
Aika Datum Month and year5.3.2007
Sivumäärä Sidoantal Number of pages82 s. + liitteet 6 s.
Tiivistelmä Referat AbstractBradyritsobit tunnetaan useiden erilaisten palkokasvien typensitojasymbiontteina. Ne muodostavatsymbiooseja esimerkiksi maailmanlaajuisesti tärkeiden viljelykasvien soijapavun (Glycine max) jamaapähkinän (Arachis hypogaea) kanssa. Bradyrhizobium-suvun edustajien ekologiasta, evoluutiosta jataksonomiasta tiedetään toistaiseksi melko vähän. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tarkastellakiinalaisten, maapähkinää, kudzua (Pueraria lobata) ja eräitä muita palkokasveja nystyröivienBradyrhizobium-kantojen sukulaisuutta, geneettistä diversiteettiä sekä suhdetta muun maailmanbradyritsobeihin. Maapähkinä on alunperin eteläamerikkalainen viljelykasvi, joka nystyröityy eri tavoin kuinesimerkiksi soijapapu. Eräs tämän tutkimuksen taustalla olevista kysymyksistä oli, mistä Kiinaan tuotuamaapähkinää nystyröivät bradyritsobit ovat peräisin, ja miten symbioosigeenien horisontaalinensiirtyminen maan (brady)ritsobipopulaatioissa on vaikuttanut symbioosin kehittymiseentulokaspalkokasvissa.
Etsin kysymyksiin vastauksia analysoimalla Bradyrhizobium-kantojen erilaisia geenejä RFLP-menetelmälläsekä kokonaista genomia AFLP-menetelmällä. Ydingeenien glnII ja recA, symbioosigeenien nifH ja nodCsekä ITS-alueen perusteella Bradyrhizobium-kannoista muodostui ryhmiä, jotka heijastivat kantojensukulaisuutta. Suurin osa tutkimistani kannoista oli eristetty maapähkinän (Arachis hypogaea) tai kudzun(Pueraria lobata) juurinystyröistä, lisäksi otin mukaan kansainvälisiä tyyppi- ja vertailukantoja. Käytinseuraavia kantoja: 22 maapähkinäkantaa (17 kiinalaista kantaa ja 5 vertailukantaa), 17 kudzua nystyröivääkantaa, 6 tyyppikantaa (Arachis-, Glycine-, Chamaecytisus- ja Vigna-sukuisia isäntäkasveja), 4Lespedeza-sukua nystyröivää kantaa sekä 9 kiinalaisia luonnonkasveja (Indigofera, Acacia,Aeschyomene, Phaseolus) nystyröiviä kantoja.
Tulokset selvittivät kiinalaista maapähkinää nystyröivien Bradyrhizobium-kantojen suhdetta muihinkiinalaisiin sekä kansainvälisiin Bradyrhizobium-kantoihin: i) Maapähkinää vaikutti nystyröivän useitaerilaisia mutta läheisessä sukulaisuussuhteessa olevia kantoja. ii) Maapähkinää ja kudzua nystyröivätkannat olivat erilaisia. iii) Kudzua nystyröi kaksi hyvin erilaista ryhmää, joista toinen sisälsi B. elkanii -kantoja ja toinen B. japonicum -kantoja. iv) Kansainväliset tyyppi- ja vertailukannat olivat kiinalaisillekannoille kaukaisempia sukulaisia. Kaiken kaikkiaan tutkittujen Bradyrhizobium-kantojen geneettinendiversiteetti oli suuri. Lisäksi huomattiin, että analysoidut geenit ryhmittyivät eri tavoin.
Maataloudessa voidaan energiansäästöön ja ekologiseen kestävyyteen käyttämällä hyväksi palkokasvienja ritsobien muodostamaa typensidontasymbioosia. Onnistuneen symbioosin aikaansaamiseksi onkuitenkin tärkeää tuntea symbioosin toiminta ja symbioosin osapuolten vaatimukset. Tämän takiaritsobitutkimus on tärkeää tulevaisuudessakin.Avainsanat Nyckelord Keywords
Bradyrhizobium, palkokasvi, nystyröinti, typensidonta, horisontaalinen geeninsiirto, symbioosigeeni,ydingeeni, ITS-alue, kromosomiSäilytyspaikka Förvaringsställe Where deposited
Muita tietoja Övriga uppgifter Further information
KiitoksetHaluan kiittää dos. Kristina Lindströmiä sekä ohjauksesta että tämän työn toteuttamisen
mahdollistamisesta. Kiitän myös dos. Lindströmin luotsaamaa "typpiryhmää" tutkijoineen
saamastani henkisestä tuesta ja useista käytännön neuvoista. Suuri kiitos MMT Leena A.
Räsäselle kärsivällisestä työn ohjaamisesta, neuvoista sekä laboratoriossa että tekstin tuottamisen
aikana, ja vielä kaikista tunneista joita omasta ajastasi korjausvaiheessa kulutit. Kiitos dos. Leena
Suomiselle tärkeästä kannustuksesta, kun kirjoittaminen oli vaikeinta, sekä raakileen
kommentoinnista. Kiitokset Paula Kokko-Gonzalesille kärsivällisestä tähän työhön liittyneisiin
laboratoriorutiineihin perehdyttämisestä sekä Tuomas Olkkoselle tätä tutkimusta varten tehdystä
esityöstä, eli erilaisten alukkeiden testaamisesta tutkituille kannoille.
Kaikista suurin kiitos Tuomas Mattilalle henkisestä tuesta, suurta apua tuoneista matemaattisista
oppitunneista ja teoreettisista keskusteluista, kriittisistä mielipiteistä aina pyydettäessä, sekä
varauksettomasta ja aidosta kiinnostuksesta työtäni ja sen tekijää kohtaan.
100
100
95
100
85
92
100
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
B.
Aneta Dresler-Nurmi
Zewdu Teref ework
Paula Kokko-Gonzales
Tuomas Olkkonen.
Leena Suominen
Kristina Lindström
Leena A. RäsänenISÄ
ÄITI
TUOMAS
sp.
i
Pueraria
Asiantuntijakommentit
Asiantuntijakommentit
Labra-apu
Labra-apu
Kirjoitustuki
Kirjoitustuki, tutkimus
Ohjaus
100
100
95
100
85
92
100
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
B.
Aneta Dresler-Nurmi
Zewdu Teref ework
Paula Kokko-Gonzales
Tuomas Olkkonen.
Leena Suominen
Kristina Lindström
Leena A. RäsänenISÄ
ÄITI
TUOMAS
sp.
i
Pueraria
Asiantuntijakommentit
Asiantuntijakommentit
Labra-apu
Labra-apu
Kirjoitustuki
Kirjoitustuki, tutkimus
Ohjaus
100
100
95
100
85
92
100
100
100
95
100
85
92
100
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
B.
Aneta Dresler-Nurmi
Zewdu Teref ework
Paula Kokko-Gonzales
Tuomas Olkkonen.
Leena Suominen
Kristina Lindström
Leena A. RäsänenISÄ
ÄITI
TUOMAS
sp.
i
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
B.
Aneta Dresler-Nurmi
Zewdu Teref ework
Paula Kokko-Gonzales
Tuomas Olkkonen.
Leena Suominen
Kristina Lindström
Leena A. RäsänenISÄ
ÄITI
TUOMAS
sp.
i
Pueraria
Asiantuntijakommentit
Asiantuntijakommentit
Labra-apu
Labra-apu
Kirjoitustuki
Kirjoitustuki, tutkimus
Ohjaus
LyhenteetSTH infektio sivujuuren tyvihalkeaman kautta
ITS internally transcribed sequence
AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism
HUM hiivauute-mannitoli
TY tryptoosi-hiivauute
PCR polymerase chain reaction
MDS multi-dimensional scaling
HAMBI Helsingin yliopiston mikrobiologinen kantakokoelma
CCBAU Culture Collection of Beijing Agricultural University
USDA the United States Department of Agriculture
LMG Collection of the Laboratorium voor Microbiologie en Microbie
UPGMA Unweighed Pair Group Method with Averages
Tiivistelmä
Kiitokset
Lyhenteet
1. Kirjallisuuskatsaus ...........................................................................................................1
1. 1 Typensidonta .............................................................................................................1
1.1.1 Typensidonnan biokemiaa .....................................................................................1
Nitrogenaasientsyymi ...................................................................................................1
Nitrogenaasin toiminta ..................................................................................................2
1.1.2 Typensidonnan mikrobiologiaa................................................................................3
Vapaana elävät typensitojat..........................................................................................4
Symbionttiset typensitojat .............................................................................................4
1.1.3 Biologisen typensidonnan merkitys .........................................................................4
1.2 Palkokasvit.....................................................................................................................5
1.2.1 Yleistä .....................................................................................................................5
1.2.2 Tässä tutkimuksessa käytettyjen ritsobikantojen isäntäksvit ...................................6
Maapähkinä (Arachis hypogaea) ..................................................................................6
Kudzu (Pueraria lobata)................................................................................................8
Soijapapu (Glycine max)...............................................................................................9
Lespedeza sp. & Indigofera sp. .................................................................................10
1.3. Ritsobit........................................................................................................................11
1.3.1 Yleistä ...................................................................................................................11
1.3.2 Ritsobien geenit.....................................................................................................11
Ylläpitogeenit ..............................................................................................................12
Symbioosigeenit .........................................................................................................12
Geenien siirtyminen....................................................................................................13
1.3.3 Taksonomia...........................................................................................................14
Yleistä.........................................................................................................................14
Tutkimusmenetelmät ..................................................................................................17
1.4. Bradyrhizobium-suku ..................................................................................................18
1.4.1 Yleistä ...................................................................................................................18
1.4.2 Bradyrhizobium-lajit...............................................................................................18
1.4.3 Bradyritsobien taksonomia ....................................................................................19
1.4.4 Bradyritsobien genomi...........................................................................................21
Bradyritsobien genominen diversiteetti .......................................................................21
Lateraalinen geeninsiirto.............................................................................................21
1.5 Palkokasvin ja ritsobin välinen symbioosi ....................................................................21
1.5.1 Yleistä ...................................................................................................................21
Symbioosin merkitys eri osapuolille ............................................................................22
1.5.2 Vuoropuhelu..........................................................................................................22
Symbioosin onnistumiselle oleelliset molekyylit ..........................................................22
1.5.3 Infektioprosessi .....................................................................................................23
Soijapapu infektoituu juurikarvan kautta ja ritsobit etenevät infektiokäytävää pitkin ...24
Maapähkinän infektioprosessi: sivujuuren tyvihalkeaman kautta (STH) ja
solunsisäisesti leviten .................................................................................................25
1.5.4 Nystyrätyypit..........................................................................................................26
Indeterminantti eli jatkuvasti kasvava nystyrä.............................................................27
Determinantti eli rajatusti kasvava nystyrä..................................................................27
1.5.5 Nystyräsolukon infektoituminen.............................................................................28
Juurinystyrän toiminta.................................................................................................28
Kokeellinen osa .................................................................................................................30
2. Työn tarkoitus ................................................................................................................30
3. Materiaalit ja menetelmät...............................................................................................31
3.1 Bakteerikannat .........................................................................................................31
Kantojen kasvatus ......................................................................................................32
Puhdasviljelmät...........................................................................................................32
Puhdistettujen kantojen säilöminen pakkaseen (-70°C)..............................................32
DNA:n eristys..............................................................................................................32
3.2 Käytetyt geenitekniset menetelmät...........................................................................35
3.2.1 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)............................................35
3.2.3 PCR (Polymerase Chain Reaction) ...................................................................36
3.2.4 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) .........................................36
3.5 Tulosten käsittely......................................................................................................39
Dendrogrammien rakentaminen BioNumerics-ohjelmalla...........................................39
MDS (Multi-Dimensional Scaling) ...............................................................................39
Tilastolliset testit .........................................................................................................39
4. Tulokset .........................................................................................................................40
4.1 Käsiteltyjen kantojen ominaisuudet ..........................................................................40
4.1.1 Bradyrhizobium-kantojen kasvu.........................................................................40
4.1.2 Bradyrhizobium-kantojen geenien monistuminen ..............................................41
4.2 Bradyrhizobium-kantojen kokonaisgenomin diversiteetti AFLP-menetelmällä
analysoituna ...................................................................................................................42
4.3 Yksittäisten geenien suhde toisiinsa ja kokonaisgenomiin analysoituina RFLP-
sormenjälkien avulla.......................................................................................................45
4.3.1 ITS.....................................................................................................................47
4.3.2 recA ...................................................................................................................49
4.3.3 glnII ...................................................................................................................51
4.3.4 nifH ....................................................................................................................53
4.3.5 nodC ..................................................................................................................55
5. Tulosten tarkastelu.........................................................................................................57
5.1 Tässä työssä käytettyjen metodien soveltuvuus taksonomiatutkimuksissa..............58
5.1.1 Yksittäisten geenien suhde 16S rDNA-perusteiseen lajinmääritykseen
Bradyrhizobium-suvussa, sekä sormenjälkimenetelmien tulkittavuus.........................58
5.1.2 Tyyppikantojen käyttö tutkimuksissa..................................................................59
5.1.3 UPGMA-dendrogrammit samankaltaisuuden kuvaajina ....................................59
5.2 Tutkittujen bradyritsobien geneettinen diversiteetti...................................................60
5.2.1 Tilastollisten testien tulokset heikensivät analyysitulosten luotettavuutta ja
tulkittavuutta ...............................................................................................................60
5.2.2 AFLP maapähkinää ja kudzua nystyröivien Bradyrhizobium-kantojen genomisen
diversiteetin kuvaajana ...............................................................................................61
5.2.3 Genomisen diversiteetin heijastuminen ITS-alueeseen .....................................62
5.2.4 Ydin- ja symbioosigeenien erilaisen ryhmittymisen taustaa...............................62
5.2.5 Typensidonnan tehokkuuden mahdolliset vaikutukset genomiin .......................65
5.2.6 Palkokasvien juurinystyröiden erilaisten infektiomekanismien heijastuminen niitä
nystyröivien bakteerikantojen diversiteettiin................................................................67
5.3 Maapähkinää (Arachis hypogaea) ja kudzua (Pueraria lobata) nystyröivät
bradyritsobit horisontaalisen geeninsiirron valossa ........................................................67
5.4 Typensitojabakteereiden käyttö - tulevaisuuden mahdollisuus?..........................70
6. Johtopäätökset ..............................................................................................................71
7. Kirjallisuus......................................................................................................................73
Liiteluettelo:
Liite 1. Alustat
Liite 2. Geelit
Liite 3. DNA:n eristys
Liite 4. Reagenssit
Liite 5. PCR-ohjelmat
1
1. Kirjallisuuskatsaus
1. 1 TypensidontaTyppi on biologisille prosesseille tärkeä alkuaine aminohappojen, proteiinien ja entsyymien
rakennusosana. Kasveille typen ja veden saatavuus ovat yleensä kasvua rajoittavia tekijöitä.
Ilmakehässä typpeä on runsaasti (21 %), mutta kaksiatomisena molekyylinä (N2) se ei ole kasvien
saatavissa. Kasvit käyttävät kasvuunsa nitraatti- ja ammoniumtyppeä (NO3-, NH4
+), joita on
muodostunut maahan mikrobien hajottaessa typpipitoista orgaanista ainesta, kuten kasvi- ja
eläinjätteitä tai kuollutta mikrobistoa. Useat mikrobit kykenevät myös pelkistämään typpeä suoraan
ilmakehästä kasveille käytettävään muotoon. Ilmakehän molekulaarisen typen pelkistämistä
ammoniumioniin ja sitä kautta orgaanisiksi yhdisteiksi, kutsutaan typensidonnaksi (Madigan ym.
2003, Burris 1999).
1.1.1 Typensidonnan biokemiaa
Ilmakehän typpimolekyyli N2 on sisältämänsä kovalenttisen kolmoissidoksen takia erittäin stabiili, ja
sen sidosten rikkominen vaatii runsaasti energiaa. Yhden typpimolekyylin pelkistämiseen kuluu
laboratorio-oloissa vähintään 16 ATP-molekyyliä (Burris 1999). Myös vetyä tarvitaan reaktion
toteuttamiseen. Kokonaisreaktio on lievästi eksoterminen. Typensidonnan kaava on seuraava:
N2 + 8H+ + 8e- 2NH3 + H2
NitrogenaasientsyymiTyppeä sitovassa organismissa typensidontareaktiota katalysoiva nitrogenaasientsyymi koostuu
kahdesta pienemmästä entsyymikomponentista: dinitrogenaasista (1-komponentti) ja
dinitrogenaasireduktaasista (2-komponentti). Dinitrogenaasi (kuva 1, vas.) rakentuu kahdesta
identtisestä alayksiköstä, joita rauta-rikki-kompleksit (Fe4S4) pitävät yhdessä (Burris 1999, Ludden
1999). Dinitrogenaasireduktaasi (kuva 1, oik.) on puolestaan tetrameeri, joka koostuu kahdesta α-
ja kahdesta β-alayksiköstä (Madigan ym. 2003). α-alayksiköissä kofaktoreina toimivat rauta-
molybdeeni –kofaktorit ja β-alayksiköissä P-klusterit. Kofaktorit liittävät yksiköt toisiinsa ja toimivat
elektroninsiirtäjinä typenpelkistysreaktiossa (Burris 1999). Jotkut mikrobit kykenevät sitomaan
typpeä vaihtoehtoisilla nitrogenaasientsyymeillä, joissa ei ole F-Mo-kofaktoria, vaan molybdeenin
sijasta käytetään vanadiinia tai rautaa. Vaihtoehtoisia entsyymejä tuotetaan vain, jos molybdeenia
ei ole saatavilla (Madigan ym. 2003, Burris 1999, Ludden 1999).
2
Kuva 1. Nitrogenaasientsyymin dinitrogenaasi (vasemmalla hapettunut ja pelkistynyt muoto) ja
dinitrogenaasireduktaasi (oikea; Ludden 1999).
Nitrogenaasin toimintaTypensidontareaktiossa elektronit kulkevat elektronin luovuttajalta nitrogenaasientsyymin kautta
typpimolekyylille N2. Aluksi ATP sitoutuu dinitrogenaasireduktaasiin ja aiheuttaa siinä
konformaatiomuutoksen, minkä jälkeen dinitrogenaasireduktaasi sitoutuu dinitrogenaasiin.
Elektronit kulkevat 1-komponentilta 2-komponentille, ja typpi pelkistyy dinitrogenaasin Fe-Mo-
kofaktorissa. Yhden typpimolekyylin pelkistäminen kuluttaa kuusi elektronia, mutta
kokonaisreaktioon niitä tarvitaan kahdeksan, sillä reaktiossa pelkistyy myös H2 (Burris 1999,
Ludden 1999). Tätä reaktiota kuvaa kaava:
N2 + nMgATP + 8e- + 10H+ --> 2NH4+ + nMgADP + H2 (n > 2 per elektroni)
Nitrogenaasin pelkistämä typpi liitetään ammonium-ioniin ja assimiloidaan heti solun proteiinin-
tuotantoketjuun. Typensitojamikrobin ympäristössä oleva vapaa ammoniumtyppi säätelee
typensidontaa estämällä joko nitrogenaasin tuotantoa tai sen toimintaa. Myös N2O ja H2 voivat
toimia entsyymin inhibiittoreina sitoutumalla kompleksiin ennen N2-typpeä. Entsyymikompleksi voi
pelkistää molekulaarisen typen lisäksi myös typpioksidia (N2O), protoneja ja muita kolmoissidoksen
sisältäviä molekyyleja. (esim. syanidi, asetyleeni). Ominaisuutta voidaan käyttää hyväksi
laboratorio-oloissa, kun halutaan selvittää typensidontasysteemin tehokkuutta, mittaamalla
kaasukromatografilla asetyleenin (HC=CH) pelkistymistä etyleeniksi (H2C=CH2) (Madigan ym.
2003, Burris1999).
Koska kofaktorit ovat herkkiä hapettumiselle, nitrogenaasi toimii vain hapettomissa
oloissa. Aerobisten mikrobien on siis luotava olosuhteet, jotka mahdollistavat sekä solun hapellisen
hengityksen, että hapettoman typensidonnan. Fakultatiivit bakteerit esimerkiksi vaihtavat elektronin
vastaanottajaa typensidonnan aikana. Obligaatit aerobit ovat ratkaisseet ongelman useilla eri
tavoilla: vapaa happi voidaan poistaa kiihdyttämällä soluhengitystä tai tuottamalla hapenkulkua
hidastavia limakerroksia (Madigan ym. 2003). Nitrogenaasientsyymi voidaan myös kompleksoida
suojaavaan proteiiniin: eräät lajit stabiloivat entsyymin hapettamalla sen alayksiköt ja liittämällä ne
flavoproteiiniin (Robson 1979). Jotkut rihmamaiset syanobakteerilajit ovat eristäneet nitrogenaasin
rihman keskellä sijaitseviin erilaistuneisiin soluihin, heterokysteihin. Erilaisissa symbiooseissa
3
elävät aerobiset bakteerit, kuten ritsobit ja Frankia-suvun aktinomykeetit, saavat isäntäeliöltä
suotuisat olosuhteet sekä aerobiseen hengitykseen, että anaerobiseen typensidontaan (Madigan
ym. 2003).
1.1.2 Typensidonnan mikrobiologiaa
Typensidontaan kykeneviä mikrobeja on runsaasti. Niistä suurin osa elää itsenäisesti maa- tai
vesiympäristöissä. Aitotumallisten kasvien, sienten (esim. jäkälät) ja hyönteisten (esim. termiitit)
kanssa symbioosin muodostavat typensitojamikrobit ovat elävän luonnon kannalta erittäin tärkeitä.
Taulukosta 1, johon on koottu useita typensitojia, voidaan huomata kuinka monipuolisissa
elinympäristöissä typensitojia esiintyy.
Taulukko 1. Esimerkkejä erilaisista typensitojamikrobeista. Taulukko on laadittu Brock Biology of
Microorganisms (2003) -teoksen mukaan (s. 606). Taulukko ei kata kaikkia tunnettuja typensitojia, vaan
etenkin symbionttisia lajeja löydetään jatkuvasti lisää.
Vapaana eläviä aerobeja
Kemo-organotrofit (bakteereja) Fototrofit KemolitotrofitAzotobacter spp., Azomonas,
Klebsiella, Bacillus polymyxa,
Mycobacterium flavum,
Azospirillum lipoferum,
Citrobacter freundii,
Acetobacter diazotrophicus,
Methylomonas, Methylococcus
useat syanobakteerit, mm:
Trichodesmium
Katagnymene
Cyanothece spp.
Nostoc
Nodularia
Alcaligenes
Thiobacillus (jotkut lajit)
Streptomyces thermoautotrophicus
Vapaana eläviä anaerobeja
Kemo-organotrofit (bakteereja) Fototrofit (bakteereja) Kemolitotrofit (arkkeja)Clostridium spp.
Desulfovibrio
Desulfotomaculum
Chromaticum, Thiocapsa, Chlorobium,
Rhodospirillum, Rhodopseudomonas,
Rhodomicrobium,Rhodophila,Rhodobacter,
Heliobacterium, Heliobacillus, Heliophilum
Methanosarcina, Methanococcus,
Methanobacterium,
Methanospirillum, Methanolobus
Symbionttisista
Palkokasvien yhteydessä elävät (bakteerit) Ei-palkolkasvien yhteydessä elävätRhizobium
Bradyrhizobium
Sinorhizobium
Mesorhizobium
Azorhizobium
Allorhizobium
Frankia-suvun aktinomykeetit
(isäntäkasveina Alnus, Myrica, Ceanothus, Comptonia,
Casuarina)
Nostoc- ja Anabaena- suvun syanobakteerit sekä jotkut
muut syanobaktreerit (isäntäkasveina mm. Azolla
(saniainen), jotkut sammalet ja sienet)
4
Vapaana elävät typensitojatVapaana eläviä typensitojia on lajillisesti eniten (taulukko 1). Heterotrofiset vapaana elävät
typensitojat ovat riippuvaisia ulkopuolisista hiilenlähteistä, minkä takia niitä esiintyy eniten kasvien
juuristojen ja muiden hajoavien orgaanisten ainesten läheisyydessä. Vapaana elävät typensitojat
ovat ympäristönsä kasvien kanssa usein assosiatiivisessa suhteessa, eli vuorovaikutuksessa,
jossa molemmat osapuolet elävät itsenäisesti, mutta hyötyvät toistensa läsnäolosta (Madigan ym.
2003, Stewart 1969). Fototrofit typensitojat, kuten syanobakteerit, kykenevät yhteyttämällä
sitomaan tarvitsemansa hiilen hiilidioksidista (CO2), ja voivat siten esiintyä ympäristöissä, joissa
orgaanisen aineksen määrä on vähäinen. Esimerkiksi merien typenkierrossa syanobakteereilla on
merkittävä rooli. Vaikka vapaana elävien mikrobien sitoma typpimäärä (n. 1-5 kg/ha/vuosi) ei yllä
lähellekään symbionttisten typensitojien tasoa (jopa 100-200 kg/ha/vuosi), ne ovat silti tärkeä lisä
muiden eliöiden kasvulle (Stewart 1969, Burris 1999).
Symbionttiset typensitojatTypensitojamikrobeista ritsobit, Frankia-suvun aktinomykeetit ja useat syanobakteerit muodostavat
symbioosisuhteita monien erilaisten aitotumallisten eliöiden kanssa. Symbioosisuhteessa isäntä-
eliö saa bakteerilta kasvulleen välttämättömiä typpiyhdisteitä. Isäntäeliö tarjoaa puolestaan
bakteerille yksinkertaisia hiiliyhdisteitä ja optimaalisen ympäristön typensidontaan ja
lisääntymiseen. Isäntäeliöt ovat rakentaneet erilaisia typensidontaelimiä (esim. kasveilla
juurinystyrät, alkueläimillä ja hyönteisillä rakot ja onkalot, sienillä sekovarret), joissa bakteerit elävät
usein erilaistuneina symbioosisolumuotoina. Symbioosin muodostumisvaiheeseen liittyy
isäntäeliön ja symbiontin välistä "kemiallista vuoropuhelua", jossa määritellään symbioosin
osapuolten yhteensopivuus (Sprent 2001, Spaink 2000, Hirsch 1992).
Symbionttiset syanobakteerit kuuluvat useimmiten heterokystejä muodostaviin
sukuihin, kuten Nostoc ja Anabaena. Sienet, protistit ja kasvit toimivat niiden isäntinä (Rai ym.
2000). Frankia-suvun aktinomykeetit kykenevät sekä itsenäiseen että symbionttiseen
typensidontaan. Niiden isäntäkasveja tavataan mm. seuraavissa suvuissa: Alnus (esim. lepät),
Casuarina, Ceanothus, Colletia, Elaeagnus, Itippophae ja Purshia spp. Lajeja on useita, ja niiden
isäntäspesifisyys vaihtelee (Lie 1984). Ritsobit voivat elää sekä vapaina maassa että muodostaa
symbiooseja erilaisten palkokasvien kanssa.
1.1.3 Biologisen typensidonnan merkitys
Ilmakehästä sateen mukana laskeutuvat typpiyhdisteet tuovat typpeä eliöiden saataville
huomattavasti vähemmän kuin aktiivisesti molekulaarista typpeä sitovat mikrobit. Eliöt, joilla on
typensitojasymbiontti, ovat typpiomavaraisuutensa vuoksi vahvassa kilpailuetuasemassa.
Kuoltuaan ne myös rikastavat elinympäristöjään vapauttamalla sitomansa typen muiden eliöiden
5
käyttöön. On arvioitu, että toimivissa maaekosysteemeissä pintamaan typpipitoisuus on 5000-10
000 kg N/ha (Crawley 1997), ja esimerkiksi puuvartiset kasvit eivät kykene elämään ennen kuin
maassa on typpeä 400-1200 kg/ha. Typpiomavaraisuutensa takia typensitojakasvit ovatkin usein
ekologisesti tärkeitä avain- ja pioneerilajeja (Stewart 1969).
Biologista typensidontaa suositaan kestävän kehityksen mukaisessa maataloudessa
kemiallisesti tuotettujen lannoitteiden sijaan, sillä myös teollinen typensidonta vaatii runsaasti
energiaa. Typpiomavaraisia kasveja – etenkin palkokasveja – on käytetty viherlannoitukseen ja
maanparannukseen erilaisissa viljelykierroissa ja vuoroviljelmissä jo vuosituhansia. Kasvien
lannoitusvaikutus perustuu siihen, että osa kasveista varastoi typpeä maaperään, osa voidaan
kyntää maahan varsineen hajoamaan ja vapauttamaan jo sidottua typpeä. On arvioitu, että
biologinen typensidonta tuottaa kaksi kertaa kemiallisen sidonnan verran orgaanista typpeä
vuosittain (n. 150 miljoonaa tonnia). Tämä pätee erityisesti viljellyillä maa-alueilla (Burris 1999).
1.2 Palkokasvit
1.2.1 Yleistä
Kasvin ja bakteerin typensidontasymbiooseista ritsobien ja palkokasvien yhteiselo on tunnetuin.
Palkokasvit kuuluvat Fabaceae-heimoon (entinen Leguminosae), jota kutsutaan myös palkokasvi-
/papuheimoksi. Fabaceae-heimon sisarheimoja on kaikkiaan kolme, ja ne kuuluvat Fabales-
lahkoon. Fabaceae jaetaan kolmeen alaheimoon: Mimosoideae, Caesalpinioideae ja Faboideae
(=Papilionoideae; taulukko 2).
Palkokasviheimoon kuuluu 630 sukua ja n. 18000 lajia ruohoja, pensaita, puita ja
köynnöksiä. Ensimmäisten palkokasvien uskotaan kehittyneen noin 50-60 miljoonaa vuotta sitten
(Lavin ym. 2005). Palkokasveja löytyy lähes kaikkialta maapallolta, ja niiden elinympäristöt ovat
hyvin erilaisia. Nopea typpiaineenvaihdunta ja symbioosin muodostaminen typpeä sitovien
ritsobien kanssa ovat palkokasveille tyypillisiä piirteitä. Niiden hedelmä on useimmiten palko (Judd
ym. 1999).
Palkokasvien ekologinen ja taloudellinen merkitys johtuu niiden
typpiomavaraisuudesta. Ihmisravintona tärkeitä kasveja ovat mm. Arachis (maapähkinät), Cicer
(kikherneet), Glycine (soijapavut), Lens (linssit), Phaseolus (pavut) ja Pisum (herneet).
Maatalouden kannalta lannoituksessa ja viljelykierrossa merkittäviä kasveja ovat mm. Medigaco
(sinimailanen), Trifolium (apila) ja Vicia (virna).
6
Taulukko 2. Fabaceae-heimon alaheimot ja niiden lajimäärät (Judd ym. 1999).
Mimosoideae Caesalpinioideae Faboideae
(=Papilionoideae)
Sukuja / Lajeja 40 / 2500 150 / 2700 429 / 12615
Esimerkkisukuja Acacia, Albizia,
Calliandra, Inga,
Leucaena, Mimosa
Bauhinia, Caesalpinia,
Cassia, Chamaecrista,
Cercis, Parkinsonia
Arachis, Glycine,
Indigofera Lespedeza,
Lupinus, Melilotus,
Phaseolus, Pisum,
Pueraria, Trifolium
1.2.2 Tässä tutkimuksessa käytettyjen ritsobikantojen isäntäksvit
Maapähkinä (Arachis hypogaea)Maapähkinä (Arachis hypogaea L.) on yksivuotinen, ruohovartinen, 30-50 cm:n mittaiseksi kasvava
palkokasvi, joka kuuluu Fabaceae-heimon alaheimoon Faboideae. Lajikkeesta riippuen verso voi
kasvaa ylöspäin tai maata pitkin. Lehdykät kasvavat pareittain, ja yleensä lehdessä on kaksi 1-7
cm:n mittaista sulkasuonista lehdykkää. Kasvi on itsepölytteinen. Hernekasveille tyypillinen
keltainen kukka tuottaa hedelmöityttyään palon, johon muodostuu 2-4 siementä. Maapähkinän
siemenet eroavat muiden palkokasvien, kuten papujen, siemenistä lähinnä ohuen siemenkuorensa
perusteella. Palko tunkeutuu useita senttimetrejä syvälle maan sisään kypsymään. Koska
siemenet hautautuvat maan pinnan alle, nostetaan sadonkorjuussa maasta koko kasvi.
Maapähkinä kasvaa parhaiten hiekkapitoisessa maassa, ja se vaatii 5 kk yli 30°C:n lämpötilan
sekä 500-1000 mm vuosittaisen sademäärän. Kasvukauden pituus on 120-150 päivää. Viljellyt
lajikkeet eroavat pääasiassa siemenen maun, öljypitoisuuden, koon, muodon ja taudinkestävyyden
suhteen (Smith 1950, ICRISAT 2005).
Nykyisin viljeltävä maapähkinä on alunperin kotoisin Etelä-Amerikasta. Oletetaan,
että sitä on viljelty ensimmäisen kerran Argentiinassa tai Boliviassa. Näillä alueilla tavataan
nykyään eniten kasvin villiä kantamuotoa. Espanjalaisten valloittajien mukana ja eurooppalaisten
kaupankäynnin avulla maapähkinä on levinnyt ympäri maailmaa. Nykyään maapähkinästä
viljellään tuhansia lajikkeita lähes 100 valtiossa, ja lajikkeita kehitellään koko ajan lisää.
Kehitysmaat hallitsevat yli 96% tuotantoalasta ja 92% tuotannosta. Maapähkinä on maailman
neljänneksi tärkein ruokaöljyn sekä kolmanneksi tärkein kasvisproteiinin lähde. Ravintorikkaana
viljelykasvina, typpeä sitovana maanparannuskasvina ja eläinten rehuna maapähkinä on erittäin
7
arvokas ruokaturvan osa etenkin Afrikassa, Etelä-Amerikassa ja Kaakkois-Aasiassa. On arvioitu,
että puoli miljardia ihmistä käyttää maapähkinää ensisijaisena proteiininlähteenä. Suurin osa näistä
on pienviljelijöitä (ICRISAT 2005, University of Georgia 2003).
Kuva 2. Maapähkinä
(kuva en.wikipedia.org/wiki/Arachis_hypogaea)
Kiinassa viitteitä maapähkinänviljelystä on jo 1300-luvulta. 1600-luvulla portugalilaisten
kauppiaiden Etelä-Amerikasta tuomat uudet lajikkeet yleistyivät ja syrjäyttivät aiemmin viljellyn
maapähkinälajikkeen (Yao 2004). Toinen maapähkinätyyppi rantautui 1800-luvulla amerikkalaisten
lähetyssaarnaajien mukana. Vuodesta 1978 lähtien maapähkinäntuotanto alkoi kasvaa
kommunistisen järjestelmän kaaduttua ja maataloustuotannon vapauduttua. Kiina ja Intia ovat
nykyään alalla maailman suurimmat tuottajat, mutta valtiot kuluttavat suuren osan tuotannostaan
itse, lähinnä maapähkinäöljynä.
Maapähkinää viljellään Kiinassa 28 provinssissa, jotka jaetaan seitsemään
tuotantoalueeseen maantieteen, ilmasto-olosuhteiden ja sijainnin perusteella. Eri alueilla viljellään
erilaisia maapähkinälajikkeita, ja niiden kanssa viljelykierrossa on erilaisia ravintokasveja (Yao
2004). Kiinassa viljellään eniten USA:ssa yleisten päälajikkeiden välimuotoja. Suosituimpia
lajikkeita ovat Xuzhou 68-4, Fuhauseng, Baisha 1016, Shixuan 64, Yueyou 551, Yueyou 116,
Haihua 1, Luhua 9 ja Luhua 8130 (ILDIS 2006, ICRISAT 2005, University of Georgia 2003).
8
Kudzu (Pueraria lobata)Kudzu (Pueraria lobata (Willd.) Ohwi) on yksi Pueraria-suvun n. 20 lajista. Japanista peräisin oleva
nimi, kudzu, pohjautuu köynnöstä tarkoittavaan japaninkieliseen sanaan. P. lobata -nimen ohella
kasvista on käytetty myös muita tieteellisiä nimiä: P. montana ja P. thunbergiana (ILDIS 2006).
Kudzu on kotoperäinen kasvi eteläisessä Japanissa, Kaakkois-Kiinassa ja itäisessä Aasiassa,
sekä ihmisen levittämänä tulokkaana eteläisessä USA:ssa. Muita Pueraria-lajeja esiintyy
eteläisemmässä Kaakkois-Aasiassa.
Kudzu on kiipeävä, puuvartinen ja monivuotinen köynnös, joka voi kasvaa yhden
kasvukauden aikana 20-30 metriä pitkäksi (jopa 30 cm/vrk). Laajasta juuristosta lähtee useita, jopa
kymmeniä köynnöksiä, jotka voivat kiivetä korkealle puita ym. pitkin tai madella maata pitkin.
Köynnöksen varren paksuus on yleensä noin 2,5 cm. Pääversosta lähtevät sivuversot ovat lyhyet
(alle 10 cm). Lehdet ovat noin 20 cm pituiset ja ovaalin muotoiset, toisinaan liuskoittuneet (2-3
liuskaa) sekä alapinnaltaan ohutkarvaiset. Vain maata pitkin kasvaviin köynnöksiin muodostuu
kukkia. Noin 1-1,5 cm:n kokoisista violeteista kukista kehittyy hedelmöittymisen jälkeen litteitä,
karvaisia palkoja, jotka sisältävät 4-10 siementä. Kudzu menestyy useimmissa maalajeissa. Se
tarvitsee runsaasti valoa, yli 27°C kesälämpötilan sekä yli 100 mm:n vuotuisen sademäärän.
Laajan juuristonsa ansiosta kudzu sietää kuivuutta kohtuullisesti. Köynnökset eivät kestä kylmää,
vaan kuolevat talveksi. Juuristo pystyy talvehtimaan jopa -15°C lämpötiloissa tuottaen keväällä
uutta köynnöstä. Kudzu ei leviä helposti siemenistä vaan pikemminkin juuriston avulla, sillä uusi
verso on heikko, ja juuriston kasvaminen kestää vuosia (Mitich 2000).
Kuva 3. Kudzu (Mititch 2000).
9
Aasiassa kudzua on käytetty jo yli 1300 vuotta. Se on yleinen ravintokasvi Jaavalla, Sumatralla ja
Malesiassa. Lehtiä ja kukkia käytetään salaatin tavoin. Tärkkelyspitoisia juuria syödään ja
käytetään sakeutusaineena. Kudzua on käytetty ja käytetään edelleenkin lääke- ja rohdoskasvina.
Sillä hoidetaan mm. krapulaa, alkoholin himoa, tulehduksia, ja migreeniä (yleistä idässä), sekä
ripulia, astmaa, vilustumisia ja kuumetta (luontaishoitoa lännessä). Kiinassa kudzua on pidetty
gingsengin veroisena yleiskuntoa korottavana rohtona vuosituhansien ajan (ILDIS 2006, Mitich
2000). Rehuna se on hyvin kilpailukykyinen muiden rehukasvien joukossa (Corley ym. 1997).
Amerikkalaiset toivat kudzun Japanista Yhdysvaltoihin koristekasviksi, maan-
parannus-, eroosionesto- ja rehukäyttöön 1800-luvun lopulla, minkä jälkeen se on levinnyt
räjähdysmäisesti. Vahvan juuristonsa ansiosta kudzu on erittäin kestävä. Se lähtee kasvamaan jos
vain osa juurista on jäänyt maahan. Kudzu on aiheuttanut ongelmia ja sadonmenetyksiä USA:ssa
siinä määrin, että sen viljely on kielletty.
Soijapapu (Glycine max)Laajaan Glycine-sukuun kuuluu kaksi alasukua: Glycine Soia ja Glycine Glycine. Soia-alasuvussa
on kolme lajia (Glycine max, Glycine soia Sieb. & Zucc. ja Glycine gracilis Skvortz), joista G. max
eli soijapapu on viljelykasvina levinnyt ympäri maailmaa. G. soia ja G. gracilis ovat villikasveja,
jotka esiintyvät luontaisesti vain Aasiassa (APHIS 2006). Oletetaan, että soijapapu on jalostettu
viljelykasviksi alunperin itäisessä Pohjois-Kiinassa n. 1000 e.Kr., minkä jälkeen sitä alettiin viljellä
laajemmin Mantsuriassa. Mantsuriaa pidetäänkin lajin alkuperäisenä geenivarastona (Hymowitz
1970).
Soijapapu on yksivuotinen ja kasvaa noin metrin korkeudelle maan pinnasta.
Lehtivarsissa on kolme lehteä, ja kukat ovat palkokasville tyypilliset. Pitkälti itsehedelmöittyvät
kukat kehittyvät paloiksi, jotka sisältävät 2-4 siementä (papua).
Elintarviketeollisuudelle ja maataloudelle tärkeä soijapapu on yksi maailman eniten
viljellyistä kasvilajeista. Se on myös sekä tärkeä ravintokasvi osassa maailmaa. Viime vuosisadan
alussa soijapavun viljely oli laajamittaisinta Kaakkois-Aasiassa, mutta nykyisin intensiivisin viljely
on siirtynyt Yhdysvaltoihin ja Brasiliaan. Se on silti edelleen tärkeä viljelykasvi kaikkialla
maailmassa (APHIS 2006, ILDIS 2006, Hymowitz 1970).
10
Kuva 4. Soijapapukasvustoa
(kuva Scott Bauer, saatavilla
http://www.ars.usda.gov/is/graphics/photos/)
Kuva 5. Soijapavun auenneita palkoja.
(http://fi.wikipedia.org/wiki/Glycine_max)
Lespedeza sp. & Indigofera sp.Lespedeza-sukuun kuuluu noin 30 lajia kukkivaa, monivuotista pensaslajia. Niitä esiintyy
luontaisesti Pohjois-Amerikan lauhkeilla ja subtrooppisilla alueilla, Itä- ja Etelä-Aasiassa sekä
Australaasiassa. Lespedeza juncea on suvusta ainut, jota tavataan sekä lauhkeilla että trooppisilla
alueilla. Laji tunnetaan myös nimillä L. cuneata ja L. sericea (ILDIS 2006).
Kuva 6. Lespedeza juncea (kuva Jackie Miles
http://thebegavalley.com/plants.html).
Kuva 7. Indigofera tinctoria eli Indigofera bungeana
(www.wikipedia.org).
Indigofera bungeana (myös I. hosiei, I. longispica, I. micrantha, I. pseudotinctoria) kuuluu
Fabaceae-heimon alaheimoon Faboideae. I. bungeana on monivuotinen pensas. Muiden lajien
11
joukossa on myös ruohovartisia kasveja tai pieniä puita. Suvun edustajia kasvaa trooppisilla ja
subtrooppisilla alueilla ympäri maailman, muutama laji myös itäisen Aasian lauhkeilla alueilla
(ILDIS 2006).
1.3. Ritsobit
1.3.1 Yleistä
Ritsobit eli juurinystyräbakteerit ovat maaperäbakteereja, jotka voivat sitoa typpeä
muodostaessaan symbioosin palkokasvin kanssa. Yleensä symbioosi syntyy, kun bakteeri nystyröi
kasvien juuristoja, mutta jotkut palkokasvilajit (mm. Aeschyomene-suvun useat lajit) muodostavat
nystyröitä varsiin (Molouba ym. 1999). Bakteerit voivat elää myös vapaina maassa tai parasiitteina
nystyröissä. (Denison ja Kiers 2004). Ritsobit kuuluvat Rhizobiales-lahkoon, ja tunnetuimmat
ritsobilajit kuuluvat sukuihin Rhizobium, Mesorhizobium, Sinorhizobium, Bradyrhizobium, Allo-
rhizobium ja Azorhizobium. Yksittäinen ritsobilaji voi olla hyvin isäntäspesifinen, eli nystyröidä vain
yhtä tai muutamaa kasvilajia, tai se voi olla isäntänsä suhteen hyvin laaja-alainen. Sama pätee
palkokasveihin (Spaink 2000, Burris 1999, Young ja Haukka 1996, Willems ja Collins 1993).
Ritsobien tutkimus alkoi 1800-luvulla, kun juurinystyröiden ja typensidonnan välinen
yhteys havaittiin. Useat tutkijat eristivät palkokasvien nystyröistä bakteereita, ja lopulta koko suku
nimettiin eniten tutkitun lajin, Rhizobium leguminosarumin, mukaan. Uusien Rhizobium-suvun
lajien nimet sisälsivät usein sen kasvin nimen, josta kanta oli eristetty, koska bakteerien uskottiin
olevan hyvin valikoivia isäntänsä suhteen. Vasta 1900-luvun puolivälissä alettiin havaita, että lajista
riippuen sekä mikrobien fysiologiset ominaisuudet että isäntäspesifisyys vaihtelivat paljon. Vuonna
1982 Jordan erotti selvästi hitaammin kasvavat ritsobikannat nopeakasvuisen Rhizobium-suvun
edustajista, ja antoi uudelle suvulle nimen Bradyrhizobium (Suominen 2000, Young ja Haukka
1996). Tämän jälkeen on löydetty muita uusia ritsobisukuja ja lajeja. Vanhoja sukuja ja lajeja on
myös nimetty uudestaan. Kymmenen viimeisen vuoden aikana typpeä sitovia nystyröitä indusoivia
bakteerilajeja on löydetty myös perinteisten ritsobisukujen ulkopuolelta. Molekyylibiologisten
menetelmien kehittyminen on edistänyt taksonomista tutkimusta ja muuttanut ritsobien luokittelua
(Lindström ym. 2006, Sawada ym. 2003).
1.3.2 Ritsobien geenit
Ritsobin genomi koostuu kromosomista ja mahdollisista plasmideista. Kromosomi on yksi pitkä,
superkierteinen, kaksijuosteinen DNA-molekyyli, joka sisältää solun perusaineenvaihdunnan
kannalta tärkeät geenit sekä usein muitakin geenejä. Plasmidi on kromosomista erillinen lyhyt,
12
rengasmainen kappale kaksijuosteista DNA:ta. Yleensä plasmidissa sijaitsee geenejä, jotka eivät
ole bakteerin elintoiminnoille välttämättömiä, mutta jotka voivat tuottaa sille kilpailuedun tietyissä
olosuhteissa (Madigan ym. 2003). Ritsobin plasmidi sisältää kasvi-bakteerivuorovaikutuksessa
tärkeät symbioosi- ja typensidontageenit (mm. nod, nif, fix). Joillain ritsobilajeilla ei ole plasmidia,
vaan symbioosigeenit sijaitsevat kromosomissa (Sullivan ja Ronson 1998, Ueda 1995).
Transposoni on pala genomia, joka voi liikkua sekä genomin sisällä että genomista
toiseen eri mikrobiyksilöiden välillä. Se sisältää sekä geneettistä informaatiota (geenejä) että
sekvenssejä, joiden koodaamien proteiinien avulla plasmidi kykenee irroittautumaan genomistaan
ja liittymään uuteen (Madigan ym. 2003). Joskus ritsobien symbioosigeenit voivat liikkua
transposonien mukana lisäten siten geneettistä vaihtelua (Sullivan ja Ronson 1998).
YlläpitogeenitYlläpitogeenit sisältävät ribosomaaliset geenit sekä solun perusaineenvaihduntaan tarvittavat
(ATP-tuotanto, soluhengitys, DNA:n tuotanto ja korjaaminen jne.) geenit. Ne sijaitsevat bakteerin
kromosomissa. Tutkimuksessani käytin kahta ylläpitogeeniä, recA ja glnII. Nämä geenit liittyvät
DNA:n korjaamiseen ja proteiinintuotantoon. Eräs DNA:n korjausentsyymi sisältää RecA-proteiinin
(recA-geenin tuote), yksijuosteisen DNA-filamentin ja NTP-kofaktorin. Korjausentsyymin tehtäviä
ovat 1) yleinen geenirekombinaatio 2) SOS-responssin koordinointi, eli DNA:ta korjaavien geenien
säätely DNA:n vaurioituessa, ja 3) DNA:n korjaus (Bianco ym. 2005). GlnII-geeni koodaa
puolestaan glutamiinisyntetaasi II -entsyymiä, joka liittää ammoniumin glutamiiniin yhdessä
proteiinientuotannon vaiheessa (Fisher 1992). Glutamiinisyntetaasi II on kaikilla aitotumallisilla ja
se on löydetty pienestä osasta bakteereista. Esitumallisilla yleisempi glutamiinisyntetaasientsyymin
muoto on glutamiinisyntetaasi I (Kumada ym. 1993). Aktiivisessa, typpeä sitovassa nystyrässä
glutamiinisyntetaasia tuotetaan runsaasti (Brewin 1991).
SymbioosigeenitSymbioosigeeneihin luetaan sekä nystyröinti- että typensidontageenit. Ne ovat välttämättömiä
palkokasvin ja bakteerin onnistuneelle typensidontasymbioosille. Nystyröintiin liittyvät geenit (nod-,
nol- ja noe-geenit) ovat ritsobeille tyypillisiä, mutta typensidontaan liittyviä geenejä (nif- ja fix-
geenit) löytyy myös vapaana eläviltä typensitojilta (Suominen 2000, Hennecke 1990).
Nystyröintigeenit tuottavat Nod-tekijöitä, säätelevät niiden tuotantoa, sekä toimivat
myöhemmässä nystyränmuodostusprosessissa (Spaink 2000). Nod-tekijät ovat
signaalimolekyylejä, jotka toimivat nystyränmuodostusta edeltävän kasvin ja bakteerin vuoro-
puhelun aikana. Ne ovat eri tavoin substituoituja oligosakkarideja, joihin on kiinnittynyt yksi tai
useampia rasvahapporyhmiä. Nod-tekijöitä kutsutaan myös lipo-kito-oligosakkarideiksi, koska
niiden perusrunko on kitiinin kaltainen (kuva 8). Eri palkokasvilajit tunnistavat erilaiset Nod-tekijät,
13
joten nod-geeneillä on suuri merkitys mikrobien isäntäspesifisyydessä (Gage 2000, Spaink 2000,
Haukka ym. 1998, Ueda ym. 1995, Spaink 1994).
Kuva 8. LCO:n perusrakenne (Spaink 2000).
Yleiset nystyröintigeenit (nodABC) tuottavat Nod-faktorien oligosakkaridirunkoja. Muut nystyröintiin
liittyvät nod- nol- ja noe-geenit osallistuvat runkojen erilaisiin substituointeihin (rasvahapot,
fukosylaatio, sulfaatio, asetylaatio, N-metylaatio jne.) (Perret ym. 2000, Spaink 2000). NodC-
geenin tuote, N-asetyyliglukosaminyylitransferaasi, liittää Nod-tekijän perusrunkoon
oligosakkarideja, eli määrittelee yhdisteen pituuden (Spaink 2000). Nod-tekijän pituus ja
substituentit ovat kasvin ja mikrobin vuoropuhelussa oikean "kumppanin" tunnistuksen kannalta
tärkeitä. Tämän takia nodC-geenillä on vahva vaikutus nystyränmuodostuksen onnistumiseen.
Edellä mainittua geeniä on ritsobin genomissa vain yksi kopio. Muita nystyröintigeenejä (esim.
Nod-tekijöiden tuotantoa säätelevä nodD- geeni) voi esiintyä useampana kopiona (Ueda ym.
1995).
Typensidontaan liittyvät nif-geenit löydettiin alun perin vapaana elävästä Klebsiella
pneumoniae –maabakteerista. Ritsobien ja muiden typensitojabakteerien nif-geenit ovat
rakenteellisesti ja toiminnallisesti samankaltaisia, liittyen yleensä nitrogenaasientsyymin tuotantoon
ja säätelyyn (Hennecke 1999). Dinitrogenaasireduktaasin identtiset alayksiköt muodostuvat NifH-
proteiinista (nifH-geenin tuote) ja Fe-kofaktorista. Fix-etuliitteellä nimettyjen geenien on alunperin
havaittu liittyvän symbioottiseen typensidontaan. Lisäksi niihin kuuluu muitakin
symbioositoimintoja, kuten mikrobin erilaistuminen nystyrässä ja sytokromin tuotanto hengitys-
ketjuun (Madigan ym. 2003, Haukka ym. 1998).
Geenien siirtyminenVertikaaliseksi geeninsiirroksi kutsutaan bakteerien jakaantumisesta johtuvaa genomin kloonin
siirtymistä seuraavalle sukupolvelle. Vertikaalisessa geenien siirtymisessä evoluution oletetaan
tapahtuvan mutaatioiden kautta. Eliökunnan sukupuu on piirretty tästä näkökulmasta.
14
Horisontaalinen (eli lateraalinen) geeninsiirto mahdollistaa bakteerin rekombinaation,
ja nopean muutoksen bakteerin ilmiasussa. Tapahtumassa bakteerin oman genomin ulkopuolista
geenimateriaalia liittyy genomiin. Horisontaalinen geeninsiirto voi tapahtua vektorin avulla (virus,
transposoni tms.) tai konjugaation (DNA siirtyy kahden bakteerin ollessa läheisessä kontaktissa
toisiinsa) ja transformaation (bakteeri ottaa vapaana olevaa DNA:ta) yhteydessä. Bakteerin
jakaantuessa horisontaalisen geeninsiirron jälkeen, se siirtää uudet ominaisuudet seuraavalle
sukupolvelle (Madigan ym. 2003).
Horisontaalista geeninsiirtoa on tapahtuu kaikenlaisten geenien osalta ja kaikkien
eliöiden välillä, mutta suurin vaikutus sillä on mikrobeihin. Sen vaikutuksesta bakteerien
pääjaksojen evoluutioon on esitetty useita eriäviä mielipiteitä (Kunin ym. 2005, Kurland ym. 2003,
Gogarten ym. 2002). Yleisesti on todettu, että mitä enemmän luovuttajan ja vastaanottajan
perusgenomit ovat samankaltaiset, sitä helpommin luovuttajan geenit liittyvät vastaanottajan
genomiin. Tämän takia geenit siirtyvät useammin läheisten heimojen, sukujen ja lajien välillä.
Huomattavin merkitys lateraaligeeninsiirrossa on sillä, että se lisää bakteerin kilpailukykyä uudessa
elinympäristössä tai ekologisessa lokerossa (Gogarten ym. 2002). Esimerkiksi patogeenisuutta tai
antibioottiresistanssia aiheuttavien geenien vastaanottaminen voi lisätä bakteerikannan elin- ja
lisääntymismahdollisuuksia huomattavasti sen sijoittuessa tyhjään ekologiseen lokeroon.
Ritsobit hyödyntävät lateraaligeeninsiirtoa siirtämällä symbioosigeenejä lajien välillä
plasmidin välityksellä, kun symbioosigeenit sijaitsevat ns. symbioosiplasmidissa (Rhizobium- ja
Sinorhizobium-suvut), tai transposonin kaltaisen elementin avulla, kun ko. geenit sijaitsevat
kromosomistossa (Mesorhizobium loti). Tätä teoriaa tukevat useat tutkimukset, joissa
symbioosigeenien fylogenia ei noudata 16S rRNA:n tai ydingeenien fylogeniaa. (Debellé 2001)
Usein esim. nod-geenien ryhmittyminen tapahtuu ritsobien isäntäkasvien mukaan, kun taas 16S
rRNA-ryhmät muodostuvat bakteerilajeittain. Tutkimukset viittaavavat myös siihen, että
symbioosigeenit siirtyisivät lähinnä saman suvun edustajien, mutta eivät eri sukujen välillä
(Suominen ym. 2001, Ueda ym. 1995, Dobert ym. 1994).
1.3.3 Taksonomia
YleistäNykyinen bakteeritaksonomia perustuu pitkälti kantojen 16S rRNA-sekvenssien fylogenian ja DNA-
DNA-hybridisaatioiden perusteella tehtyihin lajimääritelmiin. Taksonien paikkansapitävyys
määritellään lisäksi erilaisin feno- ja genotyyppisin sekä biokemiallisin menetelmin. Edellä
mainittujen menetelmien avulla tehtyjä lajinmäärityksiä kutsutaan polyfaasiseksi taksonomiaksi.
(Sawada ym. 2003)
Viimeisimmän luokituksen mukaan perinteiset ritsobisuvut sijoittuvat α-
proteobakteerien ryhmässä Rhizobiales-lahkoon (kuva 9). Lahko voidaan jakaa alaryhmiin, kuten
taulukossa 3 esitetään (Sawada ym. 2003). Lahkoon kuuluu lisäksi palkokasveja nystyröiviä lajeja
15
esimerkiksi suvuista Methylobacterium ja Devosia. Muutaman viimeisen vuoden aikana
palkokasveja nystyröiviä bakteerilajeja on löydetty myös –proteobakteereiden joukosta (Chen ym.
2003, Moulin ym. 2001). Sukupuussa ritsobisuvut ovat monessa tapauksessa fylogeneettisesti
läheisempiä sukulaisia lajeille, jotka eivät nystyröi tai muodosta symbioosia palkokasvin kanssa
lainkaan, kuin toisten ritsobisukujen edustajille (kuva 9). Taksonomisia ongelmia ratkotaan
genomisten tutkimusten avulla edelleen (Lindström ja Gyllenberg 2006, Rossello-Mora ja Amann
2001, Wernegreen ja Riley 1999, Haukka ym. 1998, Sullivan ja Ronson 1998, Young ja Haukka
1996, Ueda ym. 1995).
Taulukko 3. 16S rDNA:n perusteella määritetyt Rhizobiales-lahkon alaryhmät. Jako perustuu Sawadan ym.
(2003) artikkeliin.Rhizobiales-alaryhmä Ryhmän symbionttiset
bakteerisuvut
Ryhmän muut bakteerisuvut
1 "Rhizobiaceae" Rhizobium, Allorhizobium Agrobacterium, Blastobacter
2 "Rhizobiaceae" Sinorhizobium Einsifer
3 "Phyllorhizobiaceae" Mesorhizobium Aminobacter
4 "Bradyrhizobiaceae" Bradyrhizobium, Blastobacter Agromonas, Nitrobacter, Rhodopseudomonas, Afipia
(5 "Methylobacteriaceae" Methylobacterium)
6 "Hyphomicrobiaceae" Azorhizobium Xanthobacter
(7"Hyphomicrobiaceae" Devosia)
16
Kuva 9.
Rhizobiales-
lahkoon kuuluvien
-proteobakteerien
16S rDNA
-fylogenia.
Tummennetulla
pohjalla on
merkitty
palkokasveja
nystyröivät lajit
(Sawada ym.
2003).
17
TutkimusmenetelmätBakteerilajeja erotetaan toisistaan tutkimalla sekä geneettisiä että feneettisiä ominaisuuksia.
Fenotyyppisiä ominaisuuksia tutkitaan mm. kaupallisten metaboliatestien avulla. Muita
taksonomisessa tutkimuksessa ja lajien tunnistamisessa käytettyjä menetelmiä ovat SDS-PAGE
(Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) ja MLEE (Multi Locus Enzyme
Electrophoresis) solun proteiinikoostumuksen tai FAME (Fatty Acid Methyl Ester) rasvahappo-
koostumuksen selvittämisessä (Lindström ym. 2006, Lindström ja Gyllenberg 2006, Terefework
2002).
DNA:n monistaminen PCR-reaktion (Polymerase Chain Reaction) avulla on
vaikuttanut ratkaisevasti DNA-pohjaisten menetelmien kehitykseen. Käyttämällä eri geenialueita
monistavia alukkeita voidaan tutkia bakteerin genomin osia tai muodostaa kuva bakteerigenomin
ns. sormenjäljestä (taulukko 4). Sormenjälkimenetelmillä voidaan selvittää esimerkiksi ritsobien
genomien rakennetta, samankaltaisuutta, geenien liikkumista populaatioissa ja bakteerien
evoluutiota. Sormenjälkimenetelmien lisäksi geenien sekvenointia käytetään paljon taksonomisissa
tutkimuksissa, mutta menetelmän kalleuden ja työläyden takia sillä tutkitaan harvemmin koko
genomia tai edes kokonaisia geenejä. DNA-DNA –hybridisaation avulla selvitetään kantojen välistä
suhteellista DNA-homologiaa ja erotetaan kantoja eri lajeiksi. Saman lajin edustajilla DNA-
homologian tulisi olla yli 70% (Lindström ym. 2006, Sawada 2003, Terefework 2002).
Taulukko 4. Joitain bakteerien taksonomisissa tutkimuksissa käytettyjä DNA-sormenjälkimenetelmiä
(Lindström ym. 2006, Terefework 2002, Vos ym. 1995, Berg ym. 1994, Thormann ym. 1994, Versalovic ym.
1994).
Menetelmä Periaate SoveltuvuusRFLP (Restriction Fragment
Length Polymorphism)
Haluttua genomin osaa käsitellään restriktio-
entsyymeillä ja osat erotellaan
geelielektroforeesissa.
Keskenään hyvin samanlaisten DNA-alueiden
vertailuun. Esim. yksittäiset geenit, 16S rDNA.
AFLP (Amplified Fragment
Length Polymorphism)
Bakteerin koko genomi pilkotaan, tietyin adapteri-
alukkein valitaan fragmenteista PCR-
monistettavat.
Esitumallisten ja aitotumallisten
tutkimuksessa käyttökelpoinen metodi.
Kokonais-DNA:n tutkimus.
rep-PCR (Repetitive sequence
based)
Tunnetuilla alukkeilla monistetaan yleisesti
bakteerigenomissa toistuvia sekvenssejä.
Kokonais-DNA:n tutkimus. Sopii myös lajien
väliseen vertailuun.
PFGE (Pulsed field gel
electrophoresis)
Kokonais-DNA restriktoidaan. Geeli ajetaan
vaihtuvassa sähkökentässä.
Erottelee suuria DNA-paloja.
Kantatunnistukseen.
RAPD (Randomly Amplified
Polymorphic DNA)
ap-PCR (arbitrarily primed PCR)
DAF (DNA amplification
fingerprinting)
Kokonais-DNA:sta monistetaan PCR-reaktion
avulla spesifisillä alukkeilla sattumanvaraisia
fragmentteja.
Kokonais-DNA:n tutkimukseen. Sopivat
parhaiten erilaisten kantojen tutkimiseen
tunnetun lajin sisällä.
18
Ribosomaalisia 16S- ja 23S-alayksikköjä koodaavia DNA-sekvenssejä käytetään taksonomiassa
yleisesti lajien erotteluun, koska näiden geenien oletetaan olevan suhteellisen muuttumattomia
osia ritsobien ja muiden bakteerien genomeissa. 16S- ja 23S rDNA:ta monistetaan PCR-reaktion
avulla geenijaksoille spesifisin alukkein, ja niiden sormenjälki- tai sekvenssitutkimuksilla selvitetään
bakteerien lajiutumista. Ribosomaalisten alayksiköiden geenien väliin jäävä ITS-alue (Internal
Transcribed Spacer) puolestaan koodaa erilaisten aminohappojen l-RNA –molekyyleja. ITS-alueen
sekvenssin pituus ja emäsjärjestys vaihtelevat bakteerilajien välillä, jonka takia ITS-alue soveltuu
bakteerikantojen erotteluun (Terefework 2002).
1.4. Bradyrhizobium-suku
1.4.1 Yleistä
Hidaskasvuiset Bradyrhizobium-bakteerit erotettiin Rhizobium-suvusta vuonna 1982 (Jordan
1982). Ne kasvavat hitaasti hiiva-mannitolialustalla, jossa on 6-hiilisiä yhdisteitä: Halkaisijaltaan 1
mm kokoisia pesäkkeitä muodostuu vasta 7 päivän inkuboinnin jälkeen +28°C:ssa, kun muut
ritsobit kasvava kahdessa päivässä. Bradyrhizobium-suvun edustajat kasvavat paremmin
esimerkiksi 5-hiilisiä yhdisteitä käyttäen (Lindström ym. 2006). Tähän päivään mennessä on
kuvattu kuusi Bradyrhizobium-lajia: B. japonicum, B. elkanii, B. liaoningense, B. yuanmingense, B.
betae ja B. canariense (taulukko 5, Vinuesa ym. 2005).
Useat bradyritsobit ovat isäntäkasvinsa suhteen laaja-alaisia, eli ne muodostavat
symbiooseja monen palkokasvilajin kanssa (Perret 2000). Bradyrhizobium-sukuun kuuluu
juurinystyröitä muodostavien bakteerien lisäksi kantoja, jotka indusoivat nystyröitä tiettyjen
trooppisten kasvien varsiin ja ovat fotosynteesikykyisiä. Fylogeneettisesti bradyritsobit ovat
kaukaisempia sukulaisia Rhizobiaceae-heimon ritsobeille kuin joillekin ei-nystyröiville bakteereille
(Sawada 2003, Ueda ym. 1995).
1.4.2 Bradyrhizobium-lajit
Ensimmäinen kuvattu bradyritsobi oli B. japonicum (alunperin R. japonicum), jonka Jordan (1982)
erotti Rhizobium-suvusta. Tyyppikanta oli eristetty soijapavun juurinystyrästä. Seuraavaksi
löydettiin soijapapua nystyröiviä kantoja, jotka alhaisen DNA-homologian vuoksi määriteltiin
uudeksi B. elkanii -lajiksi (Kuykendall ym. 1992). Samaisessa tutkimuksessa todettiin, että
Bradyrhizobium-suvusta löytyy muitakin DNA-homologiaryhmiä, jotka voitaisiin erotella uusiksi
lajeiksi. Vuodesta 1995 lähtien on kuvattu vielä neljä lajia: B. liaoningense (Xu ym. 1995), B.
yuanmingense (Yao ym. 2002), B. betae (Rivas ym. 2004) ja B. canariense (Vinuesa ym. 2004).
Lajit ja niiden alkuperät on kuvattu taulukossa 5.
19
Taulukko 5. Tähän mennessä nimetyt Bradyrhizobium-lajit sekä niiden alkuperämaat ja isäntäkasvit.Lajin nimi Alkuperämaa Alkuperäinen isäntäkasvi Symbioosimuoto Kirjallisuus-viite
B. japonicum Glycine max
(soijapapu)
juurinystyrä Jordan 1982
B. elkanii Glycine max juurinystyrä Kuykendall ym. 1992
B. liaoningense Glycine max juurinystyrä Xu ym. 1995
B. yuanmingense Kiina Lespedeza cuneata juurinystyrä Yao ym. 2002
B. betae Espanja Beta vulgaris
(sokerijuurikas)
kasvaimenkaltainen
muodostuma varressa
Rivas ym. 2004
B. canariense Kanariansaaret, Marokko,
Espanja, Amerikka,
Australia
useita palkokasvilajeja juurinystyrä Vinuesa ym. 2004
Bradyritsobeista on tutkittu eniten taloudellisesti tärkeiden palkokasvien, soijapavun (G. max) ja
maapähkinän (A. hypogaea) symbiontteja. Bradyritsobien tiedetään kuitenkin nystyröivän laajalti
muitakin Mimosoideae ja Faboideae (Papilionoideae) -alaheimojen palkokasveja. Fotosynteettiset
bradyritsobit muodostavat ns. varsinystyröitä Aeschyomene-suvun kasveihin (Chaintreuil ym.
2000, Giraud ym. 2000, Molouba ym. 1999). Palkokasveihin kuulumattomista villistä ja viljellystä
riisistä (Oryza brevigulata, O. sativa) on löydetty endofyytteinä eläviä fotosynteettisiä
bradyritsobikantoja (Chaintreuil ym. 2000). Endofyyttikannat eivät välttämättä muodosta typpeä
sitovia nystyröitä, mutta ne voivat muuten edistää isäntäkasviensa kasvua (Tan ym. 2001, Perret
ym. 2000, Molouba ym. 1999).
1.4.3 Bradyritsobien taksonomia
16S rDNA-sekvenssien perusteella rakennetuissa fylogeneettisissä sukupuissa Bradyrhizobium
sijoittuu Bradyrhizobiaceae-heimoon, joka on erillään Rhizobiaceae-heimosta (kuva 10, Willems
ym. 2001). Bradyritsobien lisäksi edellä mainitussa heimossa on palkokasvisymbiontti Blastobacter
denitrificans sekä ei-symbionttiset Agromonas-, Nitrobacter-, Rhodopseudomonas- ja Afipia-lajit
(kuva 9, Sawada ym. 2003). Bradyritsobien tutkimuksessa yritetäänkin parhaillaan selventää niiden
taksonomista luokitusta, sillä siinä on paljon ratkaisemattomia kysymyksiä lajien nimityksistä,
keskinäisestä sukulaisuudesta ja tehtyjen lajinmääritysten paikkansapitävyydestä (Lindström ja
Gyllenberg 2006, Vinuesa ym. 2005, Sawada 2003).
20
Kuva 10. Bradyritsobien sukulaisuus muihin Bradyrhizobiaceae-heimon lajeihin sekä toisiin ritsobeihin. Puu
on rakennettu tutkimalla 16S rDNA:n ja geenien sekvenssejä sekä DNA-DNA -homologiaa (Willems ym.
2001).
21
1.4.4 Bradyritsobien genomi
Bradyritsobien genominen diversiteettiBradyritsobilajien määrittelyn perusteena käytetty 16S rDNA-sekvenssihomologia ei anna pätevää
kuvaa lajien sukulaisuudesta, sillä DNA-DNA-hybridisaatiot ja fenotyyppiin perustuvat tutkimukset
eivät läheskään aina noudata 16S rDNA:n fylogeniaa (van Rossum ym. 1995). Esimerkiksi B.
japonicum ja B. liaoningense ovat 16S-sekvenssin perusteella hyvin läheisiä, mutta niiden DNA-
DNA-homologia on alle 40 %, mikä määrittää ne eri lajeiksi. Samoin B. japonicum on
kokonaisgenomiltaan lähempänä muita Bradyrhizobiaceae-heimoon kuuluvia sukuja (Afipia,
Agromonas, Blastobacter, Nitrobacter ja Rhodopseudomonas) kuin tutkittuja B. elkanii-kantoja
(kuva 12) (Willems ym. 2001). Bradyritsobien genominen diversiteetti tuo suuren haasteen, kun
nimetään uusia Bradyrhizobium-lajeja ja määritellään niiden välisiä sukulaisuussuhteita. (Vinuesa
ym. 2005, Saito ym. 1998, van Rossum ym. 1995, Yanagi ja Yamasato 1993).
Lateraalinen geeninsiirtoLateraalinen geeninsiirto voi olla eräs syy bradyritsobien genomiseen diversiteettiin.
Bakteerikantojen ribosomaaliset ja ylläpitogeenit ryhmittelevät kannat usein lajeihin, mutta
symbioosigeenien paikan vaihtuminen kromosomissa ja niiden siirtyminen bakteerista toiseen saa
aikaan ristiriitaisuuksia lajien yhtenäisyydessä. Symbioosigeenit eivät yleensä sijaitse plasmidissa,
vaan yhtenäisenä ”symbioosisaarekkeena” bakteerin kromosomissa (Kaneko ym. 2002). Tämä
saareke voi siirtyä transposonin kaltaisesti (Laguerre ym. 2003, Sawada ym. 2003, Sullivan ja
Ronson 1998 Ueda ym. 1995).
Kun on tutkittu bradyritsobien symbioosigeenejä ja niiden isäntäkasvien
nystyröitymistä ja typensidontaa, on havaittu että bradyritsobien symbioosigeenit ja symbioosin
tehokkuus korreloivat. Typensidonta- (nif, fix) ja etenkin yleiset nystyröintigeenit (nod)
ryhmittäytyvät usein isäntäkasvien mukaan. Sen sijaan 16S rDNA ja ylläpitogeenit eivät aina
korreloi isäntäkasvien kanssa. Samasta isäntäkasvilajista, toisinaan samalta alueeltakin, eristetyt
bradyritsobikannat osoittautuvat usein geneettisesti hyvin monimuotoisiksi (Vinuesa ym. 2005,
Vinuesa ym. 2004, Sawada ym 2003, Yang ym. 2002, Urtz ja Elkan 1996).
1.5 Palkokasvin ja ritsobin välinen symbioosi
1.5.1 Yleistä
Symbionttinen typensidonta tapahtuu palkokasvin juuristoon - tai toisinaan varteen (Rivas ym.
2004, Giraud ym. 2000) - muodostuvassa erilaistuneessa ”typensidontakudoksessa”, nystyrässä.
Nystyränmuodostuksessa voidaan erottaa seuraavat vaiheet: i) kasvin ja bakteerin välinen
22
kemiallinen vuoropuhelu, jonka avulla ”sopivat” osapuolet löytävät toisensa, ii) bakteerin
kiinnittyminen juurikarvojen pintaan ja iii) tunkeutuminen juuren sisään kasvin valmistamaan
nystyrään. Kasvi tarjoaa nystyrässä bakteerille typensidontaan sopivat olot sekä luovuttaa
yksinkertaisia hiiliyhdisteitä bakteerin sitomia typpiyhdisteitä vastaan (Sprent 2001, Boogerd ja van
Rossum 1997, Hirsch 1992).
Symbioosin merkitys eri osapuolilleRitsobien määrä maassa on yleensä niin valtava, että vain murto-osa bakteereista päätyy lopulta
palkokasvin nystyrään, mutta nämä onnistuneet yksilöt kykenevätkin tuottamaan jälkeläisiä
huomattavasti tehokkaammin kuin vapaana elävät lajitoverinsa (Denison ja Kiers 2004). Nystyrään
voi päätyä myös parasiittisia bakteerikantoja, jotka eivät sido typpeä. Joissakin tapauksissa kasvit
voivat estää parasiittisten kantojen lisääntymistä nystyrän sisällä, toisinaan eivät. Kasvin ei
kannata muodostaa nystyrää, jos typpeä on muuten maassa saatavilla, sillä nystyrän
muodostaminen vaatii energiaa ja rakennusaineita. Tästä syystä kasvi pyrkii säätelemään
nystyröintiä maan typpipitoisuuden mukaan (Denison ja Kiers 2004, Madigan 2003, Schultze ja
Kondorosi 1998).
1.5.2 Vuoropuhelu
Ritsobit suuntaavat maaperässä juurten läheisyyteen kasvien erittämien yhdisteiden
(hiilihydraatteja, orgaanisia happoja, aminohappoja, vitamiineja ja fenolisia yhdisteitä)
houkuttelemina (kuva 11). Ritsobit kerääntyvät juurten juurikarvojen läheisyyteen ja pinnoille ja
kiinnittyvät juurisolukon pintaan. Isäntäkasvin tuottamat erilaiset flavonoidiyhdisteet aloittavat
vuoropuhelun indusoimalla bakteerin nystyröintigeenit toimimaan. Vastauksena flavonoideihin
ritsobit tuottavat Nod-tekijöitä. Ne aiheuttavat kasvisolukossa morfologisia muutoksia (mm.
juurikarvan muodon muutoksia, flavonoidien tuoton lisääntymistä, esinystyräsolukon
muodostumista), jotka tähtäävät nystyränmuodostukseen (Perret 2000, Stougaard 2000, Schultze
ja Kondorosi 1998). Nystyröintigeeneihin voi vaikuttaa muillakin yhdisteillä kuin flavonoideilla.
Esimerkiksi maapähkinän ei tiedetä tuottavan flavonoideja, mutta sen juurieritteillä on silti
bradyritsobien nod-geenejä indusoiva vaikutus (Boogerd ja van Rossum 1997).
Symbioosin onnistumiselle oleelliset molekyylitPalkokasvit tuottavat useita erilaisia flavonoidiyhdisteitä (esim. isoflavonit, kalkonit, flavonolit,
flavonit, antosyanidiinit ym.; Schultze ja Kondorosi 1998). Ympäristötekijät voivat vaikuttaa niiden
indusoivaan tehoon (Angelini ym. 2003). Ritsobien tuottamien Nod-tekijöiden rakenne vaihtelee
lajin ja ”alalajin” mukaan. Ritsobeilla on tietynlaisille flavonoideille ja palkokasveilla tietynlaisille
23
Nod-tekijöille spesifiset reseptorit, joten vuoropuhelun aikana määritetään bakteerin ja kasvin
yhteensopivuus.
Ritsobi kiinnittyy kasvin juurisolun pintaan pintapolysakkaridiensa avulla (Schultze ja
Kondorosi 1998). Myös lektiineillä uskotaan olevan roolinsa isäntäspesifisyyden määrittelyssä ja
bakteerien kiinnittymisessä kasvin juureen (Hirsch 1999). Ritsobin soluseinän ulkomembraanin
eksopolysakkaridit, lipopolysakkaridit, K-antigeenit (Schultze ja Kondorosi 1998) ja sykliset
glukaanit ovat esimerkkejä muista bakteerien symbioosikumppanin valintaan ja symbioosin
onnistumiseen vaikuttavista yhdisteistä (Karr ym. 2000, Perret 2000, Boogerd ja van Rossum
1997). Niiden rakenteet ja koostumukset vaihtelevat riippuen ympäristön olosuhteista ja bakteeri-
kannoista. Yhteenvetona voidaan sanoa, että kaikilla vuoropuheluun osallistuvilla molekyyleillä on
oma tehtävänsä nystyröintiprosesin kulussa ja isäntäspesifisyydessä (Morgante ym. 2005,
Terefework 2002, Spaink 2000, Stougaard 2000).
Kuva 11. Palkokasvin ja bakteerin välinen vuoropuhelu: 1) Kasvin juuristo erittää erilaisia orgaanisia
yhdisteitä maahan 2) Bakteerit liikkuvat kohti juuristoa eritteiden houkuttelemina 3) Ritsobit kiinnittyvät
juuriin, ja tuottavat Nod-tekijöitä flavonoidien indusoimina 4) Nod-tekijät indusoivat nystyränmuodostusta ja
bakteerit siirtyvät nystyröihin. 5) Typpeä sitovia juurinystyröitä.
1.5.3 Infektioprosessi
Mikrobin ja kasvin välistä vuoropuhelua seuraa bakteerien tunkeutuminen kasviin. Isäntäkasvi
säätelee infektioprosessin etenemistä, määrää infektiotavasta (eli miten/millä ritsobi pääsee
juureen) ja päättää nystyrän muodon (Boogerd ja van Rossum 1997). On huomattu, että myös
ympäristötekijöillä on vaikutusta isäntäkasvin infektoitumiseen: olosuhteista riippuen bakteerit
24
voivat infektoida samaakin kasvia eri tavoin (Goormachtig ym. 2004). Tunnetuimmassa
infektiotavassa ritsobisolu pääsee juureen juurikarvan kautta ja etenee sieltä kohti nystyrää kasvin
muodostamaa infektiokäytävää eli infektiolankaa pitkin (engl. infection thread; Hirsch 1992).
Esimerkiksi sinimailanen, joka on ehkä tutkituin palkokasvi, ja soijapapu infektoituvat tällä tavoin.
Maapähkinässä bakteeri pääsee juureen pää- ja sivujuuren yhtymäkohtaan muodostuneesta
halkeamasta (Boogerd ja van Rossum 1997). Ritsobi voi myös tunkeutua suoraan juuren
pintasolukoiden läpi. Tätä harvinaista infektioreittiä on tavattu mm. Mimosa scrabella -lajilla (de
Faria ym. 1988). Muitakin infektiotapoja löytyy (Goormachtig ym. 2004, de Faria ym. 2001,
Boogerd ja van Rossum 1997). Koska työni käsittelee mm. soijapavun ja maapähkinän
bradyritsobeita, kuvaan seuraavissa kappaleissa infektiota näiden kahden esimerkkikasvin ja
bradyritsobin symbioosinmuodostuksen kautta.
Soijapapu infektoituu juurikarvan kautta ja ritsobit etenevät infektiokäytävää pitkinBradyritsobit pääsevät soijapavun juureen juurikarvan kautta. Kun bakteerit ovat juurten
läheisyydessä tai kiinnittyneet juurikarvan pintaan, isäntäkasvin tuottamat daidzeiini ja genisteiini
aktivoivat Nod-tekijöiden tuotannon. Nod-tekijät saavat aikaan nystyräsolujen jakaantumisen (Karr
ym. 2000), ja juurikarvan pää kihartuu bakteerien ympärille vangiten ne ”taskuun”, josta lähtee
juurikarvaa pitkin kasvamaan solunsisäinen käytävä, infektiolanka, kohti jakaantuvaa
nystyräsolukkoa eli esinystyrää. Bakteerit ovat käytännössä juurikarvan solujen ulkopuolella, koska
infektiokäytävä on erillinen "rakennelma". Bakteerit muuttuvat solunsisäisiksi vasta kun
infektiokäytävä tunkeutuu nystyräsolukkoon ja bakteerit vapautuvat nystyräsolujen sisään
isäntäsolun solukalvon ympäröiminä (Kuva 12).
Kuva 12. Soijapavun infektioprosessi. Bradyritsobi pääsee juureen juurikarvan kautta. a) Ritsobi kiinnittyy
kasvavaan juurikarvaan. b) Nod-tekijöiden vaikutuksesta juurikarva kihartuu ja vangitsee bakteerin
juurikarvan muodostamaan taskuun. Bakteerit jakaantuvat taskussa. c) Bakteerit etenevät kohti juurta ja
nystyrää isäntäkasvin muodostamaa infektiokäytävää pitkin. d) Infektiokäytävät kasvavat kohti juuren sisem-
piä osia ja kohti jakaantuvaa nystyrää (ns. esinystyrää).
25
Maapähkinän infektioprosessi: sivujuuren tyvihalkeaman kautta (STH) ja
solunsisäisesti levitenUseimmissa (sub)trooppisissa palkokasveissa (Arachis [maapähkinä], Aeschyomene, Sesbania,
Stylosanthes, Neptunia) ritsobit tunkeutuvat kasviin pää- ja sivujuuren väliseen haaraumaan
muodostuneesta halkeamasta (kuva 13). Ne pääsevät halkeamasta kasvin juuren soluväleihin.
Soluväleistä ne siirtyvät kasvisolujen sisään, lisääntyvät ja muodostavat ns. ”infektiotaskuja”.
Infektiotaskuista bakteerit kuljetetaan joko infektiokäytävää pitkin tai juuren soluväleissä,
kasvilajista riippuen, syvempiin juurisolukerroksiin ja nystyrään (Goormachtig ym. 2004). Kutsun
tätä infektiomekanismia sivujuuren tyvihalkeama (STH) -infektioksi, Goormachtigin ym. mukaan
(2004).
Maapähkinä ei muodosta infektiokäytävää kuljettaessaan bradyritsobeja nystyrään.
Juureen tunkeuduttuaan osa bradyritsobeista kolonisoi juuren pintasolukon alaisia tyvisoluja
lisääntyen siellä, osa leviää solujen välissä syvemmälle. Bradyritsobit kulkevat
maapähkinänjuuressa erottaen juurisolujen soluseinät kulkuväylän varrella toisistaan, mutta eivät
tunkeudu juurisolun sisään sytoplasman puolelle (Boogerd ja van Rossum 1997).
26
a) infektion tapahtumakohta
juuristossa
b) juurikarva (vas) ja sivujuuren
haarautumakohta (oik)
c) juurikarvan kihartuminen (vas) ja -
STH-infektio (oik)
d) infektiokäytävä (vas) ja solun-
sisäinen leviäminen (oik)
e) nystyrässä on infektoimattomia
soluja infektoitujen solujen välissä
tasaisesti levinneenä (vas) ja
”jakolinjana” (oik)
Kuva 13. Juurinystyrän muodostuminen, kun infektio tapahtuu sivujuuren tyvihalkeaman kautta (STH)
maapähkinässä (oikea) ja infektiolangan avulla soijapavussa (vasen; Boogerd ja van Rossum 1997).
1.5.4 Nystyrätyypit
Infektioprosessin tuloksena bakteerit päätyvät kasvavaan nystyrään. Palkokasveilla esiintyy
ulkonäöltään ja rakenteeltaan kahta nystyrätyyppiä (kuva 14). "Indeterminantit" eli jatkuvasti
kasvavat nystyrät ovat sylinterimiäisiä, ja "determinantit" eli rajatusti kasvavat nystyrät ovat
pallomaisia (Brewin 1991, Hirsch 1992).
Muodostuvan nystyrän tyypin päättää isäntäkasvi. Juuren pintasolukon
jakautumiskohta vaikuttaa nystyrän muotoon: Uloimman pintasolukon jakaantuminen johtaa
determinantteihin nystyröihin, kun sisemmästä pintasolukosta muodostuu indeterminantteja
nystyröitä (Hirsch 1992). Determinantteja nystyröitä muodostuu yleensä trooppisiin ruohovartisiin
palkokasveihin (esim. maapähkinä, soijapapu), kun taas indeterminantit nystyrät ovat yleisiä
Mimosoideae-heimon puuvartisissa palkokasveissa sekä lauhkean ilmaston ruohovartisissa
palkokasveissa (Räsänen 2002).
27
Kuva 14. Eri nystyrätyypit. Indeterminantissa nystyrässä voi erottaa eri vyöhykkeitä. Nystyrän kärjessä on
jatkuvasti kasvava meristeemisolukko. Determinantissa nystyrätyypissä koko nystyrä on suurin piirtein
samassa kehitysvaiheessa. m=meristeemisolukko, 1=infektio- ja erilaistumisvyöhyke,
2=typensidontavyöhyke, 3=vanhenemisvyöhyke. Kuvassa nystyräsolukko on rajattu sisempään
sylinteriin/palloon. Uloin solukerros muodostuu kasvin juurisoluista. Kuva A. M. Hirschin (1992) mukaan.
Indeterminantti eli jatkuvasti kasvava nystyräIndeterminantti nystyrä voidaan jakaa sisempään ja ulompaan kudokseen. Ulompi solukerros
muodostuu isäntäkasvin juurisolukosta, sisempi on erilaistunutta nystyräsolukkoa (Kuva 17).
Nystyrän kärjessä on jatkuvasti jakautuvaa ja erilaistuvaa meristeemisolukkoa, minkä takia
nystyrästä muodostuu sylinterinmuotoinen. Kärjen jatkuvan jakaantumisen vuoksi nystyrässä
voidaan erottaa erilaisia vyöhykkeitä: kärjessä solukko on nuorinta, lähinnä isäntäkasvin juurta
sijaitseva solukko on vanhinta. Myös infektio, bakteerien erilaistuminen bakteroideiksi,
typensidonta ja nystyrän vanheneminen tapahtuvat eri vyöhykkeissä (Kuva 14). Esimerkiksi
sinimailanen (Medigaco sp.), apila (Trifolium sp.), virna (Vicia sp.) ja herne (Pisum sp.)
muodostavat indeterminantteja nystyröitä (Hirsch 1992).
Determinantti eli rajatusti kasvava nystyräDeterminantti nystyrä on pallomainen, ja erotettavissa sisempään juuri- ja ulompaan
nystyräkudokseen kuten indeterminantti nystyrä. Verrattuna indeterminanttiin nystyrään
determinantissa nystyrässä ei ole jatkuvasti kasvavaa meristeemisolukkoa. Siinä ei ole
erotettavissa erilaisia toiminnallisia vyöhykkeitä. Nystyränmuodostuksen varhaisvaiheen jälkeen
solut lähinnä laajenevat (Kuva 14; Hirsch 1992, Brewin 1991). Soijapapu (Glycine max) ja
maapähkinä (Arachis hypogaea) muodostavat determinantteja nystyröitä. Maapähkinän kypsä,
28
determinantti nystyrä on pieni (1-5 mm) ja navoistaan hieman litistynyt (Boogerd ja van Rossum
1997).
1.5.5 Nystyräsolukon infektoituminen
Infektiokäytävässä bradyritsobit lisääntyvät ja etenevät käytävää pitkin nystyröihin, jotka ovat
muodostuneet infektioprosessin aikana. Infektiokäytävä sulautuu juurinystyrän uloimmaisiin
soluihin, jolloin ritsobit purkautuvat käytävän päästä. Ne ottavat nystyräsolujen solukasvosta kalvon
suojakseen, ja tunkeutuvat nystyräsolujen sisään. Bakteerien päälle jäävä kasvisolun solukalvo
suojaa symbioottisia bakteereita kasvin suojamekanismeilta. Nystyrässä bakteerit jakaantuvat ja
levittäytyvät edelleen (Stacey ym. 2006, Goormachtig ym. 2004, Gage 2000, Hirsch 1992).
Indeterminantti nystyrä infektoituu yleensä siten, että infektiokäytävä tunkeutuu
nystyräsolukkoon ja käytävän päästä eroaa soluseinättömiä infektiokäytävän kappaleita, "infektio-
pisaroita", jotka sisältävät yleensä 10-100 ritsobia (Vega-Hernandez ym. 2001, Brewin 1991).
Ritsobien kohdesolut ovat meristeemisolukossa, mutta infektiokäytävä ei tunkeudu
meristeemisolukkoon asti, vaan jää infektioalueelle (kuva 14). Infektiopisarat ja niiden sisältämät
ritsobit pääsevät kohdesoluihin fagosytoottisesti. Indeterminanteilla nystyröillä infektiotapa johtaa
siihen, että infektoimattomat nystyräsolut ovat tasaisemmin jakaantuneena infektoitujen solujen
seassa (Kuva 13). Osa nystyrän meristeemisoluista ei infektoidu ritsobeilla, vaan erilaistuu
nystyrän metabolian tarpeisiin. (Hirsch 1992, Brewin 1991).
Maapähkinän juuressa, STH-infektiossa, bradyritsobit kulkevat juurisolujen väleissä
kohti erilaistuvia nystyräsoluja. Juurisolujen soluseinä hajotetaan sellulolyyttisesti, ja bradyritsobit
otetaan nystyräsolujen sisään. Bradyritsobit infektoivat yleensä vain muutaman nystyräsolun ja
alkavat jakaantua nopeasti solujen sisällä. Samalla nystyräsolut jakaantuvat, ja siten infektoitujen
nystyräsolujen määrä kasvaa. Koska nystyräkudos muodostuu muutaman infektoidun solun
jakaantumisen tuloksena, voi nystyrään jäädä selkeitä infektoimattomien solujen linjoja
infektoituneiden solujen väliin (Brewin 2002, Boogerd ja van Rossum 1997, Hirsch 1992).
Juurinystyrän toimintaKun nystyrä on valmis, ritsobit erilaistuvat typpeä sitoviksi bakteroideiksi. Bakteroidit ovat yleensä
suurempia ja monimuotoisempia kuin maassa vapaana elävät ritsobit. Isäntäsolun solukalvosta
otetusta suojapeitteestä muodostuu peribakteroidinen (=symbiosomaalinen) membraani, jonka
sisällä on yksi tai useampi bakteroidi. Peribakteroidinen membraani mahdollistaa aineiden vaihdon
kasvin ja bakteerin välillä. Typpeä sitovaa yksikköä (bakteroidi[t] suljettuna peribakteroidiseen
membraaniin) kutsutaan myös symbiosomiksi (Stacey ym 2006, Brewin 2002, Verma ja Hong
1996).
29
Juurinystyrässä happiolosuhteet ovat tarkasti hallitut, koska ritsobin metabolia on
aerobinen mutta typpeä sitova nitrogenaasientsyymi vaatii hapettomat olot. Nystyrässä happea on
3-30 nmol/l, eli noin tuhannesosa ilmakehän happimäärästä (Brewin 2002). Toiminnaltaan ja
rakenteeltaan hemoglobiinin kaltainen leghemoglobiini sekä solujen väliset happitilat säätelevät
hapen saatavuutta juurinystyrässä. Leghemoglobiini sisältää rautaa, minkä takia sen muodostama
pigmentti värjää nystyrän vaaleanpunaiseksi. (Brewin 2002, Hirsch 1992). Juurinystyrässä ritsobit
ovat yhteydessä isäntäkasviin ulomman nystyräsolukon kuljetussolujen välityksellä. Kasvin
syntetisoimat yksinkertaiset hiilihydraatit diffundoituvat bakteerien energianlähteeksi, ja ritsobien
tuottamat typpiyhdisteet kuljetetaan suoraan kasvin aminohappojen tuotantoketjuun (Brewin 2002,
Stougaard 2000, Hirsch 1992).
30
Kokeellinen osa
2. Työn tarkoitusHidaskasvuiset Bradyrhizobium-bakteerit kuuluvat α-proteobakteerien pääjaksoon. Ne sijaitsevat
16S rDNA-sekvensseihin perustuvissa sukupuissa erillään nopeakasvuisemmista ritsobisuvuista
(Rhizobium, Mesorhizobium, Sinorhizobium, Allorhizobium, Azorhizobium). Bradyritsobien
muodostamia taksonomisia ryhmiä ei ole tutkittu yhtä kattavasti kuin esimerkiksi hyvin tunnettua
Rhizobium-sukua. Bradyritsobit luokitellaan ritsobeihin symbioosiominaisuuksiensa perusteella,
mutta muiden genomisten ominaisuuksiensa perusteella ne ovat usein läheisempiä sukulaisia
hyvin erilaisille, usein ei-symbioottisille bakteereille (esimerkiksi Rhodopseudomonas palustris)
(Sawada ym. 2003).
Toistaiseksi Bradyrhizobium-suvusta on nimetty kuusi lajia: B. japonicum (Jordan
1982), B. elkanii (Kuykendall ym. 1992), B. liaoningense (Xu ym. 1995), B. yuanmingense (Yao
ym. 2002), B. betae (Rivas ym. 2004) ja B. canariense (Vinuesa ym. 2004). Lajirunsaus on
epäilemättä laajempi, mutta lajien määrittäminen on vaikeaa bradyritsobien genomin laajan
diversiteetin takia. Ritsobitutkijoiden keskuudessa on pohdittu, mikä merkitys lateraalisella
geeninsiirrolla on Bradyrhizobium-suvun syntyyn ja kehitykseen. Lateraalisella geeninsiirrolla on
koetettu selittää suvun sisäistä genomista diversiteettiä ja toisaalta symbioottista
samankaltaisuutta (Vinuesa ym. 2005, Kurland ym. 2003). Myös ribosomaalisen 16S-geenin
määräävä rooli lajia määrittävänä sekvenssinä on kyseenalaistettu taksonomisessa tutkimuksessa,
kun geenien tutkimus on helpottunut ja yleistynyt (Sawada ym. 2003).
Maapähkinä (Arachis hypogaea), joka on levinnyt ihmisen mukana Etelä-Amerikasta
mm. Kiinaan 1300-1600 -luvulla, on useissa trooppisissa ja subtrooppisissa maissa tärkeä
ravintokasvi. Kiinalaisten maapähkinöitä nystyröivien bradyritsobien alkuperää ei tiedetä (Yao
2004). Kudzu (Pueraria lobata) on alun perin aasialainen, ja myös Kiinassa kasvava, ruoka- ja
lääkekasvina käytetty köynnösmäinen palkokasvi (University of Georgia 2003, Mititch 2000).
Työni tavoitteena oli tutkia i) maapähkinää nystyröivien kiinalaisten Bradyrhizobium-
kantojen diversiteettiä ja lajiutumista yleisimmin lajiutumisen tutkimisessa käytetyn 16S rDNA:n
ulkopuolella, tässä tapauksessa ydingeenien (recA ja glnII) ja symbioosigeenien (nifH ja nodC)
avulla, ii) selvittää kiinalaisten Bradyrhizobium-kantojen avulla, miten läheisiä tai kaukaisia
sukulaisia kotoperäisten villien palkokasvien, kuten kudzun, ja vierasperäisen maapähkinän
symbiontit ovat, iii) miten kiinalaiset maapähkinää ja luonnon palkokasveja (kudzu, Lespedeza- ja
Indigofera-lajit) nystyröivät Bradyrhizobium-kannat ryhmittyvät eri Bradyrhizobium -lajien
tyyppikantoihin ja soijapapua nystyröiviin bradyritsobeihin verrattuna.
Tutkimuksessani käytin Bradyrhizobium-kantoja, joita oli eristetty sekä viljellyistä
(maapähkinä ja soijapapu) että luonnonvaraisista (kudzu, Lespedeza-, Indigofera-, Acacia-,
31
Aeschyomene- ja Phaseolus-suvut) kasveista. Suurin osa kannoista oli peräisin kiinalaisista
kasveista, mutta vertailun vuoksi otin mukaan kansainvälisiä vertailu- ja tyyppikantoja.
Kokonaisgenomin yleistason vertailuun ja lajiutumisen tutkimiseen käytin AFLP-menetelmää, sekä
yksittäisten geenien tasolla PCR-RFLP-analyysia. Bakteerikantojen lajieroja analysoin
ribosomaalisia alayksiköitä koodaavien geenien välisellä ITS-alueella. ITS-alue soveltuu hyvin
bradyritsobien tutkimukseen, koska bradyritsobeilla on vain yksi ribosomaalisia alayksiköitä
koodaava rrn-operoni (Kündig ym. 1995). Erilaisten geenien merkitystä lajien ryhmittelyssä
tarkastelin kahden symbioosigeenin (nifH ja nodC) sekä kahden solun peruselintoimintoja
ylläpitävän ydingeenin (recA ja glnII) avulla.
Tutkimuksen taustalla oli kysymys kiinalaista maapähkinää nystyröivien brady-
ritsobien alkuperästä. Tarkastelen työni tuloksia mm. seuraavien hypoteesien valossa: i)
Symbioosigeenien horisontaalinen kulkeutuminen mahdollistaa paikallisten bakteerikantojen
mukautumisen uuden isäntäkasvin, maapähkinän, vaatimuksiin (Vinuesa ym. 2005, Kurland ym.
2003). ii) Maapähkinää nystyröivät bradyritsobit ovat levinneet Kiinaan maaperään maapähkinän
siementen mukana. iii) Kosmopoliitit, pitkien aikojen kuluessa erilaisiin ympäristöolosuhteisiin
sopeutuneet bradyritsobit ovat poikkeuksellisen aktiivisia geenien siirtäjiä, ja kykenevät sen takia
sopeutumaan uusiin tulokaspalkokasvilajeihin (Dresler-Nurmi ym. 2006, Woese 1987).
3. Materiaalit ja menetelmät
3.1 Bakteerikannat
Tutkimukseen otettiin mukaan mahdollisimman kattava otos erilaisia bradyritsobeja, joita oli
eristetty ja tunnistettu eri puolilla maailmaa (taulukot 3.1 ja 3.2). Kiinalaisia, maapähkinää (Arachis
hypogaea) nystyröiviä Spr-kantoja (17 kpl) valittiin kahden tutkimuksen perusteella, joissa
Bradyrhizobium sp. –kantoja oli tyypitetty 16S rDNA:n ja AFLP:n mukaan (Zhang ym. 1999, Chen
ym 2003). Kannat kuuluivat myös Helsingin yliopiston HAMBI-kantakokoelmaan. Vertailun vuoksi
tutkimukseen otettiin mukaan israelilaisen ja zimbabwelaisen kantakokoelman bradyritsobeja (5
kantaa). Pueraria- (17 kantaa) ja Lespedeza-sukujen (4 kantaa) palkokasveista eristetyt kannat
olivat peräisin kiinalaisesta CCBAU-kantakokoelmasta (Culture Collection of Beijing Agricultural
University, Peking). Tutkimuksessa mukana oli seuraavien Bradyrhizobium-lajien tyyppikannat: B.
japonicum (USDA6/HAMBI2314), B. elkanii (USDA76/HAMBI2123), B. liaoningense (HAMBI2298),
B. yuanmingense (HAMBI2220) ja B. canariense (BC-C2). Näistä useimmat (4 kpl) nystyröivät
Glycine-suvun palkokasveja, B. canariense (BC-C2) Chamaecytisus-suvun, HAMBI1661 Arachis-
suvun ja HAMBI2128 Vigna-suvun palkokasveja.
32
Kantojen kasvatusKantoja kasvatettiin hiiva-mannitoliliemessä (HUM) ja tryptoni-hiivauuteliemessä (TY) (liite 1)
+28°C:ssa ravistelussa (150 rpm) kannasta riippuen 2-5 päivää. Kantoja säilytettiin HUM-agarilla
(liite 1) huoneenlämmössä työn ajan (kolme kuukautta).
PuhdasviljelmätPakasteputkiin säilöttyjen kantojen puhtaus tarkistettiin, sillä aiemmissa tutkimuksissa oli
osoittautunut, että ”yksi kanta” saattoi sisältää useamman kannan, jotka muodostivat erilaisia
pesäkkeitä. Puhdistusta varten HUM-liemessä kasvaneesta kannasta tehtiin laimennossarja
Tween-puskurissa 10-6 -laimennokseen saakka. Laimennossarjasta pipetoitiin ja pintalevitettiin
HUMP-agarille (HUM + kongopuna) laimennokset 10-7 ja 10-8. Maljoja inkuboitiin +28°C:ssa,
kunnes pesäkkeet alkoivat näyttää selkeiltä. Erinäköisiä yksittäispesäkkeitä poimittiin
jatkotarkistusta varten sektoreihin jaetulle HUMP-agarille ja maljoja inkuboitiin 5 päivää
+28°C:ssa.
Puhdistettujen kantojen säilöminen pakkaseen (-70°C)HUM-liemen bakteerisuspension ollessa sopivan samea (noin 107 pmy yleensä 2-5 d kasvatuksen
jälkeen), siitä pipetoitiin 800 µl pakastusputkiin, joissa oli valmiiksi 200 µl 100% glyserolia (yli 20%
glyseroli). Putket pakastettiin ja säilöttiin -70°C:ssa.
DNA:n eristysDNA-eristys suoritettiin Terefeworkin (Soveltavan kemian ja mikrobiologian laitos, Helsingin
yliopisto) ohjeen mukaan (liite 3). Eristetyn DNA:n määrä ja puhtaus tarkistettiin
geelielektroforeesissa. 5 µl:n DNA-näyte, johon oli lisätty 5 µl 2x Loading Dye -väriainetta
(Promega 6x Loading Dye, laimennettu steriilillä vedellä 1:2) pipetoitiin agaroosigeeliin, ja ajettiin
HoeferSuper Sub -geelielektroforeesilaitteella 100 V:n jännitteellä 1 h ajan. Standardeina käytettiin
lambda-DNA:ta (Promega D150A 488 mg/ml), joka laimennettiin steriilillä vedellä 1:10 ja 1:100.
33
Taulukko 3.1. Tutkimuksessa käytetyt, maapähkinää nystyröivät Bradyrhizobium-kannat sekä eri Bradyrhizobium-lajien tyyppikannat. Kannat elvytettiinkylmäkuivatuista kokoelmakannoista, paitsi tähdellä* merkityt, jotka kasvatettiin pakakkasessa säilytetyistä putkista.HAMBI Muu koodi Laji Alkuperämaa Isäntäkasvi (lajike) ViiteHAMBI2125 Spr7-10 Arachis hypogaea (Tianfu No. 3) Zhang ym. (1999)HAMBI2126 Spr7-9 Arachis hypogaea (Tianfu No. 3) Zhang ym. (1999) Chen ym. (2003)HAMBI2133 Spr3-1 Arachis hypogaea (Tianfu No. 3) Zhang ym. (1999)
Chen ym. (2003)HAMBI2134 Spr2-8 Arachis hypogaea (Tianfu No. 3) Zhang ym. (1999)
Chen ym. (2003)HAMBI2135 Spr2-9 Arachis hypogaea (Tianfu No. 3) Zhang ym. (1999)
Chen ym. (2003)HAMBI2136 Spr3-3 Arachis hypogaea (Tianfu No. 3) Zhang ym. (1999)HAMBI2137 Spr3-4 Arachis hypogaea (Tianfu No. 3) Zhang ym. (1999)
Chen ym. (2003)HAMBI2138 Spr3-5 Arachis hypogaea (Tianfu No. 3) Zhang ym. (1999)HAMBI2140 Spr4-2 Arachis hypogaea (Local) Zhang ym. (1999)HAMBI2142 Spr4-6 Arachis hypogaea (Local) Zhang ym. (1999)HAMBI2143* Spr6-3 Arachis hypogaea (Tianfu No. 3) Zhang ym. (1999)
Chen ym. (2003)HAMBI2145* Spr7-1 Arachis hypogaea (Tianfu No. 3) Zhang ym. (1999)
Chen ym. (2003)HAMBI2146* Spr7-5 Arachis hypogaea (Tianfu No. 3) Zhang ym. (1999)HAMBI2147* Spr7-7 Arachis hypogaea (Tianfu No. 3) Zhang ym. (1999)HAMBI2149 Spr3-2 Arachis hypogaea (Tianfu No. 3) Zhang ym. (1999)
Chen ym. (2003)HAMBI2151 Spr3-6 Arachis hypogaea (Tianfu No. 3) Zhang ym. (1999)HAMBI2152 Spr3-7
B. sp. Kiina, Sichuaninmaakunta
Arachis hypogaea (Tianfu No. 3) Zhang ym. (1999)HAMBI2153 287 A B. sp. Israel Arachis hypogaea Zhang ym. (1999) - 283 A* Arachis hypogaea Zhang ym. (1999)HAMBI2115 LMG14299, MAR253 Arachis hypogaea Zhang ym. (1999),Chen ym. (2003)HAMBI2150 LMG14300, MAR411 Arachis hypogaea Zhang ym. (1999),Chen ym. (2003)HAMBI2116 LMG14303, MAR1445
B. sp. Zimbabwe
Arachis hypogaea Zhang ym. (1999),Chen ym. (2003)TyyppikannatHAMBI2314 ATCC10324, USDA6 B. japonicum Meksiko Glycine hispida (ATCC) Int. J. Syst. Bacteriol., 1982, 32, 136-139HAMBI2298 2281 (Chen ym. 2003) B.
liaoningenseGlycine max Int. J. Syst. Bacteriol,l 45, 706-711
HAMBI2123 LMG6134, USDA76 B. elkanii Glycine max (experimental inoculation) Int. J. Syst. Bacteriol., 1993, 43, 398-399BC-C2* B. canariense
Kiina
Chamaecytisus proliferus Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2005, 55,569-575
HAMBI1661 TAL1000 Bradyrhizobium sp.
NifTAL-kokoelmaHavaji
Arachis hypogaea Int.J.Syst.Bacteriology, 1991, 41, 104-113
HAMBI2128 TAL309, MAR1510 B. sp. Vigna ungiculata Appl. soil ecology 2005, 29(3), 236-251.(HAMBI2237) DE454* (CAAS) B. sp. Kiina Glycine max
34
Taulukko 3.2. Tutkimuksessa käytetyt kiinalaisista luonnon palkokasveista eristetyt Bradyrhizobium-kannat. X-merkityistä kannoista on tehty vain AFLP-analyysi.Kantakokoelman koodi Muu koodi Laji (16SrDNA-sekvenssin
perusteella)Alkuperämaa Isäntäkasvi Viite
HAMBI2220 B071 Bradyrhizobiumyuanmingense
Kiina Lespedeza cuneata Int. J. Syst. Evol. Microb.,2002, 52, 2219-2230,Chen ym. 2003
HAMBI2217 3211 Bradyrhizobium sp. Kiina Lespedeza juncea var. sericea Chen ym. 2003HAMBI2227 3203 Kiina Lespedeza capitata Chen ym. 2003HAMBI2228 3204 Kiina Lespedeza stipulacea Chen ym. 2003CCBAU61104 Bradyrhizobium japonicum Kiina Pueraria lobata (Wlld.) Ohwi Chen 2004CCBAU61105 X Bradyrhizobium sp. Kiina Pueraria lobata (Wlld.) Ohwi Chen 2004CCBAU61106 -”- Kiina Pueraria lobata (Wlld.) Ohwi Chen 2004CCBAU61107 X -”- Kiina Pueraria lobata (Wlld.) Ohwi Chen 2004CCBAU61109/1 X Bradyrhizobium japonicum Kiina Pueraria lobata (Wlld.) Ohwi Chen 2004CCBAU61109/2 X Bradyrhizobium sp. Kiina Pueraria lobata (Wlld.) Ohwi Chen 2004CCBAU61112/1 Bradyrhizobium sp. Kiina Pueraria lobata (Wlld.) Ohwi Chen 2004CCBAU61112/2 X Bradyrhizobium elkanii Kiina Pueraria lobata (Wlld.) Ohwi Chen 2004CCBAU61112/3 Bradyrhizobium sp. Kiina Pueraria lobata (Wlld.) Ohwi Chen 2004CCBAU61113/1 Bradyrhizobium sp. Kiina Pueraria lobata (Wlld.) Ohwi Chen 2004CCBAU61114/1 X Bradyrhizobium Kiina Pueraria lobata (Wlld.) Ohwi Chen 2004CCBAU61114/2 Bradyrhizobium sp. Kiina Pueraria lobata (Wlld.) Ohwi Chen 2004CCBAU61114/3 X Bradyrhizobium sp. Kiina Pueraria lobata (Wlld.) Ohwi Chen 2004CCBAU61114/4 X Bradyrhizobium elkanii Kiina Pueraria lobata (Wlld.) Ohwi Chen 2004CCBAU61116/1 X Bradyrhizobium Kiina Pueraria lobata (Wlld.) Ohwi Chen 2004CCBAU61116/2 Bradyrhizobium elkanii Kiina Pueraria lobata (Wlld.) Ohwi Chen 2004CCBAU61116/3 Bradyrhizobium sp. Kiina Pueraria lobata (Wlld.) Ohwi Chen 2004CCBAU61177 Bradyrhizobium sp. Kiina Acacia kalkoraCCBAU61178 Bradyrhizobium sp. Kiina Acacia kalkoraCCBAU61221 Bradyrhizobium sp. Kiina Phaseolus angularisCCBAU61301/1 Bradyrhizobium elkanii Kiina Aeschynomene indicaCCBAU61301/3 X Bradyrhizobium elkanii Kiina Aeschynomene indicaCCBAU61307/1 Bradyrhizobium elkanii Kiina Indigofera bungeanaCCBAU61307/2 Bradyrhizobium sp. Kiina Indigofera bungeanaCCBAU61307/3 X Bradyrhizobium sp. Kiina Indigofera bungeanaCCBAU61307/4 Bradyrhizobium sp. Kiina Indigofera bungeana
35
3.2 Käytetyt molekyylibiologiset menetelmät
3.2.1 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)AFLP-menetelmän on alun perin kuvannut Vos ym. (1995). Menetelmä perustuu kokonais-DNA:n
restriktointiin tiettyjen sekvenssien kohdalta ja digestoitujen restriktiofragmenttien valikoivaan
monistamiseen selektiivisillä PCR-alukkeilla. Alukkeisiin liitetty fluoresoiva väriaine (esim. HEX tai
FAM) mahdollistaa sen, että ABI-kapillaarielektroforeesilaitteen UV-valo havaitsee eri pituiset DNA-
fragmentit. Laite piirtää jokaiselle bakteerikannalle profiilin eri pituisten fragmenttien määrään
perustuen, minkä jälkeen profiili voidaan käsitellä tietokoneohjelmalla (esimerkiksi BioNumerics)
analysoitavaan muotoon. Ohjelmalla saadaan aikaan lajeille tai kannoille tyypillisiä
sormenjälkikuvioita.
Restriktio-ligaatiossa yhden näytteen 25 µl:n reaktiotilavuus sisälsi 2,5 µl 10x ligaatio-
puskuria (Fermentas), 5 u EcoR1 –restriktioentsyymiä (Promega, USA), 5 u Mse1I(Tru1I) –
restriktioentsyymiä (Fermentas), 10 pmol EcoR1-adapteria (TAG Copenhagen A/S), 20 pmol
Mse1I(Tru1I)-adapteria (TAG Copenhagen A/S), 1 u T-4 DNA-ligaasia (Fermentas) sekä 3 µl
DNA:ta. Tilavuus täydennettiin steriloidulla vedellä. Restriktion ja ligaation annettiin tapahtua
+37°C:ssa yön yli.
AFLP-PCR:ssa yhden näytteen 25 µl reaktiotilavuus sisälsi 2,5 µl 10x DyNAzyme
puskuria (Finnzymes Ltd), 6250 pmol dNTP-sekoitusta, 5 pmol EcoR1+AC+FAM –aluketta (Tag
Copenhagen, Tanska), 10 pmol Mse1I(Tru1I)+GC –aluketta (Tag Copenhagen, Tanska) , 2 u
DyNAzymeII DNA-polymeraasia (Finnzymes Ltd) sekä 2 µl restriktio-ligaatio –reaktiotuotetta.
Tilavuus täydennettiin steriilillä vedellä. PCR-reaktioon käytettiin PTC-200 Programmable Thermal
Controller -laitteen ohjelmaa "Zewdu-BACAFLP" (liite 5). Reaktiotuotteen määrä tarkistettiin
ajamalla sitä 1,5% agaroosigeelissä HoeferSuper Sub –elektroforeesilaitteella (1 h 100 V). Geelin
näytekaivoihin pipetoitiin 5 µl latausväriainetta (Promega, laimennettu 6x perusliuoksesta 1:3
steriilillä vedellä) ja 5 µl PCR-tuotetta. Kokostandardina käytettiin 10 µl laimennettua pGEM:a (liite
4). Geeli kuvattiin UV-valossa Kodak DC Zoom digitaalikameralla ja kuvat käsiteltiin Kodak ID
versio 3.5.0 –ohjelmalla. AFLP-PCR -tuotteita säilytettiin pakasteessa -20°C.
AFLP-PCR -tuotteet puhdistettiin MicroSpin S-400 HR (Amersham Biosciences
Europe, Suomi) -kolonneilla kaupallisen tuotteen ohjeen mukaan. ABI-ajoa varten näytteet
valmistettiin seuraavasti: yhtä näytettä kohti reaktioputkessa oli 12 µl deionisoitua formamidia, 0,5
µl fluoresoivaa kokostandardia GeneScanTM -500 TAMRA TM SizeStandard (AB Applied
Biosystems, UK) ja 3 µl PCR-tuotetta. Ennen ABI-ajoa seos denaturoitiin +98°C:ssa 2 min ja
asetettiin inkuboinnin jälkeen välittömästi jäihin. Näytteet ajettiin ABI PRISM 310 Genetic
36
Analyzer:lla. Injektioajaksi säädettiin 10 s ja näytteen ajoajaksi 60 min. ABI-laite piirsi PCR-
tuotteiden fragmenteista profiilit, jotka siirrettiin BioNumerics-tietokoneohjelmaan.
3.2.3 PCR (Polymerase Chain Reaction)Monistettaviksi geeneiksi valittiin nodC, nifH, glnII ja recA. Symbioosigeeneistä nodC liittyy
nystyränmuodostukseen polymerisoimalla Nod-tekijän kitiinirankaa, ja nifH typensidontaan
tuottamalla nitrogenaasientsyymin toisen komponentin, dinitrogenaasireduktaasin, alayksiköiden
proteiinirunkoja. Bakteerin perusaineenvaihdunnassa vaadittavia ydingeenejä olivat tässä
tutkimuksessa glnII ja recA, joista edellinen tuottaa glutamiinisyntetaasi II –entsyymiä ja
jälkimmäisen tuote, RecA-proteiini, on osa erästä DNA:n korjausentsyymiä. Myös bakteeri-
kromosomissa sijaitseva ITS-alue (Internal Transcribed Spacer), joka sijaitsee ribosomaalisten
16S- ja 23S-geenien välissä, monistettiin. Edellä mainittujen geenien monistuksessa käytetyt
alukkeet on mainittu taulukossa 3.3.
Yhteen PCR-reaktioon, jonka reaktiotilavuus oli 50 µl, lisättiin seuraavia aineita: 5,0 µl
10 x DyNAzyme puskuriliuosta (Finnzymes, Suomi), 25 pmol jokaista aluketta, 4000 pmol
nukleotidiseosta (Finnzymes, Suomi), 1,5 u DyNAzyme II polymeraasia (Finnzymes) sekä 1 µl
DNA-templaattia. Reaktiotilavuus täydennettiin 50 µl:aan steriilillä vedellä. Reaktiot ajettiin PTC-
200 Programmable Thermal Controller PCR-laitteella taulukossa 3.3 esitetyillä geenikohtaisilla
ohjelmilla. Ohjelmat kokonaisuudessaan löytyvät liitteestä 5.
PCR-tuotteiden määrä tarkistettiin, geeli kuvattiin ja kuvat käsiteltiin kuten
kappaleessa 3.2.1 on kerrottu. Mikäli PCR-reaktiossa oli monistunut useampi fragmentti,
oikeankokoinen DNA-fragmentti leikattiin geelistä ja puhdistettiin se kaupallisen MinEluteTM Gel
Extraction Kit:n (Qiagen) ohjeen mukaan.
3.2.4 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)RFLP-analyysia varten PCR –tuotetta pilkottiin kahdella eri restriktioentsyymillä, HaeIII (Promega,
USA) ja MspI (Fermentas). Reaktioputkeen pipetoitiin 5 µl PCR-tuotetta ja 2,7 µl jompaakumpaa
entsyymiä (1,5 u/µl). Jos PCR-tuotetta oli muodostunut reaktiossa vähän, sitä lisättiin 8 tai 10 µl:a
DNA:n määrästä riippuen. Restriktioentsyymiä oli kaikissa reaktiotilavuuksissa noin 4 u. Jos PCR-
reaktiossa oli monistunut usean kokoisia DNA-fragmentteja, geelistä puhdistettujen fragmenttien
RFLP-seokseen lisättiin myös 1 µl entsyymin puskuria: HaeIII:lle Buffer C 10X -puskuria
(Promega), ja MspI:lle Buffer Tango 10X -puskuria (Fermentas). Restriktioseosten annettiin
reagoida yön yli + 37°C:ssa, jotta kaikki DNA olisi restriktoitunut. Geelielektroforeesia varten koko
reaktiotilavuuteen lisättiin 1,5 µl laimentamatonta 6x Load Dye –väriainetta. Kokostandardeina
käytettiin 10 µl laimennettua pGEM-liuosta sekä 5 µl 50 bp DNA ladder liuosta (liite 4).
37
Restriktionäytteet ajettiin 3% agaroosigeelissä 100 V:n jännitteellä huoneenlämmössä noin 2
tuntia. Geelit kuvattiin ja kuvat käsiteltiin kuten PCR-geelit. Kuvat siirrettiin BioNumerics –tietokone-
ohjelmaan.
38
Taulukko 3.3. Tutkimuksessa monistetut geenit, monistetun sekvenssin koko ja monistamisessa käytetyt alukkeet sekä PCR-ohjelmat. Tähdellä on merkitty
alukeparit, joilla halutun geenin monistus onnistui.
Geeni Alukepari Alukkeen sekvenssi Alukkeella monistettavansekvenssin koko
Viite PTC-200Ohjelma
* FGPS 1490-72 5’-TGC GGC TGG ATC CCC TCC TT-3’ITS
*FGPL-132 5’-CCG GGT TTC CCC ATT CGG-3’
1200 bp Andronov ym. 2003 Aneta-APEKKA
(liite 5.)
nodCF
nodCI
nodCF 5’-AYG THG TYG AYG ACG GTT-3’
nodCI 5’-CGY GAC AGC CAN TCK CTA TTG-3’
930 bp Laguerre ym. 2001
*nodCF4
*nodCI
nodCF4 5’-AYG THG TYG AYG ACG GTT C-3’ 900 bp Laguerre ym. 2001
nodC
nodCFu
nodCI
nodCFu 5’-AYG THG TYG AYG ACG GIT C-3’ 900 bp Laguerre ym. 2001
Jyrki-NODD
(liite 5.)
*nifH 40F
*nifH 817R
nifH 40F 5’-GGN ATC GGC AAG TCS ACS AC-3’
nifH 817R 5’-TCR AMC AGC ATG TCC TCS AGC TC-3’
800 bp Vinuesa ym. 2005nifH
nifH-F
nifH-I
nifH-F 5’-TAC GGN AAR GGS GGN ATC GC AA-3’
nifH-I 5’-AGC ATC TCY TCS AGY TCN TCC A-3’
780 bp Laguerre ym. 2001
Aneta-NIF-H
(liite 5.)
recA *recA-41F
*recA-640R
recA-41F 5’-TTC GGC AAG GGM TCG RTS ATG-3’
recA-640R 5’-ACA TSA CRC CGA TCT TCA TGC-3’
800 bp Vinuesa ym. 2005
glnII-12F
glnII-689R
glnII-12F 5’-YAA GCT CGA CTA CAT YTC-3’
glnII-689R 5’-TGC ATG CCS GAG CCG TTC CA-3’
650 bp Vinuesa ym. 2005
Jyrki-CELB
(liite 5.)
glnII
*GSII-1
*GSII-2
GSII-1 5’-AAC CGA GAT CAA GGA ATT CG-3’
GSII-2 5’ATG CCC GAG CCG TTC CAG TC-3’
600 bp Turner ja Young 2000 Aneta-APEKKA1
(liite 5.)
39
3.5 Tulosten käsittely
Dendrogrammien rakentaminen BioNumerics-ohjelmallaRFLP- ja AFLP-geelit analysointiin BioNumerics –ohjelmalla (Applied Maths BVBA/Inc,
Belgia/USA). ABI-ajojen AFLP-profiilit muunnettiin BioNumerics-ohjelman ymmärtämään muotoon,
jolloin diagrammit muunnettiin sormenjälkikuvioiksi. Geelielektroforeesikuvien sormenjälkikuvioiden
fragmentit vahvistettiin ja kuvat rajattiin. Kunkin geenin kahden restriktion (MspI ja HaeIII) kuvat
yhdistettiin yhdeksi sukupuuksi.
Tulosten samankaltaisuusarvot laskettiin Dice-kaavalla, SD, joka on
sormenjälkikuvien yhteisten fragmenttien lukumäärä jaettuna näytteiden fragmenttien lukumäärän
keskiarvolla (kaava 1).
SD(i,j)= Nyht(i,j) (1)
[N(i)+N(j)]/2 , missä
SD(i,j) = rivin i ja sarakkeen j samankaltaisuusarvo matriisissa
Nyht(i,j) = i:lle ja j:lle yhteisten fragmenttien lukumäärä
N(i) = näytteen i fragmenttien lukumäärä
N(j) = näytteen j fragmenttien lukumäärä
Ohjelma vertasi jokaisen kannan kyseistä sormenjälkikuviota kaikkien muiden kantojen saman
analyysin sormenjälkikuvioihin. Samankaltaisuusarvoista muodostui samankaltaisuusmatriisi, jonka
pohjalta ohjelma piirsi UPGMA (Unweighed Pair Group Method with Averages) –menetelmällä
puun. Puut haarautuvat samanlaisuusprosenttien mukaan. Samanlaisuusprosentit näkyvät puun
yläpuolella kuvien vasemmassa ylälaidassa.
MDS (Multi-Dimensional Scaling)Multi-Dimensional Scaling –analyysit esittävät Dice-kertoimeen perustuvan samankaltaisuus-
matriisin kolmiulotteisessa muodossa. Ritsobikantojen muodostamien ryhmien väliset etäisyydet ja
suhteet näkyvät MDS-avaruudessa todenmukaisemmin kuin kaksiulotteisessa UPGMA-puussa.
Tilastolliset testitYhteisfeneettinen korrelaatioluku (cophenetic correlation) kertoo, miten hyvin dendrogrammi kuvaa
samankaltaisuusmatriisia. Jos puun haaran korrelaatioluku on yli 90%, dendrogrammi
havainnollistaa sen sisältämien ryhmien keskinäiset suhteet hyvin. Jos luku on alle 90%, suhteet
40
ovat monimutkaisemmat kuin mitä dendrogrammi voi esittää (Dresler-Nurmi ym. 2000). AFLP- ja
RFLP-analyysin tuloksista koostetuista UPGMA-puista muodostettiin genotyyppiryhmiä pääasiassa
sellaisten puiden haaroista, joiden yhteisfeneettinen korrelaatioarvo ylitti 90%.
Bootstrap-analyysillä pyrittiin testaamaan, kuinka toistettavia tutkimuksen tulokset
olivat. Testillä arvioitiin fylogeneettisessä analyysissä muodostuneiden ryhmien luotettavuutta.
Testissä (jonka tässä tapauksessa teki BioNumerics-ohjelma) n-kokoisen otoksen (esim. kolmen
ryhmän kantojen lukumäärä) bootstrap-arvo laskettiin seuraavasti: Tuotettiin sattumanvaraisia, n-
kokoisia otoksia poimien analyysitulosjakaumasta satunnaisia sormenjälkiä. Näin saaduista
otoksista laskettiin estimaatin arvot. Saatujen estimaattien arvojen keskiarvo lähestyy
analyysitulosmatriisin estimaatin odotusarvoa ja varianssia (Laininen 2001, Felsenstein 1985).
Käytännössä ohjelma teki analyysituloksista 200 kpl bootstrapreplikaatteja, joista bootstrap-arvot
laskettiin. Replikaattien lukumäärä (200 kpl) on Hillisin ja Bullin (1993) ehdottama minimilukumäärä
tilastollisen luotettavuuden kannalta, kun ryhmien toistettavuutta arvioidaan. Jos bootstrap-arvo on
>95%, on ryhmä tilastollisesti toistettava (Felsenstein 1985).
4. Tulokset
4.1 Käsiteltyjen kantojen ominaisuudet
4.1.1 Bradyrhizobium-kantojen kasvuEnnestään HUM-agarilla kasvaneet Bradyrhizobium-kannat kasvoivat HUM- ja TY-ravintoliemissä
nopeammin kuin lyofilisoidut kannat. Suurin osa kannoista kasvoi huomattavasti paremmin HUM-
liemessä kuin TY-liemessä. Lisäksi HUM-liemessä kasvatetuista kannoista DNA:n eristäminen oli
helpompaa, ja eristetty DNA oli puhtaampaa. Kantojen kasvuaika kohtuulliseen sameuteen (noin
107 pmy/ml) kesti liemessä 3-5 päivää, kuten Jordan (1982) on artikkelissaan esittänyt.
HUM-agarilla kasvaneiden kantojen muodostamien pesäkkeiden ulkonäkö ja väri
vaihtelivat hieman. Pesäkkeiden limaisuus (eksopolysakkaridien tuotto), liman väri (samea tai
kirkas) ja bakteerikasvuston väri (valkoinen tai kellertävä) olivat kannoilla erilaisia. Pesäkkeiden
ulkonäkö ei noudattanut taksonomista ryhmäjakoa. Kuukauden huoneenlämmössä inkuboinnin
jälkeen pesäkkeet olivat yleensä sulautuneet yhteen ja bakteerikasvusto saattoi peittää maljan
lähes kokonaan.
Tutkimuslaitoksista lähetettyjen kantojen puhtaus tarkistettiin ennen jatkotutkimuksia,
sillä aiempien tutkimusten yhteydessä oli toisinaan ilmennyt, että ympäristöstä "äskettäin" eristetty
ritsobikanta koostuikin kahdesta tai kolmesta eri ritsobikannasta tai –lajista. Tuolloin eri
41
bakteerikannat olivat tuottaneet erinäköisiä pesäkkeitä. Tässä työssä puhdistetut kannat
osoittautuivat ”puhdasviljelmiksi” (eli ne sisälsivät vain yhden kannan), sillä niiden bakteeri-
pesäkkeet olivat samannäköisiä, kasvoivat yhtä nopeasti ja keräsivät HUMP-agarilla punaista
pigmenttiä samalla tavalla.
4.1.2 Bradyrhizobium-kantojen geenien monistuminenValittujen geenien monistamista varten testatuista alukkeista kaikki eivät toimineet. Taulukossa 4.1
on ilmoitettu geenejä monistaneet alukeparit sekä alukeparien kanssa käytetyt PCR-ohjelmat.
Geenien monistaminen tehtiin kaikkien kantojen kohdalla samalla alukeparilla.
Pienikin ero alukkeen aloituskohdan sekvenssin ja tutkittavan bakteerikannan geenisekvenssin
välillä voi estää alukkeen liittymisen tutkittavaan DNA:han. Seitsemän Bradyrhizobium-kannan
kohdalla molempien symbioosiin osallistuvien geenien (nodC ja nifH) monistaminen epäonnistui.
Symbioosigeenit vaikuttivat vaihtelevan pitkälti isäntäkasvin mukaan, ja monistamisvaikeuksien
perusteella tutkimuksen Bradyrhizobium-kantojen symbioosigeenien voidaan sanoa olevan moni-
muotoisempia kuin ydingeenien. HAMBI2152 ja HAMBI2115:n nodC-geenin kohdalla
monistaminen onnistui toisilla alukkeilla (nodC-F ja nodCI). Nämä sekvenssit eivät olleet
kuitenkaan vertailukelpoisia alkuperäisillä alukkeilla monistettuihin geeneihin, sillä ne monistivat
hieman eri aluetta nodC-geenistä. Tästä syystä kannat on jätetty nodC-RFLP –analyysista pois.
Alukeparilla GSII-1 ja GSII-2 saatiin glnII-geenin PCR-tuotetta kaikista kannoista,
mutta suuri osa tuotteista jouduttiin puhdistamaan, koska DNA:sta monistui kaksi tai kolme
fragmenttia. Kannat HAMBI2150 (LMG14300) ja HAMBI 2128 (LMG14306, TAL309) tuottivat PCR-
reaktiossa muista kannoista poikkeavan, noin 1000 emäsparin kokoisen fragmentin, joita käytettiin
RFLP-analyyseissä.
recA –geenin monistaminen onnistui recA-41F ja recA640R –alukeparin avulla, mutta
fragmentti oli pienempi kuin Vinuesan ym. (2005; 800bp) kokeissa. PCR-tuote sisälsi vain yhden
noin 600 emäsparin kokoisen fragmentin, mutta joillakin kannoilla fragmentti näkyi agaroosi-
geelissä erittäin heikosti. Kantojen CCBAU61221 ja HAMBI2152 recA-geenit eivät monistuneet
lainkaan useista yrityksistä huolimatta. Molempien ydingeenien monistamisen epäonnistuminen
CCBAU61221-kannasta viittaa siihen, että sen ydingeenit poikkeavat huomattavasti muista
analysoiduista Bradyrhizobium-kannoista.
ITS-alueen monistaminen onnistui hyvin FGPL-132 ja FGPS1490-72 –alukeparien
avulla. PCR-tuote sisälsi yhden, yleensä n. 1200 emäsparin kokoisen fragmentin. Kannat
HAMBI1661, CCBAU61307/2 ja CCBAU61307/3 tuottivat hieman suuremman fragmentin (n. 1600
emäsparia).
42
Taulukko 4.1. Geenien monistuksessa toimineet PCR-ohjelmat ja alukkeet
Monistettava geeni PCR-ohjelma Alukepari
ITS Aneta-APEKKA FGPL-132 – FGPS1490-72nodC Jyrki-NODD nodCF4 – nodCInifH Aneta-NIFH nifH 40F – nifH 817RrecA Jyrki-CELB recA-41F – recA-640RglnII Aneta- APEKKA1 GSII-1 – GSII-2
4.2 Bradyrhizobium-kantojen kokonaisgenomin diversiteetti AFLP-
menetelmällä analysoituna
AFLP osoittaa bakteerikantojen erilaisuutta kokonaisgenomin tasolla. AFLP:lla tuotettujen
sormenjälkien avulla voidaan ryhmitellä bakteerikantoja genomin perusteella, joka osoittaa
lajiutumista. Toisaalta AFLP-sormenjälkien avulla voidaan tunnistaa identtiset kannat (kloonit), sillä
tämä menetelmä osoittaa pieniäkin kokonais-DNA:n eroavuuksia, toisin kuin 16S rDNA:han
perustuvat identifiointimenetelmät (RFLP, osittaissekvennointi). Tässä työssä AFLP:n avulla
pyrittiin selvittämään, miten bradyritsobit eroavat toisistaan kokonaisgenomin tasolla, ja miten tämä
ryhmittely suhteutuu erillisten geenien perusteella tapahtuvaan ryhmittymiseen.
Osa Bradyrhizobium-kannoista jätettiin myöhemmistä tutkimuksista pois, koska
niiden AFLP-profiilit osoittautuivat identtisiksi. Toisin sanoen kyseessä oli sama kanta (taulukko
4.2).
Taulukko 4.2. AFLP-profiilien perusteella toisille kannoille identtisiksi osoittautuneet CCBAU-kannat. Kannat
jätettiin pois RFLP-tutkimuksesta.
Kanta Laji (Bradyrhizobium) Identtinen AFLP-profiiliCCBAU61105 B. sp. CCBAU61106CCBAU61107 B. sp. CCBAU 61106CCBAU61109/2 B. sp. CCBAU61109-1CCBAU61112/2 B. elkanii CCBAU61112-1CCBAU61114/1 B. sp.CCBAU61114/3 B. sp.CCBAU61114/4 B. elkanii
CCBAU61114-2 CCBAU61114-2
CCBAU61116/1 B. sp. CCBAU61116/2 ja CCBAU61116/3CCBAU61301/3 B. elkanii CCBAU61301-1CCBAU61307/3 B. sp. CCBAU61307-2
AFLP-dendrogrammissa (kuva 4.1b) yhteisfeneettiset korrelaatioarvot olivat yleensä yli 90%, kun
kantojen samankaltaisuusarvo oli yli 50%. Tämän vuoksi ryhmät muodostettiin yli 50%
samankaltaisuusarvon ylittäviin haaroihin. Yli 70% bootstrap-arvoja oli vain ryhmissä, joiden
samankaltaisuus oli yli 50%.
43
AFLP-analyysin tulosten mukaan Bradyrhizobium-kantojen kokonaisgenomin
diversiteetti oli suuri, mitä osoitti neljä seikkaa: 1) Ryhmiä muodostui paljon (13 kpl). 2) Ryhmien
samankaltaisuusarvo oli alhainen (yli 50%). 3) Ryhmät olivat pieniä, käsittäen 2-7 kantaa. 3)
Dendrogrammin antamat samankaltaisuusarvot kuvasivat huonosti ryhmien suhteita toisiinsa.
Taulukko 4.3 havainnollistaa, että AFLP-tulokset heijastivat Bradyrhizobium-kantojen
kokonaisgenomin mosaiikkimaisuutta: erilaiset geenityypit (geeniryhmät) järjestäytyivät hyvin
vaihtelevasti genomiin, taulukko näyttää lähes palapelin paloista koostetulta.
AFLP-tulosten MDS-analyysi (kuva 4.1a) esittää ryhmien väliset suhteet toisiinsa
selkeämmin kuin UPGMA-puu. Etenkin MDS-kuvassa ilmenee, että maapähkinää nystyröi useita
pieniä bradyritsobiryhmiä, jotka olivat kokonaisgenomiltaan erilaisia, mutta kuitenkin lähes aina
läheisempiä toisilleen kuin kudzun nystyräbakteereille. Kudzua nystyröivistä kannoista erosi kolme
hyvin erityyppistä ryhmää: ryhmä 8 (B. elkanii –kantoja), ryhmä 13 (B. elkanii –kantoja) ja ryhmä 11
(B. japonicum kantoja).
Kuva 4.1a AFLP-analyysin tuloksista Dice-kaavalla lasketut kantojen väliset etäisyydet esitettynä MDS-analyysin avulla. Kuva
vasemmalla esittää itsenäisten kantojen väliset suhteet, ja kuva oikealla dendrogrammin kolmiulotteisena. Ryhmien värit vastaavat
taulukon 4.3 värejä: Punasävyiset kannat nystyröivät kudzua, vihreäsävyiset kannat maapähkinää ja keltaiset kannat Lespedeza-lajeja.
Etenkin oikeanpuoleinen kuva näyttää selkeästi, kuinka kudzua nystyröivät B. elkanii –kannat (punaisen sävyt) eroavat B. japonicum –
kannoista (vaaleanpunaiset).
Seuraavalla sivulla: Kuva 4.1b. Bradyrhizobium-kantojen kokonaisgenomin diversiteetti AFLP-menetelmällä analysoituna. Diversiteetti
on suuri, mitä osoittavat kannoista muodostuneet useat, pienet ryhmät, joiden suhteet toisiinsa ovat epäselvät. UPGMA-dendrogrammi
perustuu Dice-kaavalla analyysituloksista laskettuun samankaltaisuusmatriisiin. Ryhmät on muodostettu hyvän yhteisfeneettisen
korrelaation (yli 90%) perusteella yli 50% samankaltaisuusarvoilla. Korrelaatioarvot näkyvät dendrogrammin haarassa, yli 70%
bootstrap-arvot on merkattu B:llä.
44
AFLPbradyrhizobium AFLP
100
9080706050403020
10085
68
10071, B=70
100, B=100
98
96
100, B=72
96
88
100
85
100, B=77
85
100, B=92
100
10078
83, B=97
93
100, B=97
95
79
100
78
100, B=9999
98
100, B=81
88, B=97
97
83
83
100
100
93
82
100, B=8995
100, B=8396
97
98, B=87
94
97
96
79
100, B=80
79
10098
80
100100
93
79
80
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
sp.
sp.
sp.
canariense
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
elkanii
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
liaoningense
sp.
sp.
sp.
sp.
elkanii
sp.
sp.
elkanii
elkanii
sp.
sp.
sp.
sp.
elkaniisp.
sp.
sp.
japonicum
sp.
sp.
japonicum
sp.
sp.
japonicum
yuanmingense
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
elkanii
elkanii
sp.
sp.
sp.
HAMBI2116/LMG14303
HAMBI2217
HAMBI2227
BC-C2
HAMBI2146
HAMBI2147
HAMBI2145
HAMBI2126
HAMBI2125
HAMBI2228
HAMBI2135
HAMBI2143
HAMBI2134
HAMBI2142
HAMBI2140
CCBAU61178
HAMBI2123/USDA 76
HAMBI2151
HAMBI2133
HAMBI2137
HAMBI2138
HAMBI2149
HAMBI2136
HAMBI2298
DE454
HAMBI1250/LMG14300
HAMBI2128/LMG14306
CCBAU61112-1
CCBAU61112-2
CCBAU61113-1
CCBAU61112-3
CCBAU61301-1
CCBAU61301-3
CCBAU61116-1
HAMBI1661/TAL1000
CCBAU61114-1
CCBAU61114-3
CCBAU61307-1CCBAU61307-4
283A
HAMBI2153
HAMBI2314/USDA6
CCBAU61106
CCBAU61107
CCBAU61109-1
CCBAU61105
CCBAU61109-2
CCBAU61104
HAMBI2220
CCBAU61307-2
CCBAU61307-3
HAMBI2152
CCBAU61221
CCBAU61177
CCBAU61114-4
CCBAU61116-2
CCBAU61116-3
CCBAU61114-2
LMG 14299
Arachis
Lespedeza
Lespedeza
Chamaecytisus
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Lespedeza
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Acacia
Glycine
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Glycine
Glycine
Arachis
Arachis
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Aeschynomene
Aeschynomene
Pueraria
Arachis
Pueraria
Pueraria
IndigoferaIndigofera
Arachis
Arachis
Glycine
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Lespedeza
Indigofera
Indigofera
Arachis
Phaseolus
Acacia
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Arachis
Zimbabwe
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
Zimbabwe
Zimbabwe
China
China
China
China
China
China
China
Hawai
China
China
ChinaChina
Israel
Israel
Mexico
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
Zimbabwe
.
13
11
12
9
10
7
8
6
5
4
3
2
1
AFLPbradyrhizobium AFLP
100
9080706050403020
10085
68
10071, B=70
100, B=100
98
96
100, B=72
96
88
100
85
100, B=77
85
100, B=92
100
10078
83, B=97
93
100, B=97
95
79
100
78
100, B=9999
98
100, B=81
88, B=97
97
83
83
100
100
93
82
100, B=8995
100, B=8396
97
98, B=87
94
97
96
79
100, B=80
79
10098
80
100100
93
79
80
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
sp.
sp.
sp.
canariense
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
elkanii
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
liaoningense
sp.
sp.
sp.
sp.
elkanii
sp.
sp.
elkanii
elkanii
sp.
sp.
sp.
sp.
elkaniisp.
sp.
sp.
japonicum
sp.
sp.
japonicum
sp.
sp.
japonicum
yuanmingense
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
elkanii
elkanii
sp.
sp.
sp.
HAMBI2116/LMG14303
HAMBI2217
HAMBI2227
BC-C2
HAMBI2146
HAMBI2147
HAMBI2145
HAMBI2126
HAMBI2125
HAMBI2228
HAMBI2135
HAMBI2143
HAMBI2134
HAMBI2142
HAMBI2140
CCBAU61178
HAMBI2123/USDA 76
HAMBI2151
HAMBI2133
HAMBI2137
HAMBI2138
HAMBI2149
HAMBI2136
HAMBI2298
DE454
HAMBI1250/LMG14300
HAMBI2128/LMG14306
CCBAU61112-1
CCBAU61112-2
CCBAU61113-1
CCBAU61112-3
CCBAU61301-1
CCBAU61301-3
CCBAU61116-1
HAMBI1661/TAL1000
CCBAU61114-1
CCBAU61114-3
CCBAU61307-1CCBAU61307-4
283A
HAMBI2153
HAMBI2314/USDA6
CCBAU61106
CCBAU61107
CCBAU61109-1
CCBAU61105
CCBAU61109-2
CCBAU61104
HAMBI2220
CCBAU61307-2
CCBAU61307-3
HAMBI2152
CCBAU61221
CCBAU61177
CCBAU61114-4
CCBAU61116-2
CCBAU61116-3
CCBAU61114-2
LMG 14299
Arachis
Lespedeza
Lespedeza
Chamaecytisus
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Lespedeza
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Acacia
Glycine
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Glycine
Glycine
Arachis
Arachis
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Aeschynomene
Aeschynomene
Pueraria
Arachis
Pueraria
Pueraria
IndigoferaIndigofera
Arachis
Arachis
Glycine
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Lespedeza
Indigofera
Indigofera
Arachis
Phaseolus
Acacia
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Arachis
Zimbabwe
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
Zimbabwe
Zimbabwe
China
China
China
China
China
China
China
Hawai
China
China
ChinaChina
Israel
Israel
Mexico
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
Zimbabwe
.
AFLPbradyrhizobium AFLP
100
9080706050403020
10085
68
10071, B=70
100, B=100
98
96
100, B=72
96
88
100
85
100, B=77
85
100, B=92
100
10078
83, B=97
93
100, B=97
95
79
100
78
100, B=9999
98
100, B=81
88, B=97
97
83
83
100
100
93
82
100, B=8995
100, B=8396
97
98, B=87
94
97
96
79
100, B=80
79
10098
80
100100
93
79
80
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
AFLPbradyrhizobium AFLP
100
9080706050403020
10085
68
10071, B=70
100, B=100
98
96
100, B=72
96
88
100
85
100, B=77
85
100, B=92
100
10078
83, B=97
93
100, B=97
95
79
100
78
100, B=9999
98
100, B=81
88, B=97
97
83
83
100
100
93
82
100, B=8995
100, B=8396
97
98, B=87
94
97
96
79
100, B=80
79
10098
80
100100
93
79
80
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
sp.
sp.
sp.
canariense
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
elkanii
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
liaoningense
sp.
sp.
sp.
sp.
elkanii
sp.
sp.
elkanii
elkanii
sp.
sp.
sp.
sp.
elkaniisp.
sp.
sp.
japonicum
sp.
sp.
japonicum
sp.
sp.
japonicum
yuanmingense
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
elkanii
elkanii
sp.
sp.
sp.
HAMBI2116/LMG14303
HAMBI2217
HAMBI2227
BC-C2
HAMBI2146
HAMBI2147
HAMBI2145
HAMBI2126
HAMBI2125
HAMBI2228
HAMBI2135
HAMBI2143
HAMBI2134
HAMBI2142
HAMBI2140
CCBAU61178
HAMBI2123/USDA 76
HAMBI2151
HAMBI2133
HAMBI2137
HAMBI2138
HAMBI2149
HAMBI2136
HAMBI2298
DE454
HAMBI1250/LMG14300
HAMBI2128/LMG14306
CCBAU61112-1
CCBAU61112-2
CCBAU61113-1
CCBAU61112-3
CCBAU61301-1
CCBAU61301-3
CCBAU61116-1
HAMBI1661/TAL1000
CCBAU61114-1
CCBAU61114-3
CCBAU61307-1CCBAU61307-4
283A
HAMBI2153
HAMBI2314/USDA6
CCBAU61106
CCBAU61107
CCBAU61109-1
CCBAU61105
CCBAU61109-2
CCBAU61104
HAMBI2220
CCBAU61307-2
CCBAU61307-3
HAMBI2152
CCBAU61221
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
sp.
sp.
sp.
canariense
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
elkanii
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
liaoningense
sp.
sp.
sp.
sp.
elkanii
sp.
sp.
elkanii
elkanii
sp.
sp.
sp.
sp.
elkaniisp.
sp.
sp.
japonicum
sp.
sp.
japonicum
sp.
sp.
japonicum
yuanmingense
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
elkanii
elkanii
sp.
sp.
sp.
HAMBI2116/LMG14303
HAMBI2217
HAMBI2227
BC-C2
HAMBI2146
HAMBI2147
HAMBI2145
HAMBI2126
HAMBI2125
HAMBI2228
HAMBI2135
HAMBI2143
HAMBI2134
HAMBI2142
HAMBI2140
CCBAU61178
HAMBI2123/USDA 76
HAMBI2151
HAMBI2133
HAMBI2137
HAMBI2138
HAMBI2149
HAMBI2136
HAMBI2298
DE454
HAMBI1250/LMG14300
HAMBI2128/LMG14306
CCBAU61112-1
CCBAU61112-2
CCBAU61113-1
CCBAU61112-3
CCBAU61301-1
CCBAU61301-3
CCBAU61116-1
HAMBI1661/TAL1000
CCBAU61114-1
CCBAU61114-3
CCBAU61307-1CCBAU61307-4
283A
HAMBI2153
HAMBI2314/USDA6
CCBAU61106
CCBAU61107
CCBAU61109-1
CCBAU61105
CCBAU61109-2
CCBAU61104
HAMBI2220
CCBAU61307-2
CCBAU61307-3
HAMBI2152
CCBAU61221
CCBAU61177
CCBAU61114-4
CCBAU61116-2
CCBAU61116-3
CCBAU61114-2
LMG 14299
Arachis
Lespedeza
Lespedeza
Chamaecytisus
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Lespedeza
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Acacia
Glycine
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Glycine
Glycine
Arachis
Arachis
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Aeschynomene
Aeschynomene
Pueraria
Arachis
Pueraria
Pueraria
IndigoferaIndigofera
Arachis
Arachis
Glycine
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Lespedeza
Indigofera
Indigofera
Arachis
Phaseolus
Acacia
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Arachis
Zimbabwe
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
Zimbabwe
Zimbabwe
China
China
China
China
China
China
China
Hawai
China
China
ChinaChina
Israel
Israel
Mexico
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
Zimbabwe
.
13
11
12
9
10
7
8
6
5
4
3
2
1
45
4.3 Yksittäisten geenien suhde toisiinsa ja kokonaisgenomiin
analysoituina RFLP-sormenjälkien avulla
RFLP perustuu restriktioentsyymien kykyyn katkaista kaksijuosteinen DNA tietyn sekvenssin
kohdalta. Katkaisukohdan sijoittuminen DNA-fragmentin eri kohtaan saa aikaan erikokoisten DNA-
fragmenttien syntymisen. Kun restriktoidut DNA-fragmentit ajetaan agaroosigeelissä, muodostuu
sormenjälkikuvioita, jotka voivat olla tutkittavasta fragmentista riippuen suku-, laji- tai
kantaspesifisiä.
Verrattuna 16S rDNA-geeniin ITS on kohtalaisen nopeasti muuntuva alue. Sen on
esitetty erittelevän kantoja ”lajeittain tai alalajeittain”. Ydingeenien (recA, glnII) RFLP-analyyseillä
pyrin mm. selvittämään, korreloivatko ydingeenit Bradyrhizobium-lajin identifioinnin mukaan
(identifiointi on yleensä perustunut 16S rDNA -geenin osittais- tai kokonaissekvennointiin) tai
lajiutumista indikoivaan ITS-RFLP –analyysiin. Symbioosigeenien RFLP-analyysin avulla pyrin
mm. selvittämään, ryhmittävätkö ne Bradyrhizobium-kannat isäntäkasvin mukaan, ja minkälainen
on symbioosigeenien diversiteetti. Pyrin myös saamaan selvää lateraalisen geeninsiirron
vaikutuksesta kiinalaisten kantojen genomiin, koska bradyritsobien kromosomistossa sijaitsevien
symbioosigeenien tiedetään voivan siirtyä ns. symbioosisaarekkeina bakteerista toiseen (Sullivan
ja Ronson 1998).
Tutkimuksessa analysoitujen Bradyrhizobium-kantojen ryhmittymiset eri geenien
mukaan näkyvät dendrogrammeissa 4.2b-4.6b, kantojen sekä kantaryhmien väliset suhteet MDS-
analyyseissa 4.2a-4.6a, sekä genotyyppiryhmät kannoittain taulukossa 4.3.
46
Taulukko 4.3. Bradyrhizobium-kantojen AFLP- ja RFLP-analyyseissä muodostuneet Bradyrhizobium-
kantojen genotyyppiryhmät. Ryhmät muodostettiin UPGMA-dendrogrammien mukaan, kun yhteisfeneettisen
korrelaation arvo oli yli 90% (kuvat 4.2-4.6). u = ryhmien ulkopuolella, p = PCR-tuote puuttuu, x = kannasta
analysoitu vain AFLP ja ITS.Kanta Laji Isäntäkasvi Alkuperäm
aaAFLP ITS recA glnII nifH nodC
CCBAU61112/2 B. elkanii P. lobata (Wlld.) Ohwi Kiina 8 1 x x x xCCBAU61114/1 B. sp. P. lobata (Wlld.) Ohwi Kiina u 1 x x x xCCBAU61301/3 B. elkanii A. indica Kiina 8 1 x x x xCCBAU61112/1 B. sp. P. lobata (Wlld.) Ohwi Kiina 8 1 1 8 4 1CCBAU61112/3 B. sp. P. lobata (Wlld.) Ohwi Kiina 8 1 1 8 4 1CCBAU61113/1 B. sp. P. lobata (Wlld.) Ohwi Kiina 8 3 1 8 4 1CCBAU61116/2 B. elkanii P. lobata (Wlld.) Ohwi Kiina 13 1 9 7 4 1CCBAU61116/3 B. sp. P. lobata (Wlld.) Ohwi Kiina u 1 9 7 4 1CCBAU61114/2 B. sp. P. lobata (Wlld.) Ohwi Kiina u 2 9 7 4 1CCBAU61301/1 B. elkanii A. indica Kiina 8 1 8 7 4 1CCBAU61307/1 B. elkanii I. bungeana Kiina 9 1 8 1 4 4CCBAU61307/4 B. sp. I. bungeana Kiina 9 2 8 1 4 4CCBAU61116/1 B. sp. P. lobata (Wlld.) Ohwi Kiina u 2 x x x xH2125/Spr7-10 B. sp. A.hypogaea (Tianfu 3) Kiina 2 3 5 1 3 4CCBAU61114/4 B. elkanii P. lobata (Wlld.) Ohwi Kiina 13 3 x x x xH2217 (3211) B. sp. L. juncea var. Sericea Kiina 1 4 u 2 u pH2227 (3203) B. sp. L. capitata Kiina 1 4 4 2 u pH2228 (3204) B. sp. L. stipulacea Kiina 2 4 8 3 u uCCBAU61177 B. sp. A. kalkora Kiina u 5 9 u 4 pCCBAU61221 B. sp. P. angularis Kiina u 5 p u u uH2133/Spr3-1 B. sp. A.hypogaea (Tianfu 3) Kiina 6 6 5 u 2 4H2136/Spr3-3 B. sp. A.hypogaea (Tianfu
No. 3)Kiina,Sichuan
6 6 7 6 2 2
H2137/Spr3-4 B. sp. A.hypogaea (Tianfu 3) Kiina 6 6 7 3 2 2H2143/Spr6-3 B. sp. A.hypogaea (Tianfu 3) Kiina 3 7 3 5 p pH2145/Spr7-1 B. sp. A.hypogaea (Tianfu 3) Kiina 2 7 4 12 3 4H2146/Spr7-5 B. sp. A.hypogaea (Tianfu 3) Kiina 2 7 4 12 3 4H2147/Spr7-7 B. sp. A.hypogaea (Tianfu 3) Kiina 2 7 4 12 3 4H2126/Spr7-9 B. sp. A.hypogaea (Tianfu 3) Kiina 2 7 5 1 3 4H2149/Spr3-2 B. sp. A.hypogaea (Tianfu 3) Kiina 6 7 7 11 2 2H2151/Spr3-6 B. sp. A.hypogaea (Tianfu 3) Kiina 6 7 7 10 2 2H2142/Spr4-6 B. sp. A. hypogaea Local) Kiina 4 8 3 u 1 4H2134/Spr2-8 B. sp. A.hypogaea (Tianfu 3) Kiina 4 8 7 3 1 4H2135/Spr2-9 B. sp. A.hypogaea (Tianfu 3) Kiina 3 8 7 3 u 4CCBAU61104 B. japonicum P. lobata (Wlld.) Ohwi Kiina 11 9 2 9 u 3CCBAU61106 B. sp. P. lobata (Wlld.) Ohwi Kiina 11 9 2 9 u 3CCBAU61109/1 B. japonicum P. lobata (Wlld.) Ohwi Kiina 11 9 2 10 u 3CCBAU61105 B. sp. P. lobata (Wlld.) Ohwi Kiina 11 9 x x x xCCBAU61107 B. sp. P. lobata (Wlld.) Ohwi Kiina 11 9 x x x xCCBAU61109/2 B. sp. P. lobata (Wlld.) Ohwi Kiina 11 9 x x x xCCBAU61178 B. sp. A. kalkora Kiina 5 10 u p 1 pH2220 (B071) B.
yuanmingenseL. cuneata Kiina u 10 u 11 u p
H2153 /287 A B. sp. A. hypogaea Israel 10 11 6 5 1 1283 A B. sp. A. hypogaea Israel 10 11 6 4 1 4H2150/LMG14300 B. sp. A. hypogaea Zimbabwe u 11 11 13 u 3H2116/LMG14303 B. sp. A. hypogaea Zimbabwe 1 11 u 4 p pH2314/USDA6 B. japonicum G. hispida (ATCC) Meksiko u 12 2 3 u 2H2128/LMG14306 B. sp. Vigna ungiculata u 12 11 13 2 2H2115/LMG14299 B. sp. A. hypogaea Zimbabwe u u 2 4 u pH2138/Spr3-5 B. sp. A.hypogaea (Tianfu 3) Kiina 6 u 7 6 2 2CCBAU61307/2 B. sp. I. bungeana Kiina 12 u 8 u p pH2123/USDA76 B. elkanii G. max? 6 u 10 6 2 2DE454* (CAAS) B. sp. G. max Kiina 7 u 10 6 p pH2298/2281 B.
liaoningenseG. max Kiina 7 u 10 6 u p
H2152/Spr3-7 B. sp. A.hypogaea (Tianfu 3) Kiina u u p 2 u pBC-C2* B. canariense C. proliferus u u u 4 u pH1661/TAL1000 B. sp. Arachis hypogaea nifTAL u u u u p pH2140/Spr4-2 B. sp. A. hypogaea (Local) Kiina 5 u u u p pCCBAU61114/3 B. sp. P. lobata (Wlld.) Ohwi Kiina u u x x x xCCBAU61307/3 B. sp. I. bungeana Kiina 12 u x x x x
47
4.3.1 ITSTutkittujen Bradyrhizobium-kantojen ITS-alueen diversiteetti oli suuri. ITS-alue korreloi pitkälti
kannan isäntäkasvin ja maantieteellisen alkuperän mukaan. ITS-dendrogrammissa määritettiin
ryhmät yli 70% samankaltaisuusarvolla, sillä alempien samankaltaisuuksien kohdalla
yhteisfeneettisen korrelaation arvot olivat <90% (kuva 4.2b). Ryhmät 6, 7, 8 ja 9 muodostettiin,
vaikka niiden korrelaatioarvot olivat alhaiset. Yli 70% bootstrap-arvot tukivat vain 100%
samankaltaisia ryhmiä sekä muutamaa kahden kannan ryhmää (ryhmät 5 ja 10).
Bradyrhizobium-kantojen ITS-alueen laajaa diversiteettiä kuvaa kolme seikkaa: 1)
Ryhmiä muodostui runsaasti (12 kappaletta). 2) Ryhmät olivat pääasiassa pieniä, käsittäen 2-9
kantaa. 3) Ryhmien sisäiset samankaltaisuusarvot olivat korkeat, mutta niiden väliset suhteet olivat
epäselvät. MDS-analyysi (kuva 4.3.1a) havainnollistaa kuinka kaukaisia sukulaisia kudzua
nystyröivät B. japonicum -kannat (vaaleanpunaiset) ja B. elkanii -kannat (punasävyiset ja oranssit)
ovat, sekä miten kiinalaiset maapähkinää nystyröivät kannat sijoittuvat niiden välimaastoon. ITS-
alueen perusteella Lespedeza-sukua nystyröivät kannat olivat läheisiä kudzua nystyröiville
kannoille. Tyyppikannat olivat hyvin hajanainen joukko. UPGMA-puussa ne erosivat muista
bradyritsobikannoista jo 30% samankaltaisuudella.
Kuva 4.2a. ITS-alueen RFLP:n tuloksista Dice-kaavalla lasketut kantojen etäisyydet esitettynä MDS-analyysin avulla. Ryhmien värit
noudattavat taulukon 4.3 värejä: Punaisen sävyiset ovat kudzua nystyröiviä B. elkanii –kantoja, vaaleanpunainen B. japonicum, vihreän
sävyt esittävät maapähkinää nystyröiviä kantoja ja keltaiset Lespedezaa nystyröiviä kantoja. Kuva havainnollistaa tehokkaasti, että
kiinalaista maapähkinää nystyröivät kannat jäävät kudzua nystyröivien kantojen väliin, ja että tyyppikannat ovat kaukaisia sekä toisilleen
että kiinalaisille kannoille. Oikeanpuoleisessa kuvassa dendrogrammi havainnollistaa kantojen suhteet toisiinsa puussa, ja kuvan
kiertyneisyys tuo parhaiten esiin tyyppikantojen hajanaisuuden analyysituloksissa.
Seuraava sivu: Kuva 4.2b. Bradyritsobien ITS-RFLP-analyyseista rakennettu UPGMA-puu. Puu perustuu Dice-kertoimella laskettuun
analyysitulosten samankaltaisuusmatriisiin. Puun haaroissa näkyvät yhteisfeneettisen korrelaation arvot sekä 70% ylittävät bootstrap-
arvot (B). Ryhmien sisäinen suuri samankaltaisuus (70%) osoittaa kantojen läheisyyttä, ja ryhmien väliset epäselvät suhteet yleisesti
suurta diversiteettiä.
48
ITSMspI+ITSHaeIIIITS-RFLP-Iiris
100
908070605040302010100
100, B=70
100, B=1000
0
00
100
96
96
100
100
100
65
100, B=82100
76
87
100, B=78
88
89
90
91
10050
100, B=70100
82
82
100
100, B=850
100
83
83
74
10050
74
81
100, B=83
100, B=88
100
100, B=89
84
84
100, B=7694
83
84
88
89
100
100, B=870
92
100, B=89
87, B=70
90
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
sp.
sp.
sp.
sp.
elkanii
elkanii
elkanii
sp.
elkanii
sp.
elkanii
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
elkanii
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.sp.
liaoningense
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.sp.
canariense
sp.sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.sp.
sp.
japonicum
sp.
japonicum
sp.
sp.sp.
yanmingense
sp.
sp.
elkanii
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
japonicum
sp.
HAMBI1661/TAL1000
CCBAU61307-2
CCBAU61112-1
CCBAU61114-1
CCBAU61301-1
CCBAU61301-3
CCBAU61307-1
CCBAU61112-3
CCBAU61116-2
CCBAU61116-3
CCBAU61112-2
CCBAU61114-3
CCBAU61114-2
CCBAU61116-1
CCBAU61307-4
CCBAU61113-1
CCBAU61114-4
HAMBI2217
HAMBI2228
HAMBI2227
CCBAU61177
CCBAU61221
HAMBI2152HAMBI2140
HAMBI2298
HAMBI2138
DE454
HAMBI2136
HAMBI2137
HAMBI2126HAMBI2133
BC-C2
HAMBI2151HAMBI2149
HAMBI2143
HAMBI2145
HAMBI2147
HAMBI2146
HAMBI2125
HAMBI2134HAMBI2142
HAMBI2135
CCBAU61109-1
CCBAU61109-2
CCBAU61104
CCBAU61107
CCBAU61105CCBAU61106
HAMBI2220
CCBAU61178
HAMBI2115/LMG14299
HAMBI2123/USDA 76
CCBAU61307-3
HAMBI2153
HAMBI2116/LMG14303
283A
LMG14300
HAMBI2150/LMG14300
HAMBI2314/USDA 6
HAMBI2128/LMG14306
Arachis
Indigofera
Pueraria
Pueraria
Aeschynomene
Aeschynomene
Indigofera
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Indigofera
Pueraria
Pueraria
Lespedeza
Lespedeza
Lespedeza
Acacia
Phaseolus
ArachisArachis
Glycine
Arachis
Glycine
Arachis
Arachis
ArachisArachis
Chamaecytisus
ArachisArachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
ArachisArachis
Arachis
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
PuerariaPueraria
Lespedeza
Acacia
Arachis
Glycine
Indigofera
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Glycine
Arachis
Hawaii
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
ChinaChina
China
China
China
China
China
ChinaChina
ChinaChina
China
China
China
China
China
ChinaChina
China
China
China
China
China
ChinaChina
China
China
Zimbabwe
China
Israel
Zimbabwe
Israel
Zimbabwe
Zimbabwe
Mexico
Zimbabwe
.
.
.
1
2
3
4
5
7
6
8
9
10
11
12
B=86
B=100
ITSMspI+ITSHaeIIIITS-RFLP-Iiris
100
908070605040302010100
100, B=70
100, B=1000
0
00
100
96
96
100
100
100
65
100, B=82100
76
87
100, B=78
88
89
90
91
10050
100, B=70100
82
82
100
100, B=850
100
83
83
74
10050
74
81
100, B=83
100, B=88
100
100, B=89
84
84
100, B=7694
83
84
88
89
100
100, B=870
92
100, B=89
87, B=70
90
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
sp.
sp.
sp.
sp.
elkanii
elkanii
elkanii
sp.
elkanii
sp.
elkanii
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
elkanii
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.sp.
liaoningense
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.sp.
canariense
sp.sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.sp.
sp.
japonicum
sp.
japonicum
sp.
sp.sp.
yanmingense
sp.
sp.
elkanii
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
japonicum
sp.
HAMBI1661/TAL1000
CCBAU61307-2
CCBAU61112-1
CCBAU61114-1
CCBAU61301-1
CCBAU61301-3
CCBAU61307-1
CCBAU61112-3
CCBAU61116-2
CCBAU61116-3
CCBAU61112-2
CCBAU61114-3
CCBAU61114-2
CCBAU61116-1
CCBAU61307-4
CCBAU61113-1
CCBAU61114-4
HAMBI2217
HAMBI2228
HAMBI2227
CCBAU61177
CCBAU61221
HAMBI2152HAMBI2140
HAMBI2298
HAMBI2138
DE454
HAMBI2136
HAMBI2137
HAMBI2126HAMBI2133
BC-C2
HAMBI2151HAMBI2149
HAMBI2143
HAMBI2145
HAMBI2147
HAMBI2146
HAMBI2125
HAMBI2134HAMBI2142
HAMBI2135
CCBAU61109-1
CCBAU61109-2
CCBAU61104
CCBAU61107
CCBAU61105CCBAU61106
HAMBI2220
CCBAU61178
HAMBI2115/LMG14299
HAMBI2123/USDA 76
CCBAU61307-3
HAMBI2153
HAMBI2116/LMG14303
283A
LMG14300
HAMBI2150/LMG14300
HAMBI2314/USDA 6
HAMBI2128/LMG14306
Arachis
Indigofera
Pueraria
Pueraria
Aeschynomene
Aeschynomene
Indigofera
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Indigofera
Pueraria
Pueraria
Lespedeza
Lespedeza
Lespedeza
Acacia
Phaseolus
ArachisArachis
Glycine
Arachis
Glycine
Arachis
Arachis
ArachisArachis
Chamaecytisus
ArachisArachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
ArachisArachis
Arachis
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
PuerariaPueraria
Lespedeza
Acacia
Arachis
Glycine
Indigofera
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Glycine
Arachis
Hawaii
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
ChinaChina
China
China
China
China
China
ChinaChina
ChinaChina
China
China
China
China
China
ChinaChina
China
China
China
China
China
ChinaChina
China
China
Zimbabwe
China
Israel
Zimbabwe
Israel
Zimbabwe
Zimbabwe
Mexico
Zimbabwe
.
.
.
ITSMspI+ITSHaeIIIITS-RFLP-Iiris
100
908070605040302010100
100, B=70
100, B=1000
0
00
100
96
96
100
100
100
65
100, B=82100
76
87
100, B=78
88
89
90
91
10050
100, B=70100
82
82
100
100, B=850
100
83
83
74
10050
74
81
100, B=83
100, B=88
100
100, B=89
ITSMspI+ITSHaeIIIITS-RFLP-Iiris
100
908070605040302010100
100, B=70
100, B=1000
0
00
100
96
96
100
100
100
65
100, B=82100
76
87
100, B=78
88
89
90
91
10050
100, B=70100
82
82
100
100, B=850
100
83
83
74
10050
74
81
100, B=83
100, B=88
100
100, B=89
84
84
100, B=7694
83
84
88
89
100
100, B=870
92
100, B=89
87, B=70
90
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
sp.
sp.
sp.
sp.
elkanii
elkanii
elkanii
sp.
elkanii
sp.
elkanii
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
elkanii
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.sp.
liaoningense
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.sp.
canariense
sp.sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.sp.
sp.
japonicum
sp.
japonicum
sp.
sp.sp.
yanmingense
sp.
84
84
100, B=7694
83
84
88
89
100
100, B=870
92
100, B=89
87, B=70
90
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
sp.
sp.
sp.
sp.
elkanii
elkanii
elkanii
sp.
elkanii
sp.
elkanii
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
elkanii
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.sp.
liaoningense
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.sp.
canariense
sp.sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.sp.
sp.
japonicum
sp.
japonicum
sp.
sp.sp.
yanmingense
sp.
sp.
elkanii
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
japonicum
sp.
HAMBI1661/TAL1000
CCBAU61307-2
CCBAU61112-1
CCBAU61114-1
CCBAU61301-1
CCBAU61301-3
CCBAU61307-1
CCBAU61112-3
CCBAU61116-2
CCBAU61116-3
CCBAU61112-2
CCBAU61114-3
CCBAU61114-2
CCBAU61116-1
CCBAU61307-4
CCBAU61113-1
CCBAU61114-4
HAMBI2217
HAMBI2228
HAMBI2227
CCBAU61177
CCBAU61221
HAMBI2152HAMBI2140
HAMBI2298
HAMBI2138
DE454
HAMBI2136
HAMBI2137
HAMBI2126HAMBI2133
BC-C2
HAMBI2151HAMBI2149
HAMBI2143
HAMBI2145
HAMBI2147
HAMBI2146
HAMBI2125
HAMBI2134HAMBI2142
HAMBI2135
CCBAU61109-1
CCBAU61109-2
CCBAU61104
CCBAU61107
CCBAU61105CCBAU61106
HAMBI2220
CCBAU61178
HAMBI2115/LMG14299
HAMBI2123/USDA 76
CCBAU61307-3
HAMBI2153
HAMBI2116/LMG14303
283A
LMG14300
HAMBI2150/LMG14300
HAMBI2314/USDA 6
HAMBI2128/LMG14306
Arachis
Indigofera
Pueraria
Pueraria
Aeschynomene
Aeschynomene
Indigofera
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Indigofera
Pueraria
Pueraria
Lespedeza
Lespedeza
Lespedeza
Acacia
Phaseolus
ArachisArachis
Glycine
Arachis
Glycine
Arachis
Arachis
ArachisArachis
Chamaecytisus
ArachisArachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
ArachisArachis
Arachis
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
PuerariaPueraria
Lespedeza
Acacia
Arachis
Glycine
Indigofera
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Glycine
Arachis
Hawaii
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
ChinaChina
China
China
China
China
China
ChinaChina
ChinaChina
China
China
China
China
China
ChinaChina
China
China
China
China
China
ChinaChina
China
China
Zimbabwe
China
Israel
Zimbabwe
Israel
Zimbabwe
Zimbabwe
Mexico
Zimbabwe
.
.
sp.
elkanii
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
japonicum
sp.
HAMBI1661/TAL1000
CCBAU61307-2
CCBAU61112-1
CCBAU61114-1
CCBAU61301-1
CCBAU61301-3
CCBAU61307-1
CCBAU61112-3
CCBAU61116-2
CCBAU61116-3
CCBAU61112-2
CCBAU61114-3
CCBAU61114-2
CCBAU61116-1
CCBAU61307-4
CCBAU61113-1
CCBAU61114-4
HAMBI2217
HAMBI2228
HAMBI2227
CCBAU61177
CCBAU61221
HAMBI2152HAMBI2140
HAMBI2298
HAMBI2138
DE454
HAMBI2136
HAMBI2137
HAMBI2126HAMBI2133
BC-C2
HAMBI2151HAMBI2149
HAMBI2143
HAMBI2145
HAMBI2147
HAMBI2146
HAMBI2125
HAMBI2134HAMBI2142
HAMBI2135
CCBAU61109-1
CCBAU61109-2
CCBAU61104
CCBAU61107
CCBAU61105CCBAU61106
HAMBI2220
CCBAU61178
HAMBI2115/LMG14299
HAMBI2123/USDA 76
CCBAU61307-3
HAMBI2153
HAMBI2116/LMG14303
283A
LMG14300
HAMBI2150/LMG14300
HAMBI2314/USDA 6
HAMBI2128/LMG14306
Arachis
Indigofera
Pueraria
Pueraria
Aeschynomene
Aeschynomene
Indigofera
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Indigofera
Pueraria
Pueraria
Lespedeza
Lespedeza
Lespedeza
Acacia
Phaseolus
ArachisArachis
Glycine
Arachis
Glycine
Arachis
Arachis
ArachisArachis
Chamaecytisus
ArachisArachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
ArachisArachis
Arachis
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
PuerariaPueraria
Lespedeza
Acacia
Arachis
Glycine
Indigofera
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Glycine
Arachis
Hawaii
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
ChinaChina
China
China
China
China
China
ChinaChina
ChinaChina
China
China
China
China
China
ChinaChina
China
China
China
China
China
ChinaChina
China
China
Zimbabwe
China
Israel
Zimbabwe
Israel
Zimbabwe
Zimbabwe
Mexico
Zimbabwe
.
.
.
1
2
3
4
5
7
6
8
9
10
11
12
B=86
B=100
49
4.3.2 recArecA-geenin RFLP-tuloksissa ryhmät muodostettiin yli 60% samankaltaisuusarvoilla (kuva 4.3b).
Bootstrap-arvot olivat hyvin harvoissa ryhmissä yli 70% (kuva 4.3b).
recA-RFLP-analyysit osoittivat, että Bradyrhizobium-kantojen recA-geenin
diversiteetti oli suuri. recA-geeni ryhmitti kannat yleensä samaa isäntäkasvia, maantieteellistä
taustaa ja 16S rDNA-perusteista lajinmääritystä noudattaen. MDS-analyysi (kuva 4.3a) osoitti, että
ryhmät eivät olleet toisilleen yhtä läheisiä kuin ITS-alueen analyysissa, mutta sijoittuivat toistensa
suhteen samankaltaisesti kuin ITS-RFLP-analyysissä.
Kuva 4.3a. recA-RFLP:n tuloksista Dice-kaavalla lasketut kantojen etäisyydet kuvattuna MDS-analyysina. Kuvassa on esitetty
läheisimpien kantojen suhteet, ja osa poikkeavimmista kannoista on jäänyt MDS-avaruuden ulkopuolelle. Ryhmät, joissa kannoilla on
identtiset recA-geenit, näkyvät yhtenä pisteenä. Ryhmien värit noudattavat taulukon 4.3 värejä: Punaisen sävyt kuvaavat kudzua
nystyröiviä B. elkanii –kantoja, vaaleanpunaiset B. japonicum -kantoja, vihreän sävyt esittävät maapähkinää nystyröiviä kantoja ja
keltaiset Lespedezaa nystyröiviä kantoja. Maapähkinää ja kudzua nystyröivien kantojen väliin jää paljon tyyppikantoja.
50
Kuva 4.3.b. Bradyritsobien recA-geenin RFLP-analyysista muodostetun Dice-samankaltaisuusmatriisin perusteella muodostuneet
ryhmät UPGMA-dendrogrammilla kuvattuna. Puun haaroissa näkyvät yhteisfeneettisen korrelaation arvot, sekä 70% ylittävät bootstrap-
arvot (B). Ryhmät muodostettiin yhteisfeneettisen korrelaation arvoilla, jotka ylittävät 90%. Ryhmät olivat pieniä ja niiden väliset suhteet
epäselviä. Geenin diversiteetti oli yleisesti suuri. Lyhenteet: Chi=China, Zim=Zimbabwe, Mex=Mexico, Ha=Hawaiji.
recA HaeIII+recA MspI
recA-RFLP-Iiris
100
9080706050403020100, B=99
100
96
96
1000
100
98, B=75
94
100
87
18
100, B=970
100
100, B=94
100
95
83
100, B=80
94
100. B=84
100
100, B=98
87
100
91
91
77
79
79
100
100, B=83
93
90
100, B=98
100
93
94
94
100
94
100, B=100
100
95
91
76
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
sp.
sp.
sp.
canariense
sp.
japonicum
sp.
japonicumsp.
japonicum
sp.
sp.
yuanmingense
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
elkanii
elkanii
sp.
sp.
elkanii
sp.
sp.
sp.
elkanii
sp.
liaoningense
sp.sp.
sp.
CCBAU61112-1
CCBAU61112-3
CCBAU61113-1
BC-C2
HAMBI2217
CCBAU61104
CCBAU61106
CCBAU61109-1HAMBI2115/LMG14299
HAMBI2314/USDA6
HAMBI2142
HAMBI2143
HAMBI2220
HAMBI2116/LMG14303
HAMBI2145
HAMBI2146
HAMBI2147
HAMBI2227
HAMBI2126
HAMBI2125
HAMBI2133283A
HAMBI2153
HAMBI1661/TAL1000
HAMBI2136
HAMBI2138
HAMBI2137
HAMBI2134
HAMBI2135
HAMBI2151
HAMBI2149
HAMBI2140
CCBAU61307-2
CCBAU61307-4
CCBAU61301-1
CCBAU61307-1
HAMBI2228
CCBAU61114-2
CCBAU61116-2
CCBAU61116-3
CCBAU61177
CCBAU61178
HAMBI2123/ USDA76
DE454
HAMBI2298
HAMBI2150/LMG14300HAMBI2150/LMG14300
HAMBI2128/LMG14306
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Chamaecytisus
Lespedeza
Pueraria
Pueraria
PuerariaArachis
Glycine
Arachis
Arachis
Lespedeza
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Lespedeza
Arachis
Arachis
ArachisArachis
Arachis
Arachi
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Indigofera
Indigofera
Aeschynomene
Indigofera
Lespedeza
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Acacia
Acacia
Glycine
Glycine
Glycine
ArachisArachis
Arachis
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.Zim.
Mex.
Chi.
Chi.
Chi.
Zim.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.Israel
Israel
Ha.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Zim.Zim.
Zim.
.
.
.
11
10
9
8
6
7
4
5
2
3
1
recA HaeIII+recA MspI
recA-RFLP-Iiris
100
9080706050403020100, B=99
100
96
96
1000
100
98, B=75
94
100
87
18
100, B=970
100
100, B=94
100
95
83
100, B=80
94
100. B=84
100
100, B=98
87
100
91
91
77
79
79
100
100, B=83
93
90
100, B=98
100
93
94
94
100
94
100, B=100
100
95
91
76
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
sp.
sp.
sp.
canariense
sp.
japonicum
sp.
japonicumsp.
japonicum
sp.
sp.
yuanmingense
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
elkanii
elkanii
sp.
sp.
elkanii
sp.
sp.
sp.
elkanii
sp.
liaoningense
sp.sp.
sp.
CCBAU61112-1
CCBAU61112-3
CCBAU61113-1
BC-C2
HAMBI2217
CCBAU61104
CCBAU61106
CCBAU61109-1HAMBI2115/LMG14299
HAMBI2314/USDA6
HAMBI2142
HAMBI2143
HAMBI2220
HAMBI2116/LMG14303
HAMBI2145
HAMBI2146
HAMBI2147
HAMBI2227
HAMBI2126
HAMBI2125
HAMBI2133283A
HAMBI2153
HAMBI1661/TAL1000
HAMBI2136
HAMBI2138
HAMBI2137
HAMBI2134
HAMBI2135
HAMBI2151
HAMBI2149
HAMBI2140
CCBAU61307-2
CCBAU61307-4
CCBAU61301-1
CCBAU61307-1
HAMBI2228
CCBAU61114-2
CCBAU61116-2
CCBAU61116-3
CCBAU61177
CCBAU61178
HAMBI2123/ USDA76
DE454
HAMBI2298
HAMBI2150/LMG14300HAMBI2150/LMG14300
HAMBI2128/LMG14306
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Chamaecytisus
Lespedeza
Pueraria
Pueraria
PuerariaArachis
Glycine
Arachis
Arachis
Lespedeza
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Lespedeza
Arachis
Arachis
ArachisArachis
Arachis
Arachi
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Indigofera
Indigofera
Aeschynomene
Indigofera
Lespedeza
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Acacia
Acacia
Glycine
Glycine
Glycine
ArachisArachis
Arachis
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.Zim.
Mex.
Chi.
Chi.
Chi.
Zim.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.Israel
Israel
Ha.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Zim.Zim.
Zim.
.
.
.
recA HaeIII+recA MspI
recA-RFLP-Iiris
100
9080706050403020100, B=99
100
96
96
1000
100
98, B=75
94
100
87
18
100, B=970
100
100, B=94
100
95
83
100, B=80
94
100. B=84
100
100, B=98
87
100
91
91
77
79
79
100
100, B=83
93
90
100, B=98
100
93
94
94
100
94
100, B=100
100
95
91
76
recA HaeIII+recA MspI
recA-RFLP-Iiris
100
9080706050403020100, B=99
100
96
96
1000
100
98, B=75
94
100
87
18
100, B=970
100
100, B=94
100
95
83
100, B=80
94
100. B=84
100
100, B=98
87
100
91
91
77
79
79
100
100, B=83
93
90
100, B=98
100
93
94
94
100
94
100, B=100
100
95
91
76
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
sp.
sp.
sp.
canariense
sp.
japonicum
sp.
japonicumsp.
japonicum
sp.
sp.
yuanmingense
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
elkanii
elkanii
sp.
sp.
elkanii
sp.
sp.
sp.
elkanii
sp.
liaoningense
sp.sp.
sp.
CCBAU61112-1
CCBAU61112-3
CCBAU61113-1
BC-C2
HAMBI2217
CCBAU61104
CCBAU61106
CCBAU61109-1HAMBI2115/LMG14299
HAMBI2314/USDA6
HAMBI2142
HAMBI2143
HAMBI2220
HAMBI2116/LMG14303
HAMBI2145
HAMBI2146
HAMBI2147
HAMBI2227
HAMBI2126
HAMBI2125
HAMBI2133283A
HAMBI2153
HAMBI1661/TAL1000
HAMBI2136
HAMBI2138
HAMBI2137
HAMBI2134
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
sp.
sp.
sp.
canariense
sp.
japonicum
sp.
japonicumsp.
japonicum
sp.
sp.
yuanmingense
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
elkanii
elkanii
sp.
sp.
elkanii
sp.
sp.
sp.
elkanii
sp.
liaoningense
sp.sp.
sp.
CCBAU61112-1
CCBAU61112-3
CCBAU61113-1
BC-C2
HAMBI2217
CCBAU61104
CCBAU61106
CCBAU61109-1HAMBI2115/LMG14299
HAMBI2314/USDA6
HAMBI2142
HAMBI2143
HAMBI2220
HAMBI2116/LMG14303
HAMBI2145
HAMBI2146
HAMBI2147
HAMBI2227
HAMBI2126
HAMBI2125
HAMBI2133283A
HAMBI2153
HAMBI1661/TAL1000
HAMBI2136
HAMBI2138
HAMBI2137
HAMBI2134
HAMBI2135
HAMBI2151
HAMBI2149
HAMBI2140
CCBAU61307-2
CCBAU61307-4
CCBAU61301-1
CCBAU61307-1
HAMBI2228
CCBAU61114-2
CCBAU61116-2
CCBAU61116-3
CCBAU61177
CCBAU61178
HAMBI2123/ USDA76
DE454
HAMBI2298
HAMBI2150/LMG14300HAMBI2150/LMG14300
HAMBI2128/LMG14306
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Chamaecytisus
Lespedeza
Pueraria
Pueraria
PuerariaArachis
Glycine
Arachis
Arachis
Lespedeza
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Lespedeza
Arachis
Arachis
ArachisArachis
Arachis
Arachi
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Indigofera
Indigofera
Aeschynomene
Indigofera
Lespedeza
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Acacia
Acacia
Glycine
Glycine
Glycine
ArachisArachis
Arachis
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.Zim.
Mex.
Chi.
Chi.
Chi.
Zim.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.Israel
Israel
Ha.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Chi.
Zim.Zim.
Zim.
.
.
.
11
10
9
8
6
7
4
5
2
3
1
51
4.3.3 glnIIglnII-RFLP –dendrogrammissa (kuva 4.4b) ryhmät muodostettiin yli 60% samankaltaisuusarvolla,
koska yhteisfeneettiset korrelaatioarvot olivat yli 90%. Bootstrap-arvot tukivat vain ryhmää 12 (kuva
4.4b) ja 100% samankaltaisten kantojen muodostamia joukkoja. Muussa dendrogrammissa arvot
olivat alle 70%.
Analysoitujen Bradyrhizobium-kantojen glnII-geenien diversiteetti oli erittäin suuri
(taulukko 4.3). Dice-dendrogrammi kuvasi ryhmien suhteita melko heikosti (kuva 4.4b). Ryhmät
muodostuivat yleensä saman isäntäkasvin, maantieteellisen taustan ja 16S rDNA-perusteisen
lajinmäärityksen mukaan. Ryhmien väliset suhteet voidaan parhaiten havaita MDS-kuvassa.
Ryhmä 13, joka sisälsi kannat HAMBI2150 (zimbabwelainen maapähkinäkanta) ja
HAMBI 2128 (isäntäkasvina Vigna sp.) poikkesi selvästi muista tutkimuksen bradyritsobeista,
koska niiden recA-fragmentin koko oli huomattavasti suurempi (1000 bp) kuin muilla kannoilla (600
bp).
Kuva 4.4a. glnII-RFLP:n tuloksista Dice-kaavalla lasketut kantojen etäisyydet esitettynä MDS-analyysilla. Ryhmät, joiden kantojen glnII-
geeni oli identtinen, on esitetty yhtenä pisteenä, ja hyvin erilaiset kannat ovat jääneet rajallisen MDS-avaruuden ulkopuolelle. Ryhmien
värit vastaavat taulukon 4.3 värejä: punasävyiset pisteet ovat kudzua nystyröiviä B. elkanii -kantoja, vaaleanpunaiset B. japonicum –
kantoja. Vihreän sävyt edustavat kiinalaista maapähkinää nystyröiviä kantoja ja keltaiset Lespedeza-kantoja. Vasemman puoleisessa
kuvassa on esitetty kantojen väliset suhteet toisiinsa, oikeanpuoleisessa kuvassa on dendrogrammi kolmiulotteisena. Kuva
havainnollistaa, että bradyritsobien glnII vaihtelee erittäin paljon. Kudzua nystyröivät kannat ovat tämän geenin perusteella läheisempiä
kuin muiden analysoitujen geenien perusteella.
52
Kuva 4.4b. Bradyritsobien glnII-geenin RFLP-analyysista muodostetun Dice-samankaltaisuusmatriisin perusteella piirretty UPGMA-
dendrogrammi. Puun haaroissa näkyvät yhteisfeneettisen korrelaation arvot sekä yli 70% bootstrap-arvot (B). Geenin diversiteetti oli
suuri. Kannoista muodostui useita pieniä ryhmiä, ja niiden väliset suhteet eivät kuvautuneet puussa selkeästi. Ryhmien muodostus yli
90% yhteisfeneettisillä korrelaatioarvoilla oli samankaltaista kuin recA-geenin kohdalla.
GlnIIHaeIII +GlnIIMspIGlnII -RFLP -Iiris
1009080706050403020
100
100, B=93
88
100
73
82
100, B=97
100
100
96
69
71
100
64
84
100
75
100
89
100
64
63
70
100
50
63
100, B= 89
100
80
82
100
81
100
100
70
75
66
100
65
100
100
100, B=98
100
96
68
100, B=1000
71
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
sp .
sp .
elkanii
sp .
sp .
sp .
sp .
sp .
sp .
sp .
sp .
japonicum
sp .
sp .
sp .
canariense
sp .
sp .
sp .
sp .
sp .
liaoningense
elkanii
sp .
elkanii
sp .
elkanii
sp .
sp .
sp .
sp .
sp .
japonicum
sp .
sp .
sp .
sp .
japonicum
sp .
sp .
sp .
yuanmingense
sp .
sp .
sp .
sp .
sp .
sp .
sp .
HAMBI2126
HAMBI2125
CCABU61307 -1
CCBAU61307 -4
HAMBI2217
HAMBI2227
HAMBI2152
HAMBI2134
HAMBI2135
HAMBI2228
HAMBI2137
HAMBI2314/USDA6
HAMBI1661/TAL1000
283A
HAMBI2115/LMG14299
BC-C2
HAMBI2116/LMG14303
HAMBI2153
HAMBI2143
HAMBI2136
HAMBI2138
HAMBI2298
HAMBI2123/USDA76
DE454
CCBAU61301 -1
CCBAU61116 -3
CCBAU61116 -2
CCBAU61114 -2
CCBAU61112 -3
CCBAU61113 -1
CCBAU61112 -1
CCBAU61177
CCBAU61104
CCBAU61106
HAMBI2133
CCBAU61221
HAMBI2151
CBAU61109 -1
HAMBI2140
HAMBI2142
HAMBI2149
HAMBI2220
HAMBI2145
HAMBI2147
HAMBI2146
CCBAU61307 -2
HAMBI2150/LMG14300
HAMBI2150/LMG14300
HAMBI2128/LMG14306
Arachis
Arachis
Indigofera
Indigofera
Lespedeza
Lespedeza
Arachis
Arachis
Arachis
Lespedeza
Arachis
Glycine
Arachis
Arachis
Arachis
Chamaecytisus
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Glycine
Glycin
Glycine
Aeschynomene
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Acacia
Pueraria
Pueraria
Arachis
Phaseolus
Arachis
Pueraria
Arachis
Arachis
Arachis
Lespedeza
Arachis
Arachis
Arachis
Indigofera
Arachis
Arachis
Arachis
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
Mexico
Hawaii
Israel
Zimbabwe
Zimbabwe
Israel
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
Zimbabwe
Zimbabwe
Zimbabwe
.
.
13
11
12
10
9
8
7
6
5
3
4
2
1
GlnIIHaeIII +GlnIIMspIGlnII -RFLP -Iiris
1009080706050403020
100
100, B=93
88
100
73
82
100, B=97
100
100
96
69
71
100
64
84
100
75
100
89
100
64
63
70
100
50
63
100, B= 89
100
80
82
100
81
100
100
70
75
66
100
65
100
100
100, B=98
100
96
68
100, B=1000
71
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
sp .
sp .
elkanii
sp .
sp .
sp .
sp .
sp .
sp .
sp .
sp .
japonicum
sp .
sp .
sp .
canariense
sp .
sp .
sp .
sp .
sp .
liaoningense
elkanii
sp .
elkanii
sp .
elkanii
sp .
sp .
sp .
sp .
sp .
japonicum
sp .
sp .
sp .
sp .
japonicum
sp .
sp .
sp .
yuanmingense
sp .
sp .
sp .
sp .
sp .
sp .
sp .
HAMBI2126
HAMBI2125
CCABU61307 -1
CCBAU61307 -4
HAMBI2217
HAMBI2227
HAMBI2152
HAMBI2134
HAMBI2135
HAMBI2228
HAMBI2137
HAMBI2314/USDA6
HAMBI1661/TAL1000
283A
HAMBI2115/LMG14299
BC-C2
HAMBI2116/LMG14303
HAMBI2153
HAMBI2143
HAMBI2136
HAMBI2138
HAMBI2298
HAMBI2123/USDA76
DE454
CCBAU61301 -1
CCBAU61116 -3
CCBAU61116 -2
CCBAU61114 -2
CCBAU61112 -3
CCBAU61113 -1
CCBAU61112 -1
CCBAU61177
CCBAU61104
CCBAU61106
HAMBI2133
CCBAU61221
HAMBI2151
CBAU61109 -1
HAMBI2140
HAMBI2142
HAMBI2149
HAMBI2220
HAMBI2145
HAMBI2147
HAMBI2146
CCBAU61307 -2
HAMBI2150/LMG14300
HAMBI2150/LMG14300
HAMBI2128/LMG14306
Arachis
Arachis
Indigofera
Indigofera
Lespedeza
Lespedeza
Arachis
Arachis
Arachis
Lespedeza
Arachis
Glycine
Arachis
Arachis
Arachis
Chamaecytisus
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Glycine
Glycin
Glycine
Aeschynomene
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Acacia
Pueraria
Pueraria
Arachis
Phaseolus
Arachis
Pueraria
Arachis
Arachis
Arachis
Lespedeza
Arachis
Arachis
Arachis
Indigofera
Arachis
Arachis
Arachis
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
Mexico
Hawaii
Israel
Zimbabwe
Zimbabwe
Israel
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
Zimbabwe
Zimbabwe
Zimbabwe
.
.
GlnIIHaeIII +GlnIIMspIGlnII -RFLP -Iiris
1009080706050403020
100
100, B=93
88
100
73
82
100, B=97
100
100
96
69
71
100
64
84
100
75
100
89
100
64
63
70
100
50
63
100, B= 89
100
80
82
100
81
100
100
70
75
66
100
65
100
100
100, B=98
100
96
68
100, B=1000
71
GlnIIHaeIII +GlnIIMspIGlnII -RFLP -Iiris
1009080706050403020
100
100, B=93
88
100
73
82
100, B=97
100
100
96
69
71
100
64
84
100
75
100
89
100
64
63
70
100
50
63
100, B= 89
100
80
82
100
81
100
100
70
75
66
100
65
100
100
100, B=98
100
96
68
100, B=1000
71
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
sp .
sp .
elkanii
sp .
sp .
sp .
sp .
sp .
sp .
sp .
sp .
japonicum
sp .
sp .
sp .
canariense
sp .
sp .
sp .
sp .
sp .
liaoningense
elkanii
sp .
elkanii
sp .
elkanii
sp .
sp .
sp .
sp .
sp .
japonicum
sp .
sp .
sp .
sp .
japonicum
sp .
sp .
sp .
yuanmingense
sp .
sp .
sp .
sp .
sp .
sp .
sp .
HAMBI2126
HAMBI2125
CCABU61307 -1
CCBAU61307 -4
HAMBI2217
HAMBI2227
HAMBI2152
HAMBI2134
HAMBI2135
HAMBI2228
HAMBI2137
HAMBI2314/USDA6
HAMBI1661/TAL1000
283A
HAMBI2115/LMG14299
BC-C2
HAMBI2116/LMG14303
HAMBI2153
HAMBI2143
HAMBI2136
HAMBI2138
HAMBI2298
HAMBI2123/USDA76
DE454
CCBAU61301 -1
CCBAU61116 -3
CCBAU61116 -2
CCBAU61114 -2
CCBAU61112 -3
CCBAU61113 -1
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
sp .
sp .
elkanii
sp .
sp .
sp .
sp .
sp .
sp .
sp .
sp .
japonicum
sp .
sp .
sp .
canariense
sp .
sp .
sp .
sp .
sp .
liaoningense
elkanii
sp .
elkanii
sp .
elkanii
sp .
sp .
sp .
sp .
sp .
japonicum
sp .
sp .
sp .
sp .
japonicum
sp .
sp .
sp .
yuanmingense
sp .
sp .
sp .
sp .
sp .
sp .
sp .
HAMBI2126
HAMBI2125
CCABU61307 -1
CCBAU61307 -4
HAMBI2217
HAMBI2227
HAMBI2152
HAMBI2134
HAMBI2135
HAMBI2228
HAMBI2137
HAMBI2314/USDA6
HAMBI1661/TAL1000
283A
HAMBI2115/LMG14299
BC-C2
HAMBI2116/LMG14303
HAMBI2153
HAMBI2143
HAMBI2136
HAMBI2138
HAMBI2298
HAMBI2123/USDA76
DE454
CCBAU61301 -1
CCBAU61116 -3
CCBAU61116 -2
CCBAU61114 -2
CCBAU61112 -3
CCBAU61113 -1
CCBAU61112 -1
CCBAU61177
CCBAU61104
CCBAU61106
HAMBI2133
CCBAU61221
HAMBI2151
CBAU61109 -1
HAMBI2140
HAMBI2142
HAMBI2149
HAMBI2220
HAMBI2145
HAMBI2147
HAMBI2146
CCBAU61307 -2
HAMBI2150/LMG14300
HAMBI2150/LMG14300
HAMBI2128/LMG14306
Arachis
Arachis
Indigofera
Indigofera
Lespedeza
Lespedeza
Arachis
Arachis
Arachis
Lespedeza
Arachis
Glycine
Arachis
Arachis
Arachis
Chamaecytisus
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Glycine
Glycin
Glycine
Aeschynomene
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Acacia
Pueraria
Pueraria
Arachis
Phaseolus
Arachis
Pueraria
Arachis
Arachis
Arachis
Lespedeza
Arachis
Arachis
Arachis
Indigofera
Arachis
Arachis
Arachis
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
Mexico
Hawaii
Israel
Zimbabwe
Zimbabwe
Israel
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
Zimbabwe
Zimbabwe
Zimbabwe
.
.
13
11
12
10
9
8
7
6
5
3
4
2
1
53
4.3.4 nifHnifH-RFLP –dendrogrammissa ryhmät muodostettiin yli 60% samankaltaisuusarvolla (kuva 4.5b),
jotta ryhmiä voitaisiin vertailla muiden geenien RFLP-tuloksista muodostettuihin ryhmiin (kuvat
4.2b-4.6b). Yhteisfeneettisen korrelaation arvot olivat kuitenkin lähes koko dendrogrammissa yli
90%. Yli 70% bootstrap-arvot tukivat vain ryhmää 3, joitain 100% samankaltaisten kantojen
muodostamia joukkoja (kuva 4.5b).
Verrattuna ydingeeneihin ja ITS-alueeseen bradyritsobikantojen nifH-geenit
osoittivat laajaa, mutta luonteeltaan erilaista diversiteettiä: 1) ryhmiä muodostui vähemmän (5
kappaletta), 2) ryhmät olivat laajempia kuin ydingeeniryhmät, käsittäen jopa 10 kantaa, ja 3)
ryhmien ulkopuolelle jäi runsaasti toisilleen kaukaisia, ryhmiin kuulumattomia kantoja (kuvat 4.5a ja
4.5b). Kudzua nystyröineet B. japonicum –kannat olivat keskenään erilaisia, ja erottuivat selkeästi
myös tutkimuksen muista Bradyrhizobium-kannoista. B. japonicum –kantojen välinen etäisyys
kuvautuu parhaiten MDS-kuvan dendrogrammissa (kuva 4.5a, oikeanpuoleinen kuva). Analyysien
mukaan samaakin isäntäkasvia nystyröivillä Bradyrhizobium-kannoilla saattoi olla erilaiset nifH-
geenit.
Kuva 4.5a. nifH-RFLP:n tuloksista Dice-kaavalla lasketut kantojen etäisyydet esitettynä MDS-analyysilla. Ryhmissä nifH-geeniltään
identtiset kannat on esitetty yhtenä pisteenä, ja selvästi poikkeavat kannat ovat jääneet rajallisen MDS-avaruuden ulkopuolelle. Ryhmien
värit vastaavat taulukon 4.3 värejä: punasävyiset pisteet ovat kudzua nystyröiviä B. elkanii -kantoja, vaaleanpunaiset B. japonicum –
kantoja. Vihreän sävyt edustavat kiinalaista maapähkinää nystyröiviä kantoja ja keltaiset Lespedeza-kantoja. Vasemmalle kantojen
suhteet toisiinsa, oikealla dendrogrammi esitettynä kolmiulotteisena. Kuva havainnollistaa, että bradyritsobien nifH voi olla erilainen
samaakin isäntäkasvia nystyröivillä kannoilla.
54
Kuva 4.5b. Bradyritsobien nifH-geenin RFLP-analyysistä muodostetun Dice-samankaltaisuusmatriisin perusteella piirretty UPGMA-
dendrogrammi. Puun haaroissa näkyvät yhteisfeneettisen korrelaation arvot sekä 70% ylittävät boostrap-arvot (B). Ryhmät
muodostettiin yli 90% yhteisfeneettisen korrelaation arvoilla. Ryhmät olivat suurempia ja yhtenäisempiä kuin ydingeenien perusteella
muodostuneet. Lisäksi nifH-ryhmät noudattivat paremmin isäntäkasvin ja alkuperän mukaista jakoa kuin ITS, recA ja glnII.
NifH HaeIII+NifH MspI
nifH-RFLP-Iiris
100
908070605040302010
100
100
81
100
100, B=82
86
83
100
100
100
100
80
90
94
88
91
90
100
100, B=870
90, B=78
99
92
100
100
100, B=990
0
0
0
0
100
90
91
96
91
100, B=100
100
91
100
99
90
91
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
sp.
sp.
sp.
yuanmingense
sp.sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
elkaniisp.
sp.canariense
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
liaoningense
japonicum
sp.
sp.sp.
elkanii
elkanii
sp.
sp.
sp.
elkanii
sp.
sp.
sp.
sp.sp.
sp.
japonicum
sp.
japonicum
HAMBI2150/LMG14300
HAMBI2228
LMG14300
HAMBI2220
283AHAMBI2153
HAMBI2134
HAMBI2142
CCBAU61178
HAMBI2137
HAMBI2138
HAMBI2136
HAMBI2151
HAMBI2149
HAMBI2123/ USDA76HAMBI2133
HAMBI2128/LMG14306BC-C2
HAMBI2126
HAMBI2125
HAMBI2145
HAMBI2146
HAMBI2147
HAMB2135
HAMBI2298
HAMBI2314/USDA6
CCBAU61307-4
CCBAU61116-3CCBAU61177
CCBAU61301-1
CCBAU61307-1
CCBAU61112-3
CCBAU61113-1
CCBAU61114-2
CCBAU61116-2
CCBAU61112-1
CCBAU61221
HAMBI2217
HAMBI2227HAMBI2152
CCBAU61106
CCBAU61109-1
HAMBI2115/LMG14299
CCBAU61104
Arachis
Lespedeza
Arachis
Lespedeza
ArachisArachis
Arachis
Arachis
Acacia
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
GlycineArachis
ArachisChamaecytisus
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Glycine
Glycine
Indigofera
PuerariaAcacia
Aeschynomene
Indigofera
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Phaseolus
Lespedeza
LespedezaArachis
Pueraria
Pueraria
Arachis
Pueraria
Zimbabw e
China
Zimbabw e
China
IsraelIsrael
China
China
China
China
China
China
China
China
China
Zimbabw e
China
China
China
China
China
China
China
Mexico
China
ChinaChina
China
China
China
China
China
China
China
China
China
ChinaChina
China
China
Zimbabw e
China
5
4
3
2
1
B=84
NifH HaeIII+NifH MspI
nifH-RFLP-Iiris
100
908070605040302010
100
100
81
100
100, B=82
86
83
100
100
100
100
80
90
94
88
91
90
100
100, B=870
90, B=78
99
92
100
100
100, B=990
0
0
0
0
100
90
91
96
91
100, B=100
100
91
100
99
90
91
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
sp.
sp.
sp.
yuanmingense
sp.sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
elkaniisp.
sp.canariense
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
liaoningense
japonicum
sp.
sp.sp.
elkanii
elkanii
sp.
sp.
sp.
elkanii
sp.
sp.
sp.
sp.sp.
sp.
japonicum
sp.
japonicum
HAMBI2150/LMG14300
HAMBI2228
LMG14300
HAMBI2220
283AHAMBI2153
HAMBI2134
HAMBI2142
CCBAU61178
HAMBI2137
HAMBI2138
HAMBI2136
HAMBI2151
HAMBI2149
HAMBI2123/ USDA76HAMBI2133
HAMBI2128/LMG14306BC-C2
HAMBI2126
HAMBI2125
HAMBI2145
HAMBI2146
HAMBI2147
HAMB2135
HAMBI2298
HAMBI2314/USDA6
CCBAU61307-4
CCBAU61116-3CCBAU61177
CCBAU61301-1
CCBAU61307-1
CCBAU61112-3
CCBAU61113-1
CCBAU61114-2
CCBAU61116-2
CCBAU61112-1
CCBAU61221
HAMBI2217
HAMBI2227HAMBI2152
CCBAU61106
CCBAU61109-1
HAMBI2115/LMG14299
CCBAU61104
Arachis
Lespedeza
Arachis
Lespedeza
ArachisArachis
Arachis
Arachis
Acacia
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
GlycineArachis
ArachisChamaecytisus
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Glycine
Glycine
Indigofera
PuerariaAcacia
Aeschynomene
Indigofera
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Phaseolus
Lespedeza
LespedezaArachis
Pueraria
Pueraria
Arachis
Pueraria
Zimbabw e
China
Zimbabw e
China
IsraelIsrael
China
China
China
China
China
China
China
China
China
Zimbabw e
China
China
China
China
China
China
China
Mexico
China
ChinaChina
China
China
China
China
China
China
China
China
China
ChinaChina
China
China
Zimbabw e
China
NifH HaeIII+NifH MspI
nifH-RFLP-Iiris
100
908070605040302010
100
100
81
100
100, B=82
86
83
100
100
100
100
80
90
94
88
91
90
100
100, B=870
90, B=78
99
92
100
100
100, B=990
0
0
0
0
100
90
91
96
91
100, B=100
100
91
100
99
90
91
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
NifH HaeIII+NifH MspI
nifH-RFLP-Iiris
100
908070605040302010
100
100
81
100
100, B=82
86
83
100
100
100
100
80
90
94
88
91
90
100
100, B=870
90, B=78
99
92
100
100
100, B=990
0
0
0
0
100
90
91
96
91
100, B=100
100
91
100
99
90
91
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
sp.
sp.
sp.
yuanmingense
sp.sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
elkaniisp.
sp.canariense
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
liaoningense
japonicum
sp.
sp.sp.
elkanii
elkanii
sp.
sp.
sp.
elkanii
sp.
sp.
sp.
sp.sp.
sp.
japonicum
sp.
japonicum
HAMBI2150/LMG14300
HAMBI2228
LMG14300
HAMBI2220
283AHAMBI2153
HAMBI2134
HAMBI2142
CCBAU61178
HAMBI2137
HAMBI2138
HAMBI2136
HAMBI2151
HAMBI2149
HAMBI2123/ USDA76HAMBI2133
HAMBI2128/LMG14306BC-C2
HAMBI2126
HAMBI2125
HAMBI2145
HAMBI2146
HAMBI2147
HAMB2135
HAMBI2298
HAMBI2314/USDA6
CCBAU61307-4
CCBAU61116-3CCBAU61177
CCBAU61301-1
CCBAU61307-1
CCBAU61112-3
CCBAU61113-1
CCBAU61114-2
CCBAU61116-2
CCBAU61112-1
CCBAU61221
HAMBI2217
HAMBI2227HAMBI2152
CCBAU61106
CCBAU61109-1
HAMBI2115/LMG14299
CCBAU61104
Arachis
Lespedeza
Arachis
Lespedeza
ArachisArachis
Arachis
Arachis
Acacia
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
GlycineArachis
ArachisChamaecytisus
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Glycine
Glycine
Indigofera
PuerariaAcacia
Aeschynomene
Indigofera
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Phaseolus
Lespedeza
LespedezaArachis
Pueraria
Pueraria
Arachis
Pueraria
Zimbabw e
China
Zimbabw e
China
IsraelIsrael
China
China
China
China
China
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
sp.
sp.
sp.
yuanmingense
sp.sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
elkaniisp.
sp.canariense
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
liaoningense
japonicum
sp.
sp.sp.
elkanii
elkanii
sp.
sp.
sp.
elkanii
sp.
sp.
sp.
sp.sp.
sp.
japonicum
sp.
japonicum
HAMBI2150/LMG14300
HAMBI2228
LMG14300
HAMBI2220
283AHAMBI2153
HAMBI2134
HAMBI2142
CCBAU61178
HAMBI2137
HAMBI2138
HAMBI2136
HAMBI2151
HAMBI2149
HAMBI2123/ USDA76HAMBI2133
HAMBI2128/LMG14306BC-C2
HAMBI2126
HAMBI2125
HAMBI2145
HAMBI2146
HAMBI2147
HAMB2135
HAMBI2298
HAMBI2314/USDA6
CCBAU61307-4
CCBAU61116-3CCBAU61177
CCBAU61301-1
CCBAU61307-1
CCBAU61112-3
CCBAU61113-1
CCBAU61114-2
CCBAU61116-2
CCBAU61112-1
CCBAU61221
HAMBI2217
HAMBI2227HAMBI2152
CCBAU61106
CCBAU61109-1
HAMBI2115/LMG14299
CCBAU61104
Arachis
Lespedeza
Arachis
Lespedeza
ArachisArachis
Arachis
Arachis
Acacia
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
GlycineArachis
ArachisChamaecytisus
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Glycine
Glycine
Indigofera
PuerariaAcacia
Aeschynomene
Indigofera
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Phaseolus
Lespedeza
LespedezaArachis
Pueraria
Pueraria
Arachis
Pueraria
Zimbabw e
China
Zimbabw e
China
IsraelIsrael
China
China
China
China
China
China
China
China
China
Zimbabw e
China
China
China
China
China
China
China
Mexico
China
ChinaChina
China
China
China
China
China
China
China
China
China
ChinaChina
China
China
Zimbabw e
China
5
4
3
2
1
B=84
55
4.3.5 nodCnodC-RFLP –ryhmät muodostettiin dendrogrammissa 60% samankaltaisuudella (kuva 4.6b).
Yhteisfeneettinen korrelaatio tuki koko dendrogrammia, koska lähes kaikki arvot olivat yli 90%.
Bootstrap-analyysi sen sijaan tuki vain 100% samankaltaisten kantojen joukkoja (kuva 4.6b).
Tutkittujen Bradyrhizobium-kantojen nodC-geenit ryhmittyivät erilailla kuin muut
geenit (kuvat 4.6a ja 4.6b): nodC-ryhmät olivat laajemmat muihin geeneihin verrattuna, käsittäen
keskimäärin 4-12 kantaa, ja ryhmät olivat toisilleen kaukaisempia (kuva 4.6a). Toisaalta useiden
kantojen kohdalla nodC-geenin monistaminen epäonnistui useammin kuin muiden geenien
monistus, eli joidenkin kantojen nodC-sekvenssit olivat selkeästi erilaiset.
nodC-RFLP-analyysien mukaan maapähkinää nystyröineet kannat jakaantuivat
kahteen ryhmään, joissa oli mukana toisenkin isäntäkasvin nystyräbakteereita: ryhmä 2 koostui
maapähkinä- ja soijapapukannoista, ja ryhmä 4 koostui maapähkinä- ja Indigofera-kannoista.
Kudzua nystyröivistä kannoista B. japonicum -kannat (ryhmä 3) erottuivat B. elkanii -kannoista
(ryhmä 1).
HAMBI2228 (Lespedeza) ja CCBAU61221 (Phaseolus) -kannat erottuivat muista
kannoista selvästi. Ne olivat ainoat isäntäkasviaan edustavat bradyritsobikannat nodC-analyysissä.
Isäntäkasvien mukainen ryhmittyminen on nodC-geenin kohdalla loogista, sillä tämä geeni tuottaa
nystyröinnin onnistumisen kannalta tärkeitä nod-tekijöitä.
Kuva 4.6a. nodC-RFLP:n analyysituloksista Dice-kaavalla lasketut kantojen väliset etäisyydet MDS-analyysilla kuvattuna. Värit vastaavat
taulukossa 4.3 esitettyjä ryhmien värejä seuraavasti: punaisen sävyt ovat kudzua nystyröiviä kantoja, vihreän sävyt edistavat kiinalaista
maapähkinää nystyröiviä kantoja, ja keltainen Lespedeza-kantoja. Vasemmanpuoleisessa kuvassa on esitetty kantojen suhteet toisiinsa,
oikealla on dendrogrammi kolmiulotteisessa muodossa. Kuva osoittaa UPGMA-puuta selkeämmin, että nodC-ryhmät ovat keskenään
hyvin erilaisia.
56
Kuva 4.6b. Bradyritsobien nodC-geenin RFLP-analyysituloksista lasketun Dice-samankaltaisuusmatriisin perusteella piirretty UPGMA-
dendrogrammi. Puun haaroissa näkyvät yhteisfeneettisen korrelaation arvot sekä 70% ylittävät bootstrap-arvot. Ryhmät muodostettiin
yli 90% yhteisfeneettisen korrelaation arvoilla. Isäntäkasvin mukainen jako on vahvempi, ja ryhmien suhteet toisiinsa ovat selkeämmät
nodC-geenin perusteella kuin nifH-geenissä. Useat kannat puuttuvat kuvasta, koska niiden nodC-geenin PCR epäonnistui valituilla
alukkeilla.
nodC HaeIII+nodC MspI
nodC-RFLP-Iiris
100
90807060504030
100
1000
0
0
0
0
100
1000
100
94
89
100
78
91
100, B=99
100
100, B=99
93
90
1000
0
0
0
100
100, B=100
96
97
100, B=100
94
84
91
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
sp.
sp.elkanii
sp.
sp.
sp.
sp.
elkanii
sp.
elkanii
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.sp.
sp.japonicum
japonicum
sp.
japonicum
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.sp.
elkanii
sp.
sp.
sp.
sp.
HAMBI2228
CCBAU61221CCBAU61301-1
CCBAU61112-1
CCBAU61112-3
CCBAU61113-1
CCBAU61114-2
CCBAU61116-2
CCBAU61116-3
HAMBI2123/USDA 76
HAMBI2137
HAMBI2138
HAMBI2133
HAMBI2151
HAMBI2128/LMG14306HAMBI2136
HAMBI2149HAMBI2314/USDA6
CCBAU61104
CCBAU61106
CCBAU61109-1
HAMBI2150/LMG14300
HAMBI2150/LMG14300
HAMBI2126
HAMBI2142
HAMBI2145
HAMBI2146
HAMBI2147
HAMBI2125HAMBI2134
CCBAU61307-1
CCBAU61307-4
HAMBI2135
283A
HAMBI2153
Lespedeza
PhaseolusAeschynomene
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Glycine
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
ArachisArachis
ArachisGlycine
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
ArachisArachis
Indigofera
Indigofera
Arachis
Arachis
Arachis
China
ChinaChina
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
Zimbabw eChina
ChinaMexico
China
China
China
Zimbabw e
Zimbabw e
China
China
China
China
China
ChinaChina
China
China
China
Israel
Israel
3
4
2
1
B=100
B=95
nodC HaeIII+nodC MspI
nodC-RFLP-Iiris
100
90807060504030
100
1000
0
0
0
0
100
1000
100
94
89
100
78
91
100, B=99
100
100, B=99
93
90
1000
0
0
0
100
100, B=100
96
97
100, B=100
94
84
91
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
sp.
sp.elkanii
sp.
sp.
sp.
sp.
elkanii
sp.
elkanii
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.sp.
sp.japonicum
japonicum
sp.
japonicum
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.sp.
elkanii
sp.
sp.
sp.
sp.
HAMBI2228
CCBAU61221CCBAU61301-1
CCBAU61112-1
CCBAU61112-3
CCBAU61113-1
CCBAU61114-2
CCBAU61116-2
CCBAU61116-3
HAMBI2123/USDA 76
HAMBI2137
HAMBI2138
HAMBI2133
HAMBI2151
HAMBI2128/LMG14306HAMBI2136
HAMBI2149HAMBI2314/USDA6
CCBAU61104
CCBAU61106
CCBAU61109-1
HAMBI2150/LMG14300
HAMBI2150/LMG14300
HAMBI2126
HAMBI2142
HAMBI2145
HAMBI2146
HAMBI2147
HAMBI2125HAMBI2134
CCBAU61307-1
CCBAU61307-4
HAMBI2135
283A
HAMBI2153
Lespedeza
PhaseolusAeschynomene
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Glycine
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
ArachisArachis
ArachisGlycine
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
ArachisArachis
Indigofera
Indigofera
Arachis
Arachis
Arachis
China
ChinaChina
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
Zimbabw eChina
ChinaMexico
China
China
China
Zimbabw e
Zimbabw e
China
China
China
China
China
ChinaChina
China
China
China
Israel
Israel
nodC HaeIII+nodC MspI
nodC-RFLP-Iiris
100
90807060504030
100
1000
0
0
0
0
100
1000
100
94
89
100
78
91
100, B=99
100
100, B=99
93
90
1000
0
0
0
100
100, B=100
96
97
100, B=100
94
84
91
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
sp.
sp.elkanii
sp.
sp.
sp.
sp.
elkanii
sp.
elkanii
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.sp.
nodC HaeIII+nodC MspI
nodC-RFLP-Iiris
100
90807060504030
100
1000
0
0
0
0
100
1000
100
94
89
100
78
91
100, B=99
100
100, B=99
93
90
1000
0
0
0
100
100, B=100
96
97
100, B=100
94
84
91
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.
B.B.
B.
B.
B.
B.
B.
sp.
sp.elkanii
sp.
sp.
sp.
sp.
elkanii
sp.
elkanii
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.sp.
sp.japonicum
japonicum
sp.
japonicum
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.
sp.sp.
elkanii
sp.
sp.
sp.
sp.
HAMBI2228
CCBAU61221CCBAU61301-1
CCBAU61112-1
CCBAU61112-3
CCBAU61113-1
CCBAU61114-2
CCBAU61116-2
CCBAU61116-3
HAMBI2123/USDA 76
HAMBI2137
HAMBI2138
HAMBI2133
HAMBI2151
HAMBI2128/LMG14306HAMBI2136
HAMBI2149HAMBI2314/USDA6
CCBAU61104
CCBAU61106
CCBAU61109-1
HAMBI2150/LMG14300
HAMBI2150/LMG14300
HAMBI2126
HAMBI2142
HAMBI2145
HAMBI2146
HAMBI2147
HAMBI2125HAMBI2134
CCBAU61307-1
CCBAU61307-4
HAMBI2135
283A
HAMBI2153
Lespedeza
PhaseolusAeschynomene
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Glycine
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
ArachisArachis
ArachisGlycine
Pueraria
Pueraria
Pueraria
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
Arachis
ArachisArachis
Indigofera
Indigofera
Arachis
Arachis
Arachis
China
ChinaChina
China
China
China
China
China
China
China
China
China
China
Zimbabw eChina
ChinaMexico
China
China
China
Zimbabw e
Zimbabw e
China
China
China
China
China
ChinaChina
China
China
China
Israel
Israel
3
4
2
1
B=100
B=95
57
5. Tulosten tarkastelu
Tämän tutkimuksen Bradyrhizobium-kantojen sekä ydin- että symbioosigeenien diversiteetti
osoittautui suureksi. Kiinalaiset kannat muodostivat useita hyvin läheisten kantojen ryhmiä
(taulukko 4.3). ITS-alueen ja recA-geenin RFLP-ryhmät sekä AFLP korreloivat melko hyvin (kuvat
4.1a-4.3a ja 4.1b-4.3b). glnII-geeniryhmissä oli enemmän sisäistä vaihtelua kuin recA-
geeniryhmissä, mutta muilta osin (pienet ryhmät, ryhmien välisten suhteiden monimutkaisuus)
ydingeenit muistuttivat toisiaan (kuvat 4.3a/b ja 4.4a/b). ITS-ryhmät sisälsivät useanlaisia ydin- ja
symbioosigeeniryhmiä, ja symbioosigeeniryhmät sisälsivät erilaisiin ydingeeniryhmiin kuuluvia
kantoja (taulukko 4.3). Toisilleen läheisillä ITS-ryhmillä oli usein sama isäntäkasvi tai alueellinen
tausta, mutta ryhmät olivat pieniä (kuvat 4.2a ja b). Sama koski muita tutkittuja geenejä. 16S
rDNA:n perusteella määritetyt lajit saattoivat jakaantua useisiin genotyyppiryhmiin. Mm. tämän
ilmiön takia on selvää, että bradyritsobien kokonaisgenomi oli hyvin heterogeeninen, kuten AFLP
osoitti.
Yhteisen maantieteellisen alkuperän ja isäntäkasvin vaikutukset genomiin olivat
havaittavissa. Kaikissa erillisissä geeni-RFLP –tuloksissa sekä AFLP-tuloksissa voitiin erottaa
seuraavat trendit:
1) Maapähkinää nystyröivät bradyritsobit jakaantuivat useisiin pieniin ryhmiin, joiden väliset
sukulaisuussuhteet toisiiinsa vaihtelivat tutkitusta geenistä riippuen. Yleensä nämä ryhmät olivat
läheisempiä toisilleen kuin kansainvälisille Bradyrhizobium-tyyppi- ja vertailukannoille tai kudzua
nystyröiville kannoille.
2) Kudzua nystyröi kaksi hyvin erilaista bradyritsobijoukkoa, joista toinen sisälsi B. japonicum –
kantoja ja toinen B. elkanii –kantoja. B. japonicum- ja B. elkanii -joukot erosivat selvästi toisistaan.
3) Tyyppikannat eivät olleet läheistä sukua toisilleen eivätkä kiinalaisille kannoille.
Isäntäkasvi ja maantieteellinen alkuperä vaikuttivat tutkittujen Bradyrhizobium-kantojen geenien
ryhmittymiseen:
i) Etelä-Amerikasta Aasiaan tuotua maapähkinää (Arachis hypogaea) nystyröivät kannat olivat
erilaisia kuin alunperin aasialaista kudzua (Pueraria lobata) nystyröivät kannat (taulukko 4.3).
ii) Kansainväliset tyyppi- ja vertailukannat olivat toisilleen kaukaisia sukulaisia ja poikkesivat
selvästi kiinalaisista kannoista (taulukko 4.3).
iii) Maapähkinää nystyröineiden Bradyrhizobium-kantojen joukosta muodostui ryhmiä, joiden
jäsenet olivat keskenään hyvin samankaltaisia, mutta ryhmien väliset suhteet olivat vaihtelevia
(taulukko 4.3).
58
iv) Kudzua nystyröi kaksi keskenään hyvin erilaista bradyritsobiryhmää, joista toinen sisälsi B.
elkanii –kantoja ja toinen B. japonicum –kantoja. Maapähkinäkannat sijoittuivat näiden ryhmien
väliin, eivätkä selvästi kuuluneet kumpaankaan ryhmään (kuvat 4.1a-4.6a).
Tuloksista huomattiin, ettei UPGMA-puilla voitu kuvata kantojen suhteita
kokonaisuudessaan totuudenmukaisesti. Dendrogrammi kuvasi kantojen RFLP-tuloksista
laskettuja samankaltaisuusmatriiseja puutteellisesti, ja antoi siten vajavaisen kuvan kantojen
suhteista toisiinsa. Dendrogrammeista saatuja tuloksia voitiin kuitenkin tulkita, kun niiden
vajavaisuudet otettiin huomioon.
5.1 Tässä työssä käytettyjen metodien soveltuvuus taksonomia-
tutkimuksissa
5.1.1 Yksittäisten geenien suhde 16S rDNA-perusteiseen lajinmääritykseenBradyrhizobium-suvussa, sekä sormenjälkimenetelmien tulkittavuusNykyisessä taksonomiassa 16S- ja 23S- rDNA-geenien sekvensseillä on suuri rooli bakteerilajien
määrityksessä, koska niitä pidetään pitkälti muuntelemattomina genomin osina. Genomiset
tutkimukset paljastavat silti usein, että yksi geenisekvenssi kuvaa lajin sisäistä diversiteettiä varsin
vajavaisesti (Lindström ja Gyllenberg 2006, Sawada ym. 2003, Rosselló-Mora ja Amann 2001).
16S rRNAn ja rDNAn analysoinnin ongelma on, että se asettaa keinotekoiset rajat genomiselle
diversiteetille.
Tämän tutkimuksen Bradyrhizobium-kantojen genominen diversiteetti oli
huomattavasti suurempi kuin 16S rDNA:han perustuva lajitunnistus. Tutkitut geenit olivat hyvin
vaihtelevia, eivätkä ne liittyneet yksiselitteisesti 16S rDNA-perusteisiin lajimäärityksiin. Esimerkiksi
16S rDNA-geenin sekvenssin perusteella nimetyt B. elkanii –kannat olivat hyvin erilaisia muun
genominsa osalta eri puolilla maailmaa (esim. kuva 4.1b). Toisaalta esimerkiksi B. liaoningense
saattoi tietyn geenin perusteella olla B. elkanii –kannalle läheisempi kuin toinen B. elkanii –kanta,
joka oli peräisin eri isäntäkasvilajista tai maantieteelliseltä alueelta.
Yksittäisten geenien perusteella voidaan kuitenkin päätellä muita seikkoja bakteerien
ekologiasta ja elämästä. Esimerkiksi tämän tutkimuksen Bradyrhizobium-kantojen ydin- ja
symbioosigeenien samankaltaisuus ja toisaalta erilaisuus heijasti bakteerien populaatiota,
sopeutumista erilaisiin ympäristöihin, ja mahdollisesti populaatioiden välistä vuorovaikutusta
(horistontaalista geenien siirtymistä).
Kun geenejä tutkitaan sormenjälkimenetelmien avulla, tulkinnassa tulisi myös
muistaa, että tutkimus kohdentuu geenien sekvensseihin. Identtisistä sormenjälkikuvioista
huolimatta geenit eivät välttämättä ole sekvenssitasolla samanlaisia (Haukka ym. 1998). Toisaalta
59
on huomioitava, että myös nonsense-mutaatioiden aiheuttamat erot geenin sekvenssissä voivat
aiheuttaa erilaisen RFLP-sormenjäljen. Yksittäisten kantojen outo sijoittuminen, esimerkiksi
LMG14299 –kannan eroaminen AFLP-dendrogrammissa (kuva 4.1b), saattaa johtua kyseisestä
”virheestä”.
5.1.2 Tyyppikantojen käyttö tutkimuksissaTyyppikantoja käytetään tutkimuksissa yleensä edustamaan tiettyä bakteeriryhmää, -sukua tai -
lajia. Niiden avulla tunnistetaan bakteereita ja vertaillaan tutkittavien kantojen välisiä suhteita.
Tutkimukseni tulokset havainnollistivat myös tyyppikantojen käytön näkökulmasta 16S rDNA:han
perustuvan lajinmäärityksen puutteellisuutta. Tuloksista havaittiin, että samasta alkuperästä
(maantieteellinen tai isäntäkasvilaji) voi olla lähtöisin geneettisesti hyvinkin erilaisia
Bradyrhizobium-kantoja (taulukko 4.3). Tämän takia yksittäisten tyyppikantojen käyttäminen
vertailuun voi antaa yksipuolisen, jopa virheellisen, kuvan siitä, mitä ryhmää, sukua tai lajia
tutkittavat bakteerit edustavat.
Kun tyyppi- ja vertailukantoja käytetään geneettisissä identifiointi- ja fylogenia-
tutkimuksissa, tulisi analyyseihin valita mukaan riittävä määrä samankaltaisia kantoja, jotta niiden
ryhmittymistrendit suhteessa tutkimusten muihin kantoihin voitaisiin havaita. Esimerkiksi tässä
tutkimuksessa käytetty B. canariense oli lajinsa ja maantieteellisen alkuperänsä ainoa edustaja,
minkä takia lajin suhde maapähkinää nystyröiviin kantoihin jäi epäselväksi.
Valittaessa tyyppi- ja vertailukantoja Bradyrhizobium-tutkimuksiin kannattaa kiinnittää
huomiota sekä kantojen maantieteelliseen alkuperään että isäntäkasviin, jotta saataisiin
mahdollisimman yhtenäinen vertailuaineisto.
5.1.3 UPGMA-dendrogrammit samankaltaisuuden kuvaajinaKahta ”naapuria” (kantaa tai ryhmää) yhdistävää UPGMA-dendrogrammia käytetään
taksonomiassa kuvaamaan bakteerikantojen samankaltaisuutta. UPGMA-puu perustuu
analyysituloksista laskettuihin samankaltaisuusmatriiseihin. Toisinaan kahta useampi kanta on
identtinen, mutta UPGMA-menetelmällä voidaan yhdistää vain kaksi identtistä kantaa rinnakkain.
Tällöin muut identtiset kannat sijoittuvat väistämättä kauemmas kahdesta rinnastetusta, ja
aiheuttavat virhettä. Toisinaan ryhmän varhainen jako kahteen aiheuttaa sen, että myöhemmissä
haaroissa ryhmät näyttävät olevan hyvin kaukaisia toisilleen, vaikka ne todellisuudessa kuuluisivat
samaan haaraan. Tämän takia UPGMA-puu ei kuvaa samankaltaisuusmatriisia täysin totuuden-
mukaisesti.
Erilaisia matemaattisia kaavoja on kehitetty laskemaan, kuinka hyvin dendrogrammi
kuvaa samankaltaisuusmatriisia. Yhteisfeneettinen korrelaatio (cophenetic correlation) on eräs
tällainen laskukaava (Farris 1969). Tässä tutkimuksessa yhteisfeneettiset korrelaatioarvot laskettiin
dendrogrammien jokaiselle haaralle. Korrelaatioarvot kertovat kunkin ryhmän kohdalla, kuinka
60
hyvin puu kyseisessä kohdassa kuvaa samankaltaisuusmatriisia. Yhteisfeneettiset korrelaatioarvot
voidaan laskea myös kokonaisille dendrogrammeille, kuten on tehty esim. Dresler-Nurmen ym.
(2000) tutkimuksessa. Yhden arvon käyttämisessä ongelmana on kuitenkin, että yksi
”yhteisfeneettisten korrelaatioiden keskiarvo” voi peittää alleen alaryhmien heikon korrelaation. Kun
yhteisfeneettistä korrelaatiota käytetetään dendrogrammin totuudenmukaisuuden arviointiin, tulisi
siis tarkastella puun kaikkien haarojen arvoja, ja vetää johtopäätökset kokonaisuudesta. Tässä
tutkimuksessa huonot korrelaatioarvot kaukaisempien ryhmien välillä kertoivat, ettei UPGMA-puu
ole kattava tapa kuvata näin monimuotoista analyysimateriaalia. Samankaltaisuusmatriiseja
kolmiulotteisessa muodossa esittävät MDS-analyysit täydensivät kuitenkin puiden antamaa
informaatiota, koska yksi lisäulottuvuus mahdollisti esimerkiksi kolmen identtisen arvon
asettumisen yhtä kauas toisistaan.
Usein UPGMA-dendrogrammien muodostamien ryhmien paikkansapitävyyttä ja
evoluutiota arvioidaan suoraan bootstrap-arvoista, joita lasketaan poimimalla tutkittavaa ryhmää
vastaava määrä satunnaisia samankaltaisuusmatriisin arvoja toistuvasti. Bootstrap-otosten
muodostuminen kuvaa ryhmien uudelleenmuodostumisen todennäköisyyttä (Laininen 2001).
Kuitenkin se mitä bootstrap-arvot kertovat fylogeneettisen puun antamista tuloksista, riippuu paljon
analyysimenetelmistä: tutkittavien ominaisuuksien lukumäärä ja suhde toisiin tutkittaviin
ominaisuuksiin (itsenäisyys), taksonien määrä, bootstrap-otosten lukumäärä, dendrogrammin
topologia (rakenne) ja tarkasteltavan ryhmän sijoittuminen sukupuussa vaikuttavat bootstrap-
tulosten käytettävyyteen (Hillis ja Bull 1993). Useimmiten bootstrap-analyysia käytetään
sekvenoitujen geenien tutkimuksissa. Toisaalta Hampl ym. (2001) ovat tukeneet bootstrap-arvojen
käyttämistä myös DNA-sormenjälkimenetelmissä (RFLP, RAPD).
5.2 Tutkittujen bradyritsobien geneettinen diversiteetti
5.2.1 Tilastollisten testien tulokset heikensivät analyysitulosten luotettavuutta jatulkittavuuttaAnalyysituloksille tehdyt tilastolliset testit - dendrogrammien ja matriisien yhteneväisyyttä kuvaava
yhteisfeneettinen korrelaatio sekä fylogeneettisten ryhmien luotettavuutta kuvaava bootstrap-testi –
antoivat heikohkoja arvoja. Dendrogrammeissa yhteisfeneettiset korrelaatiot on merkitty jokaisessa
puun haarassa, ja 70% ylittävät bootstrap-arvot niiden viereen (kuvat 4.1b-4.6b).
Yhteisfeneettiset korrelaatioarvot osoittivat, että symbioosigeenien analyysitulokset
kuvautuivat hyvin dendrogrammeissa (kuvat 4.5b ja 4.6b). Toisilleen kaukaisemmat ydingeeni-,
ITS- ja AFLP-ryhmät sen sijaan näyttävät yhteisfeneettisen korrelaation perusteella olevan liian
61
monimutkaisissa suhteissa toisiinsa dendrogrammilla kuvattaviksi, koska suuri osa arvoista oli 80%
(kuvat 4.1b ja 4.2b). MDS-analyysien rakentamat monimutkaiset dendrogrammit osoittivat, että
ryhmien suhteiden kuvaamiseen tarvittiin kolmas ulottuvuus.
Huomioin tuloksissa vain 70% ylittävät bootstrap-arvot Hillisin ja Bullin (1993)
mukaan, koska tutkimuksessaan Hillis ja Bull esittivät, että aidosti yhtenäisissä ryhmissä bootstrap-
arvot olivat >70%. Simulaatioissaan he tosin käyttivät virusten DNA-sekvenssejä. Omissa RFLP-
tuloksissani yleensä vain 100% samankaltaisten kantojen muodostamien joukkojen bootstrap-arvot
ylittivät 70%. Jopa yhteisfeneettisen korrelaation tukemissa ryhmissä hyvät bootstrap-arvot olivat
harvinaisia (kuvat 4.1b-4.6b). Jos ryhmällä oli hyvät arvot (>70%) voitiin olettaa, että ryhmien
sisältämien kantojen läheinen sukulaisuus oli hyvin todennäköistä. Alemmat bootstrap-arvot tukivat
lähinnä oman työni aiempia AFLP- ja RFLP-analyysien tuloksia tutkittujen kantojen suuresta
genomisesta diversiteetistä. Lisäksi bootstrap-arvot jäivät yleisellä tasolla viitteitä antaviksi arvoiksi,
koska Hillisin ja Bullin (1993) mainitsemia bootstrap-arvojen luotettavuuteen vaikuttavia
ominaisuuksia ei tässä tutkimuksessa käytettyjen menetelmien osalta tunnettu.
Bootstrap-testit antoivat erittäin heikkoja arvoja suuremmille ryhmille. Yleensä 100%
samankaltaisten kantojen muodostamat ryhmät saivat hyviä bootstrap-arvoja (yli 90%), mutta
kaukaisemmat erittäin huonoja (0-60%). Erityisesti glnII-analyysin UPGMA-puun bootstrap-arvot
olivat heikot. Bootstrap-testin tulokset vahvistivat, että UPGMA-puiden ryhmien luotettavuus on
suurimmillaan hyvin samankaltaisilla kannoilla. Huonot bootstrap-arvot kertovat, että satunnais-
otannoissa kyseiset kannat eivät johdonmukaisesti asetu samaan ryhmään. Tästä voidaan
päätellä, että nämä kannat eivät ole tarpeeksi samankaltaisia.
5.2.2 AFLP maapähkinää ja kudzua nystyröivien Bradyrhizobium-kantojengenomisen diversiteetin kuvaajanaAFLP-analyysin tulokset osoittivat, että tähän tutkimukseen sisältyneet Bradyrhizobium-kannat
olivat kokonaisgenomiltaan hyvin heterogeenisiä (ks. kpl 4.2). Kiinalaista maapähkinää
nystyröivien kantojen diversiteettiä on kuvattu aiemmissa kiinalaisten tutkijoiden tekemissä
tutkimuksissa: Useat tässä tutkimuksessa käytetyt, Kiinan Sichuanin maakunnassa kerätyt
maapähkinäkannat olivat samoja, joita Zhang ym. (1999) ja Chen ym. (2003) ovat tutkineet
aiemmin (ks. taulukko 3.1). Vaikka Zhangin ym. käyttämät menetelmät rep-PCR (kokonaisgenomin
analyysi), 16S rDNA:n RFLP ja FAME-rasvahappoanalyysi eroavat AFLP-analyysistä, myös niiden
antamat tulokset osoittivat tutkimuksessa käytettyjen kantojen laajaa geneettistä diversiteettiä.
Chenin ym. (2003) AFLP-analyysit osoittivat samankaltaista ryhmittymistä kuin tämän tutkimuksen
AFLP-analyysi.
Kudzun symbionttien ryhmittyminen kolmeen eri ryhmään (ks. kpl 4.2) ja niiden
eroaminen maapähkinän symbionteista noudatti aiempia AFLP-analyysituloksia (Chen 2004).
62
Useiden ominaisuuksien erojen perusteella Chen ym. (2004) ehdottivatkin niiden edustavan uusia
Bradyrhizobium-lajeja. Maantieteellinen alue ja isäntäkasvilaji olivat määräävä ryhmittelijä sekä
kiinalaisten tutkimuksissa että omassani.
5.2.3 Genomisen diversiteetin heijastuminen ITS-alueeseen16S- ja 23S- rDNA:n välissä sijaitseva ITS-alue vaihtelee enemmän kuin taksonomiassa lajin-
määritykseen käytetyt ribosomaaliset 16S- ja 23S-geenit. ITS-alueen sekvenssivaihtelua on
käytetty esim. ”alalajien” tunnistukseen (Terefework 2002, Tan ym. 2001). Koska Bradyrhizobium-
suvun edustajilla on tiedettävästi vain yksi ribosomaalisia alayksiköitä koodaava operoni, sopii ITS-
alue hyvin kuvaamaan bradyritsobien suurta diversiteettiä (Tan ym. 2001, Kündig ym. 1995).
Willems ym. (2001) vertailivat Bradyrhizobium-kantojen ITS-sekvenssien ja AFLP-
profiilien perusteella muodostettujen ryhmien suhdetta lajien sukulaisuuden määrittelyssä
käytettyyn DNA-DNA-hybridisaatioon. Tutkimuksen tulos oli, että DNA-DNA-hybridisaatio-
samankaltaisuus ja ITS-sekvenssi antavat bradyritsobien taksonomisista suhteista samankaltaista
tietoa. AFLP sen sijaan ei heijastanut Bradyrizobium-kantojen lajiutumista yhtä tehokkaasti kuin
ITS-sekvenssi. Esimerkiksi 40-60 % DNA-DNA-homologia ei välttämättä näkynyt AFLP-
analyysituloksissa, mutta heijastui ITS-alueen sekvenssianalyyseissä (Willems ym. 2001).
Tutkimukseni tulokset tukivat Willemsin ym. (2001) johtopäätöksiä, koska ITS-RFLP- ja AFLP-
analyysit kuvasivat Bradyrhizobium-kantojen diversiteettiä pitkälti samoin. Muodostuneet ydin- ja
symbioosigeeniryhmät eivät systemaattisesti liittyneet yhteen (ks. taulukko 4.3), mutta ITS-
ryhmissä kuvautui usein geenien mosaiikkimainen järjestäytyminen. AFLP-ryhmät muistuttivat ITS-
ryhmiä, mutta pilkkoivat ryhmät vielä pienemmiksi.
Alalajien erottelu ITS-alueen perusteella on bradyritsobeilla kyseenalaista niiden
genomisen vaihtelun vuoksi. Jos tarkastellaan tässä tutkimuksessa analysoitujen kantojen ITS-
alueiden samankaltaisuutta vain 50%:n arvolla, voidaan analyysituloksissa nähdä kantojen
ryhmittyvän ”alalajeittain” isäntäkasvin mukaan (kuvat 4.2a ja 4.2b). Kuitenkin 50% saman-
kaltaisuus on hyvin alhainen samankaltaisuus, ja näin muodostuneiden ”alalaji”-ryhmien sisäinen
ITS-alueen diversiteetti on edelleen erittäin suuri. Lisäksi näin muodostetussa alalajien
ryhmittelyssä B. canariense (isäntäkasvi C. proliferus) joutuisi kiinalaista maapähkinää nystyröivien
Bradyrhizobium-kantojen ryhmään, eli isäntäkasvikaan ei olisi perusteltu alalajeja ryhmittelevä
tekijä. Kokonaisgenomin suuren vaihtelun vaikutuksesta ITS-alue muodosti erittäin runsaasti pieniä
ryhmiä, jotka kuvaavat pikemmin populaatioita kuin alalajeja (kuvat 4.2a ja 4.2b sekä taulukko 4.3).
5.2.4 Ydin- ja symbioosigeenien erilaisen ryhmittymisen taustaaKoska ydingeeneillä on ratkaiseva rooli mikrobin perusaineenvaihdunnan ylläpidossa, niiden
sekvenssissä voi tapahtua vain hyvin pieniä muutoksia hyvin pitkän ajan kuluessa (suuret ja
nopeat muutokset ovat yleensä letaaleja). Tällä lähtöoletuksella tutkin ryhmittyivätkö ydingeenit
63
ribosomaalisen 16S-geenin mukaisesti, mutta tulokset osoittivat, että ydingeenienkin diversiteetti
oli suuri. Jos siis ydingeenien oletetaan olevan muuntumattomampia kuin esim. symbioosigeenien,
voidaan olettaa että tässä työssä tutkitut Bradyrhizobium-kannat edustivat hyvin suurta määrää
erilaisia Bradyrhizobium-sukuun kuuluvia lajeja.
Tutkimuksessani recA noudatti pitkälti ITS-alueen mukaista ryhmittymistä, mutta glnII
osoitti suurempia eroja (kpl 4.3.2 ja 4.3.3). Myös Turner ja Young (2000) havaitsivat
glutamiinisyntetaasientsyymien ja ribosomaalisen 16S-alayksikön geenejä tutkiessaan, että
bakteereilla yleisemmän glutamiinisyntetaasi I -entsyymin geeni (glnI) ja 16S-rDNA noudattivat
samanlaista ryhmittymistä, mutta glnII erosi näistä selvästi. Tutkimuksessani glnII erosi usein recA-
geenin ja ITS-alueen yhteisistä ryhmistä, mutta se ei liittynyt selvästi myöskään
symbioosigeeneihin. Turner ja Young (2000) esittivätkin, että ydingeeneihin lukeutuva glnII olisi
siirtynyt horisontaalisesti ritsobisukujen välillä. Ottaen huomioon sen, että glutamiinisyntetaasi II-
entsyymi on bakteereilla huomattavasti harvinaisempi kuin glutamiinisyntetaasi I (Kumada ym.
1993), on teoria hyvinkin mahdollinen. Kuitenkin tämän tutkimuksen tulokset näyttävät, että mikäli
geeni siirtyy horisontaalisesti bakteeripopulaatioissa, se ei todennäköisesti siirry yhdessä
symbioosigeenien kanssa, koska symbioosigeeniryhmät olivat erilaisia kuin glnII-geenin
perusteella muodostuneet ryhmät.
Sekä kasvin että bakteerin on kyettävä tuottamaan oikeanlaisia kommunikaatioon
tarvittavia molekyylejä, jotta isäntäkasvin nystyröinti onnistuisi. nod-geenien rakennemuutokset
heijastuvat ritsobien tuottamien Nod-tekijöiden rakenteisiin (Debellé ym. 2001). Tutkimukseni
tuloksissa nodC-geenit ryhmittivät kantoja sen mukaan mistä kasvilajista ne oli eristetty (kpl 4.3.5),
ja yksi nodC-geeniryhmä saattoi sisältää useita erilaisia ITS-alueen ja ydingeenien muodostamia
kantaryhmiä. Tämä osoittaa, että isäntäkasvia voi nystyröidä usea erilainen Bradyrhizobium-kanta,
jos bakteeri kykenee tuottamaan oikeanlaisia Nod-tekijöitä.
Nod-tekijöiden erilaiseen substituointiin liittyviä geenejä on erittäin paljon, ja niiden
erilaiset yhdistelmät ritsobeissa mahdollistavat erittäin laajan Nod-tekijävalikoiman maaperässä.
Moulin ym. (2004) osoittivat, että nod-geenit voivat vaihdella Bradyrhizobium-suvun sisällä
runsaasti. Siksi bradyritsobit ovat isäntänsä suhteen laaja-alaisia. Myös tutkimukseni nodC-
analyysit viittasivat siihen, että kantojen nodC-geeni oli erityisen erilaistunut, eli kannat olivat
kehittäneet spesifisiä nystyröintitekijöitä erilaisille kasveille. Useiden isäntäkasvien tehokkaaseen
nystyröintiin kykenevät bakteerit lisääntyvät runsaasti, jolloin niiden geenien leviäminen on toden-
näköisempää (Stepowski ym. 2003). On jopa esitetty, että nystyröintigeenit olisivat tällaisen
luonnonvalinnan kautta kehittyneet kasvien yhteyteen (Stepowski ym. 2003, Ueda ym. 1995).
Tähän tutkimukseen valittiin useita erilaisia isäntäkasveja nystyröiviä Bradyrhizobium-
kantoja. Tuloksista huomattiin, että sama Bradyrhizobium-laji saattoi nystyröidä usean eri suvun
isäntäkasvia. Bradyritsobien laajaa isäntäkasvivalikoimaa on esitellyt myös esimerkiksi Perret ym.
(2000). Tutkimieni Bradyrhizobium-kantojen nodC-RFLP:n perusteella muodostui kaksi erilaista
64
maapähkinää nystyröivien kantojen ryhmää: toisessa ryhmässä isäntäkasveina olivat maapähkinä
(Arachis) ja Indigofera-suvun palkokasveja, toisessa ryhmässä maapähkinä ja soijapapu (Glycine).
Ryhmät erosivat toisistaan nodC-geenin rakenteen osalta, mikä viittaa siihen, että kannoilla on
todennäköisesti jossain määrin erilaiset Nod-tekijät. Voidaankin pohtia onko maapähkinä erityisen
laaja-alainen symbionttinsa suhteen, koska sitä vaikuttaa nystyröineen sekä soijapapua nystyröiviä
bradyritsobeja että Indigofera-kasvia nystyröiviä bradyritsobeja.
Urtzin ja Elkanin (1996) tutkimus bradyritsobien symbioosigeenialueista (nifDK ja
nodABC) osoitti, että nod- ja nif-alueet ryhmittivät kantoja samoin, vaikka nod-alueen geeneissä oli
enemmän variaatiota. Tämä tutkimus kattoi kaksi yksittäistä geeniä Urtzin ja Elkanin (1996)
tutkimilta alueilta, mutta heidän tulostensa trendi oli samansuuntainen omien tulosteni kanssa:
Bradyrhizobium-kantojen nodC-geeni osoitti tutkituista geeneistä yhtenäisintä ryhmittymistä, ja
toisaalta suurimpia rakenne-eroja kantojen välillä. Molemmissa tutkimuksissa nifH ryhmitti kantoja
enemmän samansuuntaisesti nodC-geenin kanssa kuin ydingeenit. Tutkimuksessani
symbioosigeenien samankaltaisuus korreloi yleisen genomisen samankaltaisuuden kanssa, kuten
myös Urtzin ja Elkanin tutkimuksessa (1996). ”Yleinen genominen samankaltaisuus” näkyi ITS-
ryhmien ja ydingeeniryhmien yhdistyessä muutaman kannan käsittäviksi ryhmiksi. Näihin ryhmiin
kuuluvilla kannoilla oli yleensä myös samankaltaiset symbioosigeenit.
Symbioosigeenien samankaltainen ryhmittyminen perustunee siihen, että
Bradyrhizobium-suvussa symbioosigeenit liittyvät kromosomiin yhtenäisenä symbioosisaarekkeena
(Göttfert ym. 2001, Kaneko ym. 2002). B. japonicum –tyyppikanta USDA 110:n kokonaisen
genomin sekvenointi osoitti, että symbioosigeenien alue oli erilainen kuin muu genomi:
Perusgenomin G+C -sisältö poikkesi selvästi symbioosisaarekkeen vastaavasta (Kaneko ym.
2002). Lisäksi sekvennoidun B. japonicum –kannan genomi sisälsi runsaasti transposaasigeenejä,
joista suurin osa sijoittui symbioosisaarekkeeseen. Löydöt vahvistivat oletusta siitä, että symbioosi-
geenit voivat siirtyä horisontaalisesti kromosomista toiseen. Voi olla, että geenien liittyminen
kromosomiin asettaa suuremmat vaatimukset kohdegenomin rakenteelle, mikä selittäisi usein
havaittua symbioosigeenien ryhmittymistä ”yleisen genomisen samankaltaisuuden” mukaan
(Moulin ym. 2004, Wernegreen ja Riley 1999, Urtz ja Elkan 1996). On esitetty, että
Bradyrhizobium-suku olisi vaihtanut horisontaalisesti myös glnII-ydingeenejä Mesorhizobium-suvun
kanssa (Turner ja Young 2000). Sekä Bradyrhizobium- että Mesorhizobium-suvuissa kaikki geenit
sijaitsevat yhdessä kromosomissa, ja geenien siirtymisen mahdollistavien transposaasien geenejä
on löydetty molemmista suvuista (Kaneko ym. 2002, Sullivan ja Ronson 1998).
Millainen merkitys on horisontaalisella geeninsiirrolla bakteeripopulaatioissa, kun
bradyritsobien geenien diversiteetti on tässäkin tutkimuksessa havaittu erittäin laajaksi verrattuna
16S rDNA:han perustuviin lajinmäärityksiin? B. japonicum –tyyppikannan genomista löytyneet
symbioosisaarekkeen ulkopuoliset transposaasigeenit (Kaneko ym. 2002) sekä tämän tutkimuksen
kantojen glnII-geenien ryhmittyminen antavat aiheen uskoa, että ydingeenitkin voivat siirtyä
65
horisontaalisesti. Tämän tutkimuksen bradyritsobien geenien mosaiikkimainen järjestyminen
genomeissa viittaisi siihen, että Bradyrhizobium-suvussa geenit siirtyisivät joko herkemmin tai eri
tavalla kuin yleisemmin tutkituissa ritsobeissa. Bradyritsobien geenien herkästä siirtymisestä tai
omalaatuisesta järjestäytymisestä on todisteena Krausen ym. (2002) tutkimus kolmen eri ritsobi-
suvun tts-alueen rakenteesta. Krause ym. (2002) huomasivat, että isäntäspesifisyyteen vaikuttavan
III-tyypin erityssysteemin (Type III Secretory System) geenit sijoittuivat tutkitun B. japonicum –
kannan tts-alueessa hyvin eri tavalla kuin M. loti- ja R. sp. NGR234 –kantojen vastaavat. Kun R.
sp.- ja M. loti –kantojen tts-alueella geenit sijoittuivat pitkälti samassa järjestyksessä samoille
puolille aluetta, B. japonicum –kannan yksittäiset geenit olivat sijoittuneet usein päinvastaisille
puolille tts-aluetta ja lisäksi eri järjestyksessä. Tutkimieni Bradyrhizobium-kantojen geenien
mosaiikkimainen yhdistyminen genomissa vaikuttaa samalta kuin Krausen ym. (2002) havaitsema
tts-alueen poikkeuksellinen rakenne. Bradyrhizobium-suvun genomin mosaiikkimaisuutta on
havaittu myös uusimmissa tutkimuksissa (Lindström 2006, suullinen tiedonanto). Johtuuko ilmiö
siitä, että Bradyrhizobium-suvun edustajat kykenevät siirtämään geenejä suvun sisällä erityisen
aktiivisesti, vai onko mosaiikkimaisen genomin ominaisuus vain muutamien yksittäisten kantojen
erikoisuus? Asiaa voisi selvittää jatkossa esimerkiksi vertaamalla bradyritsobien
symbioosisaarekkeen rakennetta (Göttfert ym. 2001) muiden ritsobien symbioosisaarekkeiden tai
symbioosiplasmidien rakenteisiin, tai vertaamalla B. japonicum –kannan koko genomin sekvenssiä
(Kaneko ym. 2002) muiden ritsobien kokonaiseen sekvenssiin. Tietenkään yhden kannan genomi
ei kerro koko totuutta sen edustaman suvun diversiteetistä, mutta B. japonicum –kannan avulla
kyettäisiin mahdollisesti todistamaan genomin erilainen rakenne muihin ritsobeihin verrattuna. Siitä
eteenpäin Bradyrhizobium-suvun geenien siirtymismekanismit ja –spesifisyys olisivat erittäin
mielenkiintoisia tutkimuskohteita.
5.2.5 Typensidonnan tehokkuuden mahdolliset vaikutukset genomiinEräs kantojen genomin käyttäytymistä selittävä seikka voi olla niiden erilainen kyky muodostaa
symbiooseja isäntäkasvin kanssa, sekä niiden typensidontateho juurinystyrässä.
Symbioositehokkuus voi vaikuttaa isännän valintaan pidemmällä aikavälillä, koska isäntäkasvi
usein suosii tehokasta typensitojakantaa (Kiers ym. 2003). Symbioosigeenien perusteella
määritettävä symbioosigeenityyppi heijastaa usein bakteerin symbioositehokkuutta (Laguerre ym.
2003, Urtz ja Elkan 1996). Tutkimuksessani symbioosigeenityypit sisälsivät myös ydingeeneiltään
erilaisia Bradyrhizobium-kantoja. Tämä kertoo siitä, että symbioosigeenityypit mahdollistavat
useammanlaisen kasvi-bakteeri –vuorovaikutussuhteen: Joko isäntäkasville sopii usea erilainen
symbiontti, tai Bradyrhizobium-kannoille usea erilainen isäntäkasvi. Joka tapauksessa tässä
tutkimuksessa analysoidut kannat olivat hyvin sopeutuvia ja muutoskykyisiä.
Palkokasvin nystyröissä voi myös elää myös parasiittisia bakteereja, jolloin vain osa
nystyrässä elävistä bakteerilajeeista sitoo tehokkaasti typpeä (Denison ja Kiers 2004).
66
Parasiittisten nystyräbakteerien nystyröintigeenit auttavat bakteereita pääsemään juurinystyrään ja
lisääntymään siellä, mutta niiden typensidontageenit eivät sovi isäntäkasvin yhteyteen. Nystyröivät
parasiittiset bakteerit ovat voineet saada geeninsä myös horisontaalisen geeninsiirron myötä.
Parasitismi-ilmiö voi olla taustalla tutkimukseni nifH-analyysissa, jossa B. elkanii (USDA76) –
tyyppikanta päätyi ryhmänsä (kuva 4.5a) ainoaksi soijapavusta (G. max) eristetyksi kannaksi.
Rakenne-erot nifH-geenissä heijastavat todennäköisesti typensidontatehoa, koska geenillä
tuotetaan typpeä sitovan nitrogenaasientsyymin toista alayksikköä. Tutkimukseni nifH-RFLP-
tulosten mukaan USDA76 –tyyppikanta sijoittui samaan ryhmään usean kiinalaisen maapähkinä-
kannan kanssa, mutta erosi selvästi muista B. elkanii –kannoista, jotka nystyröivät kudzua.
Kuykendall ym. (1992) esittivät, että tyyppikanta USDA76 eläisi soijapavun juurinystyröissä
parasiittina, koska ko. kannalla siirrostetut soijapavut eivät sitoneet typpeä. Kanta ei soijapavun
juurinystyröissä muodostanyt aktiivista, typpeä sitovaa nitrogenaasientsyymiä. Sen sijaan Vigna
unguiculata-kasvin juuristossa kannan indusoimat nystyrät sitoivat typpeä aktiivisesti. Tämä
havainto voidaan seillää kahdella mahdollisella teorialla: i) Soijapavulle parasiittinen B. elkanii
USDA76 voi edustaa eri symbioosifenotyyppiä (biovaari) kuin 16S rDNA:n perusteella B. elkanii –
lajiksi tunnistetut kudzukannat, ja erilaisten symbioosiominaisuuksiensa takia kanta voi sitoa
maapähkinän juuristossa typpeä, tai ii) USDA76:n edustama Bradyrhizobium-ryhmä voi sisältää
maapähkinää nystyröiviä parasiitteja, mikäli nifH-geenin tuottama nitrogenaasin alayksikkö on
inaktiivinen maapähkinässä.
On mahdollista, että eri isäntäkasvit (soijapapu, kudzu ja maapähkinä) vaativat
symbiontiltaan erilaisen nitrogenaasigeenin rakenteen. Kasvikokein voitaisiin jatkossa selvittää
seuraavia asioita: 1) Voiko soijapapua nystyröivä kanta nystyröidä muita kasveja. Esimerkiksi
tässä tutkimuksesssa B. japonicum –tyyppikanta (USDA6), jonka tiedetään sitovan typpeä
aktiivisesti soijapavun nystyröissä (Jordan 1982), ryhmittyi kauas maapähkinän nystyrä-
bakteereista. Toisaalta USDA6 –tyyppikannan typensidontatehoa maapähkinässä ei ole testattu,
joten kyseisen B. japonicum –kannan isäntäspesifisyyttä ei tiedetä. 2) Onko kudzu valikoiva
symbionttinsa suhteen? Tässä tutkimuksessa havaittiin, että kudzua nystyröivällä B. japonicum –
kantaryhmällä ja B. elkanii –kantaryhmällä oli erilaiset nifH-geenit. Sopiko kudzun tehokkaaseen
nystyröintiin kaksi erirakenteista nitrogenaasientsyymiä vai oliko toinen kannoista parasiitti? 3)
Tuottiko kaksi erirakenteista nifH-geeniä identtisiä nitrogenaasin alayksikköjä? Jos kaikki
kasvikokeet osoittavat, että typensidontaa tapahtuu huolimatta erilaisesta nifH-geenistä, voi
taustalla olla nonsense-mutaatio, joka ei lopulta vaikuta geenin koodaaman proteiinin
rakenteeseen.
67
5.2.6 Palkokasvien juurinystyröiden erilaisten infektiomekanismien heijastuminenniitä nystyröivien bakteerikantojen diversiteettiinPalkokasvien juurinystyröiden tiedetään infektoituvan ainakin kahdella erilaisella mekanismilla:
infektiolangan avulla ja sivujuuren tyvihalkeaman kautta (mm. Hirsch 1992, Boogerd ja van
Rossum 1997). Eniten tutkittu nystyröintimekanismi on infektiolangan avulla tapahtuva
nystyränmuodostus (mm. Hirsch 1992), jolla esimerkiksi soijapapu infektoituu (Pueppke 1983).
Maapähkinän nystyrät puolestaan infektoituvat bradyritsobien tunkeutuessa juureen lateraalijuuren
tyvihalkeaman kautta (Boogerd ja van Rossum 1997). Juurihalkeama-infektiomekanismia ei
tunneta vielä yhtä kattavasti kuin infektiolangan avulla tapahtuvan nystyröinnin biologiaa. Useiden
kasvien juurinystyröiden on todettu infektoituvan juurihalkeaman kautta, mutta Nod-tekijöiden rooli
prosesseissa vaihtelee (Webster ym 1998, O’Callaghan ym. 1997). Nystyröiden erilaisten
infektiomekanismien taustalla voi olla hyvinkin erilainen signalointi. Esimerkisi O’Callaghanin ym.
(1997) tutkimuksessa havaittiin, että Sesbania rostrata -kasvin infektioon juurihalkeaman kautta ei
tarvita lainkaan Nod-tekijöitä. Jos Nod-tekijöillä ei ole merkitystä kommunikaatiomolekyyleinä, on
typpeä sitovan nystyrän muodostuksessa toimittava muita kasvin ja bakteerin vuoropuhelun
mahdollistavia molekyylejä. On siis mahdollista, että myös maapähkinän juurinystyröiden infektioon
liittyy muita kuin Nod-tekijöitä, eikä isäntäspesifisyys välttämättä näy nodC-analyysien tuloksissa.
Toinen havainto tutkimukseni tuloksissa, joka mahdollisesti liittyi infektiomekanismiin,
oli Bradyrhizobium-kantojen erilainen isäntäspesifisyys. Kudzua nystyröi kaksi hyvin erilaista
kantaryhmää, joista toinen sisälsi B. japonicum –kantoja ja toinen B. elkanii –kantoja. Selittäisikö
epäspesifinen infektiomekanismi sen, että kudzu ei ole spesifinen symbionttinsa suhteen? Asian
voisi selvittää yksinkertaisesti tarkastelemalla kudzun infektioprosessia. Mikäli myös kudzun
juurinystyrät infektoituvat juurihalkeaman kautta, voidaan olettaa, että maapähkinän infektio-
mekanismi on syynä sen symbionttien suureen geneettiseen diversiteettiin.
5.3 Maapähkinää (Arachis hypogaea) ja kudzua (Pueraria lobata)
nystyröivät bradyritsobit horisontaalisen geeninsiirron valossa
Fylogeneettiset tutkimukset ovat osoittaneet, että Bradyrhizobium-suvun lajit ovat hyvin kaukaisia
sukulaisia muille ritsobisuvuille (Sawada ym. 2003). Toisaalta bradyritsobien monet yhteiset
ominaisuudet muiden ritsobien kanssa (kyky muodostaa symbiooseja palkokasvien kanssa sekä
symbioosigeenien samankaltaisuus) tukevat teoriaa, jonka mukaan ritsobien symbioosigeenit
voivat siirtyä horisontaalisesti myös kaukaisempiin bakteerisukuihin (Gogarten ym. 2002).
Ritsobisukujen erilaisuuden vuoksi symbioosigeenien evoluutiosta on esitetty muun muassa, että
68
kasvi-bakteeri –vuorovaikutuksen mahdollistavat geenit olisivat alun perin kehittyneet yhtenä
”pakettina”, joka olisi levinnyt useisiin bakteerilajeihin, ja erilaistunut aikojen kuluessa kasvien
vaatimusten mukaan (esim. Moulin ym. 2004, Stepowski ym. 2003).
On esitetty, että horisontaalinen geeninsiirto tapahtuisi Bradyrhizobium-suvussa
pääasiassa suvun sisällä lajilta ja kannalta toiselle, ja että bradyritsobien vuorovaikutus muiden
ritsobisukujen kanssa olisi vähäistä (Moulin ym. 2004). Ilmiötä voi selittää se, että bradyritsobien
genomi koostuu vain yhdestä kromosomista, ja niiden geeniensiirtymismekanismi on erilainen kuin
esimerkiksi sym-plasmidia kantavilla ritsobisuvuilla (Kaneko ym. 2002, Sullivan ja Ronson 1998).
Bradyritsobien geenien on myös havaittu sijoittuvan genomiin eri tavoin kuin joissain toisissa
ritsobisuvuissa (Krause ym. 2001), mikä voi viitata aktiiviseen geenien siirtymiseen.
Tutkimuksessani Bradyrhizobium-suvun mahdollisesti aktiivista geenien vaihtoa kuvastivat i)
geenien suhteen ”mosaiikkimaisiksi” muodostuneet kantaryhmät, ii) Bradyrhizobium-kantojen suuri
geneettinen diversiteetti verrattuna harvoihin 16S rDNA-sekvenssin perusteella määritettyihin
lajeihin ja iii) laaja isäntäkasvivalikoima harvojen lajien keskuudessa.
Maantieteellinen etäisyys rajoittaa luonnollisesti populaatioiden geeninvaihtoa, mikä
näkyy bakteerikantojen i) alueellisena samankaltaisuutena ja ii) eri alueilla niiden välisenä
erilaisuutena (Zhang ym. 1999, van Rossum ym. 1995). Horisontaalinen geeninsiirto on aktiivisinta
samassa ympäristössä elävien kantojen kesken, mikä havaittiin myös tässä tutkimuksessa tiettyjen
kiinalaisten kasvilajien nystyräbakteerien samankaltaisuutena (Lespedeza, Pueraria).
Maapähkinäkantojen eroja voivat kuitenkin maantieteellisen etäisyyden lisäksi selittää myös
isätntäkasvin genomin erot (Chen ym. 2003, Wilkinson ym. 1996). Esimerkiksi Chen ym. (2003)
vertailivat erilaisten maapähkinälajikkeiden ja bradyritsobien yhteensopivuutta nystyröinti- ja
typensidontakyvyn kannalta. He huomasivat, että jotkut maapähkinälajikkeet muodostivat typpeä
sitovia nystyröitä useammanlaisten bradyritsobien kanssa, toiset vain tietyn bradyritsobikannan
kanssa. Horisontaalinen geeninsiirto ei siis ole ainoa diversiteettiin vaikuttava tekijä.
Bradyrhizobium-suvun bakteerit elävät ja nystyröivät maapähkinää ympäri maailmaa (Chen ym.
2003, Saleena ym. 2001, Zhang 1999, Urtz ja Elkan 1996). Yleisesti oletetaan, että maapähkinä on
alun perin kotoisin Etelä-Amerikasta, josta nykyisin Kiinassa viljeltävät lajikkeet on 1600-luvulla
tuotu kauppiaiden mukana Kiinaan. On myös esitetty, että Kiinassa viljeltiin erilaisia
maapähkinälajikkeita jo tätä ennen (Yao 2004). On siis mahdollista, että paikallinen
bradyritsobikanta on sopeutunut uuteen kasvilajiin, mutta on myös esitetty että maapähkinän
mukana on tullut vieraita bakteerikantoja jotka ovat sopeutuneet uusiin maaperäolosuhteisiin.
Tämän tutkimuksen taustalla oli kolme erilaista teoriaa maapähkinää nystyröivien bradyritsobien
alkuperästä. Tuloksista ei voida johtaa suoria vastauksia kysymyksiin, mutta niistä voidaan
kuitenkin päätellä jotain:
69
i) Mahdollistiko symbioosigeenien horisontaalinen kulkeutuminen paikallisten kantojen
sopeutumisen uuteen kasvilajiin, eli maapähkinään?
Tutkimuksessa analysoitujen Bradyrhizobium-kantojen mosaiikkimainen genomi tuki
vahvasti geenien siirtymisteoriaa, mutta geenien siirtymisen määrää ja suuntaa on vaikea arvioida.
Koska kudzua ja maapähkinää nystyröivät kannat olivat niin erilaisia, voidaan olettaa, että
maapähkinää nystyröivät kannat eivät olleet peräisin kudzusta. Toisaalta maapähkinää nystyröi
useita pieniä ryhmiä hieman erilaisia Bradyrhizobium-kantoja, mikä voi tarkoittaa maapähkinän
olevan laaja-alainen symbionttinsa suhteen. Kun lisäksi tiedetään, että bradyritsobit voivat
nystyröidä useampaa isäntäkasvia (Perret ym. 2000), on todennäköistä että tulokaslaji on saanut
symbiontikseen paikallisten palkokasvilajien symbiontteja.
On mahdollista, että nykyisin viljeltäviin maapähkinälajikkeisiin on sopeutunut 1300-
luvulla viljeltyä kiinalaista maapähkinää nystyröineitä bakteerikantoja. Mikäli Kiinan maaperässä on
jo valmiiksi ollut maapähkinän nystyröinnin mahdollistavia ”geenipaketteja”, on horisontaalinen
geenien siirtyminen ollut helppoa. Avoimeksi kysymykseksi jää, mistä vanhempi maapähkinälaji on
kotoisin, mistä sitä nystyröivät Bradyrhizobium-kannat ovat tulleet, ja kuinka kauan kannoilla on
ollut aikaa muuntua maapähkinän tehokkaiksi symbionteiksi
ii) Saapuivatko bakteerit Kiinaan maapähkinän siementen mukana?
Tämän tutkimuksen tuloksissa teoriaa vastustaa se, että kiinalaiset bradyritsobit olivat kaukaisia
sukulaisia kansainvälisiin maapähkinää nystyröineisiin vertailukantoihin. Jos bradyritzobit olisivat
saapuneet siementen mukana Kiinaan, niillä olisi ollut vain muutamia vuosisatoja aikaa muuntua
nykyisenkaltaisiksi kannoiksi. Kansainvälisten vertailukantojen ja kiinalaisten maapähkinäkantojen
genomien erot olivat tuloksissani niin suuria, että voidaan epäillä olisiko 500-700 vuoden
maapähkinänviljely Kiinassa riittänyt niin suureen bradyritsobien erilaistumiseen.
Lisäksi kiinalaisten maapähkinäkantojen muodostamat ryhmät olivat ITS-alueen,
ydingeenien ja AFLP:n perusteella yleensä hieman läheisempiä muita kiinalaisia kasveja
nystyröivien kantojen ryhmille, kuin kansainvälisille tyyppi- ja vertailukannoille. Nämä
perusgenomin sukulaisuudesta kertovat tulokset tukivat pikemmin sitä, että paikalliset kannat
olisivat sopeutuneet tulokaskasveihin.
iii) Ovatko kosmopoliitit bradyritsobit poikkeuksellisen aktiivisia geenien siirtäjiä tai mutaatioherkkiä,
ja sen takia sopeutuvat hyvin uusiin tulokaspalkokasvilajeihin?
Bakteerien evoluutio on alkanut jo 1,5 miljardia vuotta sitten (Woese 1987) ja palkokasvien kehitys
vasta 50-60 miljoonaa vuotta sitten (Lavin ym. 2005). Bradyritsobien genomin muuntelukyvystä
kertoo esimerkiksi se, että 16S rDNA:n perusteella määritettäviä lajeja on vähän, mutta näillä
harvoilla lajeilla on suuri geneettinen diversiteetti (esim. tämä tutkimus, Willems ym. 2001, Tan ym.
2001). Bradyritsobit vaihtavat geenejä keskenään, mahdollisesti erilaisella mekanismilla kuin muut
70
ritsobit (Krause 2001, Moulin ym. 2004), ja ovat todennäköisesti sopeutuneet ympäristötekijöihin
vuosimiljoonien aikana. Yksi mahdollinen teoria olisi, että aktiivisen geenien siirtymisen ansiosta
bradyritsobien keskuudessa on muodostunut monipuolinen geenivaranto. Tulokaskasvilajien
saapuessa uusille alueille, kuten tässä tapauksessa maapähkinän saapuessa Kiinaan, olisi brady-
ritsobeilla ollut mahdollisuus sopeutua helposti uusiin isäntäkasveihin.
Tämän tutkimuksen tulokset tukivat teoriaa siitä, että maapähkinän saapuessa
Kiinaan sille valikoitui nystyröintiin sopivia, alun perin kiinalaisia bradyritsobeja. Tutkimuksessa
havaittu kiinalaisten kantojen perusgenomin sukulaisuus (ks. kohta ii) viittaa kantojen yhteiseen
maantieteelliseen taustaan. Tutkittujen kantojen mosaiikkimainen genomi puolestaan viittaa
aktiiviseen geenien vaihtoon kiinalaisten ritsobien välillä. Useiden pienien kantaryhmien
muodostuminen maapähkinää nystyröineistä Bradyrhizobium-kannoista voi johtua siitä, että
maapähkinä ei ole symbionttinsa suhteen erityisen valikoiva. On mahdollista, että useat erilaiset,
jopa eri kasveja nystyröineet bakteerit ovat kyenneet muodostamaan sen kanssa
symbioosisuhteen. Maapähkinän tiedetään nystyröiden tiedetään infektoituvan eri mekanismilla
kuin useiden muiden palkokasvien nystyröiden (Boogerd ja van Rossum 1997). Infektiomekanismi
voi vaikuttaa kasvin spesifisyyteen sitä nystyröivien bakteerien suhteen.
Geenikeskusteorian (gene center theory, Vavilov 1926) mukaan kasvin geneettinen diversiteetti on
suurin alueella, josta kasvi on kotoisin. Palkokasvien tapauksessa myös kasvia nystyröivien
ritsobien diversiteetti on laajin kasvin alkuperäisessä ympäristössä. Kun maapähkinän tiedetään
olevan lähtöisin Etelä-Amerikasta, voisi jatkotutkimuksessa selvittää eteläamerikkalaisten ja
kiinalaisten maapähkinäkantojen geneettistä sukulaisuussuhdetta ja toisaalta isäntäkasvin
geneettistä diversiteettiä. Eteläamerikkalaista maapähkinää nystyröivien Bradyrhizobium-kantojen
diversiteetin laajuus, eri mannerten maapähkinäkantojen sukulaisuus, maapähkinäkantojen
sijoittuminen suhteessa toisen isäntäkasvin (kudzun) symbiontteihin, sekä maapähkinän
maailmanlaajuinen diversiteetti sekä suhde kasvia nystyröiviin erilaisiin bradyritsobikantoihin
voisivat valottaa kiinalaisen maapähkinäsymbiontin historiaa, sekä kertoa paljon uutta
Bradyrhizobium-suvun historiasta ja sen symbioosiominaisuuksista.
5.4 Typensitojabakteereiden käyttö - tulevaisuuden mahdollisuus?
Typensidontasymbioosin tunteminen on ensimmäinen askel sen hyödyntämiseen. Kasvin ja
bakteerin välinen vuorovaikutus on ensisijainen, mutta ei ainoa symbioosinmuodostukseen
vaikuttava tekijä. Ympäristön olosuhteet voivat myös estää teoriassa yhteensopivien lajien
symbioosin. Esimerkiksi maaperän happamuuden vaikutusta bradyritsobien toimintaan ja
71
symbioosinmuodostukseen ovat tutkineet mm. Vinuesa ym. (2004), Angelini ym. (2003) ja Saleena
ym. (2001).
Viherlannoittaminen palkokasveilla, eli kasvuston kyntäminen maahan kasvukauden
lopussa, parantaa maaperän laatua. Viljelykierrossa palkokasvin lannoittava vaikutus saadaan
hyödyksi viljelemällä vuorovuosina palkokasvia ja muita viljelykasveja (Rajala 2004). Etenkin
trooppisilla alueilla harjoitetussa seosviljelyssä (intercropping) viljelykasvien väliin istutetaan
palkokasvia jatkuvan typensidonnan takaamiseksi. Palkokasvien soveltuvuutta myös monivuotisten
energiakasvien (esim. ruokohelpi) lannoitukseen olisi syytä tutkia.
Biologisen typensidonnan suosiminen ei ole uusi käsite, mutta se on kemiallisen
lannoitetuotannon markkinoiden kasvun/kasvattamisen myötä aktiivisesti unohdettu. Teollisten
typpilannoitteiden korvaaminen biologisilla lannotteilla (palkokasvit, biokaasutuksen jäämäliete,
kotieläinten tuottama lietelanta yms.) on nykyisessä maailmassa välttämätön energiansäästötoimi.
Noin kolmannes maanviljelyn energiankulutuksesta johtuu keinotekoisten lannotteiden käytöstä
(esim. Kim ja Dale 2005). Tuntemalla typensidontasymbioosin taustalla olevat tekijät, kuten
bakteerien geneettinen diversiteetti ja toiminta erilaisissa ympäristöissä, voidaan saada aikaan
hyvin toimivia ja luonnollisia typensidontasymbiooseja, sekä mahdollistaa energiankulutuksen ja
talouden kannalta tehokas, ekologisesti kestävä, ja tuottava maanviljelys kaikkialla maailmassa.
6. Johtopäätökset
Tämän tutkimuksen tulokset osoittivat, että i) tutkittujen Bradyrhizobium-kantojen ydin- (recA ja
glnII) ja symbioosigeenien (nifH ja nodC) diversiteetti oli erittäin suuri, ii) nämä geenit eivät
noudattaneet 16S rDNA-sekvenssiin perustuvaa lajijakoa, ja iii) ydin- ja symbioosigeenit
ryhmittyivät hieman eri tavoin. Tutkitut kannat edustivat Bradyrhizobium-suvun bakteereita, joita oli
kerätty eri puolilta maailmaa ja eri isäntäkasveista, mikä selittänee osin niiden suurta diversiteettiä.
Kuitenkin myös samoilta alueilta peräisin olevissa bradyritsobeissa esiintyi suurta geneettistä
vaihtelua. Etenkin useiden pienien ryhmien muodostuminen ydingeeneistä antaa olettaa, että
tutkitut kannat edustivat suurta määrää Bradyrhizobium-lajeja tai alalajeja. Kaiken kaikkiaan
vaikutti siltä, että bradyritsobien genomin rakenteessa on suurta vaihtelua.
Tulokset viittasivat siihen, että Bradyrhizobium-kantojen sukulaisuus liittyi isäntäkasvi-
lajiin ja maantieteelliseen alkuperään. Työn tavoitteisiin kirjattuihin tutkimuskysymyksiin saatiin
seuraavia vastauksia:
72
i) Maapähkinää nystyröivien kiinalaisten Bradyrhizobium-kantojen diversiteetti jalajiutuminen muiden kuin 16S rDNA:n suhteen: Maapähkinää nystyöivien
Bradyrhizobium-kantojen diversiteetti oli suuri. Kantojen genomin rakenne vaihteli sekä
maantieteellisen alkuperän että isäntäkasvilajin perusteella, ja samaa kasvia (sekä
maapähkinää että kudzua) saattoi nystyröidä usea erilainen Bradyrhizobium-kanta.
Samankaltaisten ydin- ja symbioosigeeniryhmien sekä ITS-ryhmien yhdistämät
kantaryhmät olivat kooltaan pieniä, ja heijastivat paremmin osapopulaatioiden kuin
alalajien diversiteettiä.
ii) Kiinassa kotoperäisten villien palkokasvien, kuten kudzun, ja vierasperäisenmaapähkinän symbionttien sukulaisuus: Kiinalaiset Bradyrhizobium-kannat
ryhmittyivät isäntäkasvinsa mukaan, ja niiden isäntäkasvit vaikuttivat symbionttinsa
suhteen laaja-alaisilta. Alun perin aasialaista kudzua nystyröi kaksi hyvin erilaista
kantaryhmää. Kiinalaisten maapähkinäkantojen diversiteetti oli melko suuri, mutta ne
sijoittuivat omana joukkonaan kudzua (sekä villejä kiinalaisia palkokasveja)
nystyröineiden ryhmien väliin.
iii) Kiinalaisten maapähkinää ja luonnon palkokasveja (kudzu, Lespedeza- jaIndigofera-lajit) nystyröivien Bradyrhizobium-kantojen ryhmittyminen eri Brady-rhizobium-lajien tyyppikantoihin ja soijapapua nystyröiviin bradyritsobeihinverrattuna: Kansainväliset tyyppi- ja vertailukannat olivat keskenään hyvin erilaisia,
eivätkä ne muodostaneet tilastollisesti merkittäviä ryhmiä. Kiinalaisten kantojen
muodostamat pienet ryhmät muodostivat seuraavia joukkoja: ”maapähkinää
nystyröivien kiinalaisten Bradyrhizobium-kantojen joukko”, ”kudzua nystyröivien B.
japonicum –kantojen joukko” sekä ”kudzua nystyröivien B. elkanii –kantojen joukko”.
Nämä joukot olivat kaukaisia kansainvälisille tyyppi- ja vertailukannoille. Soijapapua
nystyröivien kansainvälisten vertailukantojen sijoittumista ei voitu luotettavasti vertailla
tässä yhteydessä, koska kantoja oli hyvin vähän, ja koko tutkimuksen Bradyrhizobium-
kantojen diversiteetti oli hyvin suuri.
Tulosten tarkastelun alussa esitettyihin kysymyksiin maapähkinää nystyröivien Bradyrhizobium-
kantojen alkuperästä saatiin suuntaa antavia vastauksia. Kaikissa esitetyissä teorioissa oli
horisontaalinen geeninsiirto suuressa osassa:
i) Mikäli symbioosigeenin horisontaalinen kulkeutuminen mahdollisti paikallistenkantojen mukautumisen tuontikasviin eli maapähkinään, oli maapähkinän
nystyröinnin mahdollistavia geenejä paikallisessa maaperässä jo ennen maapähkinän
saapumista. Maapähkinää nystyröineiden kantojen diversiteetti oli suuri, joten ne
saattoivat olla peräisin useasta erilaisesta paikallisesta palkokasvista. Kannat eivät
todennäköisesti olleet peräisin kudzusta.
73
ii) Bakteerien saapuminen Kiinaan maapähkinän siementen mukana vaikutti
epätodennäköiseltä, koska kiinalaiset maapähkinäkannat erosivat selvästi kansain-
välisistä maapähkinää nystyröineistä vertailukannoista.
iii) Kosmopoliittien, erittäin vanhojen Bradyrhizobium-bakteereiden sopeutuminenuusiin isäntäkasvitulokkaisiin vallitsevien olosuhteiden myötävaikutuksellatäydentää ensimmäistä hypoteesia lisäämällä siihen historianäkökulman. Tutkittujen
Bradyrhizobium-kantojen geenien mosaiikkimainen yhdistyminen genomissa voi olla
osoitus bradyritsobien poikkeuksellisen aktiivisesta geeniensiirtämiskyvystä. Voi olla,
että sopeutumiskykyiset bradyritsobit ovat voineet mukautua useisiin erilaisiin isäntä-
kasveihin, ja maapähkinän saapuessa Kiinaan on erilaisten palkokasvien symbiontteja
siirtynyt nystyröimään maapähkinää.
Tieto ritsobien diversiteetistä ja symbioosiominaisuuksista voi olla tulevaisuudessa erittäin
hyödyllinen maatalouden harjoittajille. Typpeä sitovien symbionttisten mikrobikantojen avulla
voidaan esimerkiksi vähentää kemiallista typpilannoitusta ja parantaa maaperän rakennetta, ja
edistää siten ekologisesti, taloudellisesti ja sosiaalisesti kestävää maanviljelyä. Tehokkaiden typen-
sidontasymbioosien tunteminen on olennaista tuloksen kannalta. Koska symbioosiin kuuluu aina
kaksi osapuolta, ovat sekä kasvin ja bakteerin vaatimukset ympäristön suhteen, että niiden
keskinäinen yhteensopivuus tärkeitä tutkimuskohteita tämän päivän ympäristötutkimuksessa.
7. Kirjallisuus
Andronov E. E., Terefework Z., Roumiantseva M. L., Dzyubenko N. I., Onichtchouk O. P.,Kurchak K. N., Dresler-Nurmi A., Young J. P. W., Simarov B. V. ja Lindström K. 2003.Symbiotic and genetic diversity of Rhizobium galegae isolates collected from the Galega orientalis
gene center in the Caucasus. Applied and Environmental Microbiology 69(2), 1067-1074.
Angelini J., Castro S. ja Fabra A. 2003. Alterations in root colonization and nodC gene induction
in the peanut-rhizobia interaction under acidic conditions. Plant Physiology and Biochemistry 41,
289-294.
APHIS (Animal and Plant Health Inspection Service) 11.4. 2006. Lackey J: Soybean
[verkkojulkaisu]. USDA, APHIS, Biotechnology permits, USA [viitattu 30.9.2006] Saatavissa:
http://www.aphis.usda.gov/brs/soybean.html.
Berg D. E., Akopyants N. S. ja Kersulyte D. 1994. Fingerprinting microbial genomes using the
RAPD or AP-PCR method. Methods in Molecular and Cellular Biology 5(1), 13-24.
74
Bianco P. R. ja Kowalczykowski S. C. 2005. RecA Protein. Teoksessa: Encyclopedia of Life
Sciences. John Wiley & Sons, Ltd: Chichester http://www.els.net/ [doi:10.1038/npg.els.0003925]
Boogerd F. ja van Rossum D. 1997. Nodulation of groundnut by Bradyrhizobium: a simple
infection process by crack entry FEMS Microbiology Reviews 21 (1), 5-27.
Brewin N. J. 1991. Development of the legume root nodule. Annual Review of Cell Biology 7, 191-
226.
Brewin N. J. 2002. Root Nodules (Rhizobium, Legumes). Teoksessa: Encyclopedia of life
sciences. John Wiley&Sons Ltd: Chichester. http://www.els.net/
Burris R. H. 1999. Nitrogen Fixation. Teoksessa: Encyclopedia of Life Sciences. John Wiley &
Sons, Ltd: Chichester http://www.els.net/ [doi:10.1038/npg.els.0000626]
Chantreuil C., Giraud E., Prin Y., Lorquin J., Ba A., Gillis M., de Lajudie P. ja Dreyfus B. 2000.Photosynthetic bradyrhizobia are natural endophytes of the African wild rice Oryza brevigulata.
Applied and Environmental Microbiology 66 (12), 5437-5447.
Chen Q., Zhang X., Terefework Z., Kaijalainen S., Li D. ja Lindström K. 2003. Diversity and
compatibility of peanut (Arachis hypogaea L.) bradyrhizobia and their host plants. Plant and Soil
255, 605-617.
Chen Q. 2004. Genetic diversity and phylogeny of rhizobia isolated from six genera of legume, and
determination of the taxonomy of rhizobia from Pueraria spp. In Sichuan province, P. R. China.
[kiinankielinen väitöskirja] China Agricultural University, P.R.China.
Chen W.-M., Moulin L., Bontemps C., Vandamme P., Béna G. ja Boivin-Masson C. 2003.
Legume symbiotic nitrogen fixation by β-proteobacteria is widespread in nature. Journal of
Bacteriology 185(24), 7266-7272.
Corley R. N., Woldeghebriel A. ja Murphy M. R. 1997. Evaluation of the nutritive value of kudzu
(Pueraria lobata) as a feed for ruminants. Animal Feed Science and Technology 68, 183–188.
Cournoyer B. ja Lavire C. 1999. Analysis of Frankia evolutionary radiation using glnII sequences.
FEMS Microbiology Letters 177(1), 29-34.
Crawley M. J. 1997. The structure of plant communities. Teoksessa M.J. Crawley (toim.) Plant
Ecology 2. painos. Blackwell Science Ltd. USA. Sivut 475-531.
Debellé F., Moulin L., Mangin B., Dénarié J. ja Boivin C. 2001. nod genes and Nod signals and
the evolution of the Rhizobium-legume symbiosis. Acta Biochimica Polonica 48(2), 359-365.
Denison R. F. ja Kiers E. T. 2004. Lifestyle alternatives for rhizobia: mutualism, parasitism, and
forgoing symbiosis. FEMS Microbiology Letters 237, 187-193.
Dobert R. C., Breil B. T. ja Triplett E. W. 1994. DNA sequence of the common nodulation genes
of Bradyrhizobium elkanii and their phylogenetic relationship to those of other nodulating bacteria.
Molecular Plant-Microbe Interactions 7(5), 564-572.
Dresler-Nurmi A., Fewer D., Räsänen L. A. ja Lindström K. 2006. The diversity and evolution of
rhizobia. Käsikirjoitus (Soveltavan kemian ja mikrobiologian laitos, Helsingin yliopisto).
75
Dresler-Nurmi A., Terefework Z., Kaijalainen S., Lindström K. ja Hatakka A. 2000. Silver
stained polyacrylamide gels and fluorescence-based automated capillary electrophoresis for
detection of amplified fragment length polymorphism patterns obtained from white-rot fungi in the
genus Trametes. Journal of Microbiological Methods 41, 161-172.
de Faria S. M., Hay G. T. ja Sprent J. I. 1988. Entry of rhizobia into roots of Mimosa scabrella
Bentham occurs between epidermal cells. Journal of General Microbiology 134(8), 2291-2296.
Farris J. S. 1969. On the cophenetic correlation coefficient. Systematic Zoology 18(3), 279-285.
Felsenstein J. 1985. Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap.
Evolution 39(4), 783-791.
Fisher S. 1992. Glutamine synthesis in Streptomyces - a review. Gene 115(1-2), 13-17.
Gage D. J. ja Margolin W. 2000. Hanging by a thread: invasion of legume plants by rhizobia.
Current Opinion in Microbiology 3, 613-617.
Giraud E., Hannibal L., Fardoux J., Verméglio A. ja Dreyfus B. 2000. Effect of Bradyrhizobium
photosynthesis on stem nodulation of Aeschyomene sensitiva. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America 97(26), 14795-14800.
Gogarten J. P., Doolittle W. F. ja Lawrence J. G. 2002. Prokaryotic evolution in light of gene
transfer. Molecular Biology and Evolution 19(12), 2226-2238.
Goormachtig S., Capoen W. ja Holsters M. 2004. Rhizobium infection: lessons from the versatile
nodulation behaviour of water-tolerant legumes. Trends in Plant Science 9(11), 518-522.
Göttfert M., Röthlisberger S., Kündig C., Beck C., Marty R. ja Hennecke H. 2001. Potential
symbiosis-specific genes uncovered by sequencing a 410-kilobase DNA region of the
Bradyrhizobium japonicum chromosome. Journal of Bacteriology 183(4), 1405-1412.
Hampl V., Pavlicek A. ja Flegr J. 2001. Construction and bootstrap analysis of DNA
fingerprinting-based phylogenetic trees with the freeware program FreeTree: Application to
trichomonad parasites. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 51, 731-
735.
Haukka K., Lindström K. ja Young P. W. 1998. Three phylogenetic groups of NodA and NifH
genes in Sinorhizobium and Mesorhizobium isolates from leguminous trees Growing in Africa and
Latin America. Applied and Environmental Microbiology 64(2), 419-426.
Hennecke H. 1990. Nitrate fixation genes involved in Bradyrhizobium japonicum–soybean
symbiosis. FEBS Letters 268(2), 422-426.
Hillis D. M. ja Bull J. J. 1993. An empirical test of bootstrapping as a method for assessing
confidende in phylogenetic analysis. Systematic Biology 42(2), 182-192.
Hirsch A. M. 1992. Developmental biology of legume nodulation. New Phytologist 122, 211-237.
Hirsch A. M. 1999. Role of lectins (and rhizobial exopolysaccharides) in legume nodulation.
Current Opinion in Plant Biology 2, 320-326.
Hymowitz T. 1970. On the domestication of the soybean. Economic botany 24(4), 408-421.
76
ICRISAT 2005. Groundnut (peanut) [verkkodokumentti] International Crops Research Institute for
the Semi-Arid Tropics. [viitattu 21.9.2006] Saatavissa:
http://www.icrisat.org/GroundNut/GroundNut.htm
ILDIS (International Legume Database & Information Service) 5.7. 2006. Pueraria montana
var. lobata [verkkojulkaisu]. School of Plant Sciences, University of Reading, UK [viitattu
30.9.2006]
Saatavissa:http://www.ildis.org/LegumeWeb?version~10.01&LegumeWeb&tno~15546&genus~Pu
eraria&species~lobata
ILDIS (International Legume Database & Information Service) 5.7. 2006. Glycine max
[verkkojulkaisu]. School of Plant Sciences, University of Reading, UK [viitattu 30.9.2006]
Saatavissa:http://www.ildis.org/LegumeWeb?version~10.01&LegumeWeb&tno~13287&genus~Gly
cine&species~max
ILDIS (International Legume Database & Information Service) 5.7. 2006. Arachis hypogaea L.
[verkkojulkaisu]. School of Plant Sciences, University of Reading, UK [viitattu 30.9.2006]
Saatavissa:http://www.ildis.org/LegumeWeb?version~10.01&LegumeWeb&tno~1295&genus~Arac
his&species~hypogaea
ILDIS (International Legume Database & Information Service) 5.7. 2006. Lespedeza cuneata.
[verkkojulkaisu]. School of Plant Sciences, University of Reading, UK [viitattu 30.9.2006]
Saatavissa: http://www.ildis.org/LegumeWeb?sciname=Lespedeza+cuneata
Jordan D. C. 1982. Transfer of Rhizobium japonicum Buchanan 1980 to Bradyrhizobium gen.
nov., a genus of slow-growing root nodule bacteria from leguminous plants. International Journal of
Systematic Bacteriology 32, 136-139.
Judd W. S., Campbell C. S., Kellogg E. A. ja Stevens P. F. 1999. Plant Systematics – A
Phylogenetic Approach. Sinauer Associates Inc. USA. 464 sivua.
Kaneko T., Nakamura Y., Sato S., Minamisawa K., Uchiumi T., Sasamoto S., Watanabe A.,Idesawa K., Iriguchi M., Kawashima K., Kohara M., Matsumoto M., Shimpo S., Tsuruoka H.,Wada T., Yamada M. ja Tabata S. 2002. Complete genomic sequence of nitrogen-fixing symbiotic
bacterium Bradyrhizobium japonicum USDA110. DNA Research 9, 189-197.
Karr D. B., Liang R., Reuhs B. L. ja Emerich D. W. 2000. Altered exopolysaccharides of
Bradyrhizobium japonicum mutants correlate with impaired soybean lectin binding, but not with
effective nodule formation. Plant 211, 218-226.
Kiers E. T., Rousseau R. A., West S. A. ja Denison R. F. 2003. Host sanctions and the legume-
rhizobium mutualism. Nature 425, 78-81.
Kim S. ja Dale B. E. 2005. Environmental aspects of ethanol derived from no-tilled corn grain:
nonrenewable energy consumption and greenhouse gas emissions. Biomass and Bioenergy 28,
475-489.
77
Krause A., Doerfei A. ja Göttfert M. 2001. Mutational and transcriptional analysis of the type III
secretion system of Bradyrhizobium japonicum. Molecular Plant-Microbe Interactions 15(12), 1228-
1235.
Kumada Y., Benson D. R., Hilleman D., Hosted T. J., Rochefort D. A., Thompson C. J.,Wohlleben W. ja Tateno Y. 1993. Evolution of the glutamine synthetase gene, one of the oldest
existing and functioning genes. Proceedings of the National Academy of Science of the United
States of America 90, 3009-3013.
Kunin V., Goldovsky L., Darzentas N. ja Ouzounis C. A. 2005. The net of life: Reconstructing
the microbial phylogenetic network. Genome Research 15, 954-959.
Kurland C. G., Canback C. ja Berg O. G. 2003. Horizontal gene transfer: A critical review.
Proceedings of the National Academy of the United States of America 100(17), 9658-9662.
Kuykendall L. D., Saxena B., Devine T. E. ja Udell S. E. 1992. Genetic diversity in
Bradyrhizobium japonicum Jordan 1982 and a proposal for Bradyrhizobium elkanii sp. nov.
Canadian Journal of Microbiology 38, 501-505.
Kündig C., Beck C., Hennecke H. ja Göttfert M. 1995. A single rRNA gene region in
Bradyrhizobium japonicum. Journal of Bacteriology 177(17), 5151-5154.
Laguerre G., Louvrier P., Allard M.-R. ja Amarger N. 2003. Compatibility of rhizobial genotypes
within natural populations of Rhizobium leguminosarum biovar viciae for nodulation of host
legumes. Applied and Environmental Microbiology 69(4), 2276-2283.
Laguerre G., Nour S. M., Macheret V., Sanjuan J., Drouin P. ja Amarger N. 2001. Classification
of rhizobia based on nodC and nifH gene analysis reveals a close phylogenetic relationship among
Phaseolus vulgaris symbionts. Microbiology 147, 981-993.
Laininen P. 2001. Todennäköisyys ja sen tilastollinen soveltaminen. 5. painos. Oy Yliopisto-
kustannus/Otatieto, Hakapaino Oy, Helsinki.
Lavin M., Herendeen P. S. ja Wojciechowski M. F. 2005. Evolutionary rates analysis of
Leguminosae implicates a rapid diversification of lineages during the tertiary. Systematic Biology
54(4), 575-594.
Lie T. A., Akkermans A. D. L. ja Egeraat A. W. S. M. 1984. Natural variation in symbiotic
nitrogen-fixing Rhizobium and Frankia spp. Antonie van Leeuwenhoek 50, 489-503.
Lindström K. 2007. Suullinen tiedonanto, joka perustui E. Giraudin esitelmään ”The mosaic
genomes of two photosynthetic Bradyrhizobium strains do not contain canonical nodulation genes.”
Lindström K. ja Gyllenberg H. 2006. The species paradigm in bacteriology: Proposal for a cross-
disciplinary species concept. World Federation of Culture Collections Newsletter, July 2006, 4-13.
Lindström K., Kokko-Gonzales P., Terefework Z. ja Räsänen L. A. 2006. Differentiation of
nitrogen-fixing legume root nodule bacteria (rhizobia). Teoksessa: Cooper ja Rao (toim.) Molecular
Techniques for Soil, Rhizosphere and Plant Microorganisms. CAB International. Sivut 236-258.
78
Ludden P. W. 1999. Nitrogenase Complex. Teoksessa: Encyclopedia of Life Sciences. John Wiley
& Sons, Ltd: Chichester http://www.els.net/ [doi:10.1038/npg.els.0001386]
Madigan M. T., Martinko J. M. ja Parker J. 2003. Brock Biology of Microorganisms. 10. painos.
Pearson Education Inc. USA. 1019 sivua.
Masterson R. V., Prakash R. K. ja Atherly A. G. 1985. Conservation of symbiotic nitrogen fixation
gene sequences in Rhizobium japonicum and Bradyrhizobium japonicum. Journal of Bacteriology
163(1), 21-26.
Mathis J. N., McMillin D. E., Champion R. A. ja Hunt P. G. 1997. Genetic variation in two
cultures of Bradyrhizobium japonicum 110 differing in their ability to impact drought tolerance in
soybean. Current Microbiology 35, 363-366.
Mitich L. W. 2000. Kudzu (Pueraria lobata [Willd.] Ohwi). Weed Technology 14, 231-235.
Molouba F., Lorquin J., Willems A., Hoste B., Giraud E., Dreyfus B., Gillis M., de Lajudie P. jaMasson-Boivin C. 1999. Photosynthetic bradyrhizobia from Aeschyomene spp. are specific to
stem-nodulated species and form a separate 16S ribosomal DNA restriction fragment length
polymorphism group. Applied and Environmental Microbiology 65(7), 3084-3094.
Morgante C., Angelini J., Castro S. ja Fabra A. 2005. Role of rhizobial exopolysaccharides in
crack entry/intercellular infection of peanut. Soil Biology and Biochemistry 37(8), 1436-1444.
Moulin L., Munive A., Dreyfus B. ja Boivin-Masson C. 2001. Nodulation of legumes by members
of the β-subclass of proteobacteria. Nature 411, 948-950.
Moulin L., Béna G., Boivin-Masson C. ja Stepowski T. 2004. Phylogenetic analyses of
symbiotic nodulation genes support vertical and lateral gene co-transfer within the Bradyrhizobium
genus. Molecular Genetics and Evolution 30, 720-732.
O’Callaghan K. J., Davey M. R. ja Cocking E. C. 1997. Xylem colonization of the legume
Sesbania rostrata by Azorhizobium caulinodans. Proceedings of the Royal Society B: Biological
Sciences 264(1389), 1821-1826.
Perret X., Staehelin C. ja Broughton W. J. 2000. Molecular basis of symbiotic promiscuity.
Microbiology and Molecular Biology Reviews 64(1), 180-201.
Pueppke S. G. 1983. Rhizobium infection threads in root hairs of Glycine max (L.) Merr., Glycine
soia (L.) Sieb. and Zucc., and Vigna unguiculata (L.) Walp. Canadian Journal of Microbiology
29(1), 69-76.
Rai A. N., Söderbäck E. ja Bergman B. 2000. Cyanobacterium-plant symbioses. New Phytologist
147(3), 449-481.
Rajala J. 2004. Viljelykierrot. Teoksessa: Rajala J. (toim.) Luonnonmukainen maatalous. Helsingin
yliopiston maaseudun tutkimus- ja koulutuskeskuksen julkaisuja 80. Mikkeli 2004. Sivut 110-119.
Rivas R., Willems A., Palomo J. L., García-Benavides P., Mateos P. F., Martinez-Molina E.,Gillis M. ja Velázquez E. 2004. Bradyrhizobium betae sp. nov. isolated from roots of Beta vulgaris
79
affected by tumor-like deformations. International Journal of Systematic Evolution Microbiology (in
press).
Robson R. L. 1979. Characterization of an oxygen-stable nitrogenase complex isolated from
Azotobacter chroococcum. Biochemical Journal 181, 569–575.
Rosselló-Mora R. ja Amann R. 2001. The species concept for prokaryotes. FEMS Microbiology
Reviews 25, 39-67.
van Rossum D., Schuurmans F. P., Gillis M., Muyotcha A., van Versefeld H. W., StouthamerA. H. ja Boogerd F. C. 1995. Genetic and phenetic analyses of Bradyrhizobium strains nodulating
peanut (Arachis hypogaea L.) roots. Applied and Environmental Microbiology 61(4), 1599-1609.
Räsänen L. A. 2002. Biotic and abiotic factors influencing the development of N2-fixing symbioses
between rhizobia and the woody legumes Acacia and Prosopis. Mikrobiologian julkaisuja 2002.
Mikrobiologian osasto, Soveltavan kemian ja mikrobiologian laitos, Helsingin yliopisto. Saatavissa:
http://ethesis.Helsinki.fi/maa/skemi/vk/rasanen
Saito A., Mitsui H., Hattori R., Minamisawa K. ja Tsutomu Hattori T. 1998. Slow-growing and
oligotrophic soil bacteria phylogenetically close to Bradyrhizobium japonicum. FEMS Microbiology
Ecology 25, 277-286.
Saleena L. M., Loganathan P., Rangarajan S. ja Nair S. 2001. Genetic diversity of
Bradyrhizobium strains isolated from Arachis hypogaea. Canadian Journal of Microbiology 47, 118-
122.
Sawada H., Kuykendall L. D. ja Young J. M. 2003. Changing concepts in the systematics of
bacterial nitrogen-fixing legume symbionts. Journal of General and Applied Microbiology 49, 155-
179.
Schultze M. ja Kondorosi A. 1998. Regulation of symbiotic root nodule development. Annual
Reviews in Genetics 32, 33-57.
Smith B. W. 1950. Arachis hypogaea. Aerial flower and subterranean fruit. American Journal of
Botany 37(10), 802-815.
Spaink H. P. 2000. Root nodulation and infection factors produced by rhizobial bacteria. Annual
Review of Microbiology 54, 257–288.
Spaink H. P. 1994. Role of rhizobial lipo-chitin oligosaccharide signal molecules in root nodule
organogenesis. Plant Molecular Biology 26(5), 1413-1422.
Sprent J. I. 2001. Nodulation in legumes. Royal Botanic Gardens, Kew, s.146.
Stacey G., Libault M., Brechenmacher L., Wan J. ja May G. D. 2006. Genetics and functional
genomics of legume nodulation. Current Opinion in Plant Biology 9, 110-121.
Stepowski T., Swiderska A., Miedzinska K., Czaplinska M., Swiderski M., Biesiadka J. jaLegocki A. B. 2003. Low sequence similarity and gene content of symbiotic clusters of
Bradyrhizobium sp. WM9 (Lupinus) indicate early divergence of “lupin” lineage in the genus
Bradyrhizobium. Antonie van Leeuwenhoek 84, 115-124.
80
Stewart W. D. P. 1969. Biological and ecological aspects of nitrogen fixation by free-living micro-
organisms. Proceedings of the Royal Society of London, Series B, Biological Sciences 172, 367-
388.
Stougaard J. 2000. Regulators and regulation of legume root nodule development. Plant
Physiology 124, 531–540.
Sullivan J. T. ja Ronson C. T. 1998. Evolution of rhizobia by acquisition of a 500-kb symbiosis
island that integrates into a phe-tRNA gene. Proceedings of the National Academy of Science of
the USA 95, 5145-5149.
Suominen L., Roos C., Lortet G., Paulin L. ja Lindström K. 2001. Identification and structure of
the Rhizobium galegae common nodulation genes – evidence for horizontal gene transfer.
Molecular Biology and Evolution 18, 906-916.
Suominen L. 2000. Molecular biology of symbiotic interactions between Galega orientalis and
Rhizobium galegae. Mikrobiologian julkaisuja 29/2000. Mikrobiologian osasto, Soveltavan kemian
ja mikrobiologian laitos, Helsingin yliopisto. Sivut 1-23.
Tan Z., Hurek T., Vinuesa P., Müller P., Ladha J. K. ja Reinhold-Hurek B. 2001. Specific
detection of Bradyrhizobium and Rhizobium strains colonizing rice (Oryza sativa) roots by 16S-23S
ribosomal DNA intergenic spacer-targeted PCR. Applied and Environmental Microbiology 67(8),
3655-3664.
Terefework Z. 2002. Diversity and phylogeny of Rhizobium galegae, and reflections on molecular
evolution of rhizobium-legume symbiosis. Mikrobiologian julkaisuja 2002. Mikrobiologian osasto,
Soveltavan kemian ja mikrobiologian laitos, Helsingin yliopisto. Saatavilla:
http://ethesis.Helsinki.fi/maa/skemi/vk/terefework
Thormann C. E., Ferreira M. E., Camargo L. E. A., Tivang J. G. ja Osborn T. C. 1994.
Comparison of RFLP and RAPD markers to estimating genetic relationships within and among
cruciferous species. TAG Theoretical and Applied Genetics 88, 973-980.
Turner S. L. ja Young P. W. 2000. The glutamine synthetases of rhizobia: Phylogenetics and
evolutionary implications. Molecular Biology and Evolution 17(2), 309-319.
Ueda T., Suga Y., Yahiro N. ja Matsuguchi T. 1995. Phylogeny of Sym plasmids of rhizobia by
PCR-based sequencing of a nodC segment. Journal of Bacteriology 177(2), 468-472.
University of Georgia 2003. World Geography of the Peanut [verkkodokumentti]. Sustainable
Human Ecosystems Laboratory, Dept of Anthropology, University of Georgia, USA. [viitattu
21.9.2006]. Saatavissa: http://lanra.anthro.uga.edu/peanut/knowledgebase/countries/china.cfm
Urtz B. E. ja Elkan G. H. 1996. Genetic diversity among Bradyrhizobium isolates that effectively
nodulate peanut (Arachis hypogaea). Canadian Journal of Microbiology 42, 1121-1130.
Vavilov N. I. 1926. Studies on the origin of cultivated plants. Leningrad. 250 sivua.
Vega-Hernandez M. C., Perez-Galdona R., Dazzo F. B., Jarabo-Lorenzo A., Alfayate L. C. jaLeon-Barrioz M. 2001. Novel infection process in the indeterminate root nodule symbiosis
81
between Chamaecytisus proliferus (tagasaste) and Bradyrhizobium sp. New Phytologist 150 (3),
707-721.
Verma D. P. S. ja Hong Z. 1996. Biogenesis of the peribacteroid membrane in root nodules.
Trends in Microbiology 4(9), 364-368.
Versalovic J., Schneider M., de Bruijn F. J. ja Lupski J. R. 1994. Genomic fingerprinting of
bacteria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction. Methods in Molecular and
Cellular Biology 5(1), 25-40.
Vinuesa P., León-Barrios M., Silva C., Willems A., Jarabo-Lorenzo A., Pérez-Galdona R.,Werner D. ja Martínez-Romero E. 2004. Bradyrhizobium canariense sp. nov. , an acid-tolerant
endolymbiont fron he nodules of endemic woody legume species (Papilionoideae:Genisteae)
growing in the Canary Islands along with B. japonicum bv. genistearum, Bradyrhizobium
genospecies a and Bradyrhizobium genospecies b. International Journal of Systematic Evolution
Microbiology (in press. http://dx.doi.org/10.1099/ijs.0.63292-0)
Vinuesa P., Silva C., Werner D. ja Martinez-Romero E. 2005. Population genetics and
phylogenetic inference in bacterial molecular systematics: the roles of migration and recombination
in Bradyrhizobium species cohesion and delineation. Molecular Phylogenetics and Evolution 34(1),
29-54.
Vos P., Hogers R., Bleeker M., Reijans M., van de Lee T., Hornes M., Frijters A., Peleman J.,Kuiper M. ja Zabeau M. 1995. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acid
Research 23(21), 4407-4414.
Webster G., Jain V., Davey M. R., Gough C., Vasse J., Dénarié J. ja Cocking E. C. 1998. The
flavonoid naringenin stimulates the intercellular colonization of wheat roots by Azospirillum
caulinodans. Plant, Cell and Environment 21, 373-383.
Wernegreen J. J. ja Riley M. A. 1999. Comparison of the evolutionary dynamics of symbiotic and
housekeeping loci: A case for the genetic coherence of rhizobial lineages. Molecular Biology and
Evolution 16, 98-113.
Wilkinson H. H., Spoerke J. M. ja Parker M. A. 1996. Divergence in symbiotic compatibility in a
legume-Bradyrhizobium mutualism. Evolution 50(4), 1470-1477.
Willems A. ja Collins M. D. 1993. Phylogenetic analysis of rhizobia and agrobacteria based on
16S rRNA gene sequences. International Journal of Systematic Bacteriology 43(2), 305-313.
Willems A., Coopman R. ja Gillis M. 2001. Phylogenetic and DNA-DNA hybridization analyses of
Bradyrhizobium species. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 51,
111-117.
Woese C. R. 1987. Bacterial evolution. Microbiological Reviews 51(2), 221-271.
Xu L. M., Ge C., Cui Z., Li J. ja Fan H. 1995. Bradyrhizobium liaoningense sp. nov., isolated from
the root nodules of soybeans. International Journal of Systematic Bacteriology 45, 706-711.
82
Yanagi M. ja Yamasato K. 1993. Phylogenetic analysis of the family Rhizobiaceae and related
bacteria by sequencing of 16S rRNA gene using PCR and DNA sequencer. FEMS Microbiology
Letters 107, 115-120.
Yang J. K., Xie F. L. ja Zhou J. C. 2002. Genetic diversity and phylogeny of rhizobia isolated from
peanut (Arachis hypogaea). Yi Chuan Xue Bao 29(12), 1118-1125.
Yao G. 2004. Peanut production and utilisation in the People's republic of China
[verkkodokumentti]. Peanut in Local and Global Food Systems Series Report No.4, Department of
Anthropology, University of Georgia, USA [viitattu 30.9.2006]. Saatavissa:
http://lanra.anthro.uga.edu/peanut/download/china.pdf
Yao Z. Y., Kan F. L., Wang E. T., Wei G. H. ja Chen W. X. 2002. Characterization of rhizobia that
nodulate legume species of the genus Lespedeza and description of Bradyrhizobium
yuanmingense sp. nov. International Journal of Systematic Evolution Microbiology 52, 2219-2230.
Young P. W. ja Haukka K. E. 1996. Diversity and phylogeny of rhizobia. New Phytologist 133, 87-
94.
Zhang X., Nick G., Kaijalainen S., Terefework Z., Paulin L., Tighe S. W., Graham P. H. jaLindström K. 1999. Phylogeny and diversity of bradyrhizobium strains isolated from the root
nodules of peanut (Arachis hypogaea) in Sichuan, China. Systematic and Applied Microbiology 22,
378-386.
Kannen kuvat:Pueraria lobata (Peggy Greb) www.ars.usda.gov/is/graphics/photos/nov01/k9675-1.htm. Arachis
hypogaea
Muut kuvat:
http://en.wikipedia.org/wiki/Indigofera
http://en.wikipedia.org/wiki/Lespedeza 21.9.
Liite 1. Alustat 1/1
Alustat
HUM-liemimannitoli 10,0 g
CaCo3 4,0 g
K2HPO4 0,5 g
hiivauute 0,4 g
MgSO4 x 7H2O 0,2 g
NaCl 0,1 g
tisl. H2O 1,000 l
pH 6,8-7,0 + 0,2 25°C:ssa
Autoklavoidaan 15 minuuttia 121°C:ssa.
HUM-agarKuten HUM-liemi, mutta lisätään seokseen lisätään 15,0 g agaria.
TY-liemikaseiini 16.0 g
hiivauute 10,0 g
NaCl 5,0 g
tisl. H2O 1,000 l
pH 7,0 + 0,2 25°C:ssa
Autoklavoidaan 15 min 121°C:ssa
Liite 2. Geeli 1/1
Geeli
TAETris base 242,0 g
Etikkahappo (väk.) 57,1 ml
0,5 M EDTA, pH 8,0 100,0 ml
Täydennetään ionivaihdetulla vedellä 1000,0 ml:ksi
1,5 % agaroosigeeli0,5 x TAE 230 ml
agaroosi 3,45 g
EtBr (5 mg/ml) 6 µl
Liite 3. DNA:n eristys 1/1
DNA:n eristys
-ohjeen on laatinut Zewdu Terefework 12.4.1999
1. HUM- tai TY-liemessä kasvaneet solut kerättiin sentrifugoimalla 10 000 rpm 2 min
2. Solut (max 50 µl) suspendoitiin 400 µl:aan
100 mM Tris (Valmistetaan pipetoimalla 10 ml 1 M Tris:a ja 10 ml 0,5 M
50 mM EDTA EDTA:ta, joiden pH 8, ja lisätään 80 ml steriiliä vettä.)
ja sekoitettiin pipetoimalla edestakaisin.
3. 1M beta-merkaptoetanolia lisättiin 4 µl ja käänneltiin putkea ympäri pari kertaa.
4. Solujen lopulliseksi hajotukseksi lisättiin 50 µl 10% SDS (natriumdodekyylisulfaatti) ja
käänneltiin putkea ympäri parin minuutin ajan.
5. DNA stabiloitiin lisäämällä putkeen 50 µl 5 M NaCl ja sekoittamalla.
6. Putkea inkuboitiin 65°C:ssa 10 minuuttia DNAsin inaktivoimiseksi.
7. Putkeen lisättiin 175 µl 5 M KAC (kaliumasetaattia) ja sitä sekoitettiin voimakkaasti.
8. Putkea inkuboitiin jäävedessä vähintään 20 minuuttia.
9. Seokseen lisättiin 650 µl -20°C:ssa säilytettyä kloroformi-2-oktanoli (24:1) -liuosta ja putkea
ravisteltiin voimakkaasti.
10. 50 µl CTAB:a lisättiin ja sekoitettiin kääntelemällä putkea ylösalas, minkä jälkeen sitä
inkuboitiin 65°C:ssa 10 minuuttia.
11. Putkea sentrifugoitiin 12 000 rpm 2 minuuttia ja päällimmäinen faasi siirrettiin uuteen putkeen.
12. Lisättiin vastaava tilavuus fenoli-kloroformi (1:1) -liuosta ja sekoitettiin kunnolla.
13. Putkea sentrifugoitiin 12 000 rpm 2 minuuttia ja ylempi vesifaasi siirrettiin uuteen putkeen.
Lisättiin vastaava tilavuus kloroformi-2-oktanolia (24:1). Kohta toistettiin.
14. Putkea sentrifugoitiin 12 000 rpm 2 minuuttia ja ylempi faasi siirrettiin uuteen putkeen.
15. Lisättiin yhtä suuri tilavuus 2-isopropanolia, joka saostaa DNA:n. Inkuboitiin -20°C:ssa
vähintään 1 h.
16. Putkea sentrifugoitiin 10 000 rpm 5 minuuttia ja yläfaasi poistettiin.
17. DNA-pelletti pestiin 200 µl:lla 70% etanolia. 10 000 rpm 5 minuutin sentrifugoinnin jälkeen
etanoli voitiin kaataa pois. Pelletti kuivattiin Heto Vacuum Centrifuge -laitteella 10 minuutissa.
18. DNA liuotettiin 30 µl:aan steriiliä vettä.
19. RNAsi-entsyymiä (Roche Diagnostics Corp. Indianapolis, USA) pipetoitiin DNA-liuokseen 0,7 µl
ja inkuboitiin yön yli +37°C:ssa.
Liite 4. Reagenssit 1/1
Reagenssit
Laimennettu pGEMpGEM© DNA Markers (Promega, USA) 1µg/µl 10 µl
ster. H2O 150 µl
2 x Load Dye (Promega, USA) 160 µl
50 bp DNA LadderGeneRulerTM 50 bp DNA Ladder 0,5 µg/µl (Fermentas) 1 µl
6 x Load Dye (Promega, USA) 1 µl
ster. H2O 3 µl
AFLP-adapteritEcoRI-Ad1 5'- CTC GTA GAC TGC GTA CC -3'
EcoRI-Ad2 5'- AAT TGG TAC GCA GTC TAC -3'
MseI-Ad1 5'- GAC GAT GAG TCC TGA G -3'
MseI-Ad2 5'- TAC TCA GGA CTC AT -3'
AFLP-PCR -alukkeetEcoRI-AC-FAM 5'- FAM- GAC TGC GTA CCA ATT CAC -3'
MseI-GC 5'- GAT GAG TCC TGA GTA AGC -3'
Liite 5. PCR-ohjelmat 1/2
5. PCR-ohjelmat (PTC-200 Programmable Thermal Controller)
Zewdu - BACAFLP
1 = 50,0°C; 0:05 min
2 = 60,0°C; 0:05 min
3 = 70,0°C; 1:00 min
4 = 95,0°C; 1:00 min - DNA:n denaturaatio
5 = 94,0°C; 0:30 min
6 = 59,5°C; 0:30 min - alukkeen liittyminen juosteeseen
7 = 79,0°C; 1:30 min - DNA:n kopiointi
8 = kohdat 5-7, 29 kertaa
9 = 72,0°C; 1:30 - DNA:n viimeinen kopiointi
10 = 4,0°C
Aneta - APEKKA
1 = 94,0°C; 1:35 min - DNA:n denaturaatio
2 = 94,0°C; 0:35 min
3 = 52,0°C; 1:00 min - alukkeen liittyminen juosteeseen
4 = 0,2s lämpötilaan 72,0°C
5 = 72,0°C; 2:00 min - DNA:n kopiointi
6 = kohdat 2-5, 34 kertaa
7 = 72,0°C; 10:00 min - DNA:n viimeinen kopiointi
8 = 4,0°C
Aneta – APEKKA1
1 = 95°C; 5:00 min
2 = 94°C; 0:35 min
3 = 52°C; 1:00 min
4 = 0,2°C/s 72°C:seen
5 = 72°C; 2:00 min
6 = kohdat 2-5, 34 kertaa
7 = 72°C; 10 min
Liite 5. PCR-ohjelmat 2/2
Aneta – NIFH
1 = 95°C; 5:00 min
2 = 93°C; 2:00 min
3 = 62°C; 1:00 min
4 = 72°C; 2:00 min
5 = kohdat 2-4, 35 kertaa
6 = 72°C; 10:00 min
7 = 4°C
Jyrki – NODD
1 = 94°C; 1:35 min
2 = 94°C; 0:35 min
3 = 55°C; 1:00 min
4 = 72°C; 2:00 min
5 = kohdat 2-4, 34 kertaa
6 = 72°C; 10:00 min
7 = 4°C
Jyrki – CELB
1 = 95°C; 3:30 min
2 = 94°C; 1:10 min
3 = 56°C; 0:40 min
4 = 72°C; 2:10 min
5 = kohdat 2-4, 35 kertaa
6 = 72°C; 10:00 min
7 = 4°C
Recommended