Lipidi prezentacija.pdf

Lipidi

Smina M., Dušica P., Ivana V.B., Ivana S., Jelena M.

Slika:http://reputationdoctor.com/2006/11/trans-fat-is-the-new-cigarette-

packaged-food-companies-and-fast-food-chains-have-reputations-in-crisis/

UVOD Def. 1: Lipidi predstavljaju klasu jedinjenja, koja se

izdvaja po svojoj nerastvorljivosti u vodi i rastvorljivosti u

nepolarnim rastvaračima (etar, benzen, petroletar i dr.).

Def 2.: Lipidi su bitni za biološke sisteme, jer učestvuju u

izgradnji ćelijske membrane, obnovi ćelija i njenih

delova, ali i predstavljaju mehaničku barijeru koja štiti

ćelije od spoljnih uticaja.

Međutim, lipide nije dovoljno klasifikovati samo na osnovu njihove

rastvorljivosti, danas postoje različiti kriterijumi podele lipida!

Def. 3: Lipidi su masne kiseline ili neke druge supstancije

koje su biosintetski povezane sa masnim kiselinama

(trigliceridi, neki vitamini,fosfo- i glikolipidi, ali ne i terpeni,

steroidni hormoni i neke druge supstancije).

Def. 4: Jedna od definicija je i da su to hidrofobni ili

amfipatični mali molekuli koji nastaju iz karbanjonske

kondenzacije tioestara (masne kiseline, poliketidi i dr.) ili/i iz

karbokatjonske kondenzacije izoprenskih jedinica

(prenol,steroli i dr.).

Masne kiseline

Glicerofosfolipidi

Sfingolipidi

Poliketidi

Karbanjonski

intermedijer

Prenoli

Steroli

Karbokatjonski

intermedijer

Eritromicin

Aflatoksin B1

POLIKETIDI

PRENOL

Lipidi

Ne mogu se

saponifikovati

Mogu se

saponifikovati

Prosti Složeni Steroidi

Vitamini

(A,D,E,K)

Prostaglandini

Terpeni

Masti i ulja

Voskovi

Fosfolipidi

Sfingolipidi

Lipoproteini

Tip

lipida

uobičajeno ime hemijski tip jedinjenja Proizvodi hidrolize

I lipidi koji ne

hidrolizuju

ugljovodonici

alkoholi

masne kiseline

II jednostavni estri Masti masne kiseline (ili sapuni) + glicerol

Voskovi masne kiseline (ili sapuni) + alkohol

steroidni estri masne kiseline (ili sapuni) + steroidni alkohol

III fosfolipidi fosfatidne kiseline masne kiseline (ili sapuni) + glicerol + fosfat

Fosfatidi masne kiseline (ili sapuni) + glicerol + fosfat + aminoalkohol

IV sfingolipidi Ceramidi masne kiseline (ili sapuni) + sfingozin

Cerebrozidi masne kiseline (ili sapuni) + sfingozin + šećer

Gangliozidi masne kiseline (ili sapuni) + sfingozin + šećer + neuraminska kiselina

Struktura masnih kiselina

Struktura masne kiseline

Karboksilna

grupa

Ugljovodonični

skelet

Zasićene masne

kiseline

Smeša zasićenih i nezasićenih

masnih kiselina

Masne kiseline se dele dalje na: ZASIĆENE i NEZASIĆENE (mono- i polinezasićene)

Laurinska kiselina

Oleinska kiselina

Neutralne masti i ulja(trigliceridi).

Neutralni jer nemaju naelektrisanje niti jonizabilnih grupa.

Najzastupljeniji lipidi u prirodi.

Tripalmitin

Prost triacilglicerol

1-stearo-2,3-diolein

Složeni triacilglicerol

1-palmito-2-oleo-3-stearin

Složeni triacilglicerol

Masne kiseline

Nastaju u organizmu

biosintezom acetil-koenzima

A, uzastopnim enzimskim

reakcijama. Kako nastaju od

AcCoA, broj ugljenikovih

atoma u prirodnim masnim

kiselinama je skoro uvek

paran i masne kiseline su

uglavnom linearne.

Laurinska kiselina*

Zasićene i nezasićene masne kiseline

Zasićne masne kiseline:

Tačka topljenja raste sa porastom ugljovodoničnog lanca.

Masna kiselina C atomi Tačka topljenja

Laurinska

Miristinska

Palmitinska

Stearinska

Arahinska

Nezasićene masne kiseline:

Nezasićene masne kiseline imaju cis (Z) konfiguraciju na

dvostrukoj vezi, pa zbog toga dolazi do nepravilnog pakovanja

u lipidima, bez obzira na temperaturu.

Masna kiselina C atomi Tačka

topljenja

Palmitoleinska

Oleinska

Linolna

Linoleinska

Arahidonska

Omega broj*

Cis-Trans masne kiseline

Prirodno masne kiseline imaju cis veze, trans

veze se veštacki stvaraju hidrogenizacijom, pa

molekul može isparavati.

Cis konfiguracija 2-

buten.

Trans konfiguracija 2-

buten.

Visoka energetska barijera izmedju dve konfiguracije,

atomi su različito raspoređeni u prostoru, kao rezultat

imamo dva različita jedinjenja.

Efekat dvostrukih veza

(snižavanja tačke topljenja)

ne javlja se kod trans

izomera. Trans masne

kiseline se ponašaju kao

zasićene masne kiseline, pa

t.t. zavisi od dužine

ugljovodoničnog niza.

oleinska kiselina

oleinska kiselina

*trans-oleinska

kiselina=t.t. 450C

*cis-oleinska

kiselina=t.t. 13-140C

Linoleinska i linolna masna kiselina

mogu se konvertovati i dati

arahidonsku kiselinu.

ESENCIJALNE I NEESENCIJALNE

MASNE KISELINE

Mravlja kiselina

Sirćetna kiselina

Valerijanska kiselina

Butanska kiselina

Propanska kiselina

Ne javljaju se u

lipidima

Kapronska kiselina

Kaprilna kiselina

Kaprinska kiselina

Laurinska kiselina

Palmitinska kis.

Miristinska kiselina

Oleinska kiselina

Stearinska kiselina

Linoleinska kis.

Linolna kiselina

Arahinska kiselina

Arahidonska kis.

Behenska kiselina

Lignocerinksa kis.

Erukinskakiselina

Nervonska kiselina

Broj C atoma

Kapronska kiselina

Broj dvostrukih veza

Pozicija dvostrukih veza

Karboksilne kiselina

Ime

Esencijalne u ljudskoj ishrani

VOSKOVI Estri viših zasićenih monohidroksilnih alkohola i viših masnih kiselina:C16-C34

Karnauba vosak

Značajan udeo primesa ( i do 50%): oksikarboksilne kiseline, alkoholi, ugljovodonici i smolaste

materije.

Najpoznatiji voskovi:

Fosfolipidi su klasa lipida i značajna komponenta svih ćelijskih

membrana.

Dele sa u dve grupe na osnovu alkohola koji ih izgrađuje:

*A-glicerofosfolipidi

*B-sfingofosfolipidi -> SFINGOMIJELINI

voda

Hidrofilna

glava

Hidrofobni

rep

Vanćelijski matriks

Unutrašnjost

ćelije

Hidrofilna glava

Hidrofobni rep

Fosfolipid

Glicerofosfolipidi su fosfolipidi sa glicerolom kao osnovom.

Sfingolipidi su klasa lipida izvedeni iz

alifatičnog amino alkohola sfingozina.

Sfingozin je aminoalkohol dugačak 18

C-atoma, sa nezasićenim

ugljovodoničnim lancem.

Ceramid je zajednička strukturna

jedinica za sve sfingolipide. Sastoje se

od lanca masne kiseline vezanog

amidnom vezom za sfingozin.

Imaju važnu ulogu u prenosu ćelijskih

signala i u ćelijskom prepoznavanju.

Ceramid

Lipoprotein je biohemijski sklop koji se sastoji od lipida i proteina. Primeri takvih molekula su

lipoproteini visoke gustine(HDL) i niske gustine(LDL) koji omogućavaju prenos masti krvnim

sistemom, transmembranski lipoproteini mitohondrija i hloroplasta i bakterijski lipoproteini.

Steroidi - grupa jedinjenja koja sadrže ciklopentanoperhidrofenantrenski prsten.

Lanosterol

Ciklopentanofenantren

perhidro-sve vodonici

Obuhvataju lekove, vitamine, hormone i otrove.

Pojavljuju se slobodni ili kao glikozidi, estri i amidi.

Reakcije za identifikaciju

steroida:

1. Huppert-Salkowski-ova reakcija dokazivanja steroida:

Mesanjem 0,1% hloroformskog rastvora steroida i koncentrovane sumporne kiseline OH grupa na C3 se

dehidratise i dobija se konjugovani sistem dvostrukih veza, koji daje karakteristične bojene reakcije za

steroide. Žuta boja za holesterol, a boja za ergosterol može varirati od narandžaste do crvene.

2 .Libermann-Burchardt-ova reakcija dokazivanja steroida:

Dehidratisani holesterol međusobnim kuplovanjem, daje biholestadien. U prisustvu anhidrida sirćetne

kiseline i sulfonske kiseline, biholestadien se sulfonuje. Krajnji proizvod daje zelenu boju.

3. Whitby-jeva reakcija:

Dehidratacija steroidnog rastvora, i zatim oksidacija.

Fungisterol izolovan iz kvasca

(Saccharomyces cerevisiae).

Steroli ili steroidni alkoholi su jako zastupljeni u živom svetu,

bilo slobodni, bilo u obliku estara.

Podela:

* Zoosteroli

* Fitosteroli

* Mikosteroli

Glikolipidi

Glikolipidi

Glikoglicerolipidi

Glikosfingolipidi

Vitamini A, D, E i K

*Vitamin A-retinol

Holekalciferol (D3)

Ergokalciferol (D2)

Alfa-takoferol

*Vitamin E

Vitamin K1

Vitamin K2

Sada ćemo se malo podsetiti terpena...

Reakcije lipida

Hidroliza:

Masti i ulja se hidrolizom razlažu na

glicerol i dugolančane masne

kiseline.

Hidroliza može biti katalizovana

enzimima (isključivo način kada se

radi o živim sistemima), kiselinama

ili bazama. Baznom hidrolizom

dobijaju se soli masnih kiselina-

sapuni i glicerol.

Adicija halogena na dvostruke veze:

Dvostruke veze se dokazuju adicijom broma ili

joda iz njihovog rastvora. Dobijaju se dihalogeni

derivati.

Akroleinska reakcija:

Dehidratacijom glicerola (slobodnog ili u

lipidima) nastaje nezasićeni aldehid

akrolein, karakterističnog “oštrog mirisa”.

Reakcije karboksilne grupe:

Funkcionalni derivati karboksilnih kiselina:

Biodizel:

Tečno gorivo proizvedeno iz biljnih ulja, ili iz korišćenih masti i ulja. Proizvodi se od ulja koje se dobija od

suncokreta, soje ili uljane repice pomocu metanola i katalizatora. Po hemijskom sastavu je mešavina metil

estara masnih kiselina. Nižeg je energetskog sadržaja.

http://www.lipidmaps.org/

1. Masnih kiselina

2. Triacilglicerola

3. Fosfolipida

4. Sfingolipida

5. Holesterola (terpeni)

Biosinteza:

1. Biosinteza masnih kiselina

FAS I (fatty acid synthase - sintetaza masnih

kiselina) Enoil-ACP-

reduktaza

Β-Ketoacil-

ACP-reduktaza

Β-Hidroksiacil-ACP

dehidrataza

Β-Ketoacil-ACP

sintetaza

Malonil/acetil-CoA-

ACP transferaza

Dodavanje acetil- i malonil- grupe

Enoil-ACP-

reduktaza Β-Ketoacil-ACP-

reduktaza

Β-Hidroksiacil-

ACP dehidrataza

Β-Ketoacil-

ACP sintetaza

Malonil/acetil-

CoA-ACP

transferaza

Acetil CoA

Malonil CoA

Acetil- i malonil-

grupe vezane za

FAS kompleks

Kondenzacija

Malonil CoA

Acetil- i malonil- grupe

vezane za FAS

kompleks

1. Kondenzacija

Β-ketobutiril-ACP

Redukcija β-keto grupe (KR)

Β-ketobutiril-ACP

2. Redukcija β-

keto grupe (KR)

β-hidroksibutiril-ACP

Dehidratacija (DH)

β-hidroksibutiril-ACP

3. Dehidratacija

(DH)

trans- Δ2-butenoil-ACP

Redukcija dvostruke veze (ER)

trans- Δ2-butenoil-ACP

4. Redukcija

dvostruke

veze (ER)

Butiril-ACP

Premeštanje butanoil- grupe na Cys ostatak

β-ketoacil-ACP sintetaze

Butiril-ACP

5. Premeštanje

butanoil- grupe na

Cys ostatak β-

ketoacil-ACP sintetaze

Ponavljanje ciklusa dodavanjem još jedne

malonil- grupe na ACP

6. Dodavanje još

jedne malonil-

grupe na ACP

(MAT)

Putevi sinteze ostalih masnih kiselina

Palmitat

elongacija

elongacija

elongacija

desaturacija

desaturacija

samo u

biljkama

desaturacija

desaturacija

desaturacija

desaturacija

samo u

biljkama

Palmitoleat

Stearat

Zasićene masne

kiseline dugog

lanca Oleat

Linoleat

Linolenat

Linolenat

Eikozatrieni

Arahidonat Druge polinezasićene

masne kiseline

Dehidrogenizacija zasićenih masnih kiselina

Zasićen acil-

CoA

Nezasićen acil-

CoA

Acil-CoA

desaturaza

Biosinteza prostaglandina

arahidonat

Fosfolipid koji sadrži

arahidonat

Tromboksani Ostali

prostaglandini

2. Biosinteza triacilglicerola - prvi korak

dobijanje fosfatidne kiseline

Glukoza

glikoliza

Dihidroksiaceton

fosfat

Gicerol

L-glicerol-3-fosfat

L-glicerol-3-fosfat

Fosfatidna kiselina

Drugi korak - prevođenje do 1,2-

diacilglicerola

Fosfatidna kiselina

diacilglicerol

Treći korak - prevođenje u triacilglicerol

diacilglicerol

Triacilglicerol

3. Biosinteza fosfolipida

CDP-diacilglicerol

Kardiolipin

Fosfatidilinozitol

Fosfatidilserin

Fosfatidiletanolamin

Fosfatidiletanolamin

Fosfatidilholin

4. Biosinteza sfingolipida - prvi korak je

formiranje sfinganina

Palmitoil-CoA

Β-ketosfinganin

Sfinganin

Serin

Ceramid, sadrži

sfingozin

Cerebrozid

Fosfatidilholin

Diacilglicerol

Sfingomijelin

5. Biosinteza holesterola - podsećanje na

biosintezu terpena

Holesterol

Skvalen

Acetat

Mevalonat

Aktivirani izopren

Žučne kiseline

Karotenoidi

Steroidni

hormoni

Guma

Biljni hormoni:

Abscisinska i

giberelinska

kiselina

Hinonski

elektron

prenosioci:

ubihinon i

plastohinon

Izopren

Holesterol

Lanac fitola u

hlorofilu

Doliholi

Δ3-izopentenil

pirofosfat

Biološka uloga lipida

- Gorivo, hranljive materije

- Gradivna jedinica membrane

- Izolacija

- Specijalne uloge

Gradivna jedinica membrane

-Fosfolipidi

-Glikolipidi

-Holesterol

Gangliozidi

- Identifikovane dve forme:

GM1 i GM2

GM1

GМ2

Holesterol

- Utiče na stabilnost strukture ćelijske membrane i

pokretljivost.

- Lateralno smicanje.

Sadržaj u hrani

- žumance

- iznutrice

- riblja ikra

- punomasno mleko

- meso i mesne prerađevine

vrste namirnice holesterol(mg/100g)

mleko obrano 2

sa 3.6% masti 14

jogurt 13

majonez 105

iznutrice jetra 270

mozak 2000

mesne prerađevine mesni narezak 92

Оdаklе holesterol u bilјkama ?

Biljke imaji drugu vrstu sterola u svom

sastavu, npr. sitostanol.

Ceramid

Jedna od najvažnijih ispitivanih uloga ceramida se odnosi

na njegovu f-ju u apoptozi, ili tipu programirane ćelijske

smrti.

Studije su pokazale da ceramid aktivira apoptoticki put.

Mehanizam kojim ovaj lipid reguliše apoptozu jos uvek

nije jasan.

Takodje, ceramid je jedna od glavnih komponenti

epidermalnog sloja ljudske kože.

Sfingomijelin

Poremećaji usled nedostatka mijelinskog omotača:

- motoričke sposobnosti

- mišićna snaga i tonus

- gubitak sluha

Lecitin

U ćelijskim membranama omogućavaju prolazak hranljivih

materija u ćelije i izbacivanje štetnih.

Takođe, štite ćelije od oksidacije, što se odnosi i na

moždanu opnu.

Koriste ga i mišići i nervi.

Nedostatak lecitina

Digestivni problemi

Povišen krvni pritisak

Problemi sa zglobovima i mišićima

Kefalin

Značajan sastojak nervnog i moždanog tkiva.

Vitamin A

Vitamin D

Vitamin E

Vitamin K

hipovitaminoza

-noćno slepilo

-promene na koži

-smanjena

otpornost

organizma na

infekcije

-promene na

koštanom tkivu

(kod dece

rahitis,kod odraslih

osteoporoza)

-slabost mišića

-smanjen broj

crvenih krvnih

zrnaca

-ataksija

-pogoršanje

imunog odgovora

-pad koncentracije

protrombina u krvi

-poremećaj

koagulacije

hipervitaminoza

-crvenilo

kože,svrab

-akutno trovanje

-oštećuje

jetru,nerve,može

uticati na fetus

-višak beta-

karotena se

akumulira u

epiderm

-poremećaj

metabolizma

kalcijuma

(taloženje u

bubrezima)

-probavne

smetnje,anemija,

depresija

*u velikim

dozama,smatra se

najtoksičnijim

vitaminom

-nema štetnih

nuspojava

-pospešuje već

postojeći deficit

vitamina K

-nije toksičan čak

ni u velikim

dozama

-intravenska

primena može

izazvati probleme

sa

disanjem,kardiovas

kularni kolaps

PROSTAGLANDINI

Oni predstavljaju monociklične hidroksi-masne

kiseline, čiji se skelet sastoji od 20 C atoma. Imaju

izrazito fiziološko dejstvo.

Utiču i na transport vode kroz epitelne membrane.

Postoji više od 20 PG.

Ime prostaglandin

Ime je izvedeno iz žlezdi prostate.

Kada je prostaglandin prvi put izlovan iz

semene tečnosti od strane švedskog

fiziologa Ulf von Eulera, a u isto vreme i od

strane M. V. Goldblatta, verovalo se da je

prostaglandin sastavni deo izlučevina

prostate.

Kasnije se pokazalo da mnoga druga tkiva

izlučuju prostaglandine za različite funkcije.

Glavni medijatori nastali iz fosfolipida su

eikosanoidi ( prostanoidi i leukotrieni ) i faktor

agregacije trombocita ( PAF )

Termin “prostanoidi” obuhvata prostaglandine

(PG ) i tromboksane (TX )

Prostanoidni receptori

-Vezani za G protein-

Označeni su redom kao DP-,FP-,IP-,TP- i

EP- receptori, na osnovu pet klasa prirodnih

prostaglandina PGD2, PGF2alfa, PGI2,

tromboksana A2 i PGE2.

Tip Receptor Funkcija

PGI2 IP vazodilacija

inhibira agregaciju

trombocita

bronhodilatacija

PGE2 EP1 bronhokonstrikciju

kontrakcija glatkih misica GI

trakta

EP2 bronhodilatacija

relaksacija glatkih misica GI

trakta

vazodilatacija

EP3 kontrakcija uterusa

kontrakcija glatkih misica GI

trakta

PGF2alfa FP kontrakcija uterusa

bronhodilatacija

Prostaglandin E2 (PGE2)

-poznat u medicini kao dinoproston

-ima važnu ulogu pri porođaju

-prostaglandin koji indukuje groznicu

Tromboksan je

vazokonstriktor.On

posreduje u agregaciji

trombocita.

Prostaciklin (PGI2) sprečava formiranje

ugrušaka u toku hemostaze.

PGH2

Učestvuje u procesu

kontrakcije/relaksacije glatkih

mišića.

Luči se kod sisara, proizvodi se u materici kada je povišen nivo oksitocina, zaustavlja

proizvodnju progesterona, moze da podstakne razvoj trudnoće, ali i da je spreči.

Prostaglandin F2alfa

U većim količinama se sintetiše u mastocitima

u mozgu.

Sintetisani su u ćeliji iz arahidonske

kiseline,5-lipoksigenazom.

Primeri leukotriena su : LTA4, LTB4, LTC4,

LTD4, LTE4 i LTF4.

LTB4 je vazan medijator u svim tipovima

zapaljenja. Cisteinil-leukotrieni su posebno

značajni u astmi.

Leukotrieni

Izolovanje lipida

Izolovanje i frakcionisanje lipida se zasniva na različitoj rastvorljivosti lipida.

Univerzalni rastvarač za lipide je smjesa hloroform-metanol

Opšti postupci ekstrakcije lipida

Efikasnost postupka zavisi od hemijske prirode lipidnih komponenti i od asocijacija u kojima lipidi

učestvuju.

1. Van der Waals-ove (hidrofobne) asocijacije - adipozno tkivo

2. Vodonična vezivanja, elektrostatičke i hidrofobne asocijacije - ćelijska membrana

3. Kovalentne asocijacije - povezuju masne kiseline u estre sa polisaharidima bak. ćelijskih zidova

Opreznost u radu sa lipidima

Sprečavanje oksidovanja dvostrukih veza- svježe predestilovani rastvarači, dezaerisani rastvarači

Biljni materijal- sprečavanje enzimske degradacije lipida- alkoholne smjese

Alkohol povećava polarnost smjese što olakšava ekstrakciju polarnih molekula

Najpogodnija smjesa rastvarača je hloroform/metanol/voda (5/10/4, zapreminski)

Čuvanje lipidnog ekstrakta

Lipidi su nestabilni prema (peroksidnoj) oksidaciji i hidrolizi.

Najbolji rezultati se dobijaju korišćenjem svježeg lipidnog ekstrakta

Nekoliko nedjelja čuvanja- rastvoriti u smjesi hloroform/ metanol (2:1, zapreminski)

Kada se materijal čuva duže dodaju mu se antioksidansi (npr. BHT) i čuva na niskim temeraturama

Izolovanje lipida iz bioloških materijala

Izolovanje lipida iz jetre Ukupni lipidi mikroorganizama

metanol/ hloroform (2/1, v/v) metanol/hloroform/voda (2/1/0,8)

homogenizovanje

centrifugiranje

metanol/hloroform/voda (2/1/0,8)

Grubo frakcionisanje lipida po grupama

Silika gel u staklenoj koloni (oko 1g), nanese se 30mg lipida

Eluira se sa hloroformom ili dietil etrom , dobija se frakcija prostih lipida,

Acetonom , dobija se glikolipidna frakcija (nekad se izostavlja) i

Metanolom dobija se frakcija fosfolipida.

Acetonska precipitacija

Razdvajanje fosfatida od neutralnih lipida.

Metoda se zasniva na nerastvorljivosti većine fosfatida u hladnom acetonu, a istovremenoj

rastvorljivosti neutralnih lipida

U talogu: fosfatidi i tragovi neutralnih lipida

Frakcija rastvorna u acetonu: neutralni lipidi- gliceridi, steroli, ugljovodonici, pigmenti i tragovi

fosfatida

Particija u nemješljivim rastvaračima

Lipidi bogati gliceridima ili karotenoidima i hlorofilnim pigmentima

Smjesa lipida se raspodjeljuje u dva nemješljiva sistema rastvarača

Sistemi rastvarača koji se koriste: petroletar-85%etanol (1:1, v/v), ugljen-tetrahlorid/metanol/voda

(62/35/4, v/v/v), heksan/95% metanol (1:1, v/v)

Razdvajanje lipida na klase TLC-om

Razdvajanje lipida na klase hromatografijom na tankom sloju (TLC) silikagela

Ploče prevučene silika gelom

Eluent: heksan/dietiletar/mravlja kiselina (80:80:2, v/v)

Detekcija parama joda ili razblaženom sumpornom kiselinom

Razdvajanje TAG na RP TLC-u

klasa TAG vrsta TAG podeoni broj proporcija vode

zapreminski

S2M PPO, PStO, StStO 48, 50, 52 12

SM2 POO, StOO 48,50 14

S2D PPL, PStL, StStL 46, 48, 50 12

SMD POL, StOL 46, 48 18

SD2 PLL, StLL 44, 46 20

SMT POLn, StOLN, 44, 46 16

SDT PLLn, StLLn, ALLn 42,44,46 18

Razdvajanje TAG na RP TLC-u

S (saturated)- zasićena masna kiselina

M (monoenoic)- mononezasićena masna kiselina

D (dienoic)- dinezasićena masna kiselina

T (trienoic)- trinezasićena masna kiselina

P-palmitinska m.k.; St- stearinska m.k.; A - arahidonska m.k.; O- oleinska m.k.; L- linolna m.k. Ln-

linolenska m.k.

Ploče presvučene CaSO4

Mobilna faza: aceton/ acetonitril/voda, 70:30:X, X- voda

Podeoni broj = broj C atoma - (2xbroj dvostrukih veza)

Gasna hromatografija

Gasna hromatografija je mnogo brža od tečne hromatografije, separaciono vrijeme mjeri se obično

u sekundama.

koristi se za razdvajanje malih i srednje velikih prirodnih proizvoda- masne kiseline , etarska ulja,

steroida, ne koristi se za velike molekule- neki steroidi

Ograničenje- rastvori uzorka moraju biti isparljivi

Visoke temperature i do 300oC poboljšavaju isparljivost, ali mogu da dovedu do raspadanja

supstance

Neisparljive supstance se prevode u isparljive derivate npr. masne kiseline se prevode u isparljive

metil-estre

Razdvajanje lipida na klase GC-om

Mobilna faza u GC: vodonik ili helijum

Vodonik je eksplozivan, helijum je stabilniji, daje odlične rezultate, ali je poprilično skup

Upotrebom azota (sa manje od 5ppm kiseonika), zadovoljavajuća rezolucija pri standardnom

protoku sistema

Argon je skuplji od azota, ali ga je moguće nabaviti sa jako malim udelom kiseonika, što omogućava

analizu jako osjetljivih smjesa

Gasni hromatogram

ukupnih lipida

Razdvajanje lipida na klase HPLC-om

Reverzno-faznom HPLC na oktadecilsililnoj koloni (C-18) odvajaju se smjese slobodnih masnih

kiselina ili metil estara masnih kiselina iz fosfolipida u membranama ćelija sisara.

Eluiranje: smesa voda/acetonitril ili voda/metanol

Za odvajanje slobodnih masnih kiselina koristi se rastvor fosforne kiseline

Redosled eluiranja masnih kiselina u smjesama zavisi od koncentracije acetonitrila. Podešavanjem

polarnosti rastvarača, moguće je odvojiti bilo koju masnu kiselinu od važnosti iz smjese, ali i

razdvojiti njene strukturne i geometrijske izomere.

Razdvajanje lipida na klase HPLC-om

-Priprema slobodnih masnih kiselina i metil estara

Alkalnom ili kiselom hidrolizom

Alkalna hidroliza: miješanje uzoraka sa 1ml 0.5M NaOH u rastvoru metanol/voda (90:10), preko noći

pod N2. Zakišeljavanje, ekstrakcija sa 2 porcije 3ml heksana. Dvostruko ispiranje heksanske faze

vodom, uparavanje pod N2. Slobodne masne kiseline se drže u heksanu i rastvaraju u metanolu

neposredno prije ubrizgavanja u uređaj za HPLC.

Kisela hidroliza: 0.5M HCl u rastvoru acetonitril/voda (9:1) na 100°C, 45 minuta

Razdvajanje lipida na klase HPLC-om

-HPLC masnih kiselina i metil estara

Masne kiseline: ubrizgaju se u dve serijski povezane kolone. U prvoj koloni se eluiraju 60 minuta

70% acetonitrilom, i zatim 83% acetonitrilom tokom 4 minuta. Brzina protoka je 1mL/min. U drugoj

se eluira 58% acetonitrilom, u 50. minutu 61% acetonitrilom tokom 2 minuta, i u 90. minutu 83%

acetonitrilom tokom 2 minuta. Brzina protoka je 2mL/min

Metil-estri: razdvajanje smesom acetonitrila i vode. U kolonu se ubrizgava po 20μl uzorka,

temperatura kolone iznosi 35°C, eluiraju se 70% acetonitrilom.Unutrašnji standard je 50nmol

metil-trans-vakcenska kiselina (18C, 1 dvostruka veza) Nakon njegovog eluiranja, povećava se

koncentracija acetonitrila na 100% tokom 20 minuta.

Razdvajanje lipida na klase HPLC-om

-Fosfolipidi iz jetre pacova

Grubo frakcionisanje na silika gelu:

Fosfatidilholin (PC), fosfatidiletanolamin (PE), fosfatidilinositol (PI) i fosfatidilserin (PS)

Hromatografija na C18 reverzno-faznoj koloni za određivanje pojedinačnih molekulskih vrsta. Iz

svakog od navedenih fosfolipida, moguće je odrediti 30-35 različitih molekulskih vrsta i izvršiti

njihovu kvantifikaciju.

Ekstrakcija, ispiranje, sušenje pod N2, ponovno rastvaranje u sistemu heksan-2-propanol-voda

(40:54:6) za HPLC fosfolipida. Određivanje na talasnoj dužini od 205 nm. Ekstrakt lipida se deli u

klase fosfolipida hromatografijom na Si-100 silika gelu.

Rastvarač za eluiranje: heksan/2-propanol/25 mM fosfatni pufer/etanol/sirćetna kiselina

(367:490:62:100:0.6).

Razdvajanje lipida na klase HPLC-om

HPLC fosfolipida:

PC, PE i PI: eluirani sa 20 mM holin-hloridom u rastvoru metanol/voda/acetonitril (90.5:7:2.5),protok

od 2.0mL/min.

PS: eluiran sa 30 mM holin-hloridom u rastvoru metanol/25 mM KH2PO4/acetonitril/sirćetna kiselina

(90.5:7:2.5:0.8 ), isti protok. PC i PE se dodaju na kolonu u 50-100 μl etanola, i PI i PS u 10-20 μL

hloroforma. Frakcije se suše pod N2 i ponovo ekstrahuju.

HPLC slobodnih masnih kiselina

Kolona SUPERCOSIL LC 25x4,6 mm, mobilna faza

tetrohodrofuran/ acetonitril/ 0,1% H3PO4

(21,6:50,4:28), temperatura: 350C, detekcija 220 nm,

koncentracija uzorka 1-2 mg/mL

18:3 (cis) linolenskaa kiselina, 16:1 (cis) palmitoleinska

kiselina, 16:1(trans) palmitoleinska kiselina, 18:2 (cis)

linolna kiselina, 18:2 (trans) linoelaidinska kiselina,

18:0 stearinska kiselina, 18:1 (cis) oleinska,18:1

(trans) elaidinska kiselina

Razdvajanje lipida na klase HPLC-om

Detekcija i kvantifikacija nezasićenih jedinjenja:

Na talasnoj dužini od 192 nm

Detekcija i kvantifikacija zasićenih jedinjenja:

Na talasnoj dužini od 250 nm

Masena spektrometrija

Tehnika kojom se analiziraju molekuli na temelju njihove mase i naelektrisanja.

Jonizacija molekula u jonizatoru.

Nastali joni se provode kroz analizator koji razdvaja jone u prostoru (i vremenu)

Iz jonizatora joni idu na detektor, gdje proizvode električni signal koji se može registrovati na

računaru.

Koristi se za ustanovljavanje nedvosmislene dužine ugljovodoničnog lanca ili pozicije dvostruke

veze.