View
7
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti
LC-NMR 1
Jan Sýkora
LC/NMR
Jan Sýkora (ÚCHP AV ČR)
Dimethylcyklosiloxany(D3,D4,D5)
C18, 100% ACN, Vinj = 20ul, at = 1s, nt = 4, d1 = 0s, pad = 1s
On-flow Stop-flow
mez detekce 1 mg/ml 0.01 mg/ml
nástřik 20 µl 20 µg0,1 µmol
200 ng0.001 µmol
průtok* 0,5 ml/min -
NMR parametry
at = 1snt = 4
rel = 0 s
at =2 snt = 4 - 1000
rel = 1 s
pseudo 2D NMR spektrum „On-flow“ módu a jeho vrstevnicová projekce
1H NMR (500 MHz)
mez detekce ~ 1 mg/ml(5 µmol látky)
NMR parametrydoba měření (at) ~ 2 spočet skenů (nt) ~ 4 - 1000 relaxační prodleva (rel) ~ 1 s
LC - NMR
LC – MS
mez detekce ~ ng - pg
nástřik 1-2 µl
průtok 0,4 - 1 ml/min*
*solventy bez jakýchkoli organických látek
*solventy bez anorganických solí
NMR spektroskopie je založena na měření frekvencí jader atomů. Nejlépe se měří jádra se spinem ½, ty poskytují ve spektru jednu linii(1H-99,9 %, 13C-1 %, 29Si-4 % atd.). Frekvence jádra každého atomu závisí na jeho chemickém okolí a odráží především to, jak je jádro „stíněno“ elektrony ve svém okolí. Frekvence je vztažena k frekvenci standardu a podělena frekvencí spektrometru. Uvádí se jako chemický posun v jednotkách ppm. Případná interakce s okolními jádry se projevuje štěpením signálu na multiplet.
převzato z Bruker Almanach
Cyclohexanefor GC residual analysis (Scharlau)at = 1sd1= 1snt = 64
Acetonitrile for UV Spectroscopy (Fluka)at = 1sd1= 1snt = 4
Methanol CHROMASOLV®
(Sigma-Aldrich)at = 1sd1= 1snt = 32
AcetoneHPLC grade(Sigma-Aldrich)at = 1sd1= 1snt = 4
Stabilizátory & Nečistoty v rozpouštědlech
Analýza extraktu kopřivy dvoudomé80% HPLC Acetonitrilu v CDCl3
*
sitosterol
HPLC rozpouštědla s chemicky i magneticky ekvivalentními vodíkovými atomy poskytují v 1H NMR spektru pouze 1 signál.1 signál rozpouštědla je pro LC-NMR nejvýhodnější, blokuje pouze úzkou část NMR spektra. Rozpouštědla nemusí býtnutně deuterovaná jako u klasického NMR. Důležitáje čistota, jakékoli další látky obsahující vodíkovéatomy blokují další oblasti a znemožňují detekciv danéčásti spektra.
Z hlediska čistoty jsou v současné doběk dispozici pouze tři rozpouštědla v čistotě vhodné pro LC-NMR...
D2O (99,9% D) ~ 10.000,- Kč / lCDCl3 (99,5% D) ~ 3.000,- Kč / lCH3CN ~ 3.000,- Kč / l
tabulka převzata z katalogu firmy Phenomenex
Potlačení signálu rozpouštědlaSignály rozpouštědel jsme v
současné době schopni efektivně potlačovat.
Poloautomatický software je schopen potlačit až 7 signálů.
Po potlačení dále následuje digitální filtrace dané
frekvence. Citlivost se tak posunuje až o několik řádů.
Většina signálůměřených látek je dokonce méně intenzivní nežjsou signály uhlíkových satelitů
obklopujících signál rozpoutědla (0.5% celkového
signálu, dáno 1% výskytem izotopu 13C), proto je často
nutné zapojit dodatečný decoupling těchto signálů. V
normálních 1H NMR spektrech tyto signály většinou kvůli
vysoké koncentraci měřenélátky často nevidíme nebo
nevnímáme.
V případě gradientové eluce je třeba nastavit potlačení signálů
rozpouštědel před každou akumulací 4 skenů. Jak se mění
poměry rozpouštědel, mění se v mnoha případech i poloha
jejich signálů. Každé spektrum potom pořídíme během 15-ti sekund. U isokratické eluce
stačí nastavit potlačení jednou na začátku měření. Spektra pak
snímáme každých 5 sekund.
H2O - THF
chininMw=324.4 1.5 umol … 0.5 mg
Stop-flow experiment
SpinasterolC29H48O1
c = 6 mg/mlNástřik 0,1 mg
(20 ul)
nt = 128t ~ 7 minut
nt = 16ni = 256
t ~ 1,5hod.
nt = 200ni = 128
t ~ 15hod.
COSY
HSQC
nt = 1000t ~ 1 h.
Peak 1
Peak 2
Peak 3
COSY ~ 24 h. HSQC ~ ∞∞∞∞
ClNH
MeMe
Me
MeCl
ClNH
MeMe
Me
Sibutramine hydrochlorideSibutramine desmethyle
Sibutramine hydrochloride in CDCl3
Sibutramine in CDCl3
Sibutramine desmethyle in D2O-CH3CN
Sibutramine desmethyle hydrochloride in D2O-CH3CN
7 6 5 4 3 2 ppm1
Impurity in Sibutramine sampleStop-flow mode, nt = 1000
-NCH3
Největší uplatnění nachází LC-NMR ve výzkumu farmaceutických firem.Nejčastěji se využívá k identifikaci nečistot doprovázejících aktivní látku.
Určení nečistoty v generiku známého anorektika:Výsledky měření LC-MS naznačovaly, že nečistota bude pravděpodobnědesmethylovaná. Na HPLC se však desmethyl sibutramin eluuje jasněprvní, jak se ukázalo na vzorku standardu. Pomocí LC-NMR bylo změřenoprotonové spektrum nečistoty. Vzorek byl bohužel příliš zředěný, takžebyla část signálů překryta a špatný poměr signálu k šumu znemožňovalintegraci a měření 2D spekter (korelace vodíku s uhlíkem). Jedná se nic-méně o autentické NMR spektrum látky při dané separaci s charakteristi-ckým posunem –NCH3 skupiny. Po dodání standardu sibutramine desmethylu bylo naměřeno identické spektrum během simulace podmínekseparace (poměry rozpouštedel a koncentrace pufru) po přidání HCl.Sibutramin desmethyl byl tedy ve vzorku přítomen jako hydrochlorid..
LC-NMR farmak
GPC-NMR
start 12 min
100% CDCl3inj. 50 µl
Extrakce superkritickým CO2Extrakce superkritickým CO2 je velmi účinný zdroj nepolárních přírodních látek z různých částí rostlin. Extrakty neobsahují žádná rozpouštědla ani další příměsi. CO2 se uvolňuje při závěrečné expanzi na výstupu z extraktoru. Obsah přítomných látek se stanovuje pomocí HPLC nebo GC-MS.Identifikace závisí na počtu standardů a rozsahu knihovny MS spekter. Pro identifikaci neurčených látek (obsah kolem 5%)nastupuje LC-NMR.Příklad dominantní látky v extraktu routy vonné(obsah kolem 20%, m/z= 356). Pro předseparaci byla použita gelová kolona 100% CDCl3 (separace se dá provádět v libovolném rozpouštědle). Z 1H NMR a 2D NMR spektrer se podařilo poskládat hlavní fragmenty molekuly. Tyto fragmenty v kombinaci s kumarinovým skeletem a znalostí celkové hmoty poskytly strukturu rutamarinu; hlavní složky routy vonné(ruta graveolens) s terapeutickými účinky podobnými papaverinu.
5 x CH3 skupin
1,2 3
4 5
6
7,8
9
4 5 6
CHCl3
7,81,2,9
rutamarin
3
Recommended