View
41
Download
1
Category
Preview:
DESCRIPTION
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka. Laboratory jne metod y wykrywania w irus ów i ich przydatność w monitoringu terenowym. Dr.rer.nat.et med.habil. Hans-Christoph Selinka, - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
Laboratoryjne metody wykrywania wirusów i ich
przydatność w monitoringu terenowym
Dr.rer.nat.et med.habil. Hans-Christoph Selinka, Dr.rer.nat.et med.habil. Hans-Christoph Selinka,
FederalFederalna Agencja Środowiska,na Agencja Środowiska, Berlin, Berlin, Niemcy Niemcy
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
Drogi przenoszenia patogenów związanych ze środowiskiem wodnym
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
WHO 2004, Guidelines for Drinking Water Quality
ADENOVIRUSADENOVIRUS
NOROVIRUSNOROVIRUS
ROTAVIRUSROTAVIRUS
Spożycie (z płynami)
Wdychanie i aspiracja (z aerozolami)
Kontakt (podczas mycia)
Droga zakażenia (może wystąpić sepsa oraz zakażenie ogólne)
Żołądkowo-jelitowa Oddechowa
Skórna (szczególnie przy otarciach), przez błony śluzowe, rany, oczy
Bakterie Campylobacter spp. E. coli Salmonella spp. Shigella spp Vibrio cholerae Yersinia spp.
Wirusy Adenovirusy Astrowirusy Enterowirusy wirus WZW A wirus WZW E Norowirusy Rotawirusy Sapowirusy
Pierwotniaki i robaki jelit Cryptosporidium parvum Dracunculus medinensis Etamoeba histolytica Giardia intestinalis Toxoplasma gondii
Legionella pneumophila Mykobakteria (niegruźlicze) Naegleria fowleri Zakażenia Szereg innych czynników w warunkach szczególnego narażenia
Acanthamoeba spp. Aeromonas spp. Burkholderia pseudaomallei Mykobakterie (niegruźlicze) Leptospira spp.* Pseudomonas aeruginosa Schistosoma mansoni*
ADENOADENOWWIRUSIRUS
NORONOROWWIRUSIRUS
ROTAROTAWWIRUSIRUS
Ocena ryzyka
*Podstawy naukowe
Zarządzanie ryzykiem
*Zgodnie z polityką
Komunikowanie ryzyka *Interaktywna wymiana informacji i opinii w zakresie ryzyka
Źródło:Źródło: WHO Food Safety WHO Food Safety
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
Struktura ramowa analizy ryzyka
odpowiednie metody
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
Dzisiaj nie będę mówić o…
Liczba kolonii DIN EN ISO 6222E. coli DIN EN ISO 9308-1 DIN EN ISO 9308-3
DIN EN ISO 9308-1 Enterococci DIN EN ISO 7899-2 DIN EN ISO 7899-1 DIN EN ISO 7899-2Pseudomonas DIN EN 12780aeruginosa
Parametr Dyr. UE dot. wody pitnej Dyr. UE dot. wody w kąpieliskach
... ale raczej o:
starych – ale reaktywowanych i w międzyczasie wystandaryzowanych – oraz nowych obiecujących metodach stosowanych w mikrobiologii wody i molekularnej wirusologii
(wzbogacaniu i oczyszczaniu wirusów z próbek wody, badaniu zakaźności bakteriofagów i wirusów, lub metodach wykrywania wirusów w oparciu o PCR…)
- badania liczebności i zakaźności bakteriofagów
DNA i RNA
- pobieranie próbek wody do analizy wirusów
- oczyszczanie wirusów z próbek wody przy użyciu
filtra z włókna szklanego
- ekstrakcja kwasu nukleinowego do analizy genomu wirusa
- rola inhibitorów środowiskowych
- wykrywanie wirusów metodami PCR
- badanie zakaźności wirusów w kulturze komórkowej
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
Phage MS2
Wykrywanie i oznaczanie liczebności bakteriofagów
Fagi somatyczne DIN EN ISO 10705-2:2001
Fagi F+RNA DIN EN ISO 10705-1:2001
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
Fagi F+RNAF-Pilus
Fagi somatyczne
Bacterium Bacterium
Fagi B. fragilis DIN EN ISO 10705-4:2001
F+
Wykrywanie bakteriofagów testem łysinkowym
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
Oznaczanie liczebności bakteriofagów w próbkach wody
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Fagi F+RNA Fagi somatyczne
DIN 10705-1 10705-02-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Szczep Salmonella thyphim. E.Coli/CN żywicielski: ( WG49; NCTC 12484 ) lub ( WG5; ATCC 700078 ) E.coli K-12 Hfr ( ATCC 23631 )
Dolny agar: Tryptone-Yeast-Glucose Agar Modif. Scholten‘s Agar (TYGA) ( MSA )Górny agar: ssTYGA (0,8% agar) ssMSA (0,8% agar)
Kwas nalidyksowy: 100 µg/ml 250 µg/ml
Granica wykrywalności: 1 pfu/50 ml 1 pfu/50 ml
Fag wzorcowy: MS2 PhiX174-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
MS2
Fag138
PhiX174
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
PRD1
Morfologia płytek bakteriofagów
Próbki uzyskane z brudnych wód powierzchniowych:
zaleca się dodanie kwasu nalidyksowego, aby zapobiec wzrostowi innych bakterii
Morfologia płytek bakteriofagów
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
C.Fuchs
Badanie bakteriofaga – karta testu jakościowego
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
„Karta przewodnia” Kolifag somatyczny PhiX 174 Ar + Bri
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
20
.4.0
8
10
.5.0
8
30
.5.0
8
19
.6.0
8
9.7
.08
29
.7.0
8
18
.8.0
8
7.9
.08
27
.9.0
8
17
.10
.08
6.1
1.0
8
26
.11
.08
16
.12
.08
Data
pfu
/ m
l
x-3s x-2s x x+2s x+3s
Kontrolna seria z wzorcowym fagiem w tych badaniach jest na poziomie 45 pfu/ml
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
Monitorowanie wirusów – pobieranie prób
Związki chemiczne
Wirusy
Rozkład statystyczny
Skupiska!
Próbobranie
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
Ogólny zarys wykrywania wirusów w wodzie surowej
próbka
wody surowej
100 µl oczyszczonych kwasów nukleinowych wirusów
Próbka 10 ml odpowiednia dla biologii molekularnej i wirusologii
( DNA / RNA )
Infectivity assays
Wykrywanie wirusa metodą PCR
10-litrowa próba wody
1. Pobieranie prób wody o dużej objętości 2. Zmniejszenie objętości próbek (1:1000)3. Ekstrakcja kwasów nukleinowych wirusów 4. Testy wykrywające wirusy
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
Klasyczne metody wzbogacania wirusów w próbkach wody
Cechy wirusa Metody
Polarność powierzchniowa
kapsydu Adsorpcja / Wymywanie
Rozmiar cząsteczki Filtracja membranowa (Ultrafiltracja)
Gęstość Ultrawirowanie
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
Koncentracja wirusów przy użyciu filtrów z włókna szklanego
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
W terenie…
Włókno szklane – badania polowe dużych objętości
Próba wody: 10 litrów 1000 litrów
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
Oczyszczanie bakteryjnych kwasów nukleinowych (DNA/RNA) z próbek pobranych ze środowiska
liza etapy mycia elucja
kroki powtarzane 5 razy
Próbka 5ml
Bufor do lizy
Krzemionka
2x 50 µl Bufor do elucji
5 min 60°,1400 rpm
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
Oczyszczanie DNA i RNA
Budowa bakteriofagów i wirusów chorobotwórczych dla ludzi
Zdjęcia: dzięki uprzejmości J.Y. Scro
Wirus DNA
Wirus RNA
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
5’---CTCAGCGTTACCAT---3’3’---GAGTCGCAATGGTA---5’
5’---CUCAGCGUUACCAU---3’
N---Leu-Ser-Val-Thr---C
DNA
RNA
BIAŁKO
Transkrypcja
Translacja
DNA RNA Białko
Amplifikacja informacji genetycznej wirusów
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
Odwrotna transkrypcja
Wykrywanie wirusów metodami PCR
konwencjonalne PCR(jakościowe)
PCR czasu rzeczywistego
(ilościowe)
DNA / RNA
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
Amplifikacja informacji genetycznej wirusów poprzez polimerazową reakcję łańcuchową (PCR)
Wirusy DNA Wirusy RNA
PCR RT-PCR
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
NOROWIRUS(nested RT-PCR)
ADENOWIRUS(nested PCR)
WZW A WIRUS
(nested RT-PCR)(Mediagnost R)
Nested (RT)-PCR
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
Real-Time TaqManTM PCR
- Potrzebne są tylko: (1) matryca (próbka DNA)
(2) nieoznaczona para dla starterów
(3) specyficzna sonda w obrębie amplikonu oznakowana
2 fluorochromami (np. reporter FAM i wygaszacz TAMRA)
(4) Mastermix (koktail odczynników)
Łączy amplifikację docelowego DNA z ilościową detekcją amplikonów w tym samym naczyniu
Adenowirus 41 wzorzec
102 - 106 kopii
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
1. 5 µl próbka 2. 5 µl próbka + Ad Wzorzec 3. 10 µl próbka 4. 10 µl próbka 1:10
Testy / próbki:
Real-time PCR
Na amplifikację kwasów
nukleinowych z próbek pobranych
ze środowiska często negatywnie
wpływa obecność inhibitorów.
Dlatego zaleca się badanie próbek wzbogaconych
• Komórki A549 potraktowane próbkami wody z pozytywnym wynikiem testu Real-time PCR na obecność adenowirusa
• zakażone komórki wykazują efekty cytopatyczne (CPE) po 2-14 dniach
• następnie próbki poddaje się kolejnemu badaniu PCR „Integrated Cell Culture PCR“ (ICC-PCR)
Badanie zakaźności adenowirusa
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
(A. Heim)
Metody wykrywania wirusa
O zwiększonej czułości
Wykrywa żywe wirus nie nadające się do hodowli
Wykrywa jedynie żywe organizmy
Wykrywa zakaźnego wirusa
Skraca czas wykrywania
ICC-PCRRT-PCRHodowla komórkowa
Metoda wykrywania
Odporna na wpływ substancji hamujących PCR
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
a) Test TCID50 b) Test łysinkowy
Badanie zakaźności enterowirusa
kontrolna CVB3
Potwierdzenie obecności zakaźnych wirusów przez wyliczenie jednostek tworzących łysinki (pfu/ml) na komórkach HeLa. Charakterystyka wariantów wirusa Coxcakie B3 (CVB3) na wybranych liniach komórkowych
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
Podstawowe techniki monitorowania wirusów
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
Techniki zaawansowane:
- wydajna metoda koncentracji wirusów
- skuteczna technika ekstrakcji DNA/RNA
- systemy PCR dopasowane do wirusów
( PCR, nPCR, RT-PCR, nRT-PCR, Real-time PCR )
- systemy hodowli komórkowych do badania
zakaźności
- Multiplex PCR; ICC-PCR, technologia mikroczipowa
EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka
Dziękuję Państwu!
Recommended