KSA gene regulation - si. · PDF fileKSA: REGULATION OF GENE EXPRESSIONKSA: REGULATION OF GENE...

KSA: REGULATION OF GENE EXPRESSIONKSA: REGULATION OF GENE EXPRESSION

Assistant Professor Dr. Chatchawan Srisawat

proteindegraded mRNA

Nucleus

cytosol

1. Gene

2. Transcription

3. RNA processing

4. RNA export

5. Translation

6. RNA stability

7. Post-translationalmodifications

-S-S-

active protein

REGULATION OF GENE EXPRESSION

ANIMAL CLONING

The first successful cloned animal using differentiated adult cells (1997)

DOLLYDOLLY

Human cloning

ANIMAL CLONING

ในการ clone Dolly, ใช epithelial cell จาก mammary gland เปน donor nucleus

Dolly Parton

• เหตุใดเซลลที่มี nucleus เชน lymphocyte จึงไมถูกนํามาใชเปน donor nuclei สําหรับการ cloning อธิบาย

ANIMAL CLONING

QUESTIONQUESTION

Gene rearrangement of immunoglobulin gene

ANIMAL CLONING

ANSWERANSWER

* การ rearrangement ของยีน เปนการเปลี่ยนแปลงที่ระดับของ DNA(ตางจากขบวนการ splicing ที่เกิดที่ระดับของ RNA) ดังนั้น เซลลที่มีการ rearrange ยีนแลว โครงสรางของยีนจะไมสามารถกลับไปเหมือนเดิมอยางเชนใน germ cell ไดอีก

* การ rearrangement ของยีน เปนการเปลี่ยนแปลงที่ระดับของ DNA(ตางจากขบวนการ splicing ที่เกิดที่ระดับของ RNA) ดังนั้น เซลลที่มีการ rearrange ยีนแลว โครงสรางของยีนจะไมสามารถกลับไปเหมือนเดิมอยางเชนใน germ cell ไดอีก

ANIMAL CLONING

QUESTIONQUESTION

Dolly ตายเมื่ออายุ 6 ป (normal life-span 12-15 ป)

• cloned animal มักมีอายุขัยที่สั้นกวาปกติ อธิบาย

Telomeres shortening

Donor nuclei from somatic cells

ANIMAL CLONING

ANSWERANSWER

One possible explanation:

Gap

ปลายของ DNA ที่หดสั้นลงทุกครั้งที่มีการ replication

ปลายของ DNA ที่หดสั้นลงทุกครั้งที่มีการ replication

5’ 3’3’ 5’

5’ 3’3’ 5’

3’5’

5’3’

5’3’

3’5’

5’3’

3’5’

5’ 3’3’ 5’

primerprimerprimer

ANIMAL CLONING

ANSWERANSWER

ถาปลายของ DNA (telomere) หดสั้นมากขึ้น อาจจะทําใหสวนที่เปนยีนขาดหายไป

เซลลจะไมสามารถแบงตัวและมีชีวิตอยูได

Aging and cell death

somatic cells: e.g. skin cells (keratinocytes), fibroblasts, etc

ANIMAL CLONING

ANSWERANSWER

ในเซลลสืบพันธุ (germline) จะมีการแสดงออกของเอ็นซัยม telomerase ทําใหรักษาความยาวของ telomere ไวได

Abnormal expression อาจพบไดในเซลลมะเร็ง ทําใหเซลลมะเร็งแบงตัวไดอยางตอเนื่อง

Abnormal expression อาจพบไดในเซลลมะเร็ง ทําใหเซลลมะเร็งแบงตัวไดอยางตอเนื่อง

ANIMAL CLONING

ANSWERANSWER

• animal cloning ยังพบกับปญหาในแงของเทคนิค เนื่องจากพบวา cloned embryo จํานวนมากสวนใหญจะตาย และไมสามารถเจริญไปเปน adult animal อธิบาย

QUESTIONQUESTION

ANIMAL CLONING

myocyte adipocyte neuron

embryonic cells

leukocyte

diffe

rent

iatio

n

Chromatin structureChromatin structure

DNA methylationDNA methylation

reprogrammingreprogramming

Failure of reprogramming -> ทําให cloned embyro ไมสามารถ develop เปน adult animal ได

ANSWERANSWER

ANIMAL CLONING

Gene rearrangementGene rearrangement

proteindegraded mRNA

Nucleus

cytosol

-S-S-

active protein

2. Transcription

REGULATION OF GENE EXPRESSION

1. ควบคุมผานทาง transcription factors

2. ควบคุมผานทางการเปลี่ยนแปลงโครงสรางของ chromatin

3. ควบคุมผานทางการ methylation ของ DNA

REGULATION OF GENE EXPRESSION - TRANSCRIPTIONAL LEVEL

กลไกการควบคุมที่ระดับ transcription มี 3 วิธี คือ

• การควบคุมขบวนการ transcription โดยเฉพาะขั้นตอน transcription initiation ถือวาเปนการควบคุมการแสดงออกของยีนที่สําคัญที่สุดอันหนึ่งในเซลลของมนุษย

• การควบคุมขบวนการ transcription โดยเฉพาะขั้นตอน transcription initiation ถือวาเปนการควบคุมการแสดงออกของยีนที่สําคัญที่สุดอันหนึ่งในเซลลของมนุษย

start site

core promoter(TATA box)

exon1 exon2intronup to 10 kilobases from the start site

upstream downstream

enhancersilencer

สรุป: ขบวนการควบคุมโดย transcription factor

• ยีนหนึ่งๆ อาจจะถูกควบคุมดวย transcription factor ไดหลายชนิด

activator จับกับ DNA สวนที่เปน enhancer

repressor จับกับ DNA สวนที่เปน silencer

transcription

transcription

+

+

+

++

-

RNA polymerase II

REGULATION OF GENE EXPRESSION - TRANSCRIPTIONAL LEVEL

Transcription factors

Chromatinremodeling DNA methylation

activator

repressor

chromatin condensation

chromatin condensation

DNA methylation

DNA methylation

REGULATION OF GENE EXPRESSION - TRANSCRIPTIONAL LEVEL

TRANSCRIPTION REGULATION AND HUMAN DISEASES

ความผิดปกติของการควบคุมขบวนการ transcription อาจเกิดไดหลายรูปแบบที่สามารถนําไปสูการเกิดโรคได เชน

e.g. Rett syndrome

neonatal-onset encephalopathy, mental retardation, autism, and an Angelman-like syndrome.

• Defects of transcription factors

TRANSCRIPTION REGULATION AND HUMAN DISEASES

- Mutation of MECP2 (methylcytosine binding protein 2)

Dysregulation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) expression

ความผิดปกติของการควบคุมขบวนการ transcription อาจเกิดไดหลายรูปแบบที่สามารถนําไปสูการเกิดโรคได เชน

e.g. Rett syndrome

• Defects of transcription factors

TRANSCRIPTION REGULATION AND HUMAN DISEASES

• Mutations of DNA sequences at promoters/transcription elements

e.g. beta-thalassemia

- เปนโรคทางพันธุกรรมที่เกิดจากการสราง βglobin ซึ่งเปนสวนประกอบของ hemoglobin ลดนอยลง หรือไมมีการสรางเลย

Hemoglobin A (α2/β2)

ความผิดปกติของการควบคุมขบวนการ transcription อาจเกิดไดหลายรูปแบบที่สามารถนําไปสูการเกิดโรคได เชน

- Reduced β globin production

1. hemoglobin A (adult type)ลดลง

2. Excess α globin จะตกตะกอนภายใน red blood cell ทําใหเซลลเกิดการแตก ทําลายงาย

เกิดภาวะซีดอยางรุนแรงNormal VS. Beta thalassemia blood smear

TRANSCRIPTION REGULATION AND HUMAN DISEASES

• Mutations of DNA sequences at promoters/transcription elements

e.g. beta-thalassemia

ความผิดปกติของการควบคุมขบวนการ transcription อาจเกิดไดหลายรูปแบบที่สามารถนําไปสูการเกิดโรคได เชน

TRANSCRIPTION REGULATION AND HUMAN DISEASES

• Mutations of DNA sequences at promoters/transcription elements

ความผิดปกติของการควบคุมขบวนการ transcription อาจเกิดไดหลายรูปแบบที่สามารถนําไปสูการเกิดโรคได เชน

e.g. beta-thalassemia

TRANSCRIPTION REGULATION AND HUMAN DISEASES

การเพิ่มการแสดงออกของการเพิ่มการแสดงออกของ γγ globin gene globin gene อาจเปนวิธีหนึง่ในการรักษาอาจเปนวิธีหนึง่ในการรักษา ββ thalassemia thalassemia

Hemoglobin A-Adult type (α2/β2)

Hemoglobin F -Fetal type (α2/γ2)

Applications ของความรูเกี่ยวกับ regulation of gene expression ในการรักษา

TRANSCRIPTION REGULATION AND HUMAN DISEASES

Applications ของความรูเกี่ยวกับ regulation of gene expression ในการรักษา

Reduced β globin production

- hemoglobin A (adult type)ลดลง

- Excess α globin จะตกตะกอนภายใน red blood cell ทําใหเซลลเกิดการแตกทําลายงาย

ภาวะซดีลดลง

Increasedγ globin

production

Increasedγ globin

production

hemoglobin F เพิ่มขึน้มาแทนที่ Hb A

จะไมมี excess α globin เนื่องจากมี γ globin subunit มาใหจับกันเปน hemoglobin F

TRANSCRIPTION REGULATION AND HUMAN DISEASES

• ภายหลังคลอด, expression ของ γ globin gene จะถูกยับยั้งเนื่องจาก

chromatin condensation

DNA methylation

• การรักษาดวยยาบางชนิด สามารถกระตุน expression ของ γ globin gene ได

Applications ของความรูเกี่ยวกับ regulation of gene expression ในการรักษา

Decitabine (DACOGEN®)5-aza-2'-deoxycytidine

• Cytosine analog มีฤทธิ์ยับยั้ง DNA methyl-transferase ทําใหเกิด hypomethylation ของ DNA

BUPHENYL®

Sodium phenylbutyrate

• Butyrate มีฤทธิ์ยับยั้งของ histone deacetylase ทําใหลด condensation ของ chromatin structure

γ globin gene expression.

γ globin gene expression.

TRANSCRIPTION REGULATION AND HUMAN DISEASES

Applications ของความรูเกี่ยวกับ regulation of gene expression ในการรักษา

TRANSCRIPTION REGULATION AND HUMAN DISEASES

- inducible transcription factors โดยจับกับตัวกระตุน (ligand) เชน fatty acid- ควบคุม expression ของยีนตางๆ เชน gene ที่เกี่ยวของกับ lipid metabolism ทําใหมีการเพิ่มของ fatty acid uptake และ storage ใน adipose tissue.

Peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs)

ทําใหภาวะ insulin resistance ที่ทําใหเกิด diabetes ดีขึน้

Applications ของความรูเกี่ยวกับ regulation of gene expression ในการรักษา

TRANSCRIPTION REGULATION AND HUMAN DISEASES

AVANDIA® Rosiglitazone

• Rosiglitazone เปนยาที่พัฒนาใหมีคุณสมบัติเปน strong agonist ของ PPAR-γ

New Antidiabetic Drug

TRANSCRIPTION REGULATION AND HUMAN DISEASES

ความรู เกี่ยวกับกลไกการควบคุมการแสดงออกของยีนในปจจุบัน กําลังไดรับความสนใจศึกษามากขึ้น และจะมีบทบาทสําคัญในการรักษาโรคตางๆในอนาคต

Conclusion

proteindegraded mRNA

Nucleus

cytosol

3. RNA processing

-S-S-

active protein

REGULATION OF GENE EXPRESSION

RNA PROCESSING AND HUMAN DISEASES

exon 1 exon 2 exon 3 exon 4

Activation of cryptic splice sites

Partial deletion of exon, exonskipping, or intron inclusion

Loss of normal splice sites

Malfunctional proteins

Mutations at splice sites or introns

frameshift/ premature stop

no proteins produced

RNA PROCESSING AND HUMAN DISEASES

Mutation ที่กอโรคไมจําเปนตองเกิดใน coding region เสมอไป แตอาจเกิดในบริเวณ regulatory region, intron หรือ splice sites ซึ่งสามารถทําใหเกิด abnormal expression หรือ splicing

Conclusion

TRANSCRIPTION REGULATION AND HUMAN DISEASES

Human diseases

proteindegraded mRNA

Nucleus

cytosol6. RNA stability

-S-S-

active protein

REGULATION OF GENE EXPRESSION

RNA INTERFERENCE

ขบวนการที่ double-stranded RNA (dsRNA) ทําใหเกิดการสลายของ mRNA ทีม่ลีําดับเบสเหมอืมกันกับ dsRNA นั้น

RNA stability control

Andrew Z. Fire and Craig C. Mellofor their discovery of

"RNA interference RNA interference –– gene silencing by doublegene silencing by double--stranded RNAstranded RNA""

RNA INTERFERENCE

DICER

RNase-III ribonuclease family

5’5’3’3’

dsRNA (e.g. from virus)

MECHANISMS OF RNAi

RNA INTERFERENCE

ATP

ADP + Pi

• 21-23 nt small intefering RNAs (siRNAs)

dsRNA

5’5’3’3’

DICER

RNA INTERFERENCE

MECHANISMS OF RNAi

siRNAs

Complex formation with a multicomponentnuclease

RNA-induced silencing complex(RISC)

ATP

ADP + Pi

Active RISC (RISC*)

unwinding of siRNA

RNA INTERFERENCE

MECHANISMS OF RNAi

Active RISC (RISC*)

Target mRNA recognition(mRNA with perfect

complementarity to siRNA)

Target mRNA cleavage

5’ 3’target mRNA

degraded target mRNA by deadenylation-independent pathway

RNA INTERFERENCE

MECHANISMS OF RNAi

BIOLOGICAL FUNCTIONS OF RNAi

• อาจมีประโยชนในการปองกันตัวของเซลลตอไวรัส โดยเฉพาะพวก RNA virus

• ในปจจุบันพบวามี ยีนที่มี final product ที่มี dsRNA เปนสวนประกอบ ซึ่งทําหนาที่ควบคุมการแสดงออกของยีนที่เปน target (ใชกลไก RNA stability)

RNA INTERFERENCE

What makes RNAi technology so promising for medicine?

RNA INTERFERENCE

การคนพบ RNA interference ทําใหมีการตื่นตวัที่จะใชประโยชนจากขบวนการดังกลาว มาใชในวงการแพทย เพื่อยับยั้ง expression ของยีนที่ไมตองการ เชน ยีนที่ทาํใหเกิดมะเร็ง, ยีนของ pathogenic microorganisms ตางๆ

RNA INTERFERENCE

• ในปจจุบัน การศึกษาวิจัยในระดับลึกเกี่ยวกับหนาที่และการทํางานของยีนตางๆ ไดเพิ่มขึน้อยางมาก ทําใหเกิดความเขาใจบทบาทของยีนที่มีสวนในการทําใหเกิดโรคมากตามไปดวย

RNA INTERFERENCE

• หลังจากการศึกษาเกี่ยวกับ human genome ไดเสร็จสมบูรณลง เมื่อราวป 2000 ทําใหนักวิทยาศาสตรและแพทยสามารถทราบเกี่ยวกับลําดับเบสของยีนทุกยีนในมนุษย

RNA INTERFERENCE

• คนหายีนที่เปนเปาหมายสําหรับการรักษา

• นํา siRNA ดงักลาวเขาสูเซลล

• เกิดการยับยั้งการแสดงออกของยีนเปาหมาย รวมทั้งเกิดผลทางการรักษา

โดยอาศัยความรูจาก basic research

• สราง dsRNA (siRNA) ที่มีลําดับเบสที่ตรงกับยีนเปาหมายโดยอาศัยเความรูกียวกับลําดับเบสของยีนนั้นๆจาก genome project

RNA INTERFERENCE IN THERAPEUTICS

RNAi สําหรับการรักษามะเร็ง

control

prostrate cancer cells

ไดรับ siRNA ที่ทําให mRNA ของ antiapoptotic

gene เกิดการทําลาย

RNA INTERFERENCE IN THERAPEUTICS

Gene therapy = การรกัษาโดยการใช gene ซึ่งจะถูกนําเขาไปในเซลลเพื่อแกไขความผิดปกติของยนีที่มีอยูกอน

GENE THERAPY

GENE THERAPY

Retrovirus Adenovirus Adeno-associated virus

GENE THERAPY

GENE THERAPY

First successful case using gene therapy

Severe Combined ImmunoDeficiency (SCID)

• เกิดจากความบกพรองของเอ็นซัยม adenosine deaminase

• ทําใหการทํางานของ T- และ B- lymphocyte บกพรอง

GENE THERAPY

Bubble baby

First successful case using gene therapy

GENE THERAPY

First successful case using genetherapy to treat SCID

First successful case using gene therapy

GENE THERAPY

SUMMARY

Advanced knowledge of gene expression and its regulationAdvanced knowledge of gene expression and its regulation

Great impact on medicineGreat impact on medicine

proteindegraded mRNA

Nucleus

cytosol

1. Gene2. Transcription3. RNA processing4. RNA export5. Translation6. RNA stability

7.Post-translational modifications

-S-S-active protein