View
677
Download
33
Category
Preview:
DESCRIPTION
KROMATOGRAFI KOLOM & KROMATOGRAFI LAPIS TIPISIsolasi Kurkumin dari Kunyit (Curcuma longa L)
Citation preview
Percobaan 4
KROMATOGRAFI KOLOM & KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
Isolasi Kurkumin dari Kunyit (Curcuma longa L)
I. Tujuan
1. Melakukan dan menjelaskan teknik-teknik dasar kromatografi kolom
dan kromatografi lapis tipis
2. Menjelaskan Prinsip dasar kromatografi.
3. Melakukan isolasi campuran senyawa sampai pemurniannya secara
kromatografi kolom
II. Prinsip
Pemisahan dua atau lebih senyawa atau ion berdasarkan kecepatan
migrasinya dengan fasa gerak dan fasa diam.
III. Teori dasar
Kromatografi adalah suatu metode yang digunakan ilmuwan untuk
memisahkan senyawa organik dan anorganik sehingga senyawa tersebut
dapat dianalisis dan dipelajari. Dengan menganalisis senyawa, seorang
ilmuwan dapat mengetahui apa yang membangun senyawa tersebut.
Kromatografi adalah suatu metode fisik yang baik sekali untuk mengamati
dan menyelidiki suatu campuran dan pelarutnya. Kata kromatografi berarti
“tulisan berwarna”, artinya suatu cara seorang kimiawan dapat menguji
campuran zat cair. Ketika mempelajari material zat warna dari tumbuhan,
seorang botanis Rusia menemukan kromatografi pada tahun 1903.
Namanya adalah M.S. Tswett. Kromatografi digunakan oleh berbagai
orang dan disiplin ilmu di dalam berbagai bidang. Sebagian orang
menggunakan kromatografi untuk mengetahui komponen apa saja yang
terdapat dalam suatu zat padat atau zat cair. Metode ini digunakan juga
untuk mengetahui zat-zat yang tak dikenal dalam suatu sampel. Polisi,
FBI, dan agen detektif lainnya menggunakan kromatografi ketika
mengusut suatu kasus criminal. Metode ini digunakan pula untuk menguji
keberadaan kokain dalam urin, alkohol dalam darah, PCB (polychlorinated
benzene) dalam ikan, dan kandungan timbale dalam system perairan.
Metode kromatografi adalah cara pemisahan dua atau lebih senyawa atau
ion berdasarkan pada perbedaan migrasi dan distribusi senyawa atau ion-
ion tersebut di dalam dua fasa yang berbeda. Dua fasa ini bisa berwujud
padat-cair, cair-cair, atau gas-cair. Zat terlarut di dalam suatu fasa gerak
mengalir pada suatu fasa diam. Zat terlarut yang memiliki afinitas terhadap
fasa gerak yang lebih besar akan tertahan lebih lama pada fasa gerak,
sedangkan zat terlarut yang afinitasnya terhadap fasa gerak lebih kecil
akan tertahan lebih lama pada fasa diam. Dengan demikian senyawa-
senyawa dapat dipisahkan komponen demi komponen akibat perbedaan
migrasi di dalam fasa gerak dan fasa diam. Dalam semua metode
kromatografi terdapat fasa gerak dan fasa diam. Fasa diam adalah fasa
yang tidak bergerak, sedangkan fasa gerak adalah fasa yang bergerak
melalui fasa diam dan membawa komponen-komponen senyawa yang
akan dipisahkan. Pada posisi yang berbeda-beda, senyawa-senyawa yang
berbeda akan tertahan dan terabsorbsi pada fasa diam, dan kemudian satu
demi satu senyawasenyawa ini akan terbawa kembali oleh fasa gerak yang
melaluinya. Dalam kromatografi kertas dan kromattografi lapis tipis, fasa
gerak adalah pelarut. Fasa diam pada kromatografi kertas adalah kertas
yang menyerap pelarut polar, sedangkan fasa diam pada kromatografi lapis
tipis adalah pelat yang dilapisi adsorben tertentu. Kedua jenis kromatografi
ini menggunakan aksi kapilaritas untuk menggerakkan pelarut melalui fasa
diam.
Keakuratan hasil pemisahan dengan metode kromatografi bergantung pada
beberapa faktor berikut:
Pemilihan adsorben sebagai fasa diam
Kepolaran pelarut atau pemilihan pelarut yang sesuai sebagai fasa
gerak
Ukuran kolom (panjang dan diameter) relatif terhadap jumlah material
yang akan dipisahkan.
Laju elusi atau aliran fasa gerak.
Dengan pemilihan kondisi yang sesuai, hampir semua komponen
dalam campuran dapat dipisahkan. Dua pemilihan mendasar untuk
pemisahan secara kromatografi adalah pemilihan jenis adsorben dan
system pelarut. Pada umumnya, senyawa non polar melewati kolom lebih
cepat daripada senyawa polar, karena senyawa non polar memiliki afinitas
lebih kecil terhadap adsorben. Jika adsorben yang dipilih mengikat semua
molekul yang terlarut (baik polar maupun non polar) dengan kuat, maka
senyawa-senyawa tersebut tidak akan bergerak turun keluar dari kolom.
Sebaliknya, jika pelarut yang dipilih terlalu polar, semua zat terlarut (polar
maupun non polar) akan dengan mudah tercuci keluar kolom, tanpa
adanya pemisahan. Adsorben dan pelarut sebaiknya dipilih sedemikian
rupa sehingga kompetisi molekul-molekul terlarut di antara kedua fasa
terjadi dalam kesetimbangan. Koefisien partisi, k, yang mirip dengan
koefisien distribusi untuk ekstraksi, merupakan tetapan kesetimbangan
untuk distribusi molekul-molekuk atau ion terlarut di
antara fasa gerak dan fasa diam. Kesetimbangan ini lah yang dapat
memisahkan komponen-komponen dlam campurannya.
Fasa Diam
Silika gel, fasa diam yang paling umum digunakan sebagai fasa diam,
memiliki rumus empiris SiO2. Tetapi, pada permukaan partikel silika gel,
terdapat atom-atom oksigen yang terikat pada proton. Adanya gugus
hidroksil ini mengakibatkan permukaan silika gel sangat polar, sehingga
analit organik yang memiliki gugus fungsi polar akan terikat dengan kuat
pada permukaan partikel silika gel dan senyawa yang non polar hanya
berinteraksi lemah dengan silika gel. Molekul yang memiliki gugus fungsi
polar dapat terikat pada silika gel dalam dua cara: melalui ikatan hidrogen
dan melalui interaksi dipol-dipol. Pada gambar 1 diperlihatkan model
interaksi analit senyawa oraganik dengan silika gel.
Fasa diam lain yang juga biasa digunakan untuk kromatografi kolom dan
lapis tipis adalah alumina, yang memiliki rumus empiris Al2O3. Model
interaksi senyawa organik dengan alumina dapat dilihat pada gambar 2
berikut.
Fasa Gerak
Pada kromatografi yang menggunakan silika gel sebagai fasa diam, fasa
gerak yang digunakan adalah suatu pelarut organik atau campuran
beberapa pelarut organik. Ketika fasa gerak melalui permukaan silika gel,
fasa gerak ini membawa analit organikkmelalui partikel-partikel pada fasa
diam. Tetapi, molekul analit hanya bebas bergerak oleh adanya pelarut
apabila molekul tersebut tidak terikat pada permukaan silika gel.
Kemampuan suatu analit terikat pada permukaan silika gel dengan adanya
pelarut tertentu dapat dilihat sebagai penngabungan 2 interaksi yang saling
berkompetisi. Pertama, gugus polar dalam pelarut dapat berkompetisi
dengan analit untuk terikat pada permukaan silika gel. Dengan demikia,
jika pelarut yang sangat polar digunakan, pelarut akan berinteraksi kuat
dengan permukaan silika gel dan hanya menyisakan sedikit tempat bagi
analit untuk terikat pada silika gel. Akibatnya, analit akan bergerak cepat
melewati fasa diam dan keluar dari kolom tanpa pemisahan. Dengan cara
yang sama, gugus polar pada pelarut dapat berinteraksi kuat dengan gugus
polar dalam analit dan mencegah interaksi analit pada permukaan silika
gel. Pengaruh ini juga menyebabkan analit dengan cepat meninggalkan
fasa diam. Kepolaran suatu pelarut yang dapat digunakan untuk
kromatografi dapat dievaluasi dengan memperhatikan tetapan dielektrik
(ε) dan momen dipol (δ) pelarut. Semakin besar kedua tetapan tersebut,
semakin polar pelarut tesebut. Sebagai tambahan, kemampuan berikatan
hidrogen pelarut dengan fasa diam harus dipertimbangkan.
Semua jenis kromatografi melibatkan proses kesetimbangan molekul-
molekul yang dinamis dan cepat diantara 2 fasa (diam dan gerak).
Kesetimbangan di antara kedua fasa tersebut bergantung pada 3 faktor:
• Kepolaran dan ukuran molekul yang akan dipisahkan
• Kepolaran fasa diam
• Kepolaran fasa gerak
Isolasi Kurkumin dari Kunyit
Kunyit merupakan salah satu tumbuhan yang sudah sangat akrab dengan
masyarakat Indonesia. Rimpang (Rhizoma) dari tumbuhan ini biasa
digunakan sebagai bahan warna kuning dalam industri tekstil tradisional
serta digunakan sebagai bumbu masakan, di samping kegunaannya dalam
obat tradisional. Nama latin dari kunyit adalah Curcuma longa yang
termasuk dalam famili Zingeberaceae (temu-temuan). Komponen aktif dari
rimpang kunyit adalah kurkumin (E,E)-1,7-bis(4-hidroksi-3-metoksifenil)-
1,6-heptadien-3,5-on) yang biasanya terdapat 1,5-2% dari berat rimpang
kunyit kering. Struktur senyawa ini ditentukan tahun 1910 oleh V. Lampe
dan merupakan diarilheptanoid yang pertama ditemukan. Kurkumin juga
dapat disintesis di laboratorium. Kurkumin dilaporkan memiliki sifat
antikanker dan antitumor. Analog kurkumin telah dilaporkan pula mampu
menghambat enzim HIV-1 integrase.
IV. Alat & bahan
Alat
Alat destilasi
Penyaring vakum
Gelas ukur
Gelas kimia
Neraca analitik
Termometer
Batang pengaduk
Plat kromatografi
lapis tipis
Pipet tetes
Pipa kapiler
Gelas kimia
Spektrum UV
Kertas saring
Kolom kromatografi
Bahan
Rimpang kunyit
kering
Diklorometana
Kapas
Silika gel
Eluen
Metanol
n-heksana
air
Kertas saring
Kolom kromatografi
V. Prosedur
20 g rimpang kunyit dikering dalam 50 mL diklorometana direfluks
selama 1 jam. Campuran kemudian segera disaring dengan saringan
vakum hingga diperoleh larutan kuning. Dilarutan lalu dipekatkan melalui
distilasi pada penangas air 50 oC. Residu kuning kemerahan yang
diperoleh kemudian dicampurkan dengan 20 mL n-heksana dan diaduk
secara merata. Campuran kemudian disaring lagi dengan penyaring
vakum. Padatan yang dihasilkan selanjutnya dianalisis dengan
Kromatografi lapis tipis (TLC) menggunakan eluen CH2Cl2 : MeOH =
97:3 yang akan menunjukkan 3 komponen utama. Kromatografi
menggunakan kromatografi kolom dibuat menggunakan 15 g silika gel
dan eluen CH2Cl2 : MeOH = 99 : 1 dengan tinggi kolom berkisar antara
15-20 cm. 0,3 g diekstrak kasar yang diperoleh dilarutkan dengan sesedikit
mungkin pelarut CH2Cl2 : MeOH = 99:1 dan kemudian diteteskan secara
perlahan pada bagian atas kolom (jangan merusak permukaan kolom).
Dilakukan elusi hingga komponen pertama habis. Monitoring dilakukan
dengan menggunakan TLC. Digabungan fraksi yang mengandung
komponen pertama ini kemudian dikeringkan. Diuji spektrum UV dan IR
dari senyawa murni yang berhasil diisolasi. Proses pemisahan dilakukan
pula dengan menggunakan KLT preparatif. Diekstrak kasar (0,1 g)
dilarutkan dengan sesedikit mungkin pelarut CH2Cl2 : MeOH = 99 : 1,
kemudian ditotolkan pada batas awal pelat KLT preparatif dengan
menggunakan pipa kapiler yang diameternya lebih besar dari pada pipa
kapiler untuk titik leleh. Setelah noda kering, dilakukan elusi dengan eluen
CH2Cl2 : MeOH = 97 : 3. Hasil elusi dilihat dibawah lampu UV, kemudian
pita komponen utamanya diberi tanda dengan ujung tumpul pipa kapiler.
Bagian pita yang dipilih kemudian dipisahkan dari komponen lainnya
dengan cara mengerok lapisan silika tersebut dan ditampung pada kertas.
Dipindahkan silika tersebut ke dalam gelas kimia, dilarutkan dengan
diklorometana, kemudian saring dan cuci dengan pelarut yang sama.
Filtrat kemudian diuapkan dengan rotary evaporator (atau distilasi biasa
dengan penagas air pada suhu 60oC). Dilakukan uji kemurnian fraksi
yang diperoleh dengan KLT (eluen CH2Cl2 : MeOH = 97 : 3).
Dibandingkan kemurniannya dengan fraksi hasil pemisahan secara
kromatografi kolom!
VI. Hasil & pembahasan
Hasil pengamatan
20 gram rumpang kunyit + 50 ml diklorometana direfluks 1 jam
menghasilkan padatan dan berwarna kuning kemerahan
Hasil refluks di saringan dengan vakum menghasilkan kurkumin
kuning kemerahan
Distilasi pada penangas air pada suhu 50°C menghasilkan kurkumin
kuning kemerahan murni + n-heksana menghasilkan kurkumin
memadat atau mengkristal.
kromatografi kolom, kapas + silikagel + estrak kurkumi + eluen
CH2CI2 : MeOH = 99 : 1 menghasilkan kolom terbentuk tiga fraksi
senyawa yang ditandai dengan warna yang berbeda. Dan atas ke
bawah berturut-turut adalah warna coklat kemerahan, oranye, dan
kuning.
kromatografi lapis tipis dengan eluen CH2CI2 : MeOH = 97 : 3 +
totolkan ekstrak kurkumin dengan pipa kapiler di atas silica.
Menghasilkan nilai Rf 0,9 cm.
Pembahasan
Kromatografi adalah metode yang digunakan untuk pemisahan komponen
dan suatu sampel dimana komponen akan terdistribusi antara dua fase
yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam mungkin berupa padat atau cair
yang terikat pada bahan padat atau gel. Fase padat dapat terkemas dalam
kolom, tersebar sebagai suatu lapisan, atau terdistribusi sebagai lapisan
film. Fase gerak dapat berupa gas atau cair yang mengalir atau berpindah
dalam arah tertentu (Pure and Applied Chem, 37, 447, 1974). Analisis
dengan kromatografì dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif
maupun analisis kuantitatif. Berdasarkan mekanisme pemisahannya,
kromatografi dapat dibedakan menjadi:
Kromatografì adsorbsi
Kromatografi partisi
Kromatografì pasangan ion
Kromatografì penukar ion
Kromatografì eksklusi ukuran
Selain itu, kromatografi dapat dibedakan berrdasarkan media yang
digunakan, yaitu:
Kromatografi kertas
Kromatografi lapis tipis (KIT)
Kromatografì Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
Kromatografì Gas
Kurkumin adalah komponen utama senyawa kurkuminoid hasil metabolit
sekunder yang banyak terdapat pada tanaman jenis kunyit dan temulawak
(suku Zingiberaceae). Senyawa kurkuminoid lainnya adalah bis-demetoksi
kurkumin dan demetoksi kurkumin. Dalam dunia farmasi, penggunaan
kurkumin sebagai senyawa bahan obat telah dilakukan secara luas,
diantaranya adalah sebagai antioksidan, antiinflamasi, antiinfeksi, dan
antiviral. Pada tingkat penelitian yang lebih lanjut, kurkumin diduga dapat
bermanfaat sebagai antitumor, bahkan dapat melakukan penghambatan
replikasi human immunodeficiency virus (HIV).
Kurkumin dapat ditemukan pada dua bentuk tautomer, yaitu bentuk keto
dan bentuk enol. Struktur keto Iebih stabil atau Iebih banyak ditemukan
pada fasa padat, sedangkan struktur enol Iebih dominan pada fasa cair atau
larutan.
Untuk mengisolasi kurkumin dari kunyit, serbuk kunyit dilarutkan dalam
diklorometana. Sebagai pelarut, digunakan diklorometana karena
merupakan pelarut non polar karena senyawa yang ada dalam kunyit
merupakan senyawa organik yang cenderung bersifat non polar. lnteraksi
antar molekul non polar ini akan melarutkan senyawa yang ada dalam
kunyit termasuk kurkumin pada pelarutnya. Campuran rumpang kunyit
dengan diklorometana selanjutnya direfluks selama satu jam. Proses ini
bertujuan untuk mengekstrak kurkumin yang ada pada kunyit. Pada saat
refluks suhunya 5 oC, suhu larutan sebaiknya tidak terlalu tinggi karena
proses ini berjalan relatif lambat. Jika suhu terlalu tinggi, ekstraksi tidak
berjalan dengan sempurna sehingga tidak semua kurkumin pada kunyit
dapat diekstrak. Setelah proses refluks selesai, campuran disaring dengan
penyaringan vakum dan larutan berwarna kuning hasil penyaringan
selanjutnya dipekatkan dengan melalukan distilasi pada penangas air pada
suhu 50°C. Distilasi ini bertujuan untuk menguapkan pelarut
(diklorometana) sehingga diperoleh kurkumin kuning kemerahan.
Kemudian ditambahkan dengan n-heksana yang bertujuan untuk
menjenuhkan campuran sehingga kurkumin memadat atau mengkristal.
Setelah didapat ekstrak kurkumin, lakukan kromatografi kolom.
Kromatografi adalah cara pemisahan dua atau lebih senyawa atau ion
berdasarkan perbedaan migrasi dan distribusi senyawa atau ion-ion
tersebut di dalam dua fasa yang berbeda. Fasa diam merupakan fasa yang
tidak bergerak, senyawa yang digunakan adalah silica gel. Fasa gerak
merupakan fasa yang bergerak melalui fasa diam dan membawa
komponen-komponen yang akan dipisahkan, menggunakan suatu pelarut
organik atau campuran beberapa pelarut organik. Dalam kromatografi
kolom, kolom bagian dasar buret dibalut kapas yang telah diberi aseton
untuk menghilangkan gelembung udara. Aseton akan menyerap panas dari
buret danterjadi penurunan suhu sehingga gelembung naik ke permukaan.
Kemudian kolom disiapkan dengan silika gel sebagai fasa diam dan
CH2CI2 : MeOH = 99 : 1 sebagai fasa gerak. Dalam proses kromatografi
kolom adsorben silika gel harus terus basah karena, jika dibiarkan kering
kolom yang terbentuk dari silika gel bisa retak, sehingga proses pemisahan
zat tidak berjalan optimal. Selain itu, juga untuk memudahkan proses elusi
(larutan melewati kolom) dalam kolom. Karena digunakan silika gel yang
sangat polar, maka komponen yang bersifat lebih polar atau cenderung
polar akan berinteraksi dengan kuat, akibatnya akan tertahan lebih lama
pada fasa diam. Setelah dilakukan elusi, ada kolom terbentuk tiga fraksi
senyawa yang ditandai dengan warna yang berbeda. Dan atas ke bawah
berturut-turut adalah warna coklat kemerahan, oranye, dan kuning.
Komponen yang berwarna coklat kemerahan adalah demetoksi kurkumin.
Komponen oranye adalah bis-demetoksi kurkumin, dan komponen kuning
adalah kurkumin. Ditinjau dari segi kepolaran molekul, urutan dan yang
paling polar ke yang kurang polar adalah demetoksi kurkumin, kurkumin,
dan bis-demetoksi kurkumin. Akan tetapi, pada kolom kurkumin
menempati fraksi yang paling bawah, yang memiliki afinitas dengan silika
gel paling kecil. Hal ini terjadi karena adanya ikatan hidrogen antar
molekul kurkumin sehingga mengurangi kekuatan untuk berinteraksi dan
membentuk ikatan dengan silika gel.
Selain menggunakan kromatografi kolom, padatan yang dihasilkan
dianalisis juga dengan kromatografi lapis tipis dengan eluen CH2CI2 :
MeOH = 97 : 3 yang nonpolar dan fase diamnya merupakan silica yang
polar, kurkumin yang memiliki struktur simetris merupakan senyawa
nonpolar. Sehingga eluen menarik kurkumin yang di totolkan dengan pipa
kapiler di atas silica. Karena eluen yang non polar akan menarik kurkumin
yang nonpolar. Maka didapat nilai Rf adalah 0,9 cm.
VII. Kesimpulan
Kromatografi adalah metode yang digunakan untuk pemisahan komponen
dan suatu sampel dimana komponen akan terdistribusi antara dua fase
yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam mungkin berupa padat atau cair
yang terikat pada bahan padat atau gel. Fase padat dapat terkemas dalam
kolom, tersebar sebagai suatu lapisan, atau terdistribusi sebagai lapisan
film. Fase gerak dapat berupa gas atau cair yang mengalir atau berpindah
dalam arah tertentu. Kurkumin adalah komponen utama senyawa
kurkuminoid hasil metabolit sekunder yang banyak terdapat pada tanaman
jenis kunyit dan temulawak (suku Zingiberaceae). Senyawa kurkuminoid
lainnya adalah bis-demetoksi kurkumin dan demetoksi kurkumin.
Kromatografi kolom, padatan yang dihasilkan dianalisis kromatografi lapis
tipis dengan eluen CH2CI2 : MeOH = 97 : 3 yang nonpolar dan fase
diamnya merupakan silica yang polar, kurkumin yang memiliki struktur
simetris merupakan senyawa nonpolar. Sehingga eluen menarik kurkumin
yang di totolkan dengan pipa kapiler di atas silica. Karena eluen yang non
polar akan menarik kurkumin yang nonpolar. Maka didapat nilai Rf adalah
0,9 cm.
VIII. Pustaka
Recommended