II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes

II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes

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Généralités

• Techniques de microscopie optiques (les moins traumatisantes)

• Marquage fluorescent des molécules à suivre

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Concentrations ioniques

• Microélectrodes (H+, Na+, K+, Cl-, Ca++) mais pas rapide

• Indicateurs sensibles aux ions– luminescents (aequorine de la

méduse)– fluorescents

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Autres indicateurs fluorescents

• Autres ions

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Injection intra-cytoplasmique de molécules marqueur

• Anticorps• Protéine cellulaire purifiée marquée• Exemple tubuline

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Fig 18-21 tubuline

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Fig 16-12 tubuline

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Injection intra-cytoplasmique de molécules pour bloquer une

fonction• Anticorps anti myosine-II dans un œuf

d'oursin bloque la division sans bloquer la mitose

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Quatre méthodes d'introduction de molécules

dans la cellule

• Microinjection• Électroporation• Vésiculation• Projection à haute vitesse…

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Fig 9-40 (AB)

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Fig 9-40 (CD)

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Molécules captives

• Synthèse d'une forme inactive de la molécule

• Introduction dans la cellule• Activation à un temps et moment

donné par un faisceau lumineux• eg : molécules captives pour Ca++,

AMPc, GTP, IP3

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Fig 9-41 Caged molecules

• La molécule X devient active après le flash d'UV

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Application

• Molécules fluorescentes piégées• Grosse modification de la molécule

qui doit rester active grosse difficulté

• Tâtonnement pour créer de nouvelles molécules

• eg : tubuline

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Fig 9-42 Caged tubuline fluorescéine

• Tubuline rhodamine (rouge)• Dapi ADN (bleu)• Tubuline flourescéine piégée (mélangée aux autres et

invisible avant le rayon d'UV)

Avant UV Après UV juste à gauche de la plaque métaphasique

Après 1,5 mn Après 2,5 mn

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Desai,A1998

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Green Fluorescence Protein

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Fig 9-43 GFP

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GFP 3D

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GFP TopolGFP

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GFP mice

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GFP

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• Isolement• Séparation (FACS)• Culture primaire et secondaire• Milieu de culture• Lignée cellulaire• Transformation• Congélation• Clone• Hybride

III - Culture cellulaire

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Facs

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Hybride cellulaire

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Production AC monoclonaux

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Culture SEM

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Immuno gold en ME

ME Immuno-gold

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• Pulse-chase• Patch-Clamp• Molécules « piégées »• Les anticorps

– immunofluorescence directe– immunofluorescence indirecte

Pistage de molécules dans la cellule

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Fig 9-46

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Fig 9-47

Autoradiographie en microscopie électronique

5 mn de pulse de 3HLeucine dans cellules B de pancréas

Après 10 mn de chasse Après 45 mn de chasse

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Fig 9-48

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• Techniques biochimiques

IV - Fractionnement des cellules et analyse des

molécules