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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS
IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR, CARACTERIZAÇÃO
BIOQUÍMICA E FENOTÍPICA DE LEVEDURAS DO COMPLEXO
Candida parapsilosis (C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis)
EDINA RAQUEL MENESES SILVA
Belém – Pará
2014
EDINA RAQUEL MENESES SILVA
IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR, CARACTERIZAÇÃO
BIOQUÍMICA E FENOTÍPICA DE LEVEDURAS DO COMPLEXO
Candida parapsilosis (C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis)
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Biologia de
Agentes Infecciosos e Parasitários do
Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade Federal do Pará como
requisito parcial para a obtenção do
grau de Mestre em Biologia de
Agentes Infecciosos e Parasitários.
Orientadora: Profª. Drª. Silvia Helena
Marques da Silva.
Belém – Pará
2014
Dados Internacionais de Catalogação na publicação (CIP)
Silva, Edina Raquel Meneses.
Identificação molecular, caracterização bioquímica e fenotípica de
leveduras do complexo Candida parapsilosis (C. parapsilosis,
C. orthopsilosis e C. metapsilosis) Edina Raquel Meneses Silva. - 2014.
Orientador: Silvia Helena Marques da Silva.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Pará, Instituto
de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia de
Agentes Infecciosos e Parasitários, Belém, 2014.
1. Microbiologia médica. 2. Candidíase - Infecções. 3. Fungos.
I. Título.
CDD 22. ed. 616.9041
1
EDINA RAQUEL MENESES SILVA
IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR, CARACTERIAÇÃO
BIOQUÍMICA E FENOTÍPICA DE LEVEDURAS DO COMPLEXO
Candida parapsilosis (C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos
e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará como
requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Biologia de Agentes Infecciosos e
Parasitários.
Orientadora: Profª. Drª. Silvia Helena Marques da Silva
Instituto Evandro Chagas – SABMI / SVS / MS
Banca Examinadora: Profª. Drª. Karla Valéria Batista Lima
Instituto Evandro Chagas – SABMI – Lab. BioMol / SVS / MS
Prof. Dr. Evonnildo Costa Gonçalves
Universidade Federal do Pará – ICB / UFPA
Drª. Ana Roberta Fusco da Costa
Instituto Evandro Chagas – SABMI – Lab. BioMol / SVS / MS
Prof. Dr. Ricardo Luiz Dantas Machado (Suplente)
Instituto Evandro Chagas – SAPAR / SVS / MS
Belém, 16 de maio de 2014
2
“Ó profundidade das riquezas, tanto da sabedoria,como da ciência de Deus!
Quão insondáveis são os seus juízos, e quão inescrutáveis os seus caminhos!”
Romanos 11:33
3
Dedico esta dissertação ao Ageu Júnior e à Sarah Meneses,
meus filhos, meus tesouros, minha inspiração, minha benção.
4
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, autor da vida e consumador da minha fé, por este tão
grande privilégio e por me sustentar em todos os momentos da minha caminhada. A Ele seja a
glória, o domínio e o louvor;
Aos meus filhos Ageu Júnior e Sarah Meneses por compreenderem minhas ausências e
ainda assim torcerem pelo meu sucesso;
A minha Mãe Anastácia, por seu exemplo, pelo seu amor e por suas orações;
As minhas irmãs e irmãos por seu amor e por sempre me motivarem a continuar;
Aos amados membros da minha Igreja Presbiteriana do Conjunto Maguari, pela
comunhão e por me sustentarem com suas orações;
Aos amigos do mestrado Jannyce Guedes, Eduardo Lana, Larissa Freitas e Andrea
Leal por todos os maravilhosos momentos que me proporcionaram, pela preciosa amizade e
incentivo;
A minha querida orientadora e mestra Dra. Silvia Marques pela oportunidade, pelo seu
exemplo de dedicação e amor à ciência, pelo saber compartilhado, pelo incentivo, pela
amizade, carinho e compreensão nos momentos difíceis;
As colegas do laboratório de Micologia pelo companheirismo, amizade e trocas de
experiências;
A todos os servidores da Seção de Bacteriologia e Micologia do Instituto Evandro
Chagas;
Ao Instituto Evandro Chagas por permitir o desenvolvimento desta pesquisa;
Aos membros da banca do plano de qualificação Dr. Edvaldo Loureiro e Dra. Daniela
Rocha pelas valiosas contribuições;
Aos membros da banca examinadora Dra. Karla Lima, Dra. Roberta Fusco e Dr.
Evonnildo Gonçalves por suas contribuições;
Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários da
Universidade Federal do Pará pela oportunidade da realização desta pesquisa;
Aos professores do PPG-BAIPUFPA, por seu conhecimento compartilhado.
5
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS E QUADROS 7
LISTA DE FIGURAS 8
LISTA DE ABREVIATURAS 9
RESUMO 10
ABSTRACT 11
1 INTRODUÇÃO........................................................................................................ 12
1.1 HISTÓRICO, PERFIL TAXONÔMICO E MORFOLÓGICO DE Candida
parapsilosis................................................................................................................ 12
1.2 O COMPLEXO C. parapsilosis................................................................................ 13
1.2.1 Candida parapsilosis................................................................................................. 16
1.2.2 Candida orthopsilosis............................................................................................... 17
1.2.3 Candida metapsilosis................................................................................................ 17
1.3 EPIDEMIOLOGIA DAS ESPÉCIES DO COMPLEXO C. parapsilosis................. 19
1.4 FATORES DE RISCO.............................................................................................. 21
1.5 MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS............................................................................... 22
1.6 FATORES DE VIRULÊNCIA.................................................................................. 23
1.6.1 Formação de Biofilme.............................................................................................. 23
1.6.2 Secreção de Enzimas................................................................................................ 26
1.7 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DAS INFECÇÕES POR ESPÉCIES DE
Candida...................................................................................................................... 28
1.7.1 Identificação Molecular........................................................................................... 29
1.7.2 Identificação Bioquímica......................................................................................... 29
1.8 SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIFÚNGICOS...................................................... 30
1.9 OBJETIVOS.............................................................................................................. 35
1.9.1 Objetivo Geral.......................................................................................................... 35
1.9.2 Objetivos Específicos............................................................................................... 35
2 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................... 36
2.1 DESENHO DO ESTUDO......................................................................................... 36
2.2 ISOLADOS FÚNGICOS E CRITÉRIO DE SELEÇÃO.......................................... 36
2.3 ASPECTOS ÉTICOS DA PESQUISA..................................................................... 37
6
SUMÁRIO
2.4 IDENTIFICAÇÃO E CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS DAS
LEVEDURAS DO COMPLEXO C. parapsilosis PELO VITEK®
2.................. 37
2.5 IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR..................................................................... 37
2.5.1 Extração de DNA Genômico............................................................................. 37
2.5.2 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) ........................................................ 38
2.6 PESQUISAS DE EXOENZIMAS....................................................................... 40
2.6.1 Atividade da Gelatinase..................................................................................... 40
2.6.2 Atividade da Lipase............................................................................................ 40
2.6.3 Atividade da Urease........................................................................................... 40
2.6.4 Atividade da Desoxirribonuclease (DNase) ..................................................... 41
2.6.5 Atividade da Caseinase...................................................................................... 41
2.6.6 Atividade da Fosfolipase.................................................................................... 42
2.6.7 Atividade da Proteinase..................................................................................... 42
2.7 CULTIVO EM ÁGAR EOSINA AZUL DE METILENO MODIFICADO....... 43
2.8 ANÁLISE DA FORMAÇÃO DO BIOFILME.................................................... 43
2.9 PERFIL DE SENSIBILIDADE AOS ANTIFÚNGICOS.................................... 43
3 RESULTADOS................................................................................................. 46
3.1 REIDENTIFICAÇÃO DAS LEVEDURAS DO COMPLEXO C. parapsilosis
PELA METODOLOGIA VITEK®
2................................................................ 46
3.2 IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DAS ESPÉCIES DO COMPLEXO C.
parapsilosis............................................................................................................... 48
3.3 DETERMINAÇÃO DO PERFIL DE EXOENZIMAS DAS ESPÉCIES DO
COMPLEXO C. parapsilosis................................................................................... 48
3.4 AVALIAÇÃO E DETERMINAÇÃO DA APLICABILIDADE DO ÁGAR
EOSINA AZUL DE METILENO (EAM), COMO MEIO DE IDENTIFICAÇÃO
PRESUNTIVA PARA LEVEDURAS DO COMPLEXO C.
parapsilosis.............................................................................................................. 52
3.5 CARACTERIZAÇÃO DA FORMAÇÃO DE BIOFILME POR LEVEDURAS
DO COMPLEXO C. parapsilosis............................................................................ 54
3.6 AVALIAÇÃO DO PERFIL DE SENSIBILIDADE AOS ANTIFÚNGICOS........ 55
3.7 PARTICULARIDADE DO PERFIL FENOTÍPICO DE ISOLADOS DE
Candida parapsilosis................................................................................................ 56
4 DISCUSSÃO.......................................................................................................... 57
5 CONCLUSÕES...................................................................................................... 67
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................. 68
ANEXO................................................................................................................................ 79
7
LISTA DE TABELAS E QUADROS
Página
Quadro 1 – Primers a serem utilizados e condições da Reação em Cadeia da
Polimerase (Garcia Martinez et al., 2010; Vercher et al., 2011). 39
Quadro 2 – Fármacos, diluentes e intervalos de concentrações utilizados (CLSI,
2002) 44
Quadro 3 – Diretrizes de Interpretação dos Testes de Sensibilidade in vitro das
espécies de Candida (CLSI, 2002). 45
Tabela 1 – Identificação de leveduras de C. parapsilosis por meio do Sistema
automatizado VITEK®
2. 46
Tabela 2 – Representação da assimilação de carboidratos por meio do Sistema
VITEK®
2, de isolados de C. parapsilosis. 47
Tabela 3 – Frequências relativas e absolutas da distribuição das espécies do
complexo: CP - C. parapsilosis, CO - C. orthopsilosis e CM - C. metapsilosis, de
acordo com o sítio anatômico e ou do material dos quais foram recuperadas
primariamente. 49
Tabela 4 – Secreção de exoenzimas por leveduras do complexo C. parapsilosis. 50
Tabela 5 – Frequência da atividade enzimática das leveduras do complexo C.
parapsilosis, conforme a intensidade da produção da exoenxima. 50
Quadro 4 – Descrição das características colorimétricas dos isolados do
Complexo C. parapsilosis, sobre o ágar EAM. 53
Tabela 6 – Frequências absoluta e relativa da susceptibilidade aos antifúngicos de
isolados do complexo C. parapsilosis. 56
8
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1 – Perfis de isoenzimas definindo três grupos distintos de C. parapsilosis
(Lin et al. (1995).
14
Figura 2 – Padrões RAPD produzidos para amostras de C. parapsilosis (Tavanti
et al., 2005).
16
Figura 3 – Macromorfologia do complexo C. parapsilosis. 18
Figura 4 – Imagem de microscopia eletrônica de varredura mostrando a
arquitetura do biofilme de Candida parapsilosis em filtros microporosos de
policarbonato (Samaranayake et al, 2005). 24
Figura 5 – Produtos da amplificação de DNA de leveduras do Complexo C.
parapsilosis revelados por eletroforese em gel de agarose a 2%. 48
Figura 6 – Aspecto macromorfológico de um isolado (IEC 240) de C.
parapsilosis produtor da enzima hidrolítica Lipase. 51
Figura 7 – Aspecto macromorfológico de um isolado de C. parapsilosis produtor
da exoenzima DNAse. 51
Figura 8 – Aspecto macromorfológico da colônia de um isolado de C.
parapsilosis produtor da exoenzima Fosfolipase. 52
Figura 9 – Macromorfologia das colônias de leveduras do complexo C.
parapsilosis em ágar Eosina Azul de Metileno (EAM). 53
Figura 10 – Variações colorimétricas das colônias do complexo C. parapsilosis. 54
Figura 11 – Gráfico demonstrativo da produção de biofilme pelas cepas de CP -
C. parapsilosis, CO - C. orthopsilosis e CM - C. metapsilosis. 55
Figura 12 – Desenho esquemático do perfil fenotípico de isolados de C.
parapsilosis que exibiram alto grau de virulência por produzir biofilme, enzimas
hidrolíticas e resistência aos azóis. 56
9
LISTA DE ABREVIATURAS
AFLP – Amplification Fragment Lenght Polymorphism
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ATCC – American Type Culture Collection
CIM – Concentração Inibitória Mínima
CLSI – Clinical and Laboratory Standards Institute
DMSO – Dimetilsulfóxido
DNA – Ácido Desoxirribonucleico
EDTA – Ácido Etilenodiamino Tetra-acético
IEC – Instituto Evandro Chagas
ITS – Espaçador Transcrito Interno
MOPS – Ácido Morfopropileno Sulfônico
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase
RAPD – Randomly Amplified Polymorphic DNA
RFLP – Restriction Fragment Length Polymorphism
Rpm – Rotações por minuto
RPMI – Roswell Park Memorial Institute
SABMI – Seção de Bacteriologia e Micologia
SADH – secondary alcohol dehydrogenase
SAP – proteinase aspártica secretora
SYA1 – putative alanyltRNA synthetase
TBE – Tampão TRIS-BORATO-EDTA
TE – Tampão TRIS-EDTA
UFC – Unidade Formadora de Colônia
UTI – Unidade de Terapia Intensiva
10
RESUMO
A levedura Candida parapsilosis é um microrganismo emergente com potencial de
patogenicidade para candidíase superficial e sistêmica, elevada taxa de mortalidade e
importante impacto nos serviços de saúde. A heterogeneidade genotípica dos isolados clínicos
identificados como Candida parapsilosis levou à recente designação de três espécies
indistintas morfologicamente, mas com diferenças genotípicas suficientes para formar o
chamado Complexo C. parapsilosis: Candida parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis.
Estas espécies tem demonstrado diferenças epidemiológicas na Europa, Ásia e América
Latina, além de diferenças quanto à fatores de virulência e susceptibilidade aos antifúngicos
sendo recomendável, portanto, a identificação dos patógenos em nível de espécie para
melhorar o manejo das infecções e o adequado emprego da terapia antifúngica. A presente
pesquisa apresentou como escopo a identificação molecular e a descrição de aspectos
bioquímicos e fenotípicos de leveduras do complexo C. parapsilosis recuperadas de culturas
obtidas de diferentes espécimes clínicos de pacientes encaminhados ao Instituto Evandro
Chagas, Ananindeua – Pará, entre 2005 e 2012. Foram utilizados 52 isolados anteriormente
identificados como Candida parapsilosis por técnica semi-automatizada, os quais foram
reidentificados pelo sistema automatizado Vitek®
2. A identificação molecular das espécies
foi por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) convencional utilizando iniciadores espécie-
específicos. Foi realizada prova colorimétrica em meio de cultura ágar Eosina Azul de
Metileno (EAM) como meio de identificação presuntiva. O perfil enzimático das espécies do
complexo C. parapsilosis foi determinado por protocolos que utilizam meios de cultura
específicos para cada enzima pesquisada quanto à sua atividade (Gelatinase, Lipase, Urease,
DNAse, Caseinase, Fosfolipase e Proteinase). Os isolados também foram testados quanto à
formação de biofilme e susceptibilidade aos antifúngicos itraconazol, fluconazol e
anfotericina B. Na reidentificação pelo Vitek®
2, 44/52 (85%) foram identificados como C.
parapsilosis, e 8 (15%) tiveram suas leituras como outras espécies do gênero Candida. Pela
PCR, 44/52 isolados foram identificados como C. parapsilosis, 5/52 (9%) C. orthopsilosis e
3/52 (6%) da espécie C. metapsilosis. As exoenzimas caseinase, urease e gelatinase não foram
secretadas pelas espécies do complexo C. parapsilosis. A exoenzima DNase foi produzida por
4/52 isolados, sendo todos de C. parapsilosis. As exoenzimas proteinase, fosfolipase e lipase
foram produzidas por 48/52, 27/52 e 51/52 dos isolados, respectivamente. Todos os isolados
do complexo C. parapsilosis foram hábeis na produção de biofilme variando na intensidade
deste fator de virulência. No teste de susceptibilidade in vitro aos antifúngicos, 89% dos
isolados de C. parapsilosis apresentaram sensibilidade ao fluconazol, 79% apresentaram
sensibilidade ao itraconazol e 100% foram sensíveis à anfotericina B. As espécies C.
orthopsilosis e C. metapsilosis apresentaram padrão de sensibilidade (100%) para todos os
isolados expostos à ação farmacológica do fluconazol e da anfotericina. Algumas amostras do
complexo demonstraram resistência ao itraconazol e pelo menos uma amostra de cada espécie
apresentou sensibilidade dose dependente a esta droga. Os resultados reforçam a necessidade
de vigilância para monitorar a incidência na região destes patógenos oportunistas.
Palavras-chaves: Complexo C. parapsilosis, Identificação Molecular, Identificação
Bioquímica, Fatores de Virulência.
11
ABSTRACT
The yeast Candida parapsilosis is an emerging pathogenic microorganisms with potential for
superficial and systemic candidiasis, high mortality and significant impact on health services.
The genotypic heterogeneity of clinical isolates identified as Candida parapsilosis led to the
recent appointment of three morphologically indistinguishable species, but with genotypic
differences sufficient to form the called C. parapsilosis Complex: Candida parapsilosis, C.
orthopsilosis and C. metapsilosis. These species have demonstrated epidemiological
differences in Europe, Asia and Latin America, as well as differences in virulence factors and
susceptibility to antifungal agents being recommended, therefore, the identification of
pathogens to the species level to improve the management of infections and the appropriate
use of therapy antifungal. This research presented as the scope the molecular identification
and description of biochemical and phenotypic aspects of yeast C. parapsilosis Complex
recovered from cultures obtained from different clinical specimens from patients referred to
the Institute Evandro Chagas, Ananindeua – Pará, between 2005 and 2012. Were used 52
isolates previously identified as Candida parapsilosis by semi-automated technique, which
were again identified by automated system Vitek®
2. The molecular identification of the
species was by conventional Polymerase Chain Reaction (PCR) using species-specific
primers. Colorimetric test was carried out on agar plates Eosin Methylene Blue (EMB) as a
means of presumptive identification. The enzyme profile of the C. parapsilosis Complex
species was determined by using protocols specific to each culture media analyzed for its
enzyme activity (Gelatinase, Lipase, Urease, DNase, Caseinase, Phospholipase and
Proteinase). The isolates were also tested for biofilm formation and susceptibility to
antifungal agents itraconazole, fluconazole and amphotericin B. In re-identification by Vitek®
2 of 52 isolates, 44/52 (85%) were identified as C. parapsilosis, and 8 (15%) had their
readings as other species of Candida genus. By technique PCR, 44/52 isolates were identified
as C. parapsilosis, 5/52 (9%) C. orthopsilosis and 3/52 (6%) of the specie C. metapsilosis.
The caseinase exoenzymes, urease and gelatinase were not secreted by species of C.
parapsilosis Complex. DNase exoenzyme was produced by 4/52 isolates, all of C.
parapsilosis. The exoenzymes proteinase, phospholipase and lipase were produced by 48/52,
27/52 and 51/52 of the isolates, respectively. All isolates of the C. parapsilosis Complex were
able to produce biofilm varying the intensity of this virulence fator. In vitro susceptibility
testing to antifungal agents, 89% of C. parapsilosis isolates were susceptible to fluconazole,
79% were susceptible to itraconazole and 100% were susceptible to amphotericin B. The C.
orthopsilosis and C. metapsilosis species has presented the pattern of sensitivity (100%) for
all isolates exposed to pharmacological action of fluconazole and amphotericin B. Some
samples of the Complex were resistant to itraconazole and at least one sample of each species
showed dose-dependent sensitivity to the drug. The results reinforce the need for surveillance
to monitor the incidence of these opportunistic pathogens in the region.
Keywords: C. parapsilosis Complex, Molecular Identification, Identification Biochemistry,
Virulence Factors.
12
1 INTRODUÇÃO
1.1 HISTÓRICO, PERFIL TAXONÔMICO E MORFOLÓGICO DE Candida
parapsilosis
A espécie Candida parapsilosis foi isolada pela primeira vez em 1928 por Asford, das
fezes diarreicas de um paciente em Porto Rico, sendo primeiramente denominada de Monilia
parapsilosis para distingui-la dos isolados mais frequentes de Monilia psilosis, hoje conhecida
como Candida albicans (Trofa et al., 2008; Nosek et al., 2009). No ano de 1932, a espécie foi
reclassificada como Candida parapsilosis, nomenclatura esta utilizada atualmente (Langeron
& Talice, 1932).
No que concerne à classificação taxonômica, de acordo com o sitio oficial de
classificação de fungos, www.speciesfungorum.org, esta levedura pertence ao Reino Fungi,
Filo Ascomycota, Classe Saccharomycetes, Ordem Saccharomycetales, Gênero Candida
(Speciesfungorum, 2014). A classificação em nível de Família para a espécie C. parapsilosis
não foi atribuída até o presente momento, bem como para muitas outras (377 espécies) do
Gênero Candida, como Candida albicans e Candida tropicalis. O último escrutínio
taxonômico para C. parapsilosis ocorreu em 2010 (Catalogue of Life, 2014).
Quanto às características morfológicas, quando cultivada em ágar Sabouraud –
Dextrose e em outros meios micológicos como o ágar Batata, sob temperaturas entre 25ºC e
37ºC dentro de 48 horas (Sidrim & Rocha, 2010), C. parapsilosis exibe colônias com aspecto
variado: coloração de tonalidade branca ou bege, textura cremosa, superfície lisa, sulcada ou
enrugada, aparência brilhante ou opaca (Trofa et al., 2008; Nosek et al., 2009; Sidrim &
Rocha, 2010). Na micromorfologia, as células de C. parapsilosis exibem formas ovais,
redondas ou cilíndricas (Trofa et al., 2008; Nosek et al., 2009) e diferentemente das espécies
C. albicans e C. tropicalis que podem apresentar-se em múltiplas formas morfogenéticas
(Trofa et al., 2008), C. parapsilosis não forma hifas verdadeiras (Trofa et al., 2008; Nosek et
al., 2009). Esta levedura dimórfica quando cultivada em ágar-fubá (microcultivo em lâmina),
exibe pseudomicélio reto com células alongadas cujas ramificações muito regulares lhes
conferem aspecto de pinhos da floresta, com blastoconídios esféricos ou ovais formados nas
constrições das pseudohifas (Lacaz et al., 2002).
As variações que ocorrem na morfologia celular e das colônias de C. parapsilosis
estão relacionadas com mecanismos moleculares, com sua transição dimórfica e em resposta a
um conjunto de aminoácidos, especialmente citrulina (Trofa et al., 2008; Nosek et al., 2009).
13
A patogenicidade de C. parapsilosis é limitada pela pele intacta, uma vez que se trata de
uma levedura comensal da microbiota humana (Trofa et al., 2008; Sidrim & Rocha, 2010). É
uma levedura oportunista com potencial de patogenicidade para candidíase superficial e
sistêmica, apesar de menos comum do que Candida albicans (Lacaz et al., 2002), contudo
tem emergido como patógeno de importante impacto nos serviços de saúde (Trofa et al.,
2008), alavancando diversos estudos para melhor caracterizar este microrganismo.
1.2 O COMPLEXO C. parapsilosis
Até a última década, as pesquisas considerando a frequência do gênero Candida nos
isolados de diferentes sítios corpóreos, além das demais espécies deste gênero, faziam
referência apenas à espécie C. parapsilosis não havendo conhecimento da existência das duas
outras espécies correlatas (Kuhn et al., 2004; Laupland et al., 2005), apesar de Scherer e
Stevens (1987) já terem demonstrado uma heterogeneidade genética em isolados clínicos de
C. parapsilosis através da técnica de RFLP, evidenciando três grupos distintos (Scherer &
Stevens,1987).
Cerca de dez anos após a publicação destes dados e com os avanços no campo da biologia
molecular, uma investigação de 45 amostras, das quais 32 foram provenientes de um surto de
infecção hospitalar em San Antonio – Texas tendo como agente etiológico C. parapsilosis,
revelou a presença de três grupos distintos entre os isolados clínicos identificados como C.
parapsilosis. A distinção foi estabelecida com base nos perfis de isoenzimas (Figura 1) e
através da análise da região 5,8S do DNA ribossomal e de suas regiões adjacentes ITS1
(espaçador transcrito interno) e ITS2. Os grupos foram então denominados como Grupo I,
Grupo II e Grupo III. Assim, a heterogeneidade genotípica dos isolados de C. parapsilosis
evidenciava diferenças suficientes para caracterizar duas novas espécies (Lin et al., 1995).
14
Figura 1 - Perfis de isoenzimas definindo três grupos distintos de C.
parapsilosis: Linhas 1 a 4 – Grupo I; linhas 5 a 8 – Grupo II; linhas 9 e 10 –
Grupo III. EST (esterase), SOD (superóxido dismutase), GDH (glicose 6-fosfato
desidrogenase), MDH (malato desidrogenase), CAT (catalase), ACP (fosfatase
ácida), β-Glu (β-glicosidase) (Lin et al., 1995).
15
Outros estudos confirmaram a existência de diferenças entre os subgrupos de C.
parapsilosis assinalando a possibilidade da designação de duas novas espécies (Roy &
Meyer,1998; Kato et al., 2001).
Finalmente, os estudos de Tavanti et al. (2005), utilizando 32 isolados de diversos
sítios (unhas, vagina, boca, mãos, sangue, cateter, válvula aórtica, entre outros) originados de
várias regiões do mundo (Reino Unido, Coréia, Portugal, Espanha, Estados Unidos, entre
outras) e submetidos à técnica molecular RAPD-PCR (Randomly Amplified Polymorphic
DNA – Reação em Cadeia da Polimerase) com o primer RPO2 (Figura 2) atestaram
importante nível de diferenças genotípicas dos isolados de C. parapsilosis. A PCR também
foi utilizada para amplificar fragmentos de DNA presentes somente no grupo I, nos grupos I e
II, nos grupos I e III e presentes nos três grupos totalizando dez genes que foram
posteriormente sequenciados. Adicionalmente, foram realizadas análises das sequências das
regiões ITS, ITS2 e das regiões variáveis D1 e D2 do rRNA. O elevado polimorfismo na
região ITS1 dos grupos, não justificava a continuidade da designação como subespécies e
validaram a separação dos grupos de C. parapsilosis I a III de outras espécies de leveduras,
possibilitando a designação formal de três espécies distintas. Com isso, a denominação
Candida parapsilosis ficou reservada para o Grupo I e foram propostas duas novas espécies,
Candida orthopsilosis (Grupo II) e Candida metapsilosis (Grupo III) (Tavanti et al., 2005).
As denominações anteriores por grupos foram substituídas surgindo, portanto, o que
tem sido denominado pelos pesquisadores de Complexo C. parapsilosis (Lockhart et al.,
2008; Chen et al., 2010; Sabino et al., 2011; Sai et al., 2011; Bonfietti et al., 2012; Feng et
al., 2012), Complexo Psilosis (Nosek et al., 2009; Bertini et al., 2013), Grupo Psilosis
(Vercher et al., 2011) e Família C. parapsilosis (Sabino et al., 2010). Para esta perquisa, o
termo adotado para referenciar as três espécies foi Complexo C. parapsilosis.
Para fazer referência quanto à espécie C. parapsilosis propriamente dita, no presente
estudo será utilizada a denominação C. parapsilosis (stricto sensu) tais quais alguns estudos
na literatura (van Asbeck et al., 2008; Sabino et al., 2010; Garcia-Effron et al., 2011; Feng et
al., 2012; Peman et al., 2012). Para mencionar a espécie C. parapsilosis antes da separação
das três espécies será utilizado nesta pesquisa o termo C. parapsilosis (lato sensu).
16
1.2.1 Candida parapsilosis
C. parapsilosis foi a primeira espécie do complexo a ser descrita (Langeron & Talice,
1932). Anteriormente conhecida como Grupo I (Lin et al., 1995), tem sido denominada por
alguns autores como C. parapsilosis stricto sensu (van Asbeck et al., 2008; Sabino et al.,
2010; De Toro et al., 2011; Garcia-Effron et al., 2011; Feng et al., 2012; Peman et al., 2012;
Souza et al., 2012) indicando a diferenciação das demais espécies do complexo.
Pelas características morfológicas é indistinguível das espécies C. orthopsilosis e C.
metapsilosis (Figura 3), sendo possível diferenciá-las somente com base nas características
genotípicas (Tavanti et al., 2005). A cepa de referência de C. parapsilosis é a ATCC 22019.
Figura 2 – Padrões RAPD produzidos para amostras de C.
parapsilosis. Linhas 1 e 2, perfis RAPD obtidos para C. parapsilosis
Grupo I (A); Linhas 3 a 11, C. parapsilosis Grupo II (B1 a B4);
Linhas 12 e 13, C. parapsilosis Grupo III (C); M, ladder 100pb
(Tavanti et al., 2005).
17
1.2.2 Candida orthopsilosis (Tavanti et al., 2005)
A nova espécie C. orthopsilosis outrora conhecida como C. parapsilosis grupo II, é
morfologicamente indistinguível das espécies C. parapsilosis e C. metapsilosis. A
diferenciação dá-se com base nas seguintes características de nucleotídeos, dado o gene, a
posição do nucleotídeo no gene e o nucleotídeo fixado em C. orthopsilosis: SYA1 (putative
alanyltRNA synthetase), 101, C; 299, T; e 311, T; e SADH (secondary alcohol
dehydrogenase), 10, A; 28, C; 58, T; 76, T; 128, T; 149, A; 170, A; 197, T; 260, T; 275, T;
341, A, 350 A; 422, T; 431, G; 512, G; 518, C, e 524, G. O holótipo ( cepa ATCC 96139) foi
originalmente isolado do surto em San Antonio, a partir da ponta de um catéter utilizado para
monitorar a pressão venosa central, e tem todas as referidas características.
A denominação orthopsilosis indica afinidade com C. parapsilosis e C. metapsilosis.
1.2.3 Candida metapsilosis (Tavanti et al., 2005)
Designada anteriormente como C. parapsilosis grupo III, a nova espécie C.
metapsilosis também não pode ser distinguida morfologicamente das duas outras do
complexo Psilosis. A espécie é diagnosticada pelas características baseadas em DNA, dada a
posição de nucleotídeos e de base específica para C. metapsilosis: SYA1 (putative alanyltRNA
synthetase), 101, T; 299, C; e 311, A; e SADH (secondary alcohol dehydrogenase), 10, G; 28,
T; 58, A; 76, A; 128, C; 149, T; 170, G; 197, C; 260 C; 275, G; 341, T; 350, G; 422, C; 431,
C; 512, A; 518, A; e 524, T. A Estirpe holótipo (ATCC 96144) tem todas as características
citadas. Foi originalmente isolada a partir de uma amostra de mão, em Tacoma, Washington.
A designação metapsilosis indica afinidade com C. parapsilosis e C. orthopsilosis. Os
autores abstiveram-se de propor nomes de espécies mais individualizados em virtude do
reconhecimento da indistinguibilidade fenotípica das três espécies nos testes utilizados,
optando pelos prefixos "orto" (originalmente significando "certo” ou correto”) e "meta"
(originalmente significando "com" ou "pós"), juntamente com "para" usados por químicos
para apontar diferentes posições no mesmo anel de seis membros.
18
Figura 3 – Macromorfologia do Complexo C. parapsilosis: a) Candida parapsilosis,
amostra IEC 9; b) Candida parapsilosis, amostra IEC 12CT; c) Candida orthopsilosis,
amostra IEC 237; d) Candida orthopsilosis, amostra IEC 276; e) Candida metapsilosis,
amostra IEC 114; f) Candida metapsilosis, amostra IEC 171; Semeio em ágar Batata e
incubação por 48 h a 30ºC. Laboratório de Micologia – IEC, 2014.
19
1.3 EPIDEMIOLOGIA DAS ESPÉCIES DO COMPLEXO C. parapsilosis
A levedura C. parapsilosis é um microrganismo ubíquo e contrastando com outras
espécies de Candida, não é um patógeno humano obrigatório, ocorrendo relatos inclusive do
isolamento a partir de fontes não humanas como animais domésticos, insetos, solo, plantas e
ambientes marinhos (Trofa et al., 2008; Nosek et al., 2009; van Asbeck, et al., 2009).
Em se tratando do ambiente hospitalar, a epidemiologia de C. parapsilosis apresenta
singularidade uma vez que tem sido frequentemente isolada de superfícies físicas (van Asbeck
et al. (2009).
A incidência de fungemias por C. parapsilosis tem aumentado dramaticamente (Trofa
et al., 2008; Pemán, et al., 2012) sendo a segunda espécie de fungos oportunistas mais
comumente isolada de hemoculturas de várias áreas geográficas de acordo com Trofa et al.
(2008). Na Europa tem ocorrido uma mudança na epidemiologia das doenças fúngicas
invasivas com significativo aumento de infecções causadas por espécies não-albicans dentre
as quais C. parapsilosis (Lass-Flörl, 2009).
Um estudo de vigilância conduzido no Canadá por um período de cinco anos
evidenciou C. parapsilosis (lato sensu) como terceira espécie mais prevalente nas
candidemias invasivas (Laupland et al., 2005).
Na América Latina, poucos estudos têm sido conduzidos (Nucci et al., 2010;
Sifuentes-Osornio et al., 2012), sendo cogitado por Nucci et al. (2010) que a alta incidência
de candidíases por C. parapsilosis revelada nas pesquisas realizadas nos países latino-
americanos pode ser devida a um misto de fatores, dentre os quais, diferenças dos recursos
disponíveis para atendimento médico e programas de treinamentos, dificuldades na
implementação de programas de controle de infecção em hospitais de países emergentes, um
número limitado de profissionais de saúde disponíveis para assistência aos pacientes em
Unidade de Terapia Intensiva (UTI), e o uso empírico e profilático de drogas antifúngicas.
No Brasil são raros os estudos com Candida não-albicans, especialmente C.
parapsilosis. Segundo Colombo et al. (2006), a incidência de candidemia em hospitais
terciários é em grande parte desconhecida, e não há dados nacionais disponíveis, sendo as
pesquisas relacionadas a estudos observacionais em número limitado de centros médicos e
revisões retrospectivas. A predominância de C. parapsilosis foi demonstrada num estudo
multicêntrico nos anos de 2003 e 2004 em 11 centros médicos de nove cidades brasileiras
constatando-se que C. parapsilosis (lato sensu) representou a terceira espécie predominante
20
entre os casos, sendo a segunda causa de infecção nos casos pediátricos (Colombo et al.,
2006).
Em três estudos regionais brasileiros com pacientes provenientes dos Estados de
Pernambuco, Mato Grosso e São Paulo, C. parapsilosis (lato sensu) figurou como a segunda
espécie mais prevalente (Macêdo et al., 2009; Bruder-Nascimento et al., 2010; Favalessa et
al., 2010).
Após o reconhecimento formal das espécies do complexo C. parapsilosis, C.
parapsilosis (stricto sensu) tem emergido como um importante agente patogênico responsável
por infecções hospitalares, sendo a segunda causa mais comum de espécies de Candida
isoladas de infecções invasivas (Bonfietti et al., 2012; Feng et al., 2012).
Em pesquisa brasileira conduzida por Bonfietti et al. (2012), das 37 amostras
inicialmente classificadas como C. parapsilosis, após análise molecular pela técnica RFLP-
PCR usando a enzima de restrição BanI, 34 foram caracterizadas como C. parapsilosis, e 3
isolados foram reclassificados como C. orthopsilosis, não havendo ocorrência de C.
metapsilosis. Este resultado é similar ao encontrado num estudo multicêntrico de vigilância
realizado na Espanha, no qual a espécie C. parapsilosis foi a segunda mais predominante e C.
orthopsilosis foi a quinta espécie mais isolada dos espécimes clínicos (Pemán et al., 2012).
Uma coleção de 122 isolados de C. parapsilosis de um hospital universitário na
Espanha foi submetido à identificação molecular pela técnica RAPD com o primer RPO2 e
digestão do fragmento do gene SADH com a endonuclease BanI, sendo 91% classificados
como C. parapsilosis (stricto sensu), 8,2% das cepas reclassificadas como C. orthopsilosis e
0,8% como C. metapsilosis (de Toro et al., 2011).
Em estudo com isolados do Brasil e Espanha caracterizados por PCR em tempo real,
50 isolados foram classificados como C. parapsilosis (stricto sensu), 40 como C.
orthopsilosis e 10 como C. metapsilosis. A amostragem expressiva desta pesquisa valida a
espécie C. parapsilosis como a mais predominante do complexo C. parapsilosis (Souza et al.,
2012).
De fato, C. metapsilosis tem sido relatada como a espécie mais raramente recuperada a
partir de amostras clínicas (de Toro et al., 2011), além de que a prevalência de C. parapsilosis
em detrimento de C. orthopsilosis e C. metapsilosis já havia sido documentada ainda quando
designadas as espécies como grupos I, II, e III, respectivamente, sendo cogitado pelos autores
que a proeminência do grupo I seria devido à sua alta estabilidade no ambiente (Lin et al.,
1995).
21
Tais resultados parecem demonstrar que existem diferenças na epidemiologia das
fungemias pelos agentes do complexo C. parapsilosis, entre as diferentes áreas geográficas,
ressaltando-se a necessidade de vigilância contínua para monitorar tendências na incidência,
distribuição geográfica das espécies, e perfis de susceptibilidade aos antifúngicos (Colombo et
al., 2006).
1.4 FATORES DE RISCO
Na medicina contemporânea, as leveduras do gênero Candida denotam grande
importância devido à alta capacidade de colonizar e infectar o hospedeiro humano. Como
microrganismos comensais do homem, os fungos tornam-se patogênicos quando existem
mudanças nos mecanismos imunes do hospedeiro ou quando as barreiras anatômicas
secundárias estão comprometidas ou na ocorrência de procedimento médico invasivo
(Colombo et al., 2013).
Considerando os pacientes hospitalizados, as leveduras em questão são uma real
ameaça tendo as mãos dos trabalhadores de saúde como vetor para a aquisição de infecções
exógenas, e devido ao fato da inexecução dos protocolos de lavagem das mãos (Bonassoli et
al., 2005; Trofa et al., 2008). A pesquisa de um surto de candidíase em uma UTI neonatal
permitiu a identificação de dois genótipos principais de C. parapsilosis como a causa do surto
e como resultado de infecção cruzada com as mãos dos trabalhadores da saúde, evidenciando
a gravidade das consequências do descumprimento dos procedimentos de higiene das mãos
pela equipe de saúde (Hernández-Castro et al., 2010). Estudo regional brasileiro constatou
que C. parapsilosis foi a levedura mais frequentemente isolada (51%) das mãos de pessoas
saudáveis, incluindo os trabalhadores da unidade de terapia intensiva neonatal, aumentando
para os pacientes assistidos o risco de desenvolvimento de uma doença invasiva (Bonassoli et
al., 2005).
A doença invasiva causada por C. parapsilosis pode ocorrer sem a colonização prévia
e é frequentemente transmitida horizontalmente através de fontes externas contaminadas
(Trofa et al., 2008), sendo relatado por diversos autores os seguintes fatores de risco: o uso de
dispositivos, próteses e cateteres venosos centrais, uso de nutrição parenteral, internação em
UTI com necessidade para a admissão ou ventilação mecânica prolongada (Bonassoli et al.,
2005; Laupland et al., 2005; Trofa et al., 2008; Pappas et al., 2009; Sifuentes-Osornio et al.,
2012).
22
Quanto aos grupos mais suscetíveis tem sido descrito que neonatos, pacientes
imunocomprometidos, transplantados, queimados, neutropênicos, submetidos a
procedimentos cirúrgicos, pacientes em condições subjacentes e/ou diagnósticos tais como
hemodiálise, diabetes mellitus, neoplasias malignas, doenças do fígado e hematológicas, tem
risco aumentado para a ocorrência de fungemias de um modo geral (Laupland et al., 2005;
Trofa et al., 2008; Pappas et al., 2009), e no que concerne à C. parapsilosis como agente
patogênico, destacam-se como fatores de risco o uso de cateteres venosos, pacientes
recebendo nutrição parenteral total e neonatos de muito baixo peso (Kuhn et al., 2004;
Bonassoli et al., 2005; Trofa et al., 2008; Butler et al., 2009; Sifuentes-Osornio et al., 2012).
O uso de algumas terapias medicamentosas como antimicrobianos de espectro
estendido, terapia imunossupressora, uso de esteróides e bloqueadores H2 também tem sido
associados com risco de candidíases invasivas (Laupland et al., 2005; Lass-Flörl, 2009).
1.5 MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS
Conforme relatado anteriormente, C. parapsilosis é a segunda causa mais comum de
espécies de Candida isoladas de pacientes com infecções invasivas tais como fungemia e
endocardite (Trofa et al., 2008; Feng et al., 2012).
Outras graves manifestações clínicas relacionadas à C. parapsilosis são: meningite,
peritonite, artrite, infecção ocular, otomicose, onicomicose e infecções do trato urinário (Trofa
et al., 2008; Pappas et al., 2009; Bruder-Nascimento et al., 2010; Aguado et al., 2011). Chen
et al. (2012) pesquisando infecções fúngicas invasivas em paciente chineses com lúpus
eritematoso sistêmico constataram que um dos 18 casos estudados teve C. parapsilosis como
agente patogênico. Também relacionado a pacientes imunocomprometidos, no Brasil foi
relatado um caso raro de paciente com espondilodiscite causada por C. parapsilosis (Valiengo
et al., 2007).
A candidíase superficial é outra forma clínica comumente encontrada na prática
clínica, apresentando-se com os tipos clínicos: cutânea, das mucosas (oral, vulvovaginal, ou
balanoprepucial), mucocutânea, crônica e granulomatosa (Feng et al., 2012).
Uma destas manifestações clínicas superficiais, a candidíase vaginal, foi utilizada
como modelo num estudo experimental para avaliar comparativamente a capacidade in vivo
de C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis para colonizar e causar uma infecção
sintomática. Os resultados demostraram que as espécies do complexo C. parapsilosis são
23
hábeis em induzir vaginite em ratas tratadas com estrogênio, ocorrendo, todavia, menor
patogenicidade com a espécie C. metapsilosis (Bertini et al., 2013).
A elevação do número de casos de micoses sistêmicas em diversos grupos de
pacientes tem despertado grande interesse da comunidade científica e profissionais de saúde
(Sidrim & Rocha, 2010), especialmente porque a candidíase invasiva tem maior impacto na
evolução do paciente, sendo estimado que a mortalidade atribuível da infecção invasiva seja
elevada, em torno de 47%, apesar das autoridades estimarem a mortalidade atribuível entre
15% a 25% para adultos e de 10% a 15% para neonatos (Pappas et al., 2009). As taxas de
mortalidade relatadas para C. parapsilosis variam entre 4% e 70% (Trofa et al., 2008;
Bonfietti et al., 2012; Sifuentes-Osornio et al., 2012).
No Brasil, os dados de um estudo multicêntrico no qual C. parapsilosis (lato sensu) foi
a segunda espécie não-albicans mais predominante, revelou que as candidemias são
importantes causas de morbidade, com uma substancial carga de doenças, mortalidade e
provavelmente elevando os custos associados (Colombo et al., 2006).
1.6 FATORES DE VIRULÊNCIA
As doenças invasivas têm sua patogênese facilitada por fatores de virulência, dos quais
pouco se conhece em se tratando de C. parapsilosis (Trofa et al., 2008). Quanto às demais
espécies do complexo C. parapsilosis, mais limitados são os dados sobre os determinantes de
virulência (Bertini et al., 2013), logo, este é um desafiador campo de pesquisa para melhorar o
diagnóstico, tratamento e prevenção de doenças causada por C. parapsilosis, C. orthopsilosis
e C. metapsilosis.
1.6.1 Formação de Biofilme
Biofilmes são definidos como comunidades de microrganismos (Figura 4) e seus
produtos extracelulares (matriz adesiva protetora) associados em uma interface e, tipicamente,
ligados a uma superfície abiótica ou biótica. A colonização de superfícies pode permitir que
os microrganismos invadam células das mucosas, alterem o fluxo de cálcio nas células
epiteliais e liberem toxinas (Davey & O’Toole, 2000).
24
O passo inicial para C. parapsilosis no processo patogênico é a sua adesão às zonas
superficiais do hospedeiro (Lacaz et al., 2002; Kuhn et al., 2004; Trofa et al., 2008; Bertini et
al., 2013; Costa et al., 2013) e esta aderência a dispositivos médicos de longa duração, tais
como cateteres venosos e arteriais, válvulas cardíacas, dentre outros, facilita a formação de
biofilme (Trofa et al., 2008) e consequentes infecções fúngicas (Tavanti et al., 2010;
Sifuentes-Osornio et al., 2012). A ótima capacidade de adesão destes patógenos recuperados
de urina e sangue pode ainda facilitar a invasão ao sistema nervoso central ou estabelecer
infecção do trato urinário considerando o movimento destes fluidos (Bliss et al., 2012).
A habilidade de C. parapsilosis (lato sensu) para a formação de biofilme foi avaliada
em isolados da corrente sanguínea e da pele. A diferença estatisticamente significante na
positividade de biofilme nos isolados do sangue (59%) e da pele (19%) sugere que este fator
de virulência tem um importante papel no desenvolvimento de infecções de corrente
sanguínea (Ruzicka et al., 2007). Por outro lado, não foram encontradas diferenças
significativas quando comparada a formação de biofilme entre isolados de sangue e de outros
sítios, ao serem analisadas 122 amostras com positividade de 58,8% de produção de biofilme
por C. parapsilosis (de Toro et al., 2011).
Outra pesquisa com C. parapsilosis (lato sensu), constatou que biofilmes foram
produzidos por todos os isolados quando cultivados em uma solução contendo glicose
(Bonassoli et al., 2005). A capacidade das espécies de Candida para produzir biofilmes in
Figura 4 – Imagem de microscopia eletrônica de varredura
mostrando a arquitetura do biofilme de Candida parapsilosis em
filtros microporosos de policarbonato (diâmetro de 25 mm;
tamanho dos poros, 12 µm; Millipore) (Samaranayake et al,
2005).
25
vitro pode refletir o seu potencial para causar fungemias relacionadas com cateteres venosos
centrais em doentes que receberam nutrição parenteral total (Kuhn et al., 2004; Bonassoli et
al., 2005).
A capacidade de isolados clínicos das espécies do complexo C. parapsilosis em
formar biofilme foi averiguada por Lattif et al. (2010) sendo constatado que as três espécies
foram hábeis em formar biofilmes com topografia de superfície e arquitetura semelhantes.
Este estudo contrasta com os resultados de uma pesquisa posterior que comprovou que C.
parapsilosis (stricto sensu) foi a única espécie capaz de formar biofilmes (65 de 111
amostras), enquanto que nenhum dos 10 isolados de C. orthopsilosis nem o único isolado de
C. metapsilosis foram hábeis em produzir biofilme in vitro (de Toro et al., 2011).
Outra pesquisa avaliou se a produção de biofilme por espécimes clínicos de C.
parapsilosis (stricto sensu) seria influenciada pela temperatura (30ºC e 37ºC), considerando
que esta levedura é capaz de colonizar sítios anatômicos com temperaturas centrais diferentes.
Os resultados obtidos indicaram que este parâmetro não afeta significativamente a capacidade
de formação de biofilme in vitro, com pequenas diferenças na quantidade de matriz
extracelular produzida em diferentes temperaturas (Tavanti et al., 2010).
A detecção para a habilidade na formação de biofilme é importante para o prognóstico
da infecção, uma vez que a sua presença no foco de infecção geralmente caracteriza
cronicidade (Ruzicka et al., 2007).
Este fator de virulência torna-se importante ainda, na medida em que confere
resistência significativa aos fármacos antifúngicos limitando a penetração de substâncias
através da matriz e protegendo a célula a partir das respostas imune do hospedeiro (de Toro et
al., 2011). Os microrganismos em biofilmes também se tornam mais resistentes ao tratamento
do que aqueles na forma planctônica, ou seja, circulando livremente (Bonassoli et al., 2005;
Ruzicka et al., 2007).
Considerando a relevância clínica dos biofilmes, torna-se necessário ampliar os
conhecimentos sobre os mecanismos moleculares que levam a produção dos mesmos, assim
como a regulação genética e expressão de fatores genômicos que poderiam conduzir às
estratégias para impedir ou reduzir sua formação (Pasternak, 2009).
26
1.6.2 Secreção de Enzimas
As enzimas extracelulares secretadas por patógenos microbianos têm adquirido
atenção significativa por seu potencial papel na patogênese e como possível alvo para o
desenho de inibidores sintéticos para tratar a infecção, segundo Trofa et al. (2008), os quais
mencionam o papel de três enzimas secretadas por C. parapsilosis: proteinase aspártica
secretora (SAP), fosfolipases e lipases.
Em pesquisa analisando 26 isolados de C. parapsilosis recuperados da pele de
indivíduos, foi averiguado que todos foram produtores de proteinases (Bonassoli et al., 2005).
Similarmente, em um estudo brasileiro com espécimes de pacientes imunocomprometidos do
Estado de Pernambuco, cinco dos seis isolados de C. parapsilosis (secreção traqueal, lavado
brônquico, tecido ósseo e pele) foram produtores de proteases (Macêdo et al., 2009). Todavia,
Kuhn et al. (2004) investigando um surto de C. parapsilosis (lato sensu) concluíram em seus
resultados que a expressão de SAP não foi fator crítico para este agente patogênico.
As espécies do complexo C. parapsilosis, pesquisadas na ocasião como grupos I, II e
III, foram caracterizados por diferenças na atividade de proteinase com a maioria do grupo I
(hoje designada como C. parapsilosis) sendo moderadamente ou fortes produtores de
proteinases. Para os grupos II (C. orthopsilosis) e III (C. metapsilosis) Lin et al., (1995)
recomendaram mais estudos com isolados clínicos para confirmar a característica de baixa
atividade de SAPs (Lin et al., 1995).
Quando esta característica fenotípica foi analisada por Tavanti et al., (2010)
exclusivamente para C. parapsilosis (stricto sensu), observou-se que a maioria dos isolados
(66,1%) produziu SAP in vitro. Curiosamente neste estudo, foi constatada uma correlação
inversa estatisticamente significativa entre a atividade proteolítica e a capacidade de produção
de biofilme. A existência de uma nova via, controlaria a formação de biofilme mediada por
proteínas em que diferentes reguladores globais modulariam a formação de biofilmes pelo
controle da expressão de proteases extracelulares de Staphylococcus aureus. A correlação
inversa observada aliada ao conhecimento dessa nova via, pode indicar que o impacto
negativo de proteases extracelulares na formação do biofilme é multifatorial, podendo
promover desprendimento e liberação de um biofilme maduro, via degradação de adesinas de
C. parapsilosis e / ou componentes da matriz extracelular (Tavanti et al., 2010).
Quanto às fosfolipases, o papel na patogênese de C. parapsilosis não está bem
esclarecido. Estas enzimas são capazes de hidrolisar uma ou mais ligações éster em
glicerofosfolipídeos e os resultados para as investigações de atividade fosfolipásica de C.
27
parapsilosis são contraditórios podendo justificar-se pelo número relativamente pequeno das
amostras, bem como às diferenças biológicas entre as cepas testadas nos estudos investigados
na revisão sistemática realizada por Trofa et al. (2008).
Em relação às lipases, suas funções incluem a digestão de lipídeos para a aquisição de
nutrientes, adesão às células e tecidos do hospedeiro, interações sinérgicas com outras
enzimas, hidrólise inespecífica devido a outras atividades fosfolipolíticas, iniciação do
processo inflamatório por afetar as células do sistema imunológico e autodefesa mediada pela
lise da microbiota concorrente (Trofa et al.,2008).
Os genes CpLIP1 e CpLIP2 tem sido vinculados à patogênese das infecções fúngicas
especialmente em se tratando de pacientes recém-nascidos com muito baixo peso e pacientes
recebendo nutrição parenteral rica em lipídios totais. A expressão destes genes poderia
explicar o crescimento tardio de organismos em meio com azeite de oliva ou in vivo (Trofa et
al., 2008). As lipases parecem ser necessárias para a proliferação ótima de C. parapsilosis em
soluções lipídicas, sendo consideradas como fatores de colonização nesse ambiente rico em
gordura (Gácser et al., 2007). O gene CpLIP2 e o seu produto enzimático (lipases) são alvos
potenciais para o desenvolvimento de drogas antifúngicas, particularmente para pacientes
recebendo emulsões lipídicas (Gácser et al., 2007; Trofa et al., 2008).
Para a produção de gelatinase, poucos estudos são encontrados, mas pelo menos para o
microrganismo Enterococcus faecalis a atividade da gelatinase foi demonstrada por Park et al.
(2007) como importante fator de virulência, pois esta enzima degradou um peptídeo
antimicrobiano induzível (Gm cecropina), conhecido por desempenhar um papel crítico na
defesa do hospedeiro durante a fase inicial da infecção microbiana. A gelatinase de E. faecalis
também inibiu a opsonização e a formação do complexo de ataque à membrana resultante da
ativação da cascata do complemento, por hidrolisar o componente C3a do complemento (Park
et al., 2007)
A atividade de outra enzima, a ectofosfatase, foi averiguada por Bertini et al. (2013),
considerando a relação desta enzima com propriedades de adesão da espécie C. parapsilosis.
Os resultados obtidos no estudo demonstraram que C. parapsilosis e C.
orthopsilosis tiveram capacidade de aderência similar em detrimento de C. metapsilosis com
reduzida capacidade de invadir e alterar a estrutura das células epiteliais bucais humanas
testadas. A habilidade de adesão às células do hospedeiro como fator de virulência, entretanto,
não demonstrou correlação significativa com os níveis da enzima ectofosfatase encontrada
para as três espécies do complexo C. Parapsilosis (Bertini et al., 2013).
28
1.7 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DAS INFECÇÕES POR ESPÉCIES DE
Candida
A rápida identificação de agentes causadores de doenças infecciosas é de extrema
importância para o uso de terapia adequada. A identificação de espécies do gênero Candida
por métodos convencionais muitas vezes é difícil e frequentemente inconclusiva (Junior et al.,
2010).
Sistemas automatizados ou semi-automatizados e cromogênicos ainda são usados para
identificação de leveduras, e baseiam-se na capacidade assimilativa de substratos bioquímicos
e enzimáticos. A realização do método e interpretação dos resultados são fáceis e em menor
tempo, porém com algumas limitações que prejudicam o entendimento de peculiaridades
clínicas e epidemiológicas, como também a diferenciação da terapia adequada a cada espécie
de importância médica deste gênero (Silva & Candido, 2005; Chagas-Neto et al., 2008).
Os métodos disponíveis para a identificação de espécies de Candida são numerosos e
a escolha de um deles é determinada pelo nível de identificação requerida, aspectos clínicos,
número total de amostras examinadas rotineiramente e recursos disponíveis no laboratório
(Williams & Lewis, 2000). O diagnóstico pode ser realizado por meio de técnicas fenotípicas,
moleculares e sorológicas.
Para se chegar à identificação em nível de espécie, podem ser utilizadas primeiramente
metodologias de identificação presuntiva, baseadas nas características fenotípicas (prova do
tubo germinativo e a prova da filamentação em ágar fubá acrescido de tween 80) e por meio
da utilização de meios de cultura cromogênicos e/ou diferenciais (Sidrim & Rocha, 2010). O
meio de cultura CHROMagar®
se baseia na utilização do substrato β-glicosaminidase e
diferencia as leveduras do gênero Candida de acordo com as características morfológicas e de
coloração das colônias crescidas (de Col et al., 2009). Tais resultados presuntivos neste meio
tem demonstrado serem úteis para diferenciar apenas a espécie C. parapsilosis (lato sensu)
das demais espécies do gênero Candida (Araujo et al., 2005; de Col et al., 2009; Mímica et
al., 2009) não sendo, todavia, eficaz na distinção das espécies do complexo C. parapsilosis.
Outro meio cromogênico utilizado é o meio ágar Eosina Azul de Metileno (EAM), um
meio diferencial utilizado para o isolamento e detecção de bactérias da família
Enterobacteriaceae ou bacilos coliformes relacionados, com base na fermentação de lactose
(Koneman et al., 2008). Com o objetivo de identificar presuntivamente leveduras com base
nas propriedades tintoriais exibidas pelo crescimento das colônias sob este meio, foram
29
realizados estudos para algumas espécies do gênero Candida como Candida glabrata (Bale et
al.,1997) e Candida kefyr (Munson et al., 2002), contudo, para as espécies do complexo C.
parapsilosis, a literatura ainda não dispõe de dados sobre a utilização deste meio, o qual pode
ser um recurso laboratorial eficaz para diferenciar morfologicamente as espécies.
1.7.1 Identificação Molecular
A detecção precoce da infecção tem grande impacto sobre o quadro clínico, por isso,
atualmente, o uso de métodos moleculares está sendo utilizado extensivamente para
identificação de microrganismos (Turenne et al., 1999). Alguns autores sugerem que a
avaliação de sequências de nucleotídeos, pode ser um método preciso para resolver problemas
taxonômicos gerados por identificação inconsistente de espécies fúngicas crípticas (Chagas-
Neto et al., 2008; Colombo et al., 2011).
Várias técnicas moleculares têm sido empregadas confirmando a diferenciação das
espécies do complexo, tais como: Polimorfismo de Comprimento de Fragmento
Amplificado (Amplification Fragment Lenght Polymorphism – AFLP) (Tavanti et al., 2007;
2010), marcadores polimórficos de microssatélites (Sabino et al., 2010; Romeo et al., 2012),
Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso (Randomly Amplified Polymorphic DNA –
RAPD) (van Asbeck et al., 2008; Hernández-Castro et al., 2010; de Toro et al., 2011),
seqüenciamento de genes ribossomais (Chen et al., 2010), Reação em Cadeia da Polimerase
(PCR) baseada em análise de endonuclease de restrição (PCR-REA) (Garcia-Effron et al.,
2011); multiplex PCR em tempo real usando sondas moleculares específicas (Garcia-Effron et
al., 2011), PCR em tempo real (Hays et al., 2011; Souza et al., 2012) e também tem sido
utilizada a sequência do gene SADH e das suas regiões ITS (espaçador interno transcrito)
analisadas por PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) (Mirhendi et al.,
2010).
Adicionalmente, García Martínez et al. (2010) desenvolveram primers para a espécie
C. parapsilosis e posteriormente os primers para C. orthopsilosis e C. metapsilosis foram
desenvolvidos por Vercher et al. (2011) facilitando, portanto, a identificação das espécies do
complexo C. parapsilosis pela amplificação de um fragmento do intron do gene RPSO.
1.7.2 Identificação Bioquímica
Estes sistemas baseiam-se na capacidade de assimilação de diferentes compostos,
principalmente os carboidratos, destacando como os mais utilizados os sistemas manuais API
30
20C®
(bioMérieux, França) e o ID 32C®
(bioMérieux, França); e o sistema automatizado
VITEK®
2 (bioMérieux, França). As metodologias tradicionais são laboriosas e consomem
muito tempo. Com o aumento da susceptibilidade de diferentes espécies de leveduras, a
identificação rápida torna-se clinicamente importante (Verweij, 1999).
O VITEK®
2 é um sistema de identificação microbiológica automatizado,
apresentando três formatos (VITEK 2 compact, VITEK 2 e VITEK 2 XL) com todos os
passos necessários para executar teste de identificação e susceptibilidade, oferecendo maior
segurança e resultados mais rápidos. As placas contêm 64 poços com substratos, sendo 46
testes bioquímicos que avaliam a utilização de fonte de carbono, as atividades enzimáticas e
perfil de resistência e sensibilidade a drogas. Os cartões têm códigos de barras que contêm
informações sobre o tipo de produto, número do lote, data de validade e um identificador
exclusivo que pode ser ligado à amostra antes ou depois de carregar o cartão no sistema,
conforme informações do fabricante (bioMérieux, França).
1.8 SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIFÚNGICOS
O tratamento terapêutico das candidíases invasivas inclui a retirada de quaisquer
corpos estranhos removíveis e a administração de um antifúngico sistêmico (Trofa et al.,
2008; Pappas et al., 2009; Aguado et al., 2011).
A terapia farmacológica para candidíase compreende as seguintes classes de agentes
antifúngicos: polienos (anfotericina B nas formulações: desoxicolato, em complexo lipídico e
em dispersão coloidal), triazólicos (fluconazol, itraconazol, voriconazol, e posaconazol),
equinocandinas (caspofungina, anidulafungina e micafungina), e o fármaco flucitosina
(Pfaller et al, 2004; Pappas et al., 2009). A flucitosina ou fluocitosina não tem registro na
Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), portanto não faz parte do arsenal
farmacoterapêutico do Brasil, até o presente momento. As demais drogas citadas têm registro
nesta agência reguladora, das quais o registro mais recente foi o concedido ao posaconazol em
outubro de 2011 (ANVISA).
Embora a suscetibilidade de Candida aos agentes antifúngicos atualmente disponíveis
geralmente seja previsível se a espécie infectante for conhecida, os isolados individuais em
geral não necessariamente seguem este padrão, evidenciando, portanto a relevância clínica
dos testes de susceptibilidade para orientar a conduta terapêutica, especialmente em situações
em que ocorre falta de resposta à terapia antifúngica inicial ou na suspeita de resistência
antifúngica aos azólicos (Pappas et al., 2009).
31
O Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) tem empreendido constantes
esforços para desenvolver testes de susceptibilidade de leveduras, padronizados, reprodutíveis
e clinicamente relevantes e tem disponibilizado através de sua metodologia M27-A3, testes de
susceptibilidade das espécies de Candida ao fluconazol, itraconazol, voriconazol, flucitosina,
e às equinocandinas (Pappas et al., 2009; Jenkins, & Schuetz, 2012). O CLSI fornece o ponto
de corte para a Concentração Inibitória Mínima (CIM) e dados interpretativos para Candida
spp. para estes agentes antifúngicos citados. Os pontos de corte do CLSI para o fluconazol,
voriconazol, e para as equinocandinas foram recentemente revisados (Jenkins & Schuetz,
2012).
O método de microdiluição em caldo é o teste de referência recomendado pelo CLSI,
contudo, vários outros testes têm sido utilizados e investigados tais como: Disco difusão
(Vasconcelos Jr et al., 2011), Etests®
(bioMérieux, França), Sensititre YeastOne®
(Trek
Diagnostic Systems, EUA), Neo-Sensitabs®
ensaio de difusão utilizando tabletes com discos
de papel (Rosco, Dinamarca), e sistemas automatizados como o VITEK 2®
(bioMérieux,
França) (Bourgeois et al., 2010; Peterson et al., 2011; Jenkins & Schuetz, 2012).
Muitos estudos têm sido empreendidos para análise dos padrões de resistência
antifúngica, tanto globalmente quanto regionalmente de acordo com Sifuentes-Osornio et al.
(2012), bem como tem sido publicadas diretrizes e recomendações para orientar o uso
racional dos antifúngicos de conhecida eficácia terapêutica (Pappas et al., 2009; Aguado et
al., 2011; Colombo et al., 2013).
Na América Latina, a anfotericina B desoxicolato é o antifúngico mais utilizado,
seguido pelo fluconazol (Sifuentes-Osornio et al., 2012), inclusive em vários hospitais
públicos terciários brasileiros a anfotericina B é a droga mais comumente usada em vários
tratamentos sistêmicos de micoses, em que os pacientes permanecem hospitalizados por
longos períodos (Bruder-Nascimento et al., 2010). Embora não exista ponto de corte do CLSI
atualmente aprovado para o padrão de resistência à anfotericina B (Jenkins, & Schuetz, 2012),
as pesquisas brasileiras em geral têm apontado uma alta sensibilidade de C. parapsilosis à
este fármaco (Colombo et al., 2006; Mímica et al., 2009; Bonfietti et al., 2012) apesar de já
existirem dados relatando resistência da espécie à droga em questão, nos estados de São Paulo
e Mato Grosso (Bruder-Nascimento et al., 2010; Favalessa et al., 2010).
Quanto aos triazólicos, Lass-Flörl (2011) discorre em sua revisão comparativa que os
medicamentos desse grupo de agentes antifúngicos têm uma boa atividade in vitro e in vivo
contra C. parapsilosis (lato sensu). Contudo, os resultados dos testes de susceptibilidade
32
publicados recentemente não têm demonstrado homogeneidade. Alguns trabalhos relatam que
todos os isolados de C. parapsilosis foram sensíveis aos triazólicos testados (Tavanti et al.,
2005; Colombo et al., 2006; Serefhanoglu et al., 2012). Por outro lado, a resistência ao
fluconazol, itraconazol ou voriconazol, bem como a susceptibilidade dose-dependente tem
sido descritas com relativa frequência (Bonassoli et al., 2005; Mímica et al., 2009; Bruder-
Nascimento et al., 2010; Favalessa et al., 2010; Tavanti et al., 2010; Pfaller et al., 2011,
Clinical breakpoints for voriconazole and Candida spp.; Pemán et al., 2012).
Entre as espécies do complexo C. parapsilosis, diferenças têm sido relatadas na
resposta ao fluconazol com CIMs próximos ao ponto de corte para C. orthopsilosis e C.
metapsilosis e isolados de ambas as espécies exigindo uma maior concentração de fluconazol
para inibir seu crescimento, enquanto que C. parapsilosis teve seu crescimento inibido com
concentrações próximas da CIM (Szabó et al., 2009).
Para Lass-Flörl (2009) o uso profilático de fluconazol bem como mudanças na
estratégia para tratamento de populações consideradas de risco na Europa são prováveis
razões para a modificação na epidemiologia de doenças fúngicas invasivas neste continente.
Também foi observado que exposição anterior ao fluconazol esteve relacionada à candidemia
causada por isolados do fungo resistentes a este fármaco (Bonfietti et al., 2012).
De acordo com Bonfietti et al. (2012) o isolado de C. parapsilosis (stricto sensu) que
exibiu alto CIM para fluconazol (4 mg/L) também foi resistente ao voriconazol (CIM de 0,25
mg/L). Tal fato evidencia o potencial problema de resistência cruzada entre azólicos.
(Colombo et al., 2006; Favalessa et al., 2010; Pfaller et al., 2011, Clinical breakpoints for
voriconazole and Candida spp.).
Para as equinocandinas (caspofungina, micafungina e anidulafungina) a espécie C.
parapsilosis (stricto sensu) tem evidenciado menor sensibilidade in vitro do que as demais
espécies do complexo C. parapsilosis (van Asbeck et al., 2008; Pappas et al., 2009; Bonfietti
et al., 2012). Tavanti et al. (2010) analisaram exclusivamente C. parapsilosis (stricto sensu) e
descreveram que todos os isolados apresentaram reduzida susceptibilidade às equinocandinas,
sendo cogitado que este aspecto fenotípico da levedura esteja relacionado à mudança do
aminoácido prolina por alanina na enzima glucano sintetase codificada pelo gene fks1
(Tavanti et al., 2010). A enzima glucano sintetase catalisa a biossíntese de β-1,3 glucano,
principal componente da parede celular das leveduras, sendo esta enzima o alvo do
mecanismo de ação das equinocandinas, cuja maior resistência da espécie C. parapsilosis a
estas drogas é devida à ocorrência natural de um polimorfismo na extremidade de HS1 no
33
gene fks1, de acordo com Pfaller et al. (2011, Clinical breakpoints for the echinocandins and
Candida revisited).
Embora in vitro esta susceptibilidade de C. parapsilosis às equinocandinas apresente-
se reduzida, ensaios clínicos tem demonstrado boa eficácia destas drogas às infecções por
estas leveduras, de acordo com recente protocolo brasileiro para o manejo das candidemias
(Colombo et al., 2013).
Outra característica fenotípica das espécies C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C.
metapsilosis observada em relação às equinocandinas, tem sido denominada de efeito
paradoxal ou crescimento paradoxal (van Asbeck et al., 2008; Bizerra et al., 2011),
caracterizado pelo crescimento fúngico em concentrações de equinocandinas (caspofungina)
bem acima da CIM (Stevens et al., 2004). Este efeito paradoxal está relacionado ao padrão
ultraestrutural e bioquímico da parede celular através de um mecanismo regulatório pela
redução significativa de -1,3-glucano e elevação considerável de quitina, ambos componentes
da parede celular da levedura. Este fenômeno tem sido estudado visando o esclarecimento da
sua significância clínica (Bizerra et al., 2011).
Finalmente, de Toro et al. (2011) pesquisaram os padrões de susceptibilidade aos
antifúngicos voriconazol, anfotericina B e anidulafungina contra isolados do complexo C.
parapsilosis tanto na forma planctônica (circulando livremente) quanto na forma de biofilme.
Os resultados revelaram que a anfotericina B e anidulafungina são moderadamente eficazes
contra biofilmes de C. parapsilosis (stricto sensu), enquanto que o voriconazol não degradou
o biofilme. Para as formas planctônicas das leveduras a CIM foi maior em relação à CIM para
os biofilmes de C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C. metapsilosis.
Todos estes resultados abordados corroboram a evidente necessidade da correta
identificação da espécie em associação com os testes de suscetibilidade (Bruder-Nascimento
et al., 2010), cujo valor clínico tem sido bem reconhecido como ferramenta para otimizar o
manejo das infecções fúngicas (Pfaller et al., 2011, Clinical breakpoints for the echinocandins
and Candida revisited), pois atrasos na terapia antifúngica implicam piora no prognóstico
com aumento da mortalidade (Pappas et al., 2009). Acrescenta-se a isto, o fato de que as
pesquisas farmacêuticas para o desenvolvimento de novos antimicrobianos são mais voltadas
para drogas antibacterianas em relação aos antifúngicos (Sidrim & Rocha, 2010), sendo
imperativa a adequada utilização das poucas drogas antifúngicas disponíveis no mercado.
A identificação de patógenos fúngicos em nível de espécie, particularmente isolados
clínicos é importante para melhorar o manejo das infecções e o adequado emprego da terapia
34
antifúngica. Atualmente, alguns dos isolados até então identificados como C. parapsilosis, e
conservados em coleções de cultura, podem ser C. parapsilosis, C. orthopsilosis ou C.
metapsilosis e, consequentemente, métodos para diferenciar corretamente estas espécies
devem ser estabelecidos, em vista da dificuldade e imprecisão dos testes fenotípicos na
determinação das mesmas. Neste contexto, abordagens moleculares, bem como a avaliação de
novos métodos estão sendo desenvolvidas para estabelecer uma identificação mais rápida e
segura destas espécies recentemente descritas (Abi-Chacra et al., 2013).
Por conseguinte, considerando as importantes diferenças entre as espécies do
complexo C. parapsilosis relacionadas aos fatores de virulência e na susceptibilidade aos
antifúngicos, acima relatados, bem como, considerando os pacientes de risco e a elevada
morbi-mortalidade causadas por estes patógenos, faz-se necessária a determinação da
distribuição das espécies deste grupo de leveduras, associada ao conhecimento de seus fatores
de virulência e padrões de sensibilidade e resistência aos antifúngicos disponíveis na prática
clínica. É válido ressaltar, ainda, que a região Norte do Brasil carece de tais informações
epidemiológicas que possam auxiliar na vigilância dessas infecções.
35
1.9 OBJETIVOS
1.9.1 Objetivo Geral
Realizar a identificação molecular e descrever os aspectos bioquímicos e fenotípicos
de leveduras do Complexo C. parapsilosis (C. parapsilosis, C. orthopsilosis e C.
metapsilosis) recuperadas de diferentes sítios corpóreos, de pacientes encaminhados ao
Instituto Evandro Chagas para esclarecimento diagnóstico no período de 2005 a 2012.
1.9.2 Objetivos Específicos
Reidentificar as leveduras do Complexo C. parapsilosis pela metodologia
automatizada VITEK®
2;
Identificar as espécies do Complexo C. parapsilosis por meio da Reação em Cadeia da
polimerase (PCR) utilizando o intron do gene RPSO;
Determinar o perfil de exoenzimas (Gelatinase, Lipase, Urease, DNase, Caseinase,
Fosfolipase e Proteinase) das leveduras do Complexo C. parapsilosis;
Avaliar e determinar a aplicabilidade do ágar Eosina Azul de Metileno (EAM), como
meio de identificação presuntiva para leveduras do Complexo C. parapsilosis;
Caracterizar a formação de biofilme por leveduras do Complexo C. parapsilosis
semeadas em caldo Sabouraud e medido pela Densidade ótica (DO);
Avaliar o perfil de sensibilidade das leveduras do Complexo C. parapsilosis aos
antifúngicos (itraconazol, fluconazol e anfotericina B) pela metodologia M27-A2 do CLSI.
36
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 DESENHO DO ESTUDO
O estudo desenvolvido foi de caráter prospectivo, descritivo e transversal.
2.2 ISOLADOS FÚNGICOS E CRITÉRIO DE SELEÇÃO
Foram utilizados 52 isolados de leveduras identificadas anteriormente como C.
parapsilosis, por meio da metodologia semi-automatizada ID 32C®
(bioMérieux, França).
Estes isolados foram provenientes da coleção de culturas de leveduras do Laboratório de
Micologia da Seção de Bacteriologia e Micologia (SABMI) do Instituto Evandro Chagas
(IEC), localizado no município de Ananindeua, Estado do Pará, onde são mantidas congeladas
(em freezer a - 80ºC) em meio líquido Extrato de Malte com de 15% de glicerina.
Os isolados foram obtidos a partir de diversos espécimes clínicos (sangue, lavado
broncoalveolar, escamas epidérmicas e ungueais, biópsia de abdome e de pólipo nasal,
escarro, coprocultura, secreção de lesão e escarificado de lesão auricular) de pacientes
encaminhados ao Laboratório de Micologia da SABMI ∕ IEC para esclarecimento diagnóstico,
no período de 2005 a 2012. O estudo, portanto, partiu das culturas em estoque e não dos
espécimes clínicos.
O critério de inclusão consistiu de culturas constantes na micoteca da SABMI ∕ IEC
cujas leveduras foram previamente identificadas como C. parapsilosis, pelo método ID 32C®
(bioMérieux, França).
Os isolados fúngicos, após descongelamento, foram cultivados pelo menos três vezes
em ágar Batata - Dextrose (HIMEDIA, India) ou ágar Sabouraud - Dextrose (HIMEDIA,
India), antes de serem iniciados os ensaios, garantindo que todas as amostras estivessem
viáveis e reativadas após os cultivos e livre de contaminação.
Durante o período da pesquisa, todos os isolados foram mantidos em ágar Batata -
Dextrose (HIMEDIA, India) ou ágar Sabouraud - Dextrose (HIMEDIA, India), sob
temperatura de 27ºC. A cepa C. parapsilosis ATCC 22019 foi utilizada como referência.
37
2.3 ASPECTOS ÉTICOS DA PESQUISA
A pesquisa foi submetida ao Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do IEC e aprovada
sob o número 345.631 de 31 de julho de 2013, CAAE 18425713.9.0000.0019 (Anexo I).
2.4 IDENTIFICAÇÃO E CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS DAS LEVEDURAS
DO COMPLEXO C. parapsilosis PELO VITEK®
2
O VITEK®
2 (bioMérieux, França) é um sistema padronizado para identificação
automatizada de microrganismos, inclusive leveduras. Os microrganismos foram
primeiramente semeados em ágar Batata - Dextrose (HIMEDIA, India), incubados sob
temperatura de 27ºC e a partir de culturas recentes (24 - 48 horas) as colônias foram
transferidas para um tubo contendo 3 mL de solução salina, formando uma suspensão com
opacidade equivalente à escala 2 de McFarland (6,0 x 108 UFC/mL) , medida com o auxílio
de um densitômetro (bioMérieux, França). Posteriormente a suspensão fúngica foi inoculada
nos cartões em cartuchos de identificação e os resultados lidos após 18 h de incubação,
seguindo as orientações do fabricante (bioMérieux, França).
2.5 IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR
2.5.1 Extração de DNA Genômico
Para a extração do DNA genômico foi seguido o protocolo descrito por Sambrook et al.,
(2001), com modificações, como descrito a seguir.
As amostras de leveduras do complexo C. parapsilosis foram cultivadas em ágar
Sabouraud - Dextrose (HIMEDIA, India) e incubadas por 24 a 48 horas em temperatura ambiente
(27oC). Após crescimento, as colônias foram transferidas para microtubos de 2 mL contendo 300
µL de tampão Tris-EDTA (TE – Tris-HCl 1M pH 7.5, EDTA 0,5 M pH 8.0), onde foram
adicionados 300 µL de tampão de lise (Tris-HCl 1M pH 9.0 na solução 300 mM, EDTA100 mM
na solução, Sacarose a 50%, Dodecil Sulfato de Sódio a 10%), 300 µL de tampão de
homogeneização (Tris-HCl 1 M, NaCl 1 M, EDTA 0,5 M e Sacarose) e 15 µL de proteinase K
(10 mg / mL), submetidos a 56oC em banho-maria por 12 horas para ação da enzima.
Na segunda etapa da extração, em temperatura ambiente, foram adicionados 600 µL de
fenol-clorofórmio-álcool isoamilico (25:24:1 [vol/vol/vol]). Os microtubos foram então
homogeneizados gentilmente e centrifugados a 13000 rpm por 10 minutos com remoção da
camada superior para novo microtubo, procedimento este repetido após adição de 600 µL de
38
clorofórmio-álcool isoamil (24:1). A fração aquosa foi tratada com 100 µL de acetato de sódio
gelado (3M pH 4.8) e 500 µL de isopropanol para precipitação do DNA, e após centrifugação a
13000 rpm por 10 minutos, o sobrenadante foi desprezado gentilmente. Foram acrescentados 500
µL de etanol a 70% e novamente procedeu-se à centrifugação dos microtubos a 13000 rpm por 10
minutos. O sobrenadante foi desprezado gentilmente para não perder o DNA precipitado, o qual
foi seco em estufa a 37 oC, ressuspenso em 100 µL de tampão TE e congelado até o momento da
realização do ensaio molecular.
2.5.2 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
A identificação molecular de leveduras do complexo C. parapsilosis foi realizada
baseando-se nos primers propostos por García Martínez et al. (2010) e Vercher et al. (2011),
utilizando-se primers espécie-específicos, que amplificam um fragmento do intron do gene
RPSO pela técnica de Reação em Cadeia da Polimerase, a qual apresenta as vantagens de
especificidade e sensibilidade e não envolve equipamentos complexos e dispendiosos (García
Martínez et al., 2010).
As sequências dos primers CP1(forward) e CP2 (reverse) (García Martínez et al,.
2010), os primers CM1 (forward) e CM2 (reverse) e os primers CO1 (forward) e CO2
(reverse) (Vercher et al., 2011) específicos para C. parapsilosis, C. metapsilosis e C.
orthopsilosis, respectivamente, bem como o perfil de termociclagem e o tamanho do
fragmento para cada espécie estão no quadro 1.
Todas as amostras foram submetidas à PCR com os primers espécie-específicos CP1 e
CP2, CO1 e CO2, bem como CM1 e CM2 em reações separadas.
A reação de amplificação foi realizada com 1 M de Betaína, 4 mM MgCl2, 0,4 mM de
cada dNTP (desoxinucleotídeo trifosfato), 1 mM dos primers (CP, CM ou CO), 0,1 µL de
Taq DNA polimerase (Platinum®
Taq, Invitrogen, Brasil) e 2 µL de DNA, com volume final
de 25 µL. As reações de PCR foram realizadas em termociclador (PX2 Thermo Hybaid, RU)
conforme as condições descritas no quadro 1. O produto da amplificação foi revelado por
eletroforese em gel de agarose a 2% (p/vol) corado com SyBR®
Safe, em tampão TBE 1X (90
mM Tris, 90 mM ácido bórico, 2 mM EDTA, pH 8.3), a 69 volts, 60 miliamperes, por 90
minutos usando o marcador de peso molecular (ladder) de 100 pb e de 1kb. A visualização do
DNA foi realizada com auxílio de um transiluminador (UV).
39
Quadro 1 – Primers a serem utilizados e condições da Reação em Cadeia da Polimerase. (a) Garcia Martinez et al., 2010. (b) Vercher et al., 2011.
Espécie Primer Sequência do Primer Desnaturação
Inicial
Ciclo
(Desnaturação,
Anelamento,
Extensão)
Extensão Final Fragmento
esperado
C. parapsilosis CP1 /
CP2
CP1 (5′ AGG GAT TGC CAA TAT GCC CA 3′)
CP2 (5′ GTG ACA TTG TGT AGA TCC TTG G 3′)
Referência (a)
95 ºC / 3 min 40 X
94 ºC / 60 seg
63 ºC / 30 seg
72 ºC / 45 seg
72 ºC/ 15min 120 pb
C. orthopsilosis CO1 /
CO2
CO1 (5′ TTT CAA TAT GCC TAG AGC CAC ATT
GTG AAT AC 3′)
CO2 (5′ GCA TTA GTT AGT ATC GTC TTT TAT
TAA ATA 3′)
Referência (b)
95 ºC / 3 min 40 X
94 ºC / 60 seg
63 ºC / 30 seg
72 ºC / 45 seg
72 ºC/ 15min 190 pb
C. metapsilosis CM1 /
CM2
CM1 (5′ AAT AGA GGA GAT GTT TTA TTT GAA
TTC 3′)
CM2 (5′ GCA GAA TCC GTA AGA ACT GGG G 3′)
Referência (b)
95 ºC / 3 min 40 X
94 ºC / 60 seg
63 ºC / 30 seg
72 ºC / 45 seg
72 ºC/ 15min 210 pb
40
2.6 PESQUISAS DE EXOENZIMAS
Para todos os ensaios de exoenzimas produzidas por leveduras do complexo C.
parapsilosis foram empregados cultivos de até 48 h mantidos à temperatura de 27ºC em ágar
Sabouraud - Dextrose (HIMEDIA, India) ou ágar Batata - Dextrose (HIMEDIA, India) e
todos os experimentos foram realizados em duplicata. Os meios de cultura específicos para
cada prova enzimática, após o preparo mantiveram-se conservados sob refrigeração a 4ºC até
o momento de sua utilização.
2.6.1 Atividade da Gelatinase
A produção da gelatinase foi avaliada semeando-se o fungo em meios de cultura
contendo 12% de gelatina (3 g Extrato de carne (OXOID, Inglaterra), 5 g Peptona (OXOID,
Inglaterra), 120 g gelatina (CRQ, Brasil), 1000 mL de água destilada, pH 7). O meio foi
distribuído em tubos de ensaio 16 x 150mm e autoclavados a 121ºC por 15 minutos. As
condições de incubação foram em temperatura a 25ºC durante 60 dias. Após esse período, os
cultivos foram colocados no refrigerador a 4ºC por 1 h. Um tubo contendo somente o meio
(não semeado) foi utilizado como controle negativo. Para verificação da hidrólise da gelatina
foi considerado meio liquefeito como prova positiva e meio não liquefeito como prova
negativa (Kurtzman & Fell, 1998).
2.6.2 Atividade da Lipase
A análise foi realizada em meio Lipase contendo: 10 g peptona (OXOID, Inglaterra), 5
g NaCl (VETEC, Brasil), 0,1 g CaCl2 (NUCLEAR, Brasil), 20 g ágar Base (Merck,
Alemanha), 10 mL Tween 20 (VETEC, Brasil), em 1000 mL água destilada. O meio foi
autoclavado a 121ºC por 15 minutos. Uma porção da colônia foi depositada sob uma placa de
Petri contendo meio ágar Lipase e em seguida incubada a 27ºC por 10 dias. Foram
consideradas produtoras de lipase as amostras que produziram um halo opaco ao redor da
colônia (Muhsin et al., 1997).
2.6.3 Atividade da Urease
Foi utilizado o meio de cultura ágar Uréia de Christensen (HIMEDIA, India),
autoclavado a 121ºC por 20 minutos e resfriado a 50ºC para o acréscimo de 50 mL de solução
estéril de uréia a 40%, conforme o protocolo de Christensen (1946). Os isolados foram
inoculados em tubos de ensaio com este meio de cultura e após 7 dias de incubação a 25ºC, a
41
produção de urease foi avaliada pela mudança de cor do meio que passa de amarelo para uma
tonalidade vermelha. Um isolado de Cryptococcus neoformans foi utilizado como controle
positivo.
2.6.4 Atividade da Desoxirribonuclease (DNase)
A produção de DNase extracelular foi avaliada inoculando uma porção da colônia
fúngica no centro de uma placa de Petri, contendo meio de cultura DNase (HIMEDIA, India),
esterilizado por autoclavagem a 121ºC por 15 minutos. Após 7 dias de inoculação a 25ºC, as
placas foram pulverizada com solução de Azul de Toluidina 0,1% (100mg de Azul de
Toluidina, 1000mL de água destilada), procedendo-se à observação quanto à presença ou
ausência de um halo de degradação ao redor da colônia. O halo foi identificado como um
círculo transparente ao redor da colônia em contraste com o restante da placa, caracterizando
a produção da enzima DNase. A ausência do halo indicou teste negativo (López-Martínez et
al., 1994).
2.6.5 Atividade da Caseinase
Os isolados foram semeados em placas contendo o meio de cultura ágar Caseína
(Meio I: 10 g Leite desnatado, 100 mL água destilada; Meio II: 2 g ágar Base (Merck,
Alemanha), 100 mL água destilada, autoclavados separadamente, resfriados e misturados) e
incubados a 25ºC por 15 dias, segundo Price et al. (1982). A hidrólise da caseína foi
verificada pela formação de um halo em torno da colônia.
A análise dos resultados foi realizada através do cálculo da razão entre o diâmetro da
colônia (dc) e o diâmetro mais o halo produzido (dcd), proposto por Price et al. (1982). Esta
razão representa a atividade enzimática da caseinase (CZ).
CZ = dc ÷ dcd
Segundo Price et al. (1982):
CZ = 1,0; indica que o microrganismo não é produtor da enzima;
CZ ≥ 0,64 < 1; indica que o microrganismo é positivo, produtor da enzima;
CZ < 0,64; indica que o microrganismo é fortemente positivo, produtor de enzima.
O diâmetro da colônia foi medido com o paquímetro digital (ABSOLUTE – Mitutoyo
Products, Brasil).
42
2.6.6 Atividade da Fosfolipase
A capacidade de Candida em produzir fosfolipase foi detectada pela técnica
preconizada por Price et al. (1982), realizada em meio de cultura preparado conforme abaixo
descrito:
Meio de emulsão de ovo: 16 g gema de ovo, 16 mL solução fisiológica estéril. Os
ovos foram criteriosamente lavados em água corrente e deixados de molho em álcool a 70%
por 60 minutos. As gemas foram homogeneizadas, misturadas à solução fisiológica, filtradas
em gaze estéril e acrescentadas ao meio ágar fosfolipase resfriado.
Meio Ágar fosfolipase: 2 g Peptona (OXOID, Inglaterra), 4 g Glicose (Difco,
França), 11,46 g Cloreto de sódio (VETEC, Brasil), 0,11 g Cloreto de cálcio (Nuclear, Brasil),
4,9 g ágar Base (Merck, Alemanha), 200 mL água destilada. O meio foi autoclavado por 15
minutos a 121ºC e resfriado a 50ºC para receber o meio de emulsão de ovo.
As amostras cultivadas por 24 horas a 37ºC em ágar Sabouraud - Dextrose
(HIMEDIA, India) foram inoculadas em placa de Petri contendo meio de cultura Ágar
fosfolipase enriquecido com a emulsão de gema de ovo. As placas testes foram incubadas a
37ºC, e a leitura realizada no décimo dia. Procedeu-se à análise da mesma maneira como para
a atividade da caseinase.
2.6.7 Atividade da Proteinase
A competência de leveduras do complexo C. parapsilosis em secretar proteinase foi
detectada pela técnica descrita por Rüchel et al. (1982). Amostras cultivadas por 24 horas a
37ºC em ágar Batata - Dextrose (HIMEDIA, India) foram inoculadas em placa de Petri
contendo meio de cultura ágar proteinase, preparado conforme segue: Meio I: 18 g ágar Base
(Merck, Alemanha), 900 mL água destilada; Meio II: 11,7 g Yeast Carbon Base (HIMEDIA,
India), 2 g Albumina bovina - Fração V (Sigma, EUA), 2,5 mL Protovit® (Roche, Brasil), 100
mL água destilada estéril. O meio I foi autoclavado por 15 minutos a 121ºC e resfriado a
50ºC. O meio II foi filtrado em membrana Millipore com porosidade de 0,45 µm e
acrescentado ao meio I.
As placas testes foram incubadas a 37ºC, e a leitura realizada no décimo dia. A
presença da enzima foi detectada pela formação de um halo transparente ao redor das
colônias. A detecção da produção da exoenzima proteinase e a medida desta atividade foram
semelhantes ao da caseinase e fosfolipase, conforme proposto por Price et al. (1982).
43
2.7 CULTIVO EM ÁGAR EOSINA AZUL DE METILENO MODIFICADO
Uma porção de colônias crescidas em ágar Batata – Dextrose (HIMEDIA, India) por
24 a 48 horas à 29ºC foi inoculada em placas contendo ágar EMB (OXOID, Inglaterra)
acrescido de 10 g/mL de dextrose (Difco, França) e incubadas a 29ºC por 72 a 96 horas
protegidas da luz direta. Depois deste período, os cultivos foram avaliados quanto às
características colorimétricas exibidas (padrão de coloração e pigmento).
2.8 ANÁLISE DA FORMAÇÃO DO BIOFILME
A produção de biofilme por leveduras do complexo C. parapsilosis foi avaliada como
previamente descrito por Tavanti et al. (2007). Para isto, foi realizada uma suspensão de
leveduras em caldo Sabouraud ajustada para 1,5 x 107 células/mL. Em seguida, 20 µL de cada
suspensão de leveduras foram adicionados a 180 µL de caldo Sabouraud suplementado com 8 %
de glicose em placas de 96 poços (Corning Inc. NY). Cada isolado foi inoculado em replicata
de 5 poços. Controles negativos foram representados por replicatas de 5 poços, misturando-se
20 µL de água destilada a 180 µL de caldo Sabouraud. As placas foram incubadas a 37ºC sem
agitação. Após 24 horas, o meio de cultura foi aspirado, os poços lavados 2 vezes com 200 µL de
água destilada e novamente completados com 200 µL de água destilada. A densidade ótica (DO)
foi medida utilizando filtro de 405-450 nm em leitora de placa (Microplate reader). A
produção de biofilme para cada isolado foi considerada como segue:
Ausente – nenhuma produção, quando a densidade ótica a 450 nm foi menor que 0,03;
Fraca 0,03 ≤ DO < 0,08;
Moderada 0,08 ≤ DO < 0,16;
Alta DO ≥ 0.16.
2.9 PERFIL DE SENSIBILIDADE AOS ANTIFÚNGICOS
O perfil de sensibilidade de leveduras do complexo C. parapsilosis foi determinado
pela Concentração Inibitória Mínima (CIM) conforme o protocolo M27-A2 do CLSI (CLSI,
2002) utilizando os agentes antifúngicos itraconazol (Invitrogen, Brasil), fluconazol
(Invitrogen, Brasil) e anfotericina B (Cristália, Brasil), pela técnica de microdiluicão. O meio
de cultura utilizado foi o Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Sigma-Aldrich)
tamponado com ácido morfopropileno sulfônico (MOPS) 1,65 M (pH 7.2). Os fármacos
foram conservados sob refrigeração e ao abrigo da luz até o momento do uso. As diluições
44
dos antifúngicos foram realizadas a fim de se obter nas placas de microdiluição concentrações
que variaram conforme descrito no quadro 2. Os inóculos foram preparados a partir de
colônias com crescimento de 24 h em meio de ágar Sabouraud as quais foram ressuspensas
em 5 mL de solução salina estéril a 0,85%, a fim de se obter uma turbidez correspondente a
1x106 a 5x10
6 células por mL, ou seja, 0,5 na escala de McFarland.
Droga Diluente Concentração (μg / mL)
Fluconazol RPMI* 0,125 a 64
Itraconazol DMSO** 0,0313 a 16
Anfotericina B DMSO** 0,0313 a 16
A suspensão padrão de levedura foi misturada durante 15 segundos em vórtex, diluída
1:50 e depois 1:20 com o meio de cultura RPMI 1640, para se obter o inóculo 2X concentrado
usado no teste (de 1 x 103 a 5 x 10
3 UFC/mL). O inóculo (2X) foi diluído a 1:1 quando os
poços foram inoculados, chegando-se à concentração final desejada (de 0,5 x 103 a 2,5 x 10
3
UFC/mL).
O teste de microdiluição foi realizado em placas de microdiluição estéreis,
descartáveis, com múltiplos poços (96 poços em formato de U). As concentrações 2X da
droga foram dispensadas nos poços das fileiras 1 a 10 das placas de microdiluição, em
volumes de 100 μL, com uma pipeta multicanal. A fileira 1 continha a maior concentração da
droga e a fileira 10 a menor concentração da droga testada. Cada poço da placa de
microdiluição foi inoculado, no dia do teste, com 100 μL da correspondente suspensão 2X
concentrada do inóculo, levando às diluições das drogas e à concentração do inóculo antes
mencionados.
Os poços da fileira 11 foram usados para o controle de crescimento (controle positivo)
e continham 100 μL de meio estéril isento de droga, e 100 μL das suspensões 2X
concentradas dos inóculos. A fileira 12 da placa de microdiluição foi usada para efetuar o
controle da esterilidade com 100 μL do meio RPMI isento de drogas (controle negativo). As
Quadro 2 – Fármacos, diluentes e intervalos de concentrações utilizados
(CLSI, 2002)
* RPMI – Roswell Park Memorial Institute;
** DMSO – Dimetilsulfóxido
45
placas de microdiluição foram incubadas a 35°C por 48 h, observando presença ou ausência
de crescimento visível. Os poços de microdiluição receberam uma pontuação (escore) e o
crescimento em cada poço foi comparado com o do poço controle do crescimento (isento de
droga) com auxílio de um espelho de leitura. A seguir, cada poço da placa de microdiluição
recebeu um valor numérico, usando a seguinte escala:
0 = opticamente claro;
1 = crescimento indefinido;
2 = redução proeminente de crescimento;
3 = ligeira redução do crescimento;
4 = nenhuma redução do crescimento.
De forma complementar, foi realizada leitura em leitora de microplaca (Thermoplate,
Brasil) em filtro de comprimento de onda de 450 nm (Stoppa et al., 2009), registrando-se a
leitura de cada poço para uma leitura adicional considerando-se os critérios do CLSI de que
uma diminuição proeminente na turbidez observada visualmente corresponde à,
aproximadamente, 50% da inibição do crescimento, determinada espectrofotometricamente
(CLSI, 2002). Pelos critérios da norma de referência M27-A2 (CLSI, 2002), o valor de CIM
da anfotericina B é definido como a menor concentração em que observa o escore 0
(opticamente claro), ou seja, a CIM é distinguível como a menor concentração de droga que
impede qualquer grau de crescimento discernível, enquanto que para os azóis a CIM define-se
pela menor concentração em que observa o escore 2 (redução proeminente de crescimento).
Para a interpretação dos resultados foram utilizadas as diretrizes da norma de
referência M27-A2 (CLSI, 2002) descritas no quadro 3.
Agente antifúngico Suscetível (S)
Sensibilidade Dose-
Dependente (S-DD) Resistente (R)
Fluconazol ≤ 8 16 – 32 ≥ 64
Itraconazol ≤ 0,125 0,25 – 0,5 ≥ 1
Anfotericina B 0,25 – 1 -------- > 1
Quadro 3 – Diretrizes de Interpretação dos Testes de Sensibilidade in vitro das espécies de
Candida. Os valores correspondem aos pontos de corte (μg / mL) contra os agentes
antifúngicos (CLSI, 2002).
46
3 RESULTADOS
3.1 REIDENTIFICAÇÃO DAS LEVEDURAS DO COMPLEXO C. parapsilosis PELA
METODOLOGIA VITEK®
2
Cinqüenta e duas (52) amostras identificadas primariamente como C. parapsilosis por
meio de metodologia semi-automatizada ID 32®
foram reidentificadas pelo sistema VITEK®
2. Deste total, 44/52 (84%) isolados foram identificados como C. parapsilosis, e 8 (15%)
tiveram suas leituras como outras espécies do gênero Candida. Para estas amostras o teste foi
repetido e os resultados bioquímicos mantidos. A tabela 1 ilustra estes resultados.
Em relação à assimilação de carboidratos avaliada pelo VITEK®
2, os resultados
evidenciaram diferentes padrões de assimilação entre as espécies. Contudo, estas diferenças
não permitem separá-las por espécies (tabela 2).
As amostras IEC 167, IEC 171 e IEC 237, primariamente identificadas como C.
parapsilosis e posteriormente identificadas pela biologia molecular como C. parapsilosis, C.
metapsilosis e C. orthopsilosis, respectivamente, divergiram quanto à assimilação dos
carboidratos conforme demonstrado na tabela 2.
Espécie n % Probabilidade
C. parapsilosis 44 84 97%
C. albicans 3 6 94%
C. famata 3 6 85%
C. famata / C. guilermondii 1 2 Baixa
Discriminação
C. famata / C. tropicalis 1 2 Baixa
Discriminação
Tabela 1 – Identificação de leveduras de C. parapsilosis por meio
do Sistema automatizado VITEK® 2.
47
Nº ID
32
Bio
Mol
VITEK IML
Ta
AR
Ba
GE
Na
LA
Ca
dC
EL
a
dR
AF
a
dM
EL
a
dM
LZ
a
ISB
Ea
XL
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a
ES
C
dX
YL
a
LA
Ta
CIT
a
GR
Tas
2K
Ga
NA
Ga
dG
NT
a
12 C P C P C famata /C.
tropicalis
+ - - - - - - + + - + - - - + - + + + + +
71 C P C P C famata - - - - - - - + - - + + - - + - + - + + - 115 C P C P C famata + - + - - - - + + - - - + - - - + - + + - 223 C P C P C famata + + + + + + + + + - + - + + - - + - + + + 38 C P C P C albicans - - - - - - - - - + + - + - - + - + + + + 39 C P C P C albicans - - - - - - - - - + + - + - - + - + + + + 112 C P C P C albicans - - - - - - - + - + + + + - + + + + + + + 114 C P C M C famata
/C. guilermon
dii
+ + + + + + + + - - + + + + + + + + + - +
17 C P C P C P + - - - - - - + + - + + - - + - + - + + - 98 C P C P C P + - - - - - - + - - + + + - - - + + + + + 220 C P C P C P - - - - - - - + - - - + + - + - + + + + + 167 C P C P C P - - - - - - - + + - - + + - - - + + + + + 171 C P C M C P - - - - - - - + - - + + - - - - + + + + + 237 C P C O C P - - - - - - - + + - + + - - - - + - - - -
Tabela 2 – Representação da assimilação de carboidratos por meio do Sistema VITEK® 2, de isolados de C. parapsilosis.
CP – C. parapsilosis, CO – C. orthopsilosis, CM – C. metapsilosis. (+), POSITIVO, (-), NEGATIVO. IMLTa: L-Malato, ARBa: Arbutina,
GENa: Gentiobiose, LACa: Lactose, dCELa: D-celobiose, dRAFa: D-Rafinose, dMELa: D-Melibiose, dMLZa: D-Melizetose, ISBEa: L-
Sorbose, XLTa: Xilitol, dTREa: D-trealose, IARAa: L-arabinose, dGATa: D-galacturonato, ESC: Esculina, dXYLa: D-xilose, LATa: DL-
lactato, CITa: Citrato de sódio, GRTas: glucuronato, 2KGa: 2 - ceto-D-gluconato, NAGa: N-acetil-glucosamina, dGNTa: D-gluconato.
48
3.2 IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DAS ESPÉCIES DO COMPLEXO C.
parapsilosis
O resultado da PCR utilizando os primers espécie-específicos revelou a presença de 44
(85%) isolados da espécie C. parapsilosis stricto sensu, 3 (6%) da espécie C. metapsilosis, e 5
(9%) isolados da espécie C. orthopsilosis.
A figura 5 ilustra os produtos amplificados de duas amostras de cada espécie,
demonstrando o tamanho dos produtos obtidos na PCR, e reveladas por eletroforese em gel de
agarose a 2%.
A tabela 3 demonstra a distribuição das espécies do complexo C. parapsilosis de
acordo com o material e ∕ ou sítio anatômico de onde foram recuperadas.
Figura 5 – Produtos da amplificação de DNA de leveduras do complexo C.
parapsilosis separados por eletroforese em gel de agarose a 2%, corados com
SyBR Safe®. CP, Candida parapsilosis (120 bp); CM, Candida metapsilosis
(210 bp); CO, Candida orthopsilosis (190).
49
3.3 DETERMINAÇÃO DO PERFIL DE EXOENZIMAS DAS ESPÉCIES DO
COMPLEXO C. parapsilosis
Três das 7 exoenzimas pesquisadas não foram secretadas pelas espécies do complexo
C. parapsilosis das amostras analisadas, sendo elas as exoenzimas caseinase, urease, e
gelatinase (Tabela 4).
A exoenzima lipase foi a enzima hidrolítica mais intensamente produzida pelos
isolados de C. parapsilosis (Tabela 4, Figura 6). A intensidade da atividade enzimática é
demonstrada na tabela 5.
A exoenzima DNase (Figura 7) foi produzida por 4/52 isolados, sendo todos de C.
parapsilosis. As exoenzimas proteinase, fosfolipase (Figura 8) e lipase foram produzidas por
48/52, 27/52 e 51/52 dos isolados, respectivamente (Tabela 4).
SÍTIO ANATÔMICO ∕
ESPÉCIME CLÍNICO
CP CO CM
N % N % N %
Pele 29 66 0 0 2 67
Mucosa oral 3 7 3 60 0 0
Escarificado de lesão 3 7 0 0 0 0
Sangue 3 7 0 0 1 33
Lavado bronco-alveolar 2 4 1 20 0 0
Escarro 0 0 1 20 0 0
Outros 4 9 0 0 0 0
TOTAL 44 100 5 100 3 100
Tabela 3 – Frequências relativas e absolutas da distribuição das
espécies do complexo: CP - C. parapsilosis, CO - C. orthopsilosis e
CM - C. metapsilosis, de acordo com o sítio anatômico e ou do
material dos quais foram recuperadas primariamente.
50
Espécie Exoenzimas
Caseinase Urease Gelatinase DNAse Proteinase Fosfolipase Lipase
C. parapsilosis (n =44) - - - 4 (+) 42 (+) 22 (+) 43 (+) a,b
C. metapsilosis (n=3) - - - - 2 (+) 2 (+) 3 (+) b
C. orhtopsilosis (n=5) - - - - 4 (+) 3 (+) 5 (+) b
Total 0/52 0/52 0/52 4/52 48/52 27/52 51/52
( -), negativo; (+), positivo; a, formação de halo de precipitação moderado; b, formação de halo de precipitação
intensa
Espécie Proteinase *
Fosfolipase Lipase
Negativo Positivo Negativo Positivo Fortemente
Positivo
Negativo Positivo Fortemente
Positivo
N % N % N % N % N % N % N % N %
C. parapsilosis
(n =44)
2 5 42 95 22 50 18 41 4 9 1 2 4 11 38 87
C. metapsilosis
(n=3)
1 33 2 67 1 33 2 67 0 0 0 0 0 0 3 100
C. orthopsilosis
(n=5)
1 20 4 80 2 40 3 60 0 0 0 0 0 0 5 100
* Para a Proteinase, nenhum dos isolados apresentou atividade fortemente positiva.
Tabela 4 – Secreção de exoenzimas por leveduras do complexo C. parapsilosis.
Tabela 5 – Frequência da atividade enzimática das leveduras do complexo C. parapsilosis,
conforme a intensidade da produção da exoenxima.
51
Figura 6 – Aspecto macromorfológico de um isolado (IEC 240)
de C. parapsilosis produtor da enzima hidrolítica lipase (intenso
halo de precipitação ao redor da colônia).
Figura 7 – Aspecto macromorfológico de um
isolado de C. parapsilosis produtor da exoenzima
DNAse.
52
3.4 AVALIAÇÃO E DETERMINAÇÃO DA APLICABILIDADE DO ÁGAR EOSINA
AZUL DE METILENO (EAM), COMO MEIO DE IDENTIFICAÇÃO PRESUNTIVA
PARA LEVEDURAS DO COMPLEXO C. parapsilosis
O crescimento dos isolados no ágar Eosina Azul de Metileno (EAM) demonstrou
pequena variabilidade quanto à coloração e pigmento, nas três espécies do complexo C.
parapsilosis, conforme observado nas figuras 9 e 10.
Inicialmente todas as colônias de leveduras do complexo C. parapsilosis apresentaram
coloração rosa. Após 24-48 horas de cultivo foram observadas mudanças colorimétricas sobre
a colônia. Estas características são descritas no quadro 4.
De maneira geral, a coloração rosa sobre o Agar EAM foi indicativa de leveduras do
complexo C. parapsilosis.
A B
Figura 8 – Aspecto macromorfológico da colônia de um isolado de C.
parapsilosis produtor da exoenzima fosfolipase. A, verso da colônia; B, halo
leitoso no reverso da colônia.
53
Código Característica Descrição
BR Borda Rosa centro
corado
Colônia de crescimento rugoso central e
corado em lilás. Borda da colônia permanece
rosa.
R Rosa Colônia de crescimento liso, totalmente rosa.
A Azul Colônia de crescimento liso, totalmente azul.
RM Rosa metálico Colônia de crescimento liso, de coloração
rosa, com discreto brilho metálico sobre a
colônia.
Figura 9 – Macromorfologia das colônias de leveduras do complexo C.
parapsilosis em ágar Eosina Azul de Metileno (EAM). a) BR – Borda
Rosa centro corado; b) R – Rosa; c) A – Azul; d) RM – Rosa metálico.
Quadro 4 – Descrição das características colorimétricas dos isolados do
complexo C. parapsilosis, sobre o ágar EAM.
54
3.5 CARACTERIZAÇÃO DA FORMAÇÃO DE BIOFILME POR LEVEDURAS DO
COMPLEXO C. parapsilosis
Todos os isolados foram hábeis na produção de biofilme variando na intensidade deste
fator de virulência (Figura 11).
Dentre os isolados de C. parapsilosis 86% (38/44) exibiram moderada ou alta
formação de biofilme. Dos isolados de C. orthopsilosis 60% (3/5) foram altamente produtores
e 40% (2/5), moderadamente produtores. Enquanto que, em C. metapsilosis 67% (2/3)
exibiram alta produção e 33% (1/3) moderada produção de biofilme.
Figura 10 – Variações colorimétricas das colônias do complexo C.
parapsilosis: CP - C. parapsilosis; CO - C. orthopsilosis; CM - C.
metapsilosis, no teste Eosina Azul de Metileno (EAM). BR – Borda Rosa
centro corado; R – Rosa; A – Azul; RM – Rosa metálico.
55
3.6 AVALIAÇÃO DO PERFIL DE SENSIBILIDADE AOS ANTIFÚNGICOS
No que concerne ao ensaio de susceptibilidade in vitro aos fármacos testados, 89% dos
isolados de C. parapsilosis apresentaram sensibilidade ao fluconazol, 79% apresentaram CIM
indicativa de sensibilidade ao itraconazol e 100% foram sensíveis à anfotericina B (tabela 6).
As espécies C. orthopsilosis e C. metapsilosis apresentaram padrão de sensibilidade
(100%) para todos os isolados expostos à ação farmacológica do fluconazol e da anfotericina
B. Algumas amostras do complexo demonstraram resultado de resistência ao itraconazol e
pelo menos uma amostra de cada espécie apresentou sensibilidade dose dependente a esta
droga (Tabela 6).
Figura 11 – Gráfico demonstrativo da produção de biofilme pelas cepas de
CP - C. parapsilosis, CO - C. orthopsilosis e CM - C. metapsilosis.
56
FLUCONAZOL ITRACONAZOL ANFOTERICINA B
S R S SDD R S R
Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %
CP 39 89 5 11 35 79 6 14 3 7 44 100 0 0
CO 5 100 0 0 3 60 1 20 1 20 5 100 0 0
CM 3 100 0 0 1 33 2 67 0 0 3 100 0 0
3.7 PARTICULARIDADE DO PERFIL FENOTÍPICO DE ISOLADOS DE C.
parapsilosis
Das 38 amostras de C. parapsilosis formadoras de biofilmes, 20 também foram
positivas para as exoenzimas lipase, fosfolipase e proteinase e destas 20 amostras com
importante padrão de virulência, 4 apresentaram resistência aos azóis testados no ensaio de
susceptibilidade, conforme desenho esquemático na figura 12.
Os espécimes clínicos relacionados a estes 4 isolados altamente virulentos eram
proveniente de escamas epidérmicas ( n= 3) e sangue (n=1).
CP – C. parapsilosis, CO – C. orthopsilosis, CM – C. metapsilosis, Nº – número absoluto.
S – Sensível, SDD – Sensibilidade dose dependente, R – Resistente.
Tabela 6 – Frequências absoluta e relativa da susceptibilidade aos antifúngicos de
isolados do complexo C. parapsilosis
Figura 12 – Desenho esquemático do perfil fenotípico de isolados de C.
parapsilosis que exibiram alto grau de virulência por produzir biofilme, enzimas
hidrolíticas e resistência aos azóis.
57
4 DISCUSSÃO
As espécies do complexo C. parapsilosis, embora comensais no homem tem
despertado interesse em virtude de sua alta incidência e relação com infecções hospitalares em
várias partes do mundo (Pfaller et al., 2008; Sabino et al., 2011), tanto candidíases sistêmicas
(Laupland et al., 2005; Trofa et al., 2008; van Asbeck et al., 2009; Mirhendi et al., 2010)
quanto superficiais (Feng et al., 2012; Bertini et al., 2013) em indivíduos comprometidos. As
particularidades das espécies do complexo e seu comportamento quanto à virulência e
susceptibilidade aos antifúngicos disponíveis na prática clínica reforçam a necessidade da
identificação do patógeno em nível de espécie (Abi-Chacra et al., 2013; Németh et al., 2013).
Uma interessante particularidade das espécies do complexo foi documentada por
Sabino et al. (2011), cujo trabalho comparou o potencial de virulência de isolados ambientais
e clínicos de C. parapsilosis stricto sensu quanto à citotoxicidade, liberação de fator de
necrose tumoral-α (TNF-α), produção de filamentos e de enzimas hidrolíticas. As cepas
ambientais revelaram-se mais virulentas do que as clínicas, com maior dano tecidual
especialmente nas fases iniciais da infecção. Os autores chamam a atenção para as medidas
preventivas de vigilância ambiental e aplicação rigorosa dos procedimentos de limpeza como
fator de prevenção do aparecimento de surtos hospitalares (Sabino et al., 2011).
E na vigência de tais casos de surtos de infecções hospitalares, é imperioso que se
conheça o microrganismo para o estabelecimento do manejo adequado do tratamento
(Hernández-Castro et al., 2010), sobretudo, considerando a emergência de fungos multidroga
resistentes que utilizam dentre outros mecanismos de resistência as bombas de efluxo,
complicando o tratamento durante as infecções fúngicas oportunistas (Thakur et al., 2008), e,
por conseguinte, elevando a mortalidade e os custos associados, a exemplo do que ocorre no
cenário brasileiro (Colombo et al., 2006).
O manejo adequado das candidemias, portanto, deve ser eficaz desde a profilaxia, uso
empírico dos antifúngicos e direcionamento do tratamento de acordo com a cultura e
susceptibilidade das drogas até a decisão para a retirada do cateter intravenoso, conforme
recomendações emanadas da Sociedade Americana de Doenças Infecciosas (Chahoud et al.,
2013).
Para o cumprimento dos propósitos desta pesquisa, as amostras utilizadas estavam
armazenadas na micoteca da SABMI ∕ IEC com a identificação de C. parapsilosis pelo
método ID 32®
(bioMérieux, França) e a reidentificação pela metodologia automatizada
58
VITEK 2®
(bioMérieux, França) não foi eficiente para a identificação das espécies crípticas
do complexo, uma vez que das 52 amostras apenas 44 apresentaram-se como C. parapsilosis,
e 8 isolados obtiveram resultado inconclusivo variando entre outras espécies do gênero
Candida (C. famata/C. tropicalis, C. famata, C. albicans, C. famata/C. guilermondii).
De igual forma, Abi-chacra et al. (2013) avaliaram os perfis enzimáticos metabólicos e
a assimilação de carboidratos de 11 isolados clínicos pelo sistema VITEK®
2, sendo todos
identificados como C. parapsilosis, mas posteriormente foram identificados molecularmente
como C. parapsilosis (n=9) e C. orthopsilosis (n=2). No citado estudo as divergências
ocorreram na assimilação de 7 carboidratos, enquanto que na presente pesquisa ocorreram
diferenças na assimilação de 21 carboidratos. Faz-se necessário, entretanto, considerar o
pequeno número amostral daquele (n=11) em relação à esta (n=52), bem como o fato aqui
demonstrado de que mesmo dentro do grupo de C. parapsilosis (posteriormente confirmadas
por biologia molecular como stricto sensu) existiram divergências de assimilação dos
sacarídeos.
Em outro estudo com 81 amostras de Candida submetidas à avaliação pelo sistema
Mini API®
(bioMérieux, França) observou-se que 37% das Candida não-albicans não
puderam ser identificadas (Nunes et al., 2011), corroborando os dados da presente pesquisa
quanto à limitação destes sistemas automatizados para a identificação em nível de espécie
para o complexo C. parapsilosis.
Semelhantemente, o ensaio para a avaliação da aplicabilidade do ágar Eosina Azul de
Metileno (EAM), como meio de identificação presuntiva para leveduras do complexo C.
parapsilosis não demonstrou um padrão específico de coloração e pigmento para cada
espécie, pois todos os isolados tiveram como coloração predominante o rosa, que em alguns
isolados se mantém ou modifica após 24 horas de cultivo. A identificação através do semeio
em ágar EAM seria uma escolha mais prática, relativamente rápida (leitura em 2 ou 3 dias) e
menos onerosa. Este é um método eficaz para a identificação fenotípica do complexo C.
parapsilosis, pois todas apresentaram coloração rosa. Por outro lado não permite a
identificação em nível de espécies do complexo C. parapsilosis.
A identificação presuntiva de espécies do gênero Candida a partir de meios
cromogênicos tem sido testada no ágar Müeller–Hinton com Glicose e Azul de Metileno
(Vasconcelos Jr et al., 2011) e no ágar Cromogênico Candida (Ghelardi et al., 2008;
Vasconcelos Jr et al., 2011), contudo, os dados de utilização do ágar EAM apresentados na
59
presente pesquisa para identificação de leveduras do complexo C. parapsilosis são inéditos na
literatura.
A identificação em nível de espécie foi realizada mediante a técnica molecular da PCR
utilizando os primers espécie-específicos, atestando a presença em maior número da espécie
C. parapsilosis stricto sensu (n=44, 85%), seguida da espécie C. orthopsilosis (n=5, 9%), e C.
metapsilosis (n=3, 6%) figurando em terceiro lugar em número de isolados da coleção de
leveduras estudadas. Estes dados estão de acordo com a epidemiologia internacional (Tavanti
et al., 2005; van Asbeck et al., 2008; Chen et al., 2010; de Toro et al., 2011; Hays et al.,
2011; Vercher et al., 2011; Pemán et al., 2012) e nacional (Bonfietti et al., 2012; Abi-chacra
et al., 2013) atestando a espécie C. parapsilosis como mais prevalente, seguida das espécies
C. orthopsilosis e C. metapsilosis.
Algumas peculiaridades regionais também têm sido observadas como num estudo
multicêntrico na Espanha no qual dentre o total de isolados (n 1357) de hemoculturas
analisadas, C. orthopsilosis foi a quinta mais comum causa de fungemia (Pemán et al., 2012).
Outro estudo, desta vez na China, observou uma frequência de isolamento significativamente
elevada de C. metapsilosis (35,5%) dentre os 31 isolados analisados, dos quais a maioria foi
recuperada de amostras cutâneas ou mucocutâneas (Ge et al., 2011). Todavia, número maior
de pesquisas tem ratificado a menor frequência de C. metapsilosis no complexo (Lockhart et
al., 2008; Chen et al., 2010; Bonfietti et al., 2012; Abi-chacra et al., 2013). Esta menor
frequência não significa menor significância clínica, pois sua ocorrência em infecções de
corrente sanguínea tem sido comprovada, não devendo, portanto, ser subestimada (Gomez-
Lopez et al., 2008).
Em relação aos espécimes clínicos ou sítios anatômicos de onde têm sido recuperadas
as espécies do complexo C. parapsilosis, os estudos são bastante divergentes, mas na maioria
das pesquisas os isolados de C. parapsilosis têm sido recuperados do sangue em maior
proporção (van Asbeck et al., 2008; Chen et al., 2010; Mirhendi et al., 2010; de Toro et al.,
2011; Romeo et al., 2012) em relação às amostras cutâneas ou mucocutâneas (Feng et al.,
2012; Abi-chacra et al., 2013; Bertini et al., 2013), cujos trabalhos realmente estão publicados
em menor número. Na pesquisa ora apresentada, as cepas cultivadas e armazenadas na
micoteca foram originadas de espécimes superficiais em grande parte em relação às amostras
de sangue, contudo, este dado pode ser explicado pelo caráter ambulatorial do atendimento do
laboratório de Micologia da SABMI ∕ IEC. As amostras sanguíneas ou de lavado bronco-
60
alveolar encaminhadas pelos hospitais da região são em menor quantidade em relação
àquelas.
Quanto à atividade das exoenzimas urease, caseinase e gelatinase, todas as leveduras
do complexo C. parapsilosis apresentaram resultado negativo, bem como a produção de
DNase foi observada apenas em 4 (9%) amostras do grupo de C. parapsilosis.
A exoenzima urease, que catalisa a conversão de uréia em amônia, já foi formalmente
demonstrada como um importante fator de virulência para fungos dimórficos como
Histoplasma, Coccidioides e Paracoccidioides (Rappleye & Goldman, 2006), assim como
para Cryptococcus neoformans (Singhet al., 2013). Para leveduras do gênero Candida não há
relatos na literatura.
A atividade da exoenzima caseinase tem sido demonstrada como fator de virulência
em bactérias da espécie Enterococcus faecalis. Furumura et al. (2006) realizaram estudo com
32 isolados de E. faecalis, sendo documentada produção desta exoenzima por 24 cepas (75%).
Os autores chamaram a atenção para a caseinase como fator de virulência causador de dano à
célula epitelial humana. Não existem dados na literatura para a atividade desta exoenzima em
Candida.
A produção de gelatinase também tem sido registrada em E. faecalis. Em um estudo
multicêntrico e prospectivo realizado nos EUA, foram recuperados 219 isolados de
Enterococcus faecalis de 398 pacientes com bacteremia enterocócica, resultando em que 64%
dos isolados produziram gelatinase, contudo a presença deste fator de virulência não foi
associada a um mau desfecho como a mortalidade (Vergis et al., 2002). Outro estudo com
número menor de isolados de E. faecalis, porém, não obteve resultados positivos para a
gelatinase (Furumura et al., 2006).
Quanto à DNase, um estudo na Turquia investigou a atividade da DNase em 851
isolados de estafilococos recuperados de amostras de leite e sinalizou a importância desta
enzima para a distinção entre estafilococos patogênicos e a flora residente não patogênica
(Citak et al., 2003). Ainda não se conhece o potencial desta enzima na patogênese das
candidemias, mas considerando que 9% dos isolados de C. parapsilosis produziram esta
enzima, serão necessários mais estudos que esclareçam sua relevância na patogenia fúngica.
Concernente às demais exoenzimas testadas, as amostras de C. parapsilosis, C.
orthopsilosis e C. metapsilosis, foram hábeis em produzir lipase (98%, 100%, 100%,
respectivamente), proteinase (95%, 80%, 67%, respectivamente), e a exoenzima fosfolipase
61
(50%, 60%, 67%, respectivamente). Destas exoenzimas, a lipase foi fortemente produzida
pelas espécies do complexo.
A lipase foi demonstrada como um fator de virulência determinante em C.
parapsilosis e o metabolismo de lipídeos e virulência fúngica são pouco compreendidos
(Nguyen et al., 2009), todavia, já é conhecida a relevância desta enzima na patogenicidade
devido à digestão de lipídeos provendo nutrientes para o fungo, bem como pelo seu papel no
inicio da inflamação devido à lise da microbiota concorrente e células do sistema de defesa do
hospedeiro (Trofa et al., 2008). De fato, Abi-chacra et al. (2013) conjecturam que o papel das
lipases e fosfolipases em fungos capazes de causar micoses cutâneas e subcutâneas é
provavelmente devido à esta capacidade de causar hidrolise de gorduras no tecido subcutâneo
utilizando os resíduo de ácido graxos como fonte de nutrientes.
Considerando que as leveduras do complexo C. parapsilosis são oportunistas afetando
pacientes imunocomprometidos e dentre estes, os recém-nascidos com muito baixo peso, faz-
se necessário conhecer os fatores que contribuem para o aumento da susceptibilidade para
candidíase invasiva nestes pacientes. Para tanto, Trofa et al. (2011), propuseram um modelo
experimental de filhotes de ratos visando avaliar o impacto de genes específicos na
patogênese da doença, como os genes CpLIP1e CpLIP2 que determinam a expressão das
lipases. Os resultados atestaram entre outras coisas que as lipases são importantes para a
invasão de órgãos do hospedeiro (Trofa et al., 2011).
Em outro modelo in vivo com larvas de Galleria mellonella, Németh et al (2013)
demonstraram que as lipases do complexo C. parapsilosis tiveram maior capacidade
prejudicial da célula hospedeira e foram mortos menos eficientemente por macrófagos, o que
indica que a atividade desta enzima proporciona uma vantagem seletiva às células de Candida
durante a infecção.
No presente trabalho as três espécies expressaram alta produção de lipases, enquanto
que Németh et al. (2013) consideraram a espécie C. metapsilosis menos virulenta quanto à
expressão de enzimas lipolíticas. As variações da atividade lipolítica do complexo C.
parapsilosis podem ser devidas ao uso de metodologias diversas, bem como devido às
variações biológicas próprias das cepas em estudo (van Asbeck et al., 2009 ; Ge et al., 2011).
Quanto à secreção de fosfolipases, em C. albicans seu papel já foi elucidado como
fator de virulência sendo considerada essencial para a invasão da mucosa epitelial do
hospedeiro, visto que catalisam a hidrólise dos fosfolipídeos das membranas celulares
(Ibrahim et al., 1995). Contudo, em C. parapsilosis são poucos os estudos para o
62
esclarecimento do seu papel na patogênese (Trofa et al.,2008). Num estudo realizado na
China com 31 amostras sendo a maioria da pele, demonstrou que 90,5 % de isolados de C.
parapsilosis e 91,7% de C. metapsilosis eram produtores de fosfolipase, mas não haviam
isolados de C. orthopsilosis (Ge et al., 2011). Também para esta enzima são necessários mais
estudos que investiguem sua relação com a patogenicidade das espécies do complexo C.
parapsilosis.
Referente à atividade proteolítica das proteinases, tanto em isolados de C. albicans
quanto não-albicans são capazes de produzi-las, sendo descritas como responsáveis pela
adesão, dano tecidual e invasão (Mohan & Ballal, 2008). Curiosamente, Tavanti et al. (2010)
sugerem que existe uma correlação inversa estatisticamente significativa entre a secreção de
proteinases e a formação de biofilme propondo que as proteinases promovem o
desprendimento do biofilme maduro, pois neste trabalho 66% dos isolados da espécie C.
parapsilosis (stricto sensu) produziram proteinase, porém não foram capazes de produzir
biofilme. Tais dados são contrários aos do presente estudo, uma vez que os isolados de C.
parapsilosis (stricto sensu) exibiram tanto atividade para proteinase (95%) quanto para matriz
extracelular (100%). Resultado análogo foi obtido em estudo brasileiro no qual a formação de
biofilme foi positivamente correlacionada com a produção de proteinase com 100 % das cepas
estudadas (n=11) produtoras de proteinase (Abi-chacra et al., 2013).
Algumas das proteinases de C. parapsilosis têm sido caracterizadas e já se conhece
pelo menos duas destas enzimas, Sapp1p e Sapp2p produtos dos genes SAPP1 e SAPP2, cujos
papeis têm sido investigados para elucidar seus potenciais efeitos patogênicos (Merkerová et
al., 2006).
Quanto aos biofilmes, segundo Pasternak (2009) pouco ainda se conhece das
implicações dos mesmos em patologia humana, especialmente considerando que a presença
deste fator de virulência nos focos infecciosos torna o tratamento com os antimicrobianos
mais complicado. Esta complicação é devida, entre outros fatores, à penetração limitada de
substâncias e de células inflamatórias através da matriz do biofilme (Estivill et al., 2011),
configurando resistência ao antifúngico utilizado (Kuhn et al., 2002).
Estruturalmente, os biofilmes de C. parapsilosis exibem maior heterogeneidade
estrutural e uma densidade de células menor, após 48 h de incubação em ágar nutriente em
comparação com os biofilmes de C. albicans, fato que os diferencia na penetração de
antifúngicos nas matrizes dos mesmos (Samaranayake et al., 2005).
63
No presente estudo, todos os isolados do complexo C. parapsilosis manifestaram
habilidade entre fraca, moderada e alta produção de biofilme. Apenas 6 isolados (13%) de C.
parapsilosis foram fracamente produtores. Todos os demais isolados de C. parapsilosis, C.
metapsilosis e C. orthopsilosis foram moderadamente ou fortemente produtores de biofilme.
Estes resultados estão condizentes com a pesquisa de Lattif et al. (2010), os quais testaram 10
amostras de cada espécie do complexo C. parapsilosis provenientes de vários países do
mundo e atestaram que todos os isolados foram hábeis em formar biofilme.
Contrastando com os dados do presente estudo, na pesquisa de Tavanti et al. (2007),
nenhum dos isolados de C. orthopsilosis produziram biofilme assim como 95% das cepas de
C. metapsilosis não formaram biofilme in vitro. A falha de C. orthopsilosis em produzir
matriz extracelular contribuiria, portanto, para a relativa baixa frequência desta espécie em
ambiente clínico (Tavanti et al., 2007)
A capacidade de formação de biofilme por C. parapsilosis lato sensu foi avaliada em
23 isolados num estudo espanhol cujos resultados demonstraram ótima habilidade de
formação de biofilme em três materiais comumente utilizados como matéria prima na
fabricação de cateteres: cloreto de polivinil (PVC), poliuretano e teflon. Este dado é de grande
relevância considerando a habilidade de C. parapsilosis em colonizar a pele e em aderir em
dispositivos plásticos médicos de longa permanência como os cateteres (Estivill et al., 2011).
E uma vez comprovada esta competência para a colonização de superfícies estranhas (Trofa et
al., 2008; Tavanti et al., 2010; Estivill et al., 2011; Sifuentes-Osornio et al., 2012), na prática
clínica esta colonização pode ser reduzida ou evitada com os devidos cuidados de antissepsia
na colocação destes dispositivos invasivos, e pela utilização dos mesmos no menor tempo
possível (Pasternak, 2009).
Alguns avanços têm ocorrido quanto ao conhecimento biomolecular da formação de
biofilmes, pois recentemente foi caracterizado um gene de C. parapsilosis, o Fas2,
comprovando-se que este gene CpFas2 é essencial para o crescimento do fungo e para a
formação de biofilme (Nguyen et al., 2009). Adicionalmente, foi demonstrado que em C.
parapsilosis o fator de transcrição BCR1 (Biofilm and Cell wall Regulator 1) é requerido para
este processo de formação in vivo do biofilme e que as proteínas CFEM (common in fungal
extracellular membranes) estão envolvidas na aquisição de ferro, um nutriente limitante e
essencial para sobrevivência do fungo patogênico (Ding et al., 2011). Estas descobertas são
promissoras para futuros alvos de ação de drogas antifúngicas, entretanto, muito ainda se
precisa avançar considerando que 44% dos genes promotores da regulação gênica em
64
biofilmes intermediários de Candida e 40% dos genes que têm sua regulação reprimida em
biofilmes maduros atualmente têm funções desconhecidas (Costa et al., 2013).
Pesquisas também têm sido conduzidas no sentido de se conhecer a perfusão de
antifungicos através dos biofilmes, como demostrado nos resultados de Samaranayake et al.
(2005) os quais avaliaram a perfusão dos agentes antifúngicos anfotericina B, fluconazol e
flucitosina em biofilmes de C. parapsilosis, C. albicans e C. krusei desenvolvidos em filtros
microporosos. O transporte de antifúngicos através do biofilme de C. albicans foi mais difícil
em relação aos biofilmes de C. parapsilosis e C. krusei e os níveis de perfusão de fluconazol e
flucitocina foram mais penetrantes do que anfotericina B, embora este tenha causado mais
danos estruturais nas células superficiais do biofilme em comparação com os outros dois
antifúngicos (Samaranayake et al., 2005). Do ponto de vista clínico estes resultados ratificam
a importância da identificação do agente infectante em nível de espécie para a melhor
condução do tratamento.
No que concerne ao ensaio de susceptibilidade, para o fluconazol, 11% dos isolados de
C. parapsilosis apresentaram perfil de resistência, enquanto que as espécies C. orthopsilosis e
C. metapsilosis foram sensíveis a este fármaco. As três espécies tiveram isolados com
sensibilidade dose-dependente ao itraconazol: 14%, 20% e 67%, respectivamente. A droga
anfotericina B apresentou ótima atividade in vitro contra as três espécies, pois 100% de todos
os isolados foram sensíveis.
Estes dados estão em consonância com um estudo com um amplo número de amostras
(n 1357) na Espanha, o qual revelou moderada alteração nas taxas de resistência nos isolados
de C. parapsilosis ao fluconazol (de 0% a 4,1%), mas os isolados de C. orthopsilosis foram
todos sensíveis aos fármacos testados (fluconazol, itraconazol, voriconazol, anfotericina B,
dentre outros) (Pemán et al., 2012). Outro estudo na Espanha obteve resultados semelhantes a
estes (Gomez-Lopez et al., 2008).
Um estudo de vigilância com isolados de diversos países coletados nos anos de 2001 a
2005, não evidenciou aumento da resistência aos azóis entre os isolados de C. parapsilosis
(Pfaller et al., 2008), tal como em várias partes do mundo tem sido documentada a
sensibilidade de C. orthopsilosis e de C. metapsilosis aos azólicos e à anfotericina B (Silva et
al., 2009; Miranda-Zapico et al., 2011; Romeo et al., 2012). Todavia, já se tem observada
ocorrência de C. parapsilosis multiazol resistente (Silva et al., 2009) e de C. metapsilosis
resistente ou sensibilidade dose-dependente ao fluconazol (van Asbeck et al., 2008; Chen et
al., 2010).
65
Um dado a ser evidenciado é que todas as espécies do complexo C. parapsilosis
tiveram cepas com sensibilidade dose-dependente in vitro ao itraconazol. Conforme Aguado
et al. (2011), o itraconazol não oferece vantagem em relação ao fluconazol devido entre
outros fatores, à sua concentração sérica ser imprevisível e muito variada. Outro resultado a
ser destacado foi a sensibilidade de todos os isolados do complexo C. parapsilosis analisados
no presente estudo, ao fármaco anfotericina B. Este dado é de grande relevância posto que
formulações lipídicas de anfotericina B têm demonstrado atividade até contra biofilmes de C.
parapsilosis (Kuhn et al., 2002).
Com relação ao Brasil, um estudo realizado com 100 isolados de hemoculturas
provenientes de um hospital universitário apontou que 94% dos isolados de C. parapsilosis
(stricto sensu) foram sensíveis ao fluconazol e 6% tiveram sensibilidade intermediária
(inclusive com um isolado apresentando alto valor de CIM), mas para o itraconazol 100% dos
isolados foram sensíveis. Os isolados de C. orthopsilosis foram todos sensíveis aos fármacos
testados, dentre os quais fluconazol e itraconazol. Neste estudo nenhum dos isolados foi
reclassificado como C. metapsilosis (Bonfietti et al., 2012).
Infelizmente os dados de perfil de susceptibilidade do complexo C. parapsilosis aos
antifúngicos são escassos no Brasil (Colombo et al., 2006; Sifuentes-Osornio et al., 2012) e
na Região Norte são mais exíguos ainda. Alguns estudos nacionais designam as amostras
como C. parapsilosis sem, contudo, procederem à devida diferenciação molecular das demais
espécies do complexo C. parapsilosis (Stoppa et al., 2009; Favalessa et al., 2010).
Recente estudo de Nunes et al. (2011) com 7 amostras (coletadas entre 2008 a 2010)
procedentes de colonização e de infecção hospitalar de um hospital universitário de referência
em Belém do Pará, apontou sensibilidade de C. parapsilosis (lato sensu) numa frequência de
100% aos antifúngicos fluconazol, itraconazol, voriconazol e anfotericina B. Entretanto, o
número amostral foi pequeno (n 7) bem como dentre estas amostras poderiam haver isolados
de C. orthopsilosis ou C. metapsilosis, uma vez que o estudo não utilizou a identificação
molecular.
Igualmente, outro estudo realizado no Nordeste, com 57 cepas de C. parapsilosis
provenientes de pacientes atendidos em Hospitais do Ceará, apontou que todos os
antifúngicos testados, dentre os quais fluconazol, itraconazol e anfotericina B, apresentaram
atividade contra C. parapsilosis, não sendo detectado nenhum isolado resistente às drogas
testadas (Menezes et al., 2012). Também neste trabalho não foi realizada a identificação
molecular das espécies do complexo.
66
A presente pesquisa, portanto, é pioneira no conhecimento da ocorrência das espécies
C. parapsilosis (stricto sensu), C. orthopsilosis e C. metapsilosis, assim como seus perfis de
virulência e susceptibilidade aos antifúngicos no Pará. Contudo, é necessária a ampliação do
estudo no sentido de se conhecer a incidência destas espécies nas UTIs dos hospitais da
região, sejam em espécimes clínicos relacionados a infecções superficiais ou sistêmicas,
sejam em amostras ambientais, bem como manter vigilância laboratorial pelo monitoramento
de resistência aos fármacos utilizados na prática clínica, visando, sobretudo, o uso racional do
limitado número de drogas antifúngicas disponíveis.
67
5 CONCLUSÕES
- Os sistemas semi-automatizados e automatizados não permitem diferenciar as
espécies do complexo C. parapsilosis;
- As espécies crípticas apresentam heterogeneidade quanto à assimilação de
carboidratos, variando neste aspecto bioquímico tanto intraespécie quanto interespécie;
- O meio ágar Eosina Azul de Metileno (EAM) sugere tratar-se de alguma espécie
pertencente ao complexo, porém não tem aplicação como meio de identificação presuntiva
para individualização das espécies propriamente ditas;
- A espécie C. parapsilosis é a mais prevalente, ocorrendo também no Pará as espécies
C. orthopsilosis e C. metapsilosis;
- As exoenzimas gelatinase, urease e caseinase parecem não fazer parte das estratégias
de patogenicidade e virulência das espécies do complexo C. parapsilosis, uma vez que não
foram secretadas pelas mesmas;
- As espécies do complexo C. parapsilosis exibiram alto grau de atividade hidrolítica
através da produção de fosfolipase, lipase e proteinase, as quais têm sido reconhecidas pelo
seu importante papel na virulência fúngica;
- A DNase foi secretada por um pequeno número de amostras de C. parapsilosis sendo
necessários mais estudos com maior número amostral para a investigação do seu potencial na
patogenicidade das espécies do complexo;
- Todos os isolados analisados foram produtores de biofilme demonstrando sua
potencialidade de virulência;
- Existe a necessidade de monitoramento local do perfil de susceptibilidade de C.
parapsilosis ao fluconazol, pois alguns isolados desta espécie apresentaram resistência a este
fármaco;
- O itraconazol deve ter seu uso analisado com critério, pois pelo menos uma amostra
de cada espécie apresentou sensibilidade dose-dependente a esta droga;
- A anfotericina B continua a ser uma escolha terapêutica eficaz do ponto de vista da
sua atividade antifúngica in vitro para as três espécies do complexo C. parapsilosis.
68
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ANEXO I
DADOS DO PROJETO DE PESQUISA
Título da Pesquisa: IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR E CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DE
LEVEDURAS DO COMPLEXO C. parapsilosis (Candida parapsilosis, C. orthopsilosis e C.
metapsilosis)
Pesquisador: Silvia Marques
Área Temática:
Versão: 2
CAAE: 18425713.9.0000.0019
Instituição Proponente: Instituto Evandro Chagas/SVS/MS
Patrocinador Principal: Instituto Evandro Chagas/SVS/MS
DADOS DO PARECER
Número do Parecer: 345.631
Data da Relatoria: 31/07/2013
Apresentação do Projeto:
Projeto de interesse para saúde pública, muito bem fundamentado e claramente justificado. Trata-se da
caracterização fenotípica e molecular de leveduras do complexo C. parapsilosis, com potencial
patogenicidade para humanos.
Objetivo da Pesquisa:
Os objetivos estão claros e possibilitam responder a hipótese proposta.
Avaliação dos Riscos e Benefícios:
O pesquisador deverá considerar como riscos àqueles relacionados aos participantes do estudo, dos
quais as amostras foram isoladas, incluindo perda de garantia de sigilo informações e os
procedimentos a serem utilizados para reduzi-la ou evitá-la. Aspectos relativos a biossegurança podem
ser colocados em item a parte.
Comentários e Considerações sobre a Pesquisa:
Pesquisa relevante, claramente apresentada e metodologiamente adequada.
80
Considerações sobre os Termos de apresentação obrigatória:
O pesquisador deverá considerar como justificativa de dispensa de TCLE a dificuldade de obtenção do mesmo devido ao tempo da coleta e dificuldade de acesso aos participantes, e não
meramente porque "os isolados fazem parte da coleção de cultura do laboratório de micologia". Este
comentário se faz importante para enfatizar que as amostras ou produtos delas obtidos são oriundos de
pessoas, portanto, é de propriedade dos participantes e sua utilização deverá respeitar a dignidade e
autonomia dos mesmos, sendo que o uso destas amostras deverão obedecer as diretrizes dispostas na
Resolução CNS 441/2011.
Recomendações:
Recomendamos que a coordenação mantenha atualizados todos os documentos pertinentes ao projeto.
Este CEP se incumbirá dos procedimentos de acompanhamento preconizados pela Resolução
466/2013 e suas complementares, do Conselho Nacional de Saúde/Ministério da Saúde.
Conclusões ou Pendências e Lista de Inadequações:
Deverá ser encaminhado relatório consolidado ao final, incluindo os resultados finais da pesquisa, em
um prazo máximo de 60 (sessenta) dias, após a finalização da pesquisa.
Situação do Parecer:
Aprovado
Necessita Apreciação da CONEP:
Não
Considerações Finais a critério do CEP:
ANANINDEUA, 31 de Julho de 2013
__________________________________
Assinado por:
HELOISA MARCELIANO NUNES
(Coordenador)
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