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Parvovirus, Pasteurellenund Co.
Infektionsüberwachung bei kleinen Labornagern
Werner Nicklas
Homburg, 11. März 2019
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Das Vorgehen bei der Überwachung
ist abhängig von • wissenschaftlichen Fragestellungen• baulichen Bedingungen• Haltungsbedingungen• Herkunft (Beschaffung) der Tiere• Personal• diagnostischen Möglichkeiten• Finanzen
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Die Häufigkeit von
Untersuchungen sollte abhängig
gemacht werden
vom Risiko der
Erregereinschleppung
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Die Zahl zu untersuchender Tiere
(Stichprobe)
ist abhängig von der vermuteten
Anzahl positiver Tiere in der
Population
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Infektionsüberwachung bei Versuchstieren
Anzahl zu untersuchender Tiere (Stichprobengröße)
– „ILAR Formel“ (1976)
– Cannon and Roe (1986)
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Berechnung der Tierzahl
Voraussetzungen• Infektion gleichmäßig verteilt (beide
Geschlechter)
• Populationsgröße > 100 Tiere
• Probenentnahme nach dem Zufallsprinzip
Formel: log 0,05---------- = Anzahl Tierelog N
N = Prozentsatz nicht infiziert0.05= 95% confidence limit
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Zahl zu untersuchender Tiere
% positiv Sicherheit95% 99% 99,9%
5 59 90 13510 29 44 6620 14 21 3130 9 13 2050 5 7 10
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Sample size required for detecting disease with 99% confidence
1616200
16150
15100
1580
1460
1340
1120
1015
1010
# anim. to be sampled to detect 25% prevalencePopulation size
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Probenentnahme für Infektionsüberwachung
ausreichende Tierzahl Entnahme nach dem Zufallsprinzip
Barrieren - Zucht vorhanden möglich
Barrieren - Experiment meist vorhanden nicht möglich
Isolatorhaltung meist nicht vorhanden meist nicht möglich
Mikroisolator (Filter-top) nein
IVC nein
transgene Linie meist nicht vorhanden nicht möglich
immundefiziente Tiere nicht sinnvoll
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Sentinels
werden für Untersuchungszwecke in einen Tierbestand gebracht und nach ausreichend langer Verweilzeit (Expositionsdauer mind. 8-10 Wochen oder länger) stellvertretend für eine Population untersucht.
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Sentinels
Einsatzgebiet• experimentelle Haltungen• Immundefiziente Tiere
(keine Antikörperbildung)
• transgene Tiere (Individuum oft unersetzlich, Immundefekte?)
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Sentinels
Auswahlkriterien• Mikrobiologische Qualität (bes. bei
immundefizienten Tieren)
• Immunologische Kompetenz
• Stamm (Inzucht, Auszucht)
• Alter: junge adulte Tiere
Sentinels
Ganz wichtig!!!!!
• Mikrobiologische Qualität– Sentinels dürfen die Erreger nicht
mitbringen, auf die untersucht werden soll
– Bsp: Staph. aureus, Pneumocystis sp., Ps. aeruginosa, etc.
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Sentinels – “dirty bedding“
Sentinels werden benutzter Einstreu, Staub, Aerosolen ausgesetzt
• Wenige Sentinels repräsentieren eine Kolonie
• Einstreumenge? Nur begrenzte Mengen können übertragen werden, Risiko der „Verdünnung“ einer infektiösen Dosis
• IVC: auch Erhöhung der Wahrscheinlichkeit der Übertragung durch Exposition von Sentinelsgegenüber unfiltrierter Abluft
• Nicht alle Erreger werden leicht übertragen!!! 15
Sentinels – “dirty bedding”Nicht alle Erreger werden leicht übertragen
• Respiratorische Erreger werden kaum übertragen [z. B., Sendai Virus, Filobacterium rodentium (CAR bacillus), Mykoplasmen, Pasteurellaceae], schlechte Übertragung von Milben
• einige Erreger sind sehr stark an ihren Wirt adaptiert (Pasteurellaceae, Filobacterium rodentium, Streptobacillus moniliformis)
• Resistenz gegenüber best. Erregern (MPV, Rotavirus) nimmt mit zunehmendem Alter zu
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Sentinels – “dirty bedding”Nicht alle Erreger werden leicht übertragen
• Bei bestimmten Stämmen reduzierte Empfänglichkeit gegenüber spezifischen Erregern (e.g., MPV - C57BL/6, MVM - Auszuchtmäuse)
• Immundefiziente Tiere sind hilfreich zum Nachweis bestimmter Erreger (Pneumocystis, C. bovis)
• Serokonversion tritt z. T. sehr spät (>10 Wochen) auf, z. B. bei bakteriellen Erregern (z. B. Pasteurellaceen, Streptobacillus)
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Käfigwechsel in Umsetzstation (laminar flow), Käfige dicht verschlossen
Kein Austausch von Erregern zwischen Käfigen – bei korrektem handling
Einzelbelüftete Käfige (IVC)
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Health monitoring bei IVC Haltung
• Direkte Untersuchung von Kolonietieren ist möglich, aber große Tierzahlen notwendig
• Üblicherweise indirektes Testen über Sentinels• Gepoolte Einstreu aus mehreren Käfigen von
Kolonietieren
• Nachweis einer Infektion ist abhängig von Übertragung der Erreger auf Sentinels.
• Sentinels müssen einer infektiösen Dosisdes Erregers ausgesetzt sein
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Sentinels - IVC Haltung• Modifikationen
– Mehrere Tiere der Ausgangskolonie gehen durch einen Sentinelkäfig
– Abluft – Sentinels
• Mögliche Alternativen? – Untersuchung von kranken Tieren!!!!! – Untersuchung von eingehenden Tieren
(Prophylaxe) – Definition „Mikrobiologische Einheit“: Linie /
Stamm, Experiment– PCR zum Testen auf aktive Infektionen– Abluftfilter (PCR) 20
Information zum Infektionsstatus
• Europa: FELASA Empfehlung (2002, 2014)
• USA: keine Vorgaben (z. B. durch AALAS)
• Australien: Einfuhrbestimmungen (Hantaviren)
• Keine weltweit standardisierte Vorgehensweise für Infektionsüberwachung und Ergebnismitteilung
• Erhältliche Informationen sind sehr variabel, Lesen und Verstehen teilweise schwierig und zeitraubend 21 22
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Information zum Infektionsstatus
• Untersuchungsergebnis („test report“): erstellt vom Diagnostiklabor, gilt für Tiere einer Einsendung
• Gesundheitszeugnis („health report“): fasst Daten von regelmäßigen und wiederholten Untersuchungen zusammen, Information basiert auf größeren Tierzahlen, zusätzliche Informationen (z. B. klinische Beobachtungen, Haltungsbedingungen, Untersuchungsprogramm, etc.)
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Gesundheitszeugnis
• Genaue Bezeichnung der Herkunft („microbiological unit“), z. B. Raum-Nr., Barriere
• Haltungsbedingungen (z. B. Barriere, offene Käfige, IVC, Isolator)
• Name(n) des/der Diagnostiklabor(s)• Datum der Neubelegung / Sanierung• Datum der letzten Untersuchung
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Gesundheitszeugnis
• Anzahl untersuchter Tiere (seit Neubelegung oder für best. Zeitraum, z. B. 12/18 Monate)
• Methoden (klinisch, mikroskopisch, Serologie, Kultur, Histopathologie, PCR)
• Name(n) nachgewiesener Erreger • Name(n) nicht nachgewiesener Erreger• Behandlungen, Impfungen, etc. • Kontaktperson
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Gesundheitszeugnis
Zusätzliche für das Verständnis des Gesundheitszeugnisses wichtige Informationen
• Untersuchungsprogramm (direkte Untersuchung von Kolonietieren, Sentinels, etc.)
• Klinische Beobachtungen 30
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FELASA Empfehlungen
FELASA Recommendations for the health monitoring of rodent and rabbit colonies in breeding and experimental units. Laboratory Animals (2002) 36, 20-42
FELASA Recommendations for the health monitoring of rodent and rabbit colonies in breeding and experimental units. Laboratory Animals (2014) 48, 178-192
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AALAS/FELASA Working Group on Health Monitoring of rodents for animal transfer
Journal of the American Association for Laboratory Animal Science (2014) 53 (6), 633-640
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Infektionen bei Versuchstieren
Wichtige Aufgaben der Tierhausleitung
• Einschleppung von Mikroorganismen (von außen)
• Übertragung von Mikroorganismen innerhalb einer Kolonie
verhindern
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Wichtigste Quelle für Einschleppung von Erregern in eine Tierhaltung
Tierlieferungen von außen
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Carty et al. 2008
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Marx JO, Gaertner DJ and Smith AL.
Results of survey regarding prevalence ofadventitial infections in mice and rats at biomedical research facilities.
J Am Assoc Lab Anim Sci 2017; 56: 527-533.
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Bezug von Labortieren
• Häufiger Bezug von genetisch veränderten Tieren von sehr vielen Universitäten/Forschungseinrichtungen
• Diese Tiere sind mit einer höheren Wahrscheinlichkeit infiziert als Tiere von kommerziellen Züchtern
►Erhöhte Bedeutung von zuverlässigen Informationen zum Infektionsstatus 38
Verhindern von Erregereinschleppung
Bei Tieren, evtl. auch bei von Tieren stammenden Proben
Voraussetzung sind aussagekräftige Informationen zum Infektionsstatus
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Voraussetzung für sicheres Einbringen von Tieren
Zuverlässige und umfassende Information zum Infektionsstatus
Ist häufig schwer erhältlich!
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„SPF“
Das Freisein von einzeln aufzulistenden Erregern
muss durch regelmäßige Untersuchung
einer ausreichend großen Zahl von Tieren
(Stichprobengröße)
im richtigen Alter
mit geeigneten Methoden
nachgewiesen sein.
• “SPF”• ‘barrier-reared’ • ‘virus-antibody-free’ (VAF) • ‘SOPF’• ‘clean conventional’• ‘pathogen-free’ or ‘murine pathogen-
free’ (MPF) • ‘optimal hygienic conditions’ (OHC) • ‘health-monitored’ • ’conventional’
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Infektionen heute
• Kaum klinische Erkrankungen
• „pathogene“ Keime weitgehend eliminiert
Aber • Trotzdem Einflüsse von Erregern auf
Versuchsergebnisse
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Viren species mouse rat
Mouse hepatitis virus (MHV) x Kilham rat virus (KRV) x Mice minute virus (MMV) x Mouse parvovirus (MPV) Pneumonia virus of mice (PVM) x x Reovirus type 3 x x Sendai virus x x Mouse encephalomyelitis virus (GD VII) x x Toolan's H-1 virus x Rat Minute Virus (RMV) x Rat corona virus (RCV/SDAV) x Mouse adenovirus (FL, K87) x Ectromelia virus x K virus x Lymphocyt. choriomeningitis virus (LCMV) x Polyoma virus x Laktate dehydrogenase virus (LDV) x Mouse rota virus (EDIM) x Hantaviruses x Murine Norovirus x
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Parvoviren
• Minute Virus of Mice (MVM)
• Mouse Parvovirus (MPV)
• Mouse Kidney Parvovirus (MKPV)
• Kilham Rat Virus (KRV)
• Toolan‘s H-1 Virus (H-1)
• Rat Parvovirus (RPV)
• Rat Minute Virus (RMV)
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Parvoviren
• Replikation nur in mitotisch aktiven Zellen (S Phase)
• lytische Infektion von Tumorzellen – Beeinflussung von Tumorentstehung und -wachstum
(onkosuppressiv, Kontamination von Tumorzellen)
• Einfluß auf Embryonalentwicklung – embryonaler Frühtod, zerebellare Hypoplasie,
Missbildungen, Teratologie, Embryologie
• lymphotrop– Beeinflussung des Immunsystems, immunsuppressiv
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Murine norovirus (MNV)
Cadwell, K., et al. (2010)
Virus-Plus-Susceptibility Gene Interaction Determines Crohn’s Disease Gene Atg16L1 Phenotypes in Intestine
Cell 141, 1135–1145 “…an interaction between a specific virus infection and a mutation in the Crohn’s disease susceptibility gene Atg16L1 induces intestinal pathologies in mice…”
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Bakterielle Infektionserreger(Auswahl)
• Filobacteriumrodentium (CAR bacillus)
• Citrobacterrodentium
• Clostridium piliforme• Corynebacterium
(C.) bovis• C. kutscheri• Helicobacter spp. • Leptospira spp.
• Mycoplasma spp. • „Pasteurella
pneumotropica“ • P. multocida• Pseudomonas
aeruginosa • Salmonella sp. • Staphylococcus aureus• Streptobacillus
moniliformis• Streptococcus spp.
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Helicobacter hepaticus
Chronische Hepatitis
Empfänglich: A/J, BALB/cAnN, C3H/HeN, SCID/N, SJL/N
Resistent: C57BL/6N B6C3F1
Lebertumoren
Empfänglich: A/J (männlich)
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Helicobacter hepaticus
Entzündliche Darmerkrankungen (IBD)
• Insbesondere bei immundefizienten Mäusen (nude, scid)
• Auslösung von IBD bei verschiedenen Mäusestämmen beschrieben (Swiss-Webster, scid, A/J, IL10-/-, Rag2-/-
• Verzögerung des Auftretens von IBD bei best. Linien
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Helicobacter Infektion
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H. typhlonius
H. bilis
Pasteurellaceen
• Wichtigste Erreger bei Maus und Ratte: Rodentibacter (früher „P. pneumotropica“), aber auch andere Arten (z. B. Muribacter muris) kommen vor
• meist hohe Wirtsspezifität
• weite Verbreitung in Nagerpopulationen, klinisch häufig inapparent
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„Rodentibacter spp.“
• Besiedelt alle Schleimhäute (Atem-, Urogenital-, Verdauungstrakt, Konjunktiven)
• Pathogenität: gering
• Mortalität: keine / gering
• Bei immundefizientenTieren: reduzierte Lebenserwartung durch Abszessbildung etc.
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„Rodentibacter spp.“
Identifizierung und Bestimmung von Isolaten – ungenügend standardisierte Methoden zur
Identifizierung, kommerzielle Identifikations-Kits: nur bedingt brauchbar
Häufig ungenügende Übereinstimmung von Identifizierungsergebnissen zwischen Labors
Zuverlässigkeit Gesundheitszeugnisse?
Staphylococcus aureus
• Übertragung vom Menschen auf Versuchstiere (Nager) möglich
• weite Verbreitung in Labortierpopulationen
• wichtiger Eitererreger (Abszessbildung) auch bei immunkompetenten Tieren
• bei immundefizienten Tieren: Wund- und Hautinfektionen, Abszesse, nicht akzeptabel bei nude, scid, rag 56
ß-hämolysierende Streptokokken (B)
• gelegentlich lokale Abszesse und systemische Infektionen bei immunkompetenten Tieren (z. B. bei Transportstress)
• bei immundefizientenTieren: Infektionen des Genitaltrakts, systemische Infektionen, z. T. mit Todesfällen 57 58
Endoparasiten (Beispiele)
• Helminthen– Syphacia
– Aspiculuris
• Protozoen – Spironucleus muris
– Trichomonaden
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Ektoparasiten (Beispiele)
• Milben (Maus) – Myobia musculi, Myocoptes musculinus,
Radfordia affinis, R. ensifera, Demodex sp.
• Läuse
• Flöhe
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Vielen Dank
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