HBOT and Autoimmune Disease

C l i n . e x p . I m m u n o l . ( 1 9 9 1 ) . 8 6 , 3 2 2 - 3 2 7S u p p r e s s i v e e f f e c t o f h y p e r b a r i c o x y g e n a t i o n o n i m m u n e r e s p o n s e so f n o r m a l a n da u t o i m m u n e m i c eK . S AI TO, Y . TANAK A, T. OTA, S . ETO&U. Y AMAS HI TA*F i r s t D e p a r t m e n t o f I n t e r n a l Me di c i n e , Un i v e r s i t y o fOc c u p a t i o n a l a n d En v i r o n m e n t a l He a l t h , S c h o o l o f Me di c i n e , K i t a k y u s h i a n d *D e p a r t m e n t o f I m m u n o l o g y a n d P a r a s i t o l o g y ,Hi r o s h i m a Un i v e r s i t y , S c h o o l o f Me di c i n e , Hi r o s h i m a , J a p a n( Ac c e p t e d f o r p u b l i c a t i o n 1 5 Ma y 1 9 9 1 )S UMMARYWe s t u di e d t h e e f f e c t o f h y p e r b a r i c o x y g e n a t i o n ( HBO) o n i m m u n e r e s p o n s e s i n n o r m a l a n da u t o i m m u n e m i c e . Mi c e we r e e x p o s e dt o HBOi n a n a n i m a l c h a m b e r a t a p r e s s u r e o f 2 5 2 - 5 k P a f o r 1 ha n d o n c e a da y f o r 5 da y s . Th e i m m u n i z a t i o n o f C 3 H/He m i c e wi t h s h e e p e r y t h r o c y t e s i n du c e dm a r k e d a n t i - s h e e p e r y t h r o c y t e a n t i b o dy r e s p o n s e o n da y 7 . Ho we v e r , t h i s r e s p o n s e wa s m a r k e dl ys u p p r e s s e d i n HBO- t r e a t e dm i c e . Th e s u p p r e s s i o n i s de p e n de n t o n t h e du r a t i o n o f HBOa n d i t wo r k so n t h e e a r l y a n dt h e l a t e s t a g e o f a n t i b o dy r e s p o n s e s . HBOs u p p r e s s e s t h e de v e l o p m e n t o f b o t h s h e e pe r y t h r o c y t e - s p e c i f i c B c e l l s a n d h e l p e r T c e l l s a f t e r t h e i m m u n i z a t i o n . Th e n , we t r i e d t o e x p o s ea u t o i m m u n e m i c e t o HBO. S p o n t a n e o u s i m m u n o g l o b u l i n p r o du c t i o n o f NZBa n d MRL/l p r s p l e e nc e l l s wa s a l s o s i g n i f i c a n t l y s u p p r e s s e d b y HBO. F u r t h e r m o r e , l o n g t e r m HBOe x p o s u r e r e s u l t s i n t h es u p p r e s s i o n o f t h e de v e l o p m e n t o f a u t o i m m u n e s y m p t o m s s u c h a s p r o t e i n u r i a , f a c i a l e r y t h e m a a n dl y m p h a de n o p a t h y i n MRL/l p r m i c e . Al l t h e s et r e a t m e n t o f a u t o i m m u n e di s e a s e s .r e s u l t s s u g g e s t t h a t HBO i s a p p l i c a b l e f o r t h eK e y wo r ds HBO l u p u s m o u s e a u t o a n t i b o dyI NTROD UC TI ONHy p e r b a r i c o x y g e n a t i o n ( HBO) t h e r a p y i s c l i n i c a l l y a p p l i e d f o rp a t i e n t s wi t h l o c a l h y p o x i a s u c h a s s k i n u l c e r , c e r e b r a l i n f a r c -t i o n a n d s u dde n de a f n e s s . I t i s wi de l y a c c e p t e d t h a t t h e m a r k e di n c r e a s e o f di s s o l v e d o x y g e n i n t h e b l o o d a n d t i s s u e s r e s u l t s i nt h e p r o m o t i o n o f r e c o v e r y f r o m s u c h di s e a s e s . S o m e i n v e s t i g a -t o r s de m o n s t r a t e d t h a t t h e e x p o s u r e o f e x p e r i m e n t a l a n i m a l s t oHBOi n du c e d t h e s u p p r e s s i o n o f s e v e r a l c e l l - m e di a t e d i m m u n er e s p o n s e s s u c h a s a l l o g r a f t r e j e c t i o n ( J a c o b , Th u r n i n g &S a c k s t e de r , 1 9 7 8 ) a n dde l a y e dt y p e h y p e r s e n s i t i v i t y r e s p o n s e s t ot u b e r c u l i n p r o t e i n ( Wa r r e n , S a c k s t e de r &J a c o b 1 9 7 8 a ) . I t i sa l s o r e p o r t e d t h a t t h e f u n c t i o n s o f l e u k o c y t e s a n dm a c r o p h a g e sa r e s u p p r e s s e d b y i n v i t r o h y p e r o x i da t i o n ( Mu r p h y , Hy a m s &F i s h e r , 1 9 7 5 ; Ba b i o r , 1 9 7 8 ) . Ho we v e r , t h e r e h a s n o t b e e n a f u l le x a m i n a t i o n o f t h e m e c h a n i s m o f t h e i m m u n o s u p p r e s s i v e e f f e c to f HBO. I n a p r e v i o u s r e p o r t ( S a i t o e t a l . , 1 9 8 9 ) we s h o we d t h a tHBO m a r k e dl y r e du c e d t h e l e v e l o f s e r u m I g G , a n t i - D NAa n t i b o dy a n di m m u n e c o m p l e x e s i n p a t i e n t s wi t h s y s t e m i c l u p u se r y t h e m a t o s u s . Th i s e v i de n c e s u g g e s t s t h a t HBO m a y h a v es o m e r e g u l a t o r y f u n c t i o n s o n i m m u n e r e s p o n s e s . I n t h i s p a p e rwe s t u di e d t h e e f f e c t o f HBOo n i m m u n e r e s p o n s e s u s i n g s h e e pe r y t h r o c y t e - i m m u n i z e d m i c e a s a m o de l s y s t e m . F u r t h e r m o r e ,C o r r e s p o n de n c e : D r Uk i Y a m a s h i t a , D e p a r t m e n t o f I m m u n o l o g ya n d P a r a s i t o l o g y , Hi r o s h i m a Un i v e r s i t y , S c h o o l o f Me di c i n e , 1 - 2 - 3 ,K a s u m i , Mi n a m i k u , Hi r o s h i m a , 7 3 4 , J a p a n .we t r i e d t o e x p o s e a u t o i m m u n e m i c e t o HBO i n o r de r t oe v a l u a t e t h e t h e r a p e u t i c a p p l i c a t i o n o f HBO t o a u t o i m m u n edi s e a s e s .MATERI ALS AND METHOD SAn i m a l sC 3 H/He , NZBa n d MRL/l p r m i c e we r e p u r c h a s e d f r o m S e i waEx p e r i m e n t a l An i m a l Lt d. ( Y o s h i t o m i , J a p a n ) a n d b r e d i n o u rl a b o r a t o r y . S i x - m o n t h o l d f e m a l e C 3 H/He , 4 - m o n t h o l d f e m a l eNZB a n d 2 - m o n t h o l d f e m a l e MRL/l p r m i c e we r e u s e d f o re x p e r i m e n t s .Ex p o s u r e t o HBOMi c e c a g e d i n g r o u p s o f 1 0 we r e e x p o s e d t o HBOi n a n a n i m a lc h a m b e r a t t h e p r e s s u r e o f 2 5 2 - 5 k P a f o r 1 h o n c e a da y . Af t e r a tl e a s t 5 m i n o f f l u s h i n g , t h e e x h a u s t v a l v e wa s c l o s e da n dt h e f l o wf r o m t h e c o m m e r c i a l o x y g e n t a n k wa s a dj u s t e d t o t h e r a t e o fc o m p r e s s i o n o f 2 5 2 5 k P a . At t h e e n d o f t h e t r e a t m e n t , t h e t a n kwa s de c o m p r e s s e d s l o wl y ( 5 0 5 k P a /m i n ) .I m m u n i z a t i o n o f m i c eC 3 H/He m i c e we r e i m m u n i z e d wi t h a n i . p . i n j e c t i o n o f 5 x 1 0 8s h e e p e r y t h r o c y t e s . An t i - s h e e p e r y t h r o c y t e a n t i b o dy r e s p o n s ewa s de t e c t e d b y a di r e c t h a e m o l y t i c p l a q u e - f o r m i n g c e l l ( P F C )a s s a y u s i n g s p l e e n c e l l s .3 2 2S u p p r e s s i v e e f f e c t o f HBOo n i m m u n e r e s p o n s eP r e p a r a t i o n o fTc e l l s a n dB c e l l sS p l e e n c e l l s u s p e n s i o n s we r e p r e p a r e d f r o m m i c e b y g e n t l ydi s p e r s i n g t h e t i s s u e i n HBS S ( Ni s s u i S e i y a k u C o . , To k y o ,J a p a n ) a n d e r y t h r o c y t e s we r e l y s e d b y t r e a t m e n t wi t h Tr i s -NH4 C l . Th e s p l e e n c e l l s s u s p e n de d i n RP MI 1 6 4 0 m e di u m( Ni s s u i S e i y a k u C o . ) c o n t a i n i n g 5 % f e t a l c a l f s e r u m ( F C S ,G r a n d I s l a n d Bi o l o g i c a l C o . , G r a n d I s l a n d, NY ) we r e a p p l i e do n n y l o n wo o l c o l u m n ( F e n wa l La b o r a t o r i e s , Mo r t o n G r o v e ,I L) . Af t e r i n c u b a t i o n o f c e l l s o n t h e c o l u m n f o r I h a t 3 7 C , n o n -a dh e r e n t c e l l s we r e e l u t e d dr o p wi s e . Th e c e l l r e c o v e r y f r o m t h ec o l u m n wa s a b o u t 1 0 % o f t h e o r i g i n a l c e l l s a p p l i e d. Th er e c o v e r e d c e l l s we r e c o m p o s e d o f m o r e t h a n 9 5 %Th y l + c e l l sa n d di d n o t r e s p o n d t o B c e l l m i t o g e n s u c h a s l i p o p o l y s a c c h a r -i de ( LP S ) f r o m Es c h e r i c h i a c o l i a n dwe r e u s e da s p u r i f i e d Tc e l l s .S p l e e n c e l l s we r e a l s o t r e a t e d wi t h a n t i - Th y l - 2 m o n o c l o n a la n t i b o dy ( C e da r l a n e La b o r a t o r i e s , Ot t a wa , C a n a da ) a n dr a b b i tc o m p l e m e n t ( C e da r l a n e La b o r a t o r i e s ) a t 3 7 C f o r 1 h . Th e c e l lr e c o v e r y wa s a b o u t 4 0 % o f t h e o r i g i n a l c e l l n u m b e r s t r e a t e d.Th e r e c o v e r e d c e l l s we r e c o m p o s e d o f m o r e t h a n 9 0 %i m m u n o -g l o b u l i n - p o s i t i v e c e l l s a n d di d n o t r e s p o n d t o T c e l l m i t o g e ns u c h a s c o n c a n a v a l i n A a n d we r e u s e d a s p u r i f i e d B c e l l s( Y a m a s h i t a &Ha m a o k a , 1 9 7 9 ) .S e c o n da r y a n t i b o dy p r o du c t i o n a g a i n s t s h e e p e r y t h r o c y t e sP u r i f i e d B c e l l s ( 2 - 5 x 1 0 5 ) a n d T c e l l s ( 2 - 5 x 1 0 5 ) f r o m HBO-t r e a t e d o r u n t r e a t e d C 3 H/He m i c e p r i m e d wi t h s h e e p e r y t h r o -c y t e s we r e m i x e d i n s e v e r a l c o m b i n a t i o n s a n d c u l t u r e d wi t hI x 1 0 6 s h e e p e r y t h r o c y t e s i n RP MI 1 6 4 0 m e di u m ( Ni s s u iS e i y a k u C o . ) c o n t a i n i n g 1 0 % F C S u s i n g m i c r o t i t r e c u l t u r ep l a t e s ( F a l c o n No . 3 0 7 2 , F a l c o n P l a s t i c s , Ox n a r d, C A) a t 3 7 Cf o r 5 da y s i n 5 % C O2 a n d 9 5 % a i r . An t i - s h e e p e r y t h r o c y t ea n t i b o dy r e s p o n s e wa s de t e c t e d b y P F C a s s a y o n da y 5 .As s a y o f a n t i b o dy p r o du c t i o n b y s p l e e n c e l l sAn t i b o dy - p r o du c i n g c e l l s we r e de t e c t e d b y a di r e c t h a e m o l y t i cP F C a s s a y o n s l i de c h a m b e r s wi t h s h e e p e r y t h r o c y t e s . I nm e a s u r i n g t o t a l i m m u n o g l o b u l i n p r o du c t i o n o f s p l e e n c e l l sf r o m NZBa n dMRL/l p r m i c e , i m m u n o g l o b u l i n - p r o du c i n g c e l l swe r e de t e c t e d b y a r e v e r s e h a e m o l y t i c P F C a s s a y o n s l i dec h a m b e r s wi t h p r o t e i n A( P h a r m a c i a F i n e C h e m i c a l s , Up p s a l a ,S we de n ) c o a t e d s h e e p e r y t h r o c y t e s ( P i e r c e e t a l . 1 9 7 1 ; G r o n o w-i c z , C o u t i n h o &Me l c h e r s , 1 9 7 6 ) . I n di r e c t P F C , f a c i l i t a t e d b yr a b b i t a n t i - m o u s e I g G s e r u m , we r e de t e c t e d. Th e r e s u l t s we r ee x p r e s s e d a s t h e m e a n n u m b e r s a n ds . e . m . o fP F C /5 x 1 0 5 s p l e e nc e l l s i n t r i p l i c a t e c u l t u r e s .Ev a l u a t i o n o f c l i n i c a l e f f e c t o f l o n g t e r m HBOe x p o s u r eTwo - m o n t h - o l d f e m a l e MRL/l p r m i c e we r e e x p o s e d t o HBOo n c e ada y f o r 2 m o n t h s i n t h e c o n di t i o n s de s c r i b e da b o v e . Th e nt h e s u r v i v a l o f m i c e , b o dy we i g h t a n d we i g h t o f b i l a t e r a li n g u i n a l l y m p h n o de we r e m e a s u r e d. Ur i n e p r o t e i n wa s m e a -s u r e d s e m i q u a n t i t a t i v e l y b y m e a n s o f C o m b i s t i c s ( S a n k y o C o . ,To k y o , J a p a n ) . Ag r a di n g o f 0 - 4 wa s m a de o n t h e b a s i s o f t h ep r o t e i n c o n c e n t r a t i o n i n t h e u r i n e , t h e f i v e c a t e g o r i e s b e i n g0 - 3 0 , 3 0 - 1 0 0 , 1 0 0 - 3 0 0 , 3 0 0 - 1 0 0 0 a n d 1 0 0 0 m g /dl , r e s p e c t i v e l y .Ur i n e o f e a c h m o u s e wa s m e a s u r e d f o r 3 da y s a n dm e a n s c o r e swe r e a v e r a g e d i n b o t h c o n t r o l a n d HBOg r o u p . An t i - n u c l e a ra n t i b o di e s i n t h e s e r a we r e de t e c t e d b y ELI S A. Th e r e s u l t s we r ee x p r e s s e d a s t h e o p t i c a l de n s i t y u n i t s a t 4 0 5 n m o f wa v e l e n g t h .S t a t i s t i c a l a n a l y s i sS t a t i s t i c a l a n a l y s i s o f t h e di f f e r e n c e b e t we e n t h e c o n t r o l a n dt h ee x p e r i m e n t a l g r o u p wa s p e r f o r m e d u s i n g n o n - p a r a m e t r i cMa n n - Wh i t n e y Ut e s t .RES ULTSEf f e c t o f HBOo n a n t i - s h e e p e r y t h r o c y t e a n t i b o dy r e s p o n s eC 3 H/He m i c e we r e i m m u n i z e dwi t h s h e e p e r y t h r o c y t e , e x p o s e dt o HBO a t 2 5 2 5 k P a f o r I h o n c e a da y a n d a n t i - s h e e pe r y t h r o c y t e a n t i b o dy r e s p o n s e wa s de t e c t e d b y a di r e c t h a e m o -l y t i c a s s a y u s i n g s p l e e n c e l l s a t s e v e r a l i n t e r v a l s a f t e r i m m u n i z a -t i o n . As s h o wn i n F i g . 1 , a n t i - s h e e p e r y t h r o c y t e P F C r e s p o n s e so f c o n t r o l m i c e we r e i n c r e a s e d t o t h e l e v e l o f 4 0 0 /1 x 1 0 6 s p l e e nc e l l s o n da y 7 a n d t h e n g r a du a l l y de c r e a s e d. Ho we v e r , a n t i -s h e e p e r y t h r o c y t e P F C r e s p o n s e s o f HBO- e x p o s e d m i c e we r em a r k e dl y r e du c e d t o 1 5 0 /1 x 1 0 6 s p l e e n c e l l s , a l t h o u g h t h e t i m ec o u r s e o f a n t i b o dy r e s p o n s e o f HBO- t r e a t e dm i c e wa s s i m i l a r t ot h a t o f HBO- u n t r e a t e d m i c e . Th e n u m b e r o f s p l e e n c e l l sr e c o v e r e d a n d t h e c e l l v i a b i l i t y de t e r m i n e d b y a t r y p a n b l u e dy ee x c l u s i o n t e s t we r e n o t di f f e r e n t b e t we e n b o t hHBOa n dc o n t r o lg r o u p s . Th i s r e s u l t s u g g e s t s t h a t HBOh a s s u p p r e s s i v e a c t i v i t yo n a n t i g e n - i n du c e d i m m u n e r e s p o n s e s .K i n e t i c s t u dy o f t h e s u p p r e s s i v e e f f e c t o f HBOo n t h e a n t i b o dyr e s p o n s eNe x t , we s t u di e d t h e t i m i n g o fHBOe x p o s u r e o n t h e a n t i - s h e e pe r y t h r o c y t e P F C r e s p o n s e . We e x p o s e d s h e e p - e r y t h r o c y t e -i m m u n i z e dm i c e t o HBOf r o m da y 0 t o i n di c a t e d da y a n d s h e e p4 0 0a )4 )0xQLLI L3 0 02 0 01 0 000 ' 5 7 1 0D a y a f t e r i m m u n i z a t i o nF i g . 1 . Ef f e c t o f HBO t r e a t m e n t o n a n t i - s h e e p e r y t h r o c y t e P F Cr e s p o n s e . C 3 H/He m i c e we r e i m m u n i z e dwi t h 5 x I o 8 s h e e p e r y t h r o c y t e si n t r a p e r i t o n e a l l y o n da y 0 . Th e n , t h e m i c e we r e e x p o s e dt o HBOa t 2 5 2 5k P a f o r 1 h e v e r y da y u n t i l k i l l e d. An t i - s h e e p e r y t h r o c y t e P F C r e s p o n s ewa s de t e c t e d b y a di r e c t h a e m o l y t i c p l a q u e a s s a y u s i n g s p l e e n c e l l s o ni n di c a t e d da y . Th e r e s u l t s we r e e x p r e s s e d a s t h e m e a n P F C /1 x 1 0 6s p l e e n c e l l s + s . e . m . o f f i v e m i c e i n e a c h g r o u p .*S i g n i f i c a n t l y di f f e r e n tf r o m t h e c o n t r o l m i c e ( P