View
49
Download
0
Category
Preview:
DESCRIPTION
Soutenance de thèse. Influence de la nanostructuration énergétique des substrats dans l’adhésion et dans la différenciation des cellules neuronales modèles PC12. Guillaume Lamour Directeur de thèse : Ahmed Hamraoui 24/06/2010. - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
Influence de la nanostructuration énergétique des substrats
dans l’adhésion et dans la différenciation des cellules
neuronales modèles PC12
Guillaume Lamour
Directeur de thèse : Ahmed Hamraoui
24/06/2010
Soutenance de thèse
Différenciation neuronale : processus suivant lequel une cellule acquiert un phénotype neuronal
2
Différenciation neuronale et adhésion cellulaire : Comment les cellules interagissent avec des surfaces ?
Quels sont les mécanismes intracellulaires induits par l’adhésion à des substrats ?
Différenciation neuronale et adhésion cellulaire : Comment les cellules interagissent avec des surfaces ?
Quels sont les mécanismes intracellulaires induits par l’adhésion à des substrats ?
Différenciation neuronale et adhésion cellulaire : Comment les cellules interagissent avec des surfaces ?
Quels sont les mécanismes intracellulaires induits par l’adhésion à des substrats ?
neurite
corps cellulaire (soma)
noyau
Interactions [neurones/surfaces biocompatibles]
cône de croissance
3
Le cône de croissance : structure et fonctions
chimio-répulsionchimio-attraction
microtubule
filament d’actine
faisceau de filaments d’actine
filopode
lamellipode
axone cône de croissance
4
Propriétés de surface des biomatériaux : La neuritogénèse peut-elle être contrôlée par des paramètres d’adhésion ? Quelle stratégie de modification du matériau peut favoriser la neuritogénèse ?
Propriétés de surface des biomatériaux : La neuritogénèse peut-elle être contrôlée par des paramètres d’adhésion ? Quelle stratégie de modification du matériau peut favoriser la neuritogénèse ?
Propriétés de surface des biomatériaux : La neuritogénèse peut-elle être contrôlée par des paramètres d’adhésion ? Quelle stratégie de modification du matériau peut favoriser la neuritogénèse ?
Interactions [neurones/surfaces biocompatibles]
Adhésion cellulaire et différenciation neuronale : Comment les cellules interagissent avec des surfaces ? Quels sont les mécanismes intracellulaires induits par l’adhésion à des substrats ?
Distribution de l’énergiede surface
?
1 µm 1 µm
ΔE
Deux paramètres :
Nanorugosité Gradients locaux
FAdhésion
surface
E3E1
E2 E4E5
5
Partie I
Influence de la distribution des énergies
d’adhésion sur la neuritogénèse
6
Plan de l’exposé
Introduction
Partie I
Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse
Stratégies de modification des surfaces de verre
Caractérisation de l’état de différenciation
Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat
Partie II
Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire
Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH3 »
Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH2 »
Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule
Conclusion 7
Technique de modification du verre
8
Stratégies de modification du verre par diverses molécules
PLL
n
EDA
9
Les cellules PC12 :sont dérivées d’un phéochromocytome de rat.voient leur cycle cellulaire stoppé et se différencient sous traitement au NGF.
Cellule PC12 - 6 joursCellules PC12 - à l’ensemencement
Les cellules PC12 :sont dérivées d’un phéochromocytome de rat.
Cellule PC12 NGF 6 jours
Cellules PC12 : modèle d’étude pour la différenciation neuronale
10
Neuritogénèse des cellules PC12 sous l’effet d’un traitement au NGF
sans NGF
6 jours
avec NGF
6 jours
11
6 jours
verre/EDA
Sur PLL : Sur EDA :
Neuritogénèse induite par effet de surface
sans NGF sans NGF
6 jours 6 jours
12Gradients locaux dans les énergies d’adhésion
Plan de l’exposé
Introduction
Partie I
Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse
Stratégies de modification des surfaces de verre
Caractérisation de l’état de différenciation
Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat
Partie II
Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire
Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH3 »
Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH2 »
Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule
Conclusion 13
Expression du marqueur neuronal : MAP1B
14
verre/PLL
sans NGF
témoin négatif
verre/
PLLavec
NGF
témoin positif
verre/EDA
sans NGF
Immunomarquage de MAP1B (après 6 jours de culture)
15
avec NGF
50 µm
sans NGF
PEDA : 6 jours
PEDA : 6 jours (sans NGF)
Expression du marqueur neuronal : Tau
50 µm 25 µm
50 µm
actine
Tau
ADN
16
Plan de l’exposé
Introduction
Partie I
Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse
Stratégies de modification des surfaces de verre
Caractérisation de l’état de différenciation
Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat
Partie II
Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire
Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH3 »
Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH2 »
Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule
Conclusion17
CH3
NH2
NH3+
NH2
Influence de la nature des terminaisons
Biopolymères (acides aminés) Alkylsiloxanes
peu ou pas de neuritogénèse neuritogénèse élevée
PLL EDA
PLO HTMS
18
PL
LE
DA
HT
MS
PL
OMicroscopie interférentielle (RICM) temps accéléré (× 50)
10 µm
19
Comparaison alkylsiloxanes / biopolymères
Conditions de culture pas optimales
Multiplicité des paramètres :
mouillabilité, nanorugosité, distribution des terminaisons ↔ degré d’hétérogénéité
chimique
Nécessité d’améliorer le contrôle afin d’identifier les paramètres critiques
Comparaison alkylsiloxanes / biopolymères
Conditions de culture pas optimales
Multiplicité des paramètres :
mouillabilité, nanorugosité, distribution des terminaisons ↔ degré d’hétérogénéité
chimique
Nécessité d’améliorer le contrôle afin d’identifier les paramètres critiques
Comparaison alkylsiloxanes / biopolymères
Conditions de culture pas optimales
Multiplicité des paramètres :
mouillabilité, nanorugosité, distribution des terminaisons ↔ degré d’hétérogénéité
chimique
Nécessité d’améliorer le contrôle afin d’identifier les paramètres critiques
Comparaison alkylsiloxanes / biopolymères
Conditions de culture pas optimales
Multiplicité des paramètres :
mouillabilité, nanorugosité, distribution des terminaisons ↔ degré d’hétérogénéité
chimique
Nécessité d’améliorer le contrôle afin d’identifier les paramètres critiques
Conclusions
Influence de facteurs externes
Limites
Neuritogénèse obtenue par effet de surface
Expression de marqueurs neuronaux
Influence de gradients locaux dans les énergies d’adhésion
Reproduction de l’effet du NGF
20
Partie II
Identification des paramètres de surfaces
critiques à la réponse cellulaire
21
Plan de l’exposé
Introduction
Partie I
Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse
Stratégies de modification des surfaces de verre
Caractérisation de l’état de différenciation
Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat
Partie II
Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire
Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH3 »
Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH2 »
Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule
Conclusion 22
Modification du verre par auto-assemblage d’alkylsiloxanes
très ordonnéeconformation all-trans
Classe 1
partiellement ordonnée perte des liaisons latérales
Classe 2
très désordonnéehétérogénéité chimique accrue
Classe 3 23
Spectroscopie vibrationnelle :
génération de fréquence somme (SFG)
Techniques de caractérisation des surfaces modifiées
Mesure d’angles de contact et estimation des énergies libres des surfaces solides :
substratÉtat vibrationnel excité
ωIR
ωVis ωSFG
État fondamental
État virtuel
modèle Owens-Wendt
composantesdispersive/apolaire
énergie d’adhésion solide-liquide
composantes non-dispersive/polaire
24
Comparaison IRTF / SFG sur le spectre vibrationnel d’une monocouche d’OTS (région C-H)
25
Spectres SFG des substrats dans la région C-H
ODMS1 ; ODMS2 ; HTMSM :
Formation d’une monocouche désordonnée
Classe 2
& Classe 3
OTS (θ = 110°)
ODMS1 (θ = 77°)
HTMSH (θ = 104°)
HTMSM (θ = 56°)
ODMS2 (θ = 96°)
Classe 1OTS ; HTMSH :
Formation d’une monocouche très ordonnée
26
modèle Owens-Wendt
Techniques de caractérisation des surfaces modifiées
Mesure d’angles de contact et estimation des énergies libres des surfaces solides :
Spectroscopie vibrationnelle :
génération de fréquence somme (SFG)
composantesdispersive/apolaire
énergie d’adhésion solide-liquide
composantes non-dispersive/polaire
substratÉtat vibrationnel excité
ωIR
ωVis ωSFG
État fondamental
État virtuel
27
Estimation des énergies libres de surface
Classe 2 (▲) :
présence de gradients locaux dans les Eadhésion
Classe 3 (#) :
hétérogénéités chimiques accrues 28
Classe 1 (¤) :
Distribution homogène de l’énergie (s ≈ d )
pas d’adhésion
agrégats cellulaires flottant
adhésion limitée
quelques neurites
200 µm
Adhésion limitée sur le verre propre (les cellules tendent à se détacher)
Adhésion et neuritogénèse des PC12 sur 3 classes de surfacesaprès 48h de culture sans NGF
200 µm200 µm
classe 1 classe 2 classe 3
adhésion renforcée
forte croissance neuritique
surface très ordonnée surface (dés)ordonnée surface très désordonnée
29
Identification du facteur critique :
hétérogénéités chimiques aux échelles nanométriques
Eadhésion (classe 3) > Eadhésion (classe 2) : quelle est l’influence du γs ?
Identification du facteur critique :
hétérogénéités chimiques aux échelles nanométriques
Eadhésion (classe 3) > Eadhésion (classe 2) : quelle est l’influence du γs ?
Conclusions
30
Plan de l’exposé
Introduction
Partie I
Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse
Stratégies de modification des surfaces de verre
Caractérisation de l’état de différenciation
Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat
Partie II
Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire
Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH3 »
Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH2 »
Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule
Conclusion 31
Modification du verre par des aminosilanes
Classe 2 Classe ???
État ordonné
État désordonné
ADMS APTMS EDA
DETA PEDAMonométhoxy-silane Triméthoxy-silanes
32
EDA PEDA
ADMS APTMSeda & peda :
très hétérogènes (Classe 3)
adms & aptms :
plus homogènes (Classe 2)
deta : ???
Analyses des surfaces NH2 : théorie de Zisman
Liquides tests
énergies critiques γc
± 2 mN m-1
33
ADMS APTMS
Analyses des surfaces NH2 : théorie de Owens – Wendt
Liquides tests
énergies critiques γc
34
eda & peda :
très hétérogènes (Classe 3)
adms & aptms :
plus homogènes (Classe 2)
deta : ???
± 2 mN m-1
Cellules en culture sur les surfaces NH2/OHaprès 24h de culture sans NGF
classe 2
différenciation : +
cas particulier du deta
classe 2
classe 3
différenciation : ++++35
La réponse cellulaire est similaire entre les surfaces NH2/OH et les surfaces CH3/OH.
L’intensité de la tension de surface totale γs n’est pas critique.
Sur des surfaces homogènes (CH3, NH2, ou OH) : l’adhésion est modulée par le
degré d’affinité chimique des cellules au substrat,
et la différenciation n’est pas stimulée.
Sur des surfaces hétérogènes : l’adhésion est garantie quelle que soit le couple de
groupes chimiques (NH2/OH ou CH3/OH) produisant l’hétérogénéité,
et la différenciation est fortement stimulée.
La réponse cellulaire est similaire entre les surfaces NH2/OH et les surfaces CH3/OH.
L’intensité de la tension de surface totale γs n’est pas critique.
Sur des surfaces homogènes (CH3, NH2, ou OH) : l’adhésion est modulée par le
degré d’affinité chimique des cellules au substrat,
et la différenciation n’est pas stimulée.
Sur des surfaces hétérogènes : l’adhésion est garantie quelle que soit le couple de
groupes chimiques (NH2/OH ou CH3/OH) produisant l’hétérogénéité,
et la différenciation est fortement stimulée.
La réponse cellulaire est similaire entre les surfaces NH2/OH et les surfaces CH3/OH.
L’intensité de la tension de surface totale γs n’est pas critique.
Sur des surfaces homogènes (CH3, NH2, ou OH) : l’adhésion est modulée par le
degré d’affinité chimique des cellules au substrat,
et la différenciation n’est pas stimulée.
Sur des surfaces hétérogènes : l’adhésion est garantie quelle que soit le couple de
groupes chimiques (NH2/OH ou CH3/OH) produisant l’hétérogénéité,
et la différenciation est fortement stimulée.
Conclusions
36
Plan de l’exposé
Introduction
Partie I
Influence de la distribution des énergies de surface sur la neuritogénèse
Stratégies de modification des surfaces de verre
Caractérisation de l’état de différenciation
Nature de la surface et forces adhésives cellule-substrat
Partie II
Identification des paramètres de surface critiques à la réponse cellulaire
Culture des cellules PC12 sur des surfaces « CH3 »
Culture des cellules PC12 sur des surfaces « NH2 »
Investigation des moyens de détection dont dispose la cellule
Conclusion 37
AFM : cellules PC12 sur verre/EDA.
150 nm
38
Déstabilisation du cytosquelette d’actine par la cytochalasine-B.
témoin
[cytochalasine] = 5 µM
39
Conclusion générale.
40
Comment la cellule détecte-t-elle les gradients locaux dans les énergies
d’adhésion ?
Investigation de la dynamique des filaments d’actine
A partir de quelle dimension exacte les gradients locaux sont-ils critiques à la
réponse cellulaire ?
Création de gradients contrôlés via des nanoplots
Quels sont les médiateurs de la transmission des gradients locaux à la cellule ?
Examen du rôle éventuel de l’ion Ca2+
Comment la cellule détecte-t-elle les gradients locaux dans les énergies
d’adhésion ?
Investigation de la dynamique des filaments d’actine
A partir de quelle dimension exacte les gradients locaux sont-ils critiques à la
réponse cellulaire ?
Création de gradients contrôlés via des nanoplots
Quels sont les médiateurs de la transmission des gradients locaux à la cellule ?
Examen du rôle éventuel de l’ion Ca2+
Comment la cellule détecte-t-elle les gradients locaux dans les énergies
d’adhésion ?
Investigation de la dynamique des filaments d’actine
A partir de quelle dimension exacte les gradients locaux sont-ils critiques à la
réponse cellulaire ?
Création de gradients contrôlés via des nanoplots
Quels sont les médiateurs de la transmission des gradients locaux à la cellule ?
Examen du rôle éventuel de l’ion Ca2+
Comment la cellule détecte-t-elle les gradients locaux dans les énergies
d’adhésion ?
Investigation de la dynamique des filaments d’actine
A partir de quelle dimension exacte les gradients locaux sont-ils critiques à la
réponse cellulaire ?
Création de gradients contrôlés via des nanoplots
Quels sont les médiateurs de la transmission des gradients locaux à la cellule ?
Examen du rôle éventuel de l’ion Ca2+
Perspectives
41
Conclusion générale.
Distribution de l’énergiede surface
Distribution de l’énergiede surface
?
42
Recommended