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UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA
EVALUACIÓN DE LA INFLUENCIA DE LAS CONDICIONES DE CULTIVO DE
LOS GRANOS DE KÉFIR CULTIVADOS EN SUERO LÁCTEO EN LA
PRODUCCIÓN DE KEFIRAN
Proyecto de Grado
Autor
María Alejandra Morales Sánchez
Asesor
Felipe Salcedo Galán Ph.D.
Co-asesor
Ariel Mauricio Vaca Bohórquez
Mayo 2018
Bogotá D.C
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Universidad de los Andes | 2018
Evaluación de la influencia de las condiciones de cultivo de los granos de
kéfir cultivados en suero lácteo en la producción de Kefiran María Alejandra Morales Sánchez Universidad de los Andes, Depatamento de Ingeniería Química, Bogotá D.C., Colombia.
Resumen
Las siguientes condiciones en el cultivo de los granos de kéfir, fueron estudiadas: el tiempo de fermentación
el tipo de medio, y la adición de fuentes de carbono y nitrógeno al medio. El principal objetivo de este
proyecto es buscar condiciones de cultivo de los granos de kéfir que permitan mejorar el rendimiento de la
producción de Kefiran, utilizando como medio de cultivo el suero lácteo, sustrato de bajo costo y alto valor
nutricional. Se pudo determinar que la frecuencia de cambio de medio que permite un aumento en la
producción de Kefiran, es de 4 horas, llegando a obtener hasta un 80% más del producto que al utilizar una
frecuencia de 24 horas. Por otro lado, se obtuvo que a menor relación carbono-nitrógeno presente en el medio,
el rendimiento de la producción de Kefiran mejora de manera significativa, llegando a ser un 64% mayor que
con una relación de 40:1. Con una relación de 2:1 se logró obtener 111% más de Kefiran que con una relación
de 40:1 y un 52% más que con una relación de 10:1. Finalmente, se tiene que, aunque con la leche el
crecimiento de los granos es un 2% mayor que con el suero enriquecido con una relación C:N de 2:1, con
esta se obtiene un 13% más que con la leche. Lo cual se debe a que el rendimiento es mayor, llegando a un
53% más de rendimiento que con suero puro y un 16% más que la leche.
Palabras clave: Granos de kéfir, polímero, producción, Kefiran, exopolisacárido, cultivo, rendimiento
1. INTRODUCCIÓN
El Kefiran es un polisacárido microbial soluble en agua que contiene cantidades aproximadamente iguales
de glucosa y galactosa. Este tipo de polisacárido tiene ventajas sobre otros, al mejorar las propiedades
viscosas y viscoelásticas a bajas temperaturas de bebidas lácteas fermentadas, así como el yogurt, el queso,
el kéfir o el kumis [1]. Al ser añadido a productos alimenticios, el Kefiran actúa como espesante, estabilizante,
emulsificante, agente gelificante, y puede tener influencia sobre el tiempo de percepción de su sabor en la
boca del consumidor [2]. Adicionalmente, el Kefiran tiene ventajas sobre otros exopolisacáridos porque tiene
propiedades antifúngicas, antitumorales y antibacterianas [3]. Por su gran cantidad de usos y aplicaciones, es
importante poder aislar la mayor cantidad de este polisacárido de los granos de kéfir.
Los granos de kéfir son masas pequeñas, gelatinosas amarillentas e irregulares [4]. Contienen una compleja
mezcla microbial simbióticas de bacterias ácido-lácticas (Lactobacilos, Lactococcus, Leuconostoc,
Streptocuccus), bacterias ácido-acéticas (Acetobacteria) y levaduras (Kluyveromyces, Saccharomyces y
Torula), incluidas en una matriz viscosa de proteína polisacáridas [2] [5]. La bacteria ácido-láctica
Lactobacilos Kefiranociens es la principal productora del exopolisacárido descubierto por La Rivié en 1967
[6], el Kefiran.
Los granos de kéfir, generalmente, son cultivados en leche, a 25°, 130rpm y con una frecuencia de cambio
de medio de 24 horas [7]. Sin embargo, en estudios realizados anteriormente, se pudo identificar que el pH
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del medio llega a su estabilidad aproximadamente en 4 horas, lo cual podría ser un buen indicio del
estancamiento de la producción de ácido láctico y junto a él, la producción de Kefiran. [8]. Para el aislamiento
del Kefiran de los granos de kéfir, primero se deben diluir los granos a una temperatura que oscile entre 80-
90°C y agitación constante. A continuación, para separar partículas no solubles, se centrifuga la dilución de
los granos a 4500rpm, 25°C y 35 minutos, y como resultado se obtiene el Kefiran en el sobrenadante.
Posteriormente, se precipita el Kefiran con Etanol al 95% p/p, a una relación en volumen de 1:2 a 4°C,
durante 24 horas. Al cabo de este tiempo, se centrifuga el Kefiran a 4500rpm, 4°C durante 40 minutos, al
finalizar se obtiene en el precipitado el Kefiran. Finalmente, para purificarlo se suspende el Kefiran obtenido
en agua desionizada en relación 1:10 peso-volumen, y se repite nuevamente el procedimiento [9].
Uno de los usos del Kefiran que cuenta con un gran potencial a nivel industrial, es su implementación como
recubrimiento de alimentos. Esto se debe, a la deshidratación y pérdidas nutricionales y de apariencia a las
que están expuestos los alimentos son muy significativos. En países desarrollados la pérdida de cosecha de
frutas está entre un 5% y un 25% mientras que, en países en vía de desarrollo, esta cifra alcanza valores entre
el 20% y el 50% [10]. Por lo tanto, se ha presentado un incremento en el uso de recubrimientos de productos
alimenticios, con el fin de aumentar su vida útil. En la actualidad, la mayor parte de los empaques son
elaborados con materiales obtenidos a partir de recursos no renovables, como el petróleo, que traen consigo
perjuicios para el medio ambiente [11]. Por esta razón, se ha estado buscando un reemplazo a estos tipos de
empaques, que pueda mantener la calidad y aumentar la vida útil del producto y, sumado a esto, que sea
amigable con el medio ambiente [12]. Se ha fomentado la exploración de nuevos materiales biológicos, así
como las películas comestibles y biodegradables producidas a partir de recursos renovables [13]. Es
importante mencionar que entre las propiedades que más se destacan de algunos biopolímeros están su
estabilidad térmica, su flexibilidad, sus propiedades de barrera al vapor de agua, a distintos gases como el
dióxido de carbono, y su resistencia a sustancias químicas, entre otras [14]. En cuanto a la implementación
de películas con base a Kefiran, y estudios realizados con anterioridad, se ha podido comprobar que estas
tienen buenas propiedades de barrera al vapor de agua, sus propiedades no varían significativamente a través
del tiempo y son bastante estables [12] [15].
La producción láctea colombiana en el año 2006 contó con una producción de leche de 6.024 millones de
litros, de queso de 1.084 millones de litros y de leches fermentadas de 542 millones de litros [16]. En este
mismo año se obtuvo una producción de lactosuero de 921.672 millones de litros [16]. El suero lácteo se
define como el producto lácteo líquido obtenido durante la elaboración del queso, la caseína y productos
similares, por medio de la separación de la cuajada, luego de la coagulación de la leche, mediante la acción
de enzimas como la renina (cuajo) [17]. Este subproducto puede contener hasta un 50% de los nutrientes de
la leche (proteínas, lactosa, vitaminas y sales) considerándolo un producto de un alto valor nutricional. Esta
gran concentración de proteínas conlleva a que el suero tenga una gran carga orgánica, y al ser desechado
genera un alto impacto ambiental [18]. Hoy día este producto se utiliza como alimento para cerdos y terneros
o es lanzado a ríos y potreros, por un litro de suero se puede llegar a contaminar hasta una tonelada de agua
[19], y como en Colombia no se regula este tipo de desechos, se pueden producir problemas de contaminación
en ríos y lagunas de ciertas regiones lechereas del país [20]. Por ello, se busca la aplicación de este
subproducto en otros campos como sustrato microbiano [21]. En el presente trabajo se desea utilizar el suero
lácteo, por su bajo costo y carga nutricional, como medio de cultivo de los granos de kéfir.
El crecimiento de bacterias puede verse afectado por numerosos factores. Aunque aún no es claro lo que
limita el crecimiento bacteriano, es de vital importancia saber cuáles elementos químicos pueden intervenir
en él [22]. Esta limitación se puede ver desde dos puntos de vista distintos. Primero, se puede relacionar con
la cantidad de sustrato, sin tener en cuenta un elemento en particular. El segundo, se relaciona con la calidad
del sustrato, es decir, la influencia de la relación entre elementos como C/N, C/P o N/P sobre el crecimiento
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de la bacteria [22]. Con este último se podría determinar cuál elemento es el encargado de limitar el
crecimiento bacteriano. La calidad de los sustratos asimilados, en función de la relación C/N del sustrato,
también influye en las eficiencias de crecimiento, al conocerlas, se puede proceder a estimar los porcentajes
de carbono orgánico y nitrógeno que se respiran, se excretan y aquellos que se utilizan en la producción de
biomasa. Los sustratos asimilados se pueden dividir en dos tipos, no nitrogenados (carbohidratos y lípidos),
y nitrogenados (proteínas y aminoácidos) [23]. Cabe resaltar que, las eficiencias de crecimiento de carbono
y nitrógeno no son independientes, ya que la estequiometría de estos elementos debe mantenerse en la
biomasa bacteriana. Es evidente la importancia de la relación de las fuentes de carbono y nitrógeno en el
crecimiento de las bacterias, en el presente estudio se desea observar como dicha relación afecta el
crecimiento de los granos de kéfir, y por lo tanto la producción de Kefiran.
2. OBJETIVOS
En el presente trabajo se pretende evaluar el efecto del suero lácteo como medio de cultivo de los granos de
kéfir en la producción de Kefiran, comparando la frecuencia del cambio de medio de cultivo utilizado
tradicionalmente, 24 horas, y un tiempo donde el pH del fermento es aproximadamente estable, 4 horas [8].
Igualmente, se pretende identificar el efecto de la relación de las fuentes de carbono y nitrógeno (C/N)
presentes en el medio de cultivo en la producción de Kefiran. Finalmente, se compara el crecimiento de los
granos de kéfir y la producción de Kefiran utilizando como sustrato de los granos leche, suero, y suero
enriquecido con la mejor relación C/N, utilizando como frecuencia del cambio de medio aquella con la cual
se obtuvo los mejores resultados.
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. Materiales
3.1.1. Obtención y cultivo de los granos de kéfir
Los granos de kéfir utilizados fueron obtenidos de un cultivo realizado durante dos años por Ariel Mauricio
Vaca, en el laboratorio de bioprocesos del Departamento de Ingeniería Química de la Universidad de los
Andes. Para aumentar la cantidad de los granos, se llevó a cabo su inoculación, en el mismo laboratorio, en
un baño agitado a 25°C, 130 rpm y una frecuencia de cambio de medio del cultivo de 4 horas. Como medio
de cultivo se utilizó leche entera UHT, con una relación de 6mL de leche por gramo de granos de kéfir.
3.1.2. Fuentes de carbono estudiadas
Para realizar las curvas estándar para la cuantificación de azúcares, se utiliza lactosa monohidratada PanReac
AppliChem, glucosa9 anhídrida Scharlau y galactosa al 99+% Acros.
3.2. Métodos
3.2.1. Aislamiento y cuantificación de Kefiran
Para el aislamiento de Kefiran, se trata cierta cantidad de granos con agua destilada a una proporción de 1:10
en peso durante una hora, manteniendo una temperatura entre 80 a 90°C y agitación constante.
Posteriormente, se procede a centrifugar la mezcla a 4500 rpm y 25°C durante 35 minutos. El precipitado
resultante se desecha, mientras que en el sobrenadante se encuentra el Kefiran. El cual se precipita con etanol
industrial al 95% a una relación 1:1, a 4°C durante 24 horas. La mezcla se centrifuga nuevamente a 4500
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rpm, 3°C y 40 minutos, obteniendo como precipitado el Kefiran. Para obtener un producto de una mayor
pureza, se repite de nuevo el proceso descrito con anterioridad. El Kefiran obtenido al finalizar el proceso es
secado en un liofilizador durante 24 horas. El producto final se somete a una prueba termogravimétrica para
definir su pureza y la cantidad de humedad presente en el polímero.
3.2.2. Caracterización del Kefiran
3.2.2.1. Análisis termogravimétrico (TGA)
Para el análisis termogravimétrico se toma una muestra de aproximadamente 2 mg del Kefiran obtenido.
El barrido de temperatura se realiza desde 25 hasta 700°C, con una rampa de calentamiento de 10°C/min,
en una atmósfera de nitrógeno UAP. Dicho análisis de lleva a cabo para hacer evidente la temperatura en
la que el polímero pierde masa en mayor cantidad, y la cual se podría decir es la temperatura de
degradación del polímero. Adicionalmente, permite obtener el porcentaje de humedad presente en la
muestra evaluada.
3.2.2.2. Calorimetría diferencial de barrido (DSC)
El análisis de calorimetría diferencial de barrido se realiza con una muestra de aproximadamente 1.9 mg
dispuesta en una celda hermética de aluminio. El barrido se lleva a cabo desde una temperatura de 25 hasta
250°C, utilizando una rampa de calentamiento de 10°C/min en una atmósfera de nitrógeno UAP.
3.2.3. Cuantificación de las fuentes de carbono
Las fuentes de carbono por cuantificar son la lactosa, la galactosa y la glucosa. Se utiliza el método de
cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) [24], en primera instancia se deben realizar las curvas de
calibración de cada uno de los azúcares. En una balanza analítica se dispone un balón aforado de 20 mL, se
añade 0.02g del azúcar (Dilución I), y se procede a aforar con agua destilada, llegando a una concentración
de 1 ppm. Se realizan 5 puntos distintos para la realización de la curva, las respectivas diluciones se muestran
en la Tabla 1.
Tabla 1. Puntos para la curva de calibración para cuantificación de azúcares. Concentración
corregida válida solo para la lactosa.
Es importante mencionar que la lactosa utilizada es monohidratada, lo cual indica que, del peso total el 5%
corresponde a la molécula de H2O presente en el reactivo. Dado lo anterior, se realiza una corrección en los
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puntos de la curva de calibración de la lactosa. Los parámetros del método HPLC utilizados se especifican
en la Tabla 2.
Tabla 2. Parámetros del método HPLC
3.2.4. Cuantificación de fuentes de nitrógeno
El método de Bradford es utilizado para determinar la concentración de proteínas en general [25]. Para este
método se sigue el protocolo publicado por Gold Biotechnology. Primero se realiza la preparación del
reactivo de Bradford, a un balón aforado de 1 L se añade 100 mg de azul de Cromassie G-250, posteriormente,
se agrega 50 mL de etanol al 95% p/p, y lentamente se añade ácido fosfórico al 85% p/p. El contenido del
balón se mezcla hasta la dilución total del azul de Cromassie, finalmente se afora. El reactivo se almacena en
un shot de 1 L a 4°C.
Para realizar la curva de calibración, se realiza una solución de albúmina bovina, con una concentración de
albúmina de 0.5mg/mL. Con una micropipeta se toman diferentes volúmenes de la solución anterior [0 µL
(0 µg), 10 µL (5 µg), 20 µL (10 µg), 30 µL (15 µg), 40 µL (20 µg), 50 µL (25 µg)], y se disponen en celdas
para espectrofotometría. Posteriormente, se añade 1.5 mL del reactivo de Bradford en cada celda, se cubre
con plástico paraffin y se mezcla invirtiéndola. Después de 10 minutos, se mide la absorbancia a 595nm.
El análisis de la muestra de concentración de proteína desconocida se realiza pipeteando de 10 a 50 µL de la
muestra, si es necesario, se diluye. La idea es obtener una absorbancia que se encuentre dentro de los puntos
de la curva de calibración. A cada una de las celdas se añade 1.5 mL del reactivo de Bradford, y se tratan
igual que el procedimiento de la curva de albúmina. Si la concentración de proteína no se encuentra en el
rango de la curva estándar, se cambia la dilución de la muestra, y se mide la absorbancia nuevamente. Para
calcular la cantidad de proteína en la muestra, se utiliza la ecuación de la regresión lineal de la curva estándar
(Ecuación 1 y 2).
𝜇𝑔 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 =𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 − 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑐𝑒𝑝𝑡𝑜 𝑐𝑜𝑛 𝑒𝑗𝑒 𝑌
𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒
Ecuación 1
𝜇𝑔 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎
𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎= 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 Ecuación 2
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3.2.5. Evaluación del efecto del suero lácteo como medio de cultivo de los granos de kéfir en la
producción de Kefiran, con una frecuencia de cambio de medio de cultivo de 4 y 24 horas
Con el fin de aprovechar el suero lácteo, se desea evaluar la influencia de la frecuencia de cambio de medio
de cultivo de los granos en su crecimiento, y en la producción de Kefiran, utilizando como sustrato suero
lácteo. La producción de Kefiran y de ácido láctico se lleva a cabo simultáneamente. A medida que el ácido
láctico se produce, el pH del medio disminuye, llegando a su estabilidad en un punto en el tiempo, el cual
fue estudiado anteriormente (Figura 1) [8].
Figura 1. Acidez total en función del tiempo [8]
Con el fin de aumentar la producción de Kefiran, se decide evaluar un tiempo de fermentación de 4 horas, y
el tiempo que tradicionalmente se utiliza, 24 horas. La inoculación de los granos se lleva a cabo a 25°C, con
una agitación constante de 130 rpm. La relación entre en el peso de los granos (g) y el volumen del medio
(mL) es de 1:6.
La producción de suero lácteo para esta evaluación se realiza de manera casera. Se toman 550 mL de leche
entera pasteurizada Colanta, se vierte en una olla y se aplica calor en una estufa. Simultáneamente, se añade
¼ de cuajo MILKSET®, en trozos, teniendo en cuenta una buena distribución. Posteriormente, se adicionan
otros 550 mL de leche, justo antes de que empiece a ebullir el contenido de la olla, se retira del calor y se
deja reposar durante 12 horas. El suero es el sobrenadante resultante, para separarlo del precipitado se cuela
en un tamiz de plástico y se almacena a 4°C para su preservación.
Los granos son pesados cada vez que se realiza cambio de medio. Después de 14 días de cultivo, se realiza
el aislamiento de Kefiran. El producto final se pesa y se somete a una prueba de TGA, para obtener el peso
total final de Kefiran obtenido. Se realiza duplicado del experimento.
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3.2.6. Evaluación de la influencia de la relación de fuentes de carbono y nitrógeno (C/N) presentes
en el medio de cultivo de los granos de kéfir en la producción de Kefiran
La relación C/N puede ser un factor determinante en el crecimiento de los granos de kéfir y consecuentemente
en la producción de Kefiran puesto que las bacterias sintetizan estos productos del sustrato para su
crecimiento, y demás procesos biológicos [26]. Cuando a las bacterias se les ofrece una mezcla de fuentes de
carbono, estas prefieren aquellas que pueden metabolizar con una mayor rapidez. Para la mayoría de las
bacterias, la fuente de carbono preferida es la glucosa [27]. Por otro lado, las fuentes de carbono son
indispensables para sintetizar proteínas y ácidos nucleicos, dichas fuentes pueden ser orgánicas e inorgánicas.
En un estudio realizado por Azjsek et al. (2013), se obtuvo el mayor incremento de masa de los granos de
kéfir utilizando fuentes orgánicas de nitrógeno, así como la triptona (15.97g/L) [1]. Es importante mencionar
que, se supone que la bacteria solo consume carbono de las fuentes de los carbohidratos, los carbonos
presentes en las fuentes de nitrógeno son utilizados para la glucólisis.
Teniendo en cuanto lo anterior, y que se analizan bacterias ácido-lácticas, para evaluar la influencia de la
relación C/N en el crecimiento de los granos de kéfir y la producción de Kefiran, dependiendo de la relación
de fuentes requerida, el medio se enriquece con lactosa como fuente de carbono, y triptona como fuente de
nitrógeno.
Primero, se realiza la cuantificación de fuentes de carbono y nitrógeno presentes en el suero lácteo (se utiliza
dicho medio, con el fin de su aprovechamiento). Seguido, se evalúa el crecimiento de los granos de kéfir
cultivados en medios con una relación C/N diferente. Uno donde se limite el carbono (2:1), otro donde se
limite el nitrógeno (40:1) y para el último, teniendo cuenta que el suero tiene una relación aproximada de
27:1, limitando el nitrógeno, se escoge una relación intermedia pero que no limite al carbono de manera
drástica (10:1). La inoculación de los granos se realiza durante 14 días, en un baño agitado, con agitación de
130 rpm, temperatura de 25°C y frecuencia de cambio de medio de 24 horas. La relación de los granos con
el medio se mantiene de 1:6 peso-volumen. Finalmente, se aísla el Kefiran. El producto final se pesa y se
somete a una prueba de TGA, para obtener el pero total final de Kefiran obtenido, y poder definir la relación
C/N que mejora la producción de este. Se realiza duplicado del experimento.
3.2.7. Evaluación del crecimiento de los granos de kéfir cultivados en leche, suero lácteo, y suero
lácteo enriquecido en la producción de Kefiran
Para dar soporte a los resultados obtenidos, se pretende comparar el crecimiento de los granos de kéfir y la
producción de Kefiran, teniendo en cuenta tres diferentes medios de cultivo. Para el primer cultivo, se utiliza
como sustrato leche entera KLIM ®, a una concentración de 0.13g/L. Para el segundo, se utiliza suero lácteo
como medio de cultivo. Para el último, se utiliza suero lácteo enriquecido, teniendo en cuenta la relación C/N
que permitió un mejor crecimiento de granos y producción de Kefiran. La inoculación se realiza en un baño
agitado, a 25°C, agitación de 130 rpm y con una frecuencia de cambio de medio de 4 horas.
4. RESULTADOS
4.1. Evaluación del efecto del suero lácteo como medio de cultivo de los granos de kéfir en la
producción de Kefiran, con una frecuencia de cambio de medio de cultivo de 4 y 24 horas
La evaluación del efecto del suero lácteo como medio de cultivo de los granos de kéfir con diferentes
frecuencias de cambio de medio se realiza durante 14 días, comenzando con 19 gramos de granos. Los
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tiempos evaluados fueron 4 horas y 24 horas, con su respectiva réplica. En la Figura 2 se muestra el
incremento de masa de los granos después del tiempo evaluado. Se evidencia que el crecimiento de los granos
realizando un cambio de medio con una frecuencia de 4 horas es significativamente mayor que realizando el
cambio cada 24 horas, incrementando su masa un 101% más que con una frecuencia de 24 horas.
Figura 2. Incremento de la masa de los granos de kéfir después de 14 días de cultivo
En cuanto a la influencia de la frecuencia de cambio de medio de cultivo de los granos de kéfir, utilizando
como sustrato suero lácteo, en la producción de Kefiran se tiene que, con una frecuencia de 4 horas, en 14
días se puede llegar a producir 80% más de Kefiran que con una frecuencia de cambio de medio de 24 horas
(Figura 3). El incremento de peso de los granos y la producción de Kefiran en las diferentes frecuencias de
cambio de medio fueron de 33.76 g y 1.60 g para 4 horas, y de 16.74 g y 0.85 g para 24 horas. Es importante
mencionar que con ayuda del análisis termogravimétrico se pudo definir la cantidad de humedad presente en
las muestras de Kefiran liofilizado, teniendo en cuenta dicho porcentaje, se obtuvo la cantidad final total de
Kefiran (Tabla 3).
Tabla 3. Cantidad final de Kefiran teniendo en cuenta el porcentaje de humedad obtenida por medio de TGA
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Figura 3. Producción final de Kefiran con diferentes frecuencias de cambio de medio de cultivo de los granos de kéfir
Finalmente, se determina que por gramo de kéfir aproximadamente el 3% corresponde al Kefiran con un
cambio de medio de 4 horas, mientras que utilizando un tiempo de cambio de medio de 24 horas se obtiene
que aproximadamente el 2% es Kefiran (Figura 4). Con lo anterior se puede decir que con un periodo de
cambio de medio de 4 horas se puede obtener un 28% más de Kefiran, por gramo de kéfir que con un tiempo
de 24 horas. Lo anterior se puede dar gracias al aumento de nutrientes disponibles para la alimentación de
las bacterias, lo cual permite el aumento de producción de Kefiran. Al comparar dicha hipótesis con el
comportamiento del pH con respecto al tiempo (Figura 1) [8], se evidencia que con un tiempo de cambio de
medio de 4 horas no solo se ve beneficiada la producción de Kefiran, sino también la producción de ácido
láctico.
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Figura 4. Cantidad de Kefiran obtenido por gramo de kéfir
Para caracterizar el Kefiran obtenido, se realiza un análisis termogravimétrico de las muestras de Kefiran
después de su liofilización. Los resultados obtenidos fueron graficados junto a su derivada para llevar un
análisis más exacto de las tasas de pérdida de peso (Figura 4). Para realizar la comparación con el Kefiran
cultivado en leche, se plasma igualmente, el TGA de una muestra de Kefiran obtenido a partir del cultivo de
los granos en leche, con una frecuencia de cambio de medio de 24 horas, cultivado en el laboratorio de
bioprocesos de la Universidad de los Andes [8]. En los termogramas se logra identificar dos regiones de
pérdida de masa, la primera desde los 50 a los 100°C, correspondiente a la evaporación del agua, el segundo
desde los 275 hasta los 300°C, correspondiente a la degradación del polímero. Teniendo en cuenta lo anterior,
se puede decir que la temperatura de degradación del polímero para cada muestra es 308.81 ± 1.11°C ,
298.52 ± 4.26°C y 271.71 ± 16.76°C, para el Kefiran producido a partir de leche como medio de cultivo, con
una frecuencia de cambio de medio de 24 horas, el Kefiran obtenido a partir de suero como medio de cultivo
con una frecuencia de cambio de medio de 24 horas y de 4 horas, respectivamente. Adicionalmente se puede
ver diferencias en la segunda pendiente, lo cual se puede explicar por la presencia de impurezas en la muestra.
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Figura 5. TGA y curva derivada de TGA del Kefiran obtenido utilizando suero como sustratos y diferentes frecuencias de cambio de medio
Adicionalmente, se evidencia en las derivadas de los termogramas de frecuencia de cambio de medio de 4
horas, la presencia de una punta adicional después de la curva de degradación del polímero. Como hipótesis
de este comportamiento se plante la presencia de impurezas y lípidos. Sin embargo, para validar esta hipótesis
se lleva a cabo un análisis termogravimétrico del residuo, el cual se muestra en la Figura 6. Como se puede
observar, hay dos curvas que sobresalen del residuo, la primera tiene una temperatura característica de
pérdida de peso de 266.2°C, con lo cual se podría decir, que aún en el residuo se observa la presencia de
Kefiran. La segunda, tiene una temperatura característica de 328.99°C. Al comparar dicho punto con el
observado en los termogramas de una frecuencia de cambio de medio de 4 horas, se evidencia que coinciden,
es decir, si se podría afirmar que el Kefiran producido utilizando dicha frecuencia posee impurezas y lípidos,
presentes en el residuo.
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Figura 6. TGA y curva derivada de TGA del residuo del Kefiran
Por otro lado, se realiza una calorimetría diferencial de barrido con el fin de realizar una caracterización
térmica del Kefiran obtenido. Igualmente, se pretende comparar los resultados del Kefiran obtenido a partir
del cultivo de los granos de kéfir utilizando leche como sustrato, medio que se utiliza tradicionalmente y el
obtenido utilizando suero como sustrato. La Figura 7 muestra el termograma DSC de una muestra de Kefiran
cultivado en leche, cultivo realizado por Ariel Vaca en el laboratorio de bioprocesos de la Universidad de los
Andes [28], y dos muestras de Kefiran producido a partir del uso de suero lácteo como medio de cultivo de
los granos de kéfir. La primera utilizando un tiempo de fermentación del medio de 4 horas, y la segunda
utilizando un tiempo de 24 horas. Para todas las muestras se logra identificar un pico después de los 160°C,
al igual que unas fluctuaciones alrededor de los 130 y 150°C. Al comparar el DSC con el TGA se puede
observar que los puntos endotérmicos no coinciden con un cambio de peso considerable, lo cual indicaría la
presencia de un cambio de entalpía de primer orden que representa la fusión de dominios cristalinos del
Kefiran [28]. Por otro lado, las fluctuaciones señaladas en los termogramas de la frecuencia de cambio de
medio de 4 horas pueden deberse a la presencia de impurezas en las muestras.
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Figura 7. DSC del Kefiran. Comparación de Kefiran obtenido utilizando leche y suero lácteo como sustrato
Una de las características de los biopolímeros es la presencia de puentes de hidrógeno, con lo cual los picos
descendentes muestran el calor necesario para romper dichos enlaces. Al observar el comportamiento del
flujo de calor con respecto a la temperatura (Figura 7), se puede distinguir que la muestra de Kefiran cultivado
en suero con un tiempo de fermentación del medio de 4 horas, requiere un mayor calor para romper los
puentes de hidrógeno. Lo anterior se podría explicar por medio de un aumento de densidad de la muestra a
causa de la presencia de lípidos, proteínas y otras impurezas que se pueden adquirir cada vez que se realiza
el cambio de medio.
4.2. Evaluación de la influencia de la relación de fuentes de carbono y nitrógeno (C/N) presentes en
el medio de cultivo de los granos de kéfir en la producción de Kefiran
Ya que el suero cuenta con la gran ventaja de ser un subproducto de alto valor nutricional y bajo costo, se
desea aprovechar como sustrato microbiano. Para evaluar la influencia de la relación de las fuentes de
carbono y nitrógeno (C/N) presentes en el medio de cultivo de los granos de kéfir en la producción de Kefiran,
utilizando como sustrato suero, primero se debe realizar una caracterización de este. En cuanto a las fuentes
de carbono, se realiza una cuantificación de lactosa, puesto que, en la leche, los carbohidratos están
representados en su mayoría por lactosa [29], igualmente se cuantifica la glucosa y la galactosa. La
cuantificación de carbohidratos se lleva a cabo por medio de HPLC, con los parámetros mencionados en la
sección de metodología.
Para asegurar la eficiencia del método y la calidad de las curvas de calibración, en la Figura 8 se muestra la
cromatografía de las soluciones estándar de 1ppm de los azúcares a cuantificar. Se puede observar que la
separación de los tres analitos se da entre los 11 y 19 minutos, el minuto restante permite asegurar que los
componentes de la matriz eluyan de la columna entre cada inyección. Aunque se evidencia que las curvas de
la galactosa y la lactosa alcanzan a solaparse, el error no será significativo, por el área que se ve implicada.
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Adicionalmente, al analizar las curvas de calibración obtenidas (Anexo 2), se evidencia que todos los puntos
de referencia se acoplan a la regresión lineal realizada por el equipo, con respecto a la correlación obtenida,
para todos los estándares, esta supera los 0.99, confirmando la confiabilidad de los resultados [30].
Figura 8. Cromatografía de soluciones estándar de 1ppm de lactosa, glucosa y galactosa
La cuantificación de proteínas se realiza por medio del método de Bradford, en el cual, primero se debe
realizar una curva estándar de albúmina bovina (Figura 9). Gracias a la curva estándar es posible obtener una
ecuación de la regresión lineal de los puntos tenidos en cuenta para la misma. La confiabilidad de la curva es
dada por la correlación, la cual al superar los 0.99 asegura la confiabilidad del método.
Figura 9. Curva estándar de albúmina bovina
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Para cuantificar las fuentes de carbono en el suero, se realizaron diluciones de 1:20 y 1:50 de cuatro muestras
de suero, obtenido en diferentes días, los resultados se pueden observar en la Tabla 4. Ya que se desea saber
en promedio, cual es la concentración de carbohidratos en el suero lácteo, se eliminan los valores
inconsistentes, obteniendo una concentración de lactosa de 49.96 ± 1.65 g/L, cabe resaltar que no se registró
la presencia de glucosa o galactosa en las muestras. Los valores inconsistentes pueden deberse a errores
durante la preparación de las diluciones. Teniendo en cuenta que el suero obtenido es dulce, ya que utiliza
enzimas para su coagulación, se desea comparar la concentración obtenida con la reportada en la literatura
[31], según la cual la concentración de lactosa en la leche está entre los 46 y 52 g/L.
Tabla 4. Resultados del HPLC para cuantificación de fuentes de carbono en el suero lácteo
Tres muestras de suero lácteo fueron caracterizas en cuanto las fuentes de nitrógeno (concentración de
proteínas). En la Tabla 5 se muestra los resultados para diferentes volúmenes tomados de muestra (10, 20,
30 y 40 μL).
Tabla 5. Resultados Bradford cuantificación de proteínas en suero lácteo
La concentración promedio de proteínas presente en el suero lácteo es de 1.82 ± 0.45 g/L. Al comparar la
concentración obtenida, con la reportada en la literatura (6-10 g/L) [31], se obtiene una diferencia
significativa, no obstante, las réplicas realizadas dan confianza de los resultados. Cabe aclarar que cada
volumen tomado es una réplica que se realiza ya que, para Bradford, solo es necesario tomar un volumen.
Igualmente, cada volumen fue replicado.
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Teniendo la concentración de fuentes de carbono y nitrógeno definidas, se pudo determinar en qué medida
se enriquece el suero para cumplir con los requerimientos de la relación carbono nitrógeno definidos, en la
Tabla 6 se especifica el enriquecimiento necesario de cada medio a evaluar.
Tabla 6. Caracterización en cuanto a fuentes de carbono y nitrógeno de los medios evaluados
La evaluación de la influencia de la relación de fuentes de carbono y nitrógeno (C/N) presentes en el medio
de cultivo de los granos de kéfir, en su crecimiento se lleva a acabo durante 14 días, teniendo una cantidad
inicial de 16.5 gramos de granos. Para cada evaluación se realiza una réplica. Es importante mencionar, que
se deseaba comparar el crecimiento de los granos de kéfir y la producción del Kefiran, utilizando como
sustrato suero sin enriquecer, ya que al cuantificar las fuentes de nitrógeno y carbono la relación fue de 27.43.
Sin embargo, la disponibilidad de granos de kéfir era limitada, y no se podía realizar la comparación con los
resultados del objetivo anterior ya que el crecimiento se ve afectado directamente por la cantidad inicial de
bacterias, a mayor muestra, mayor incremento se presenta.
Figura 10. Incremento de la masa de los granos de kéfir después de 14 días de cultivo
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En la Figura 10 se muestra el incremento de masa de los granos de cultivo de los granos de kéfir. Se observa
que, a medida que disminuye la relación carbono nitrógeno, mayor será el incremento de masa de los granos.
Con una relación de C/N de 2:1 los granos de kéfir pueden incrementar su masa hasta en un 114% más que
con una relación de 40:1. Lo anterior, se debe a que el nitrógeno es uno de los principales componentes de
las células bacterianas, junto al carbono y al oxígeno, cumpliendo el rol de constituyente de proteínas, ácidos
nucleicos y coenzimas. Igualmente, dicho nutriente inorgánico, junto al fósforo son utilizados como fuentes
de energía y hacen parte de las reacciones químicas que se llevan a cabo en el metabolismo intracelular [32].
Por otro lado, si la relación C/N del medio de cultivo bacteriano es mayor que el demandado por las bacterias,
se tendrá eficiencias de crecimiento bajas. Una alta relación de C/P se relaciona con una rotación lenta de
productos primarios, y sólo un pequeño porcentaje de la producción primaria neta será consumida por las
bacterias [33].
Figura 11. Producción final de Kefiran con diferentes proporciones C/N del medio de cultivo de los granos de kéfir
Al evaluar la influencia de la relación C/N del medio de cultivo de los granos de kéfir en la producción de
Kefiran (Figura 11), se puede evidenciar que, con una relación de 2:1 se puede llegar a obtener hasta un 111%
más de Kefiran que con una relación de 40:1 y un 52% más que con una relación de 10:1. El incremento de
masa de los granos y la producción de Kefiran para las diferentes relaciones de C/N fueron de 4.47g y 1.2g,
3.57g y 0.79g, y 1.32g y 0.57g, para las relaciones 2:1, 10:1 y 40:1, respectivamente. Finalmente, en la
Figura 12 se presenta la cantidad obtenida de Kefiran en gramos por gramo de granos de kéfir. Como se
evidencia, a menor relación carbono-nitrógeno mayor será el porcentaje de Kefiran presente en los granos de
kéfir. Con una relación de 2:1 se logra obtener 0.05g de Kefiran por gramo de kéfir, mientras que con una
relación de 40:1 se obtiene 0.02 gramos.
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Figura 12. Cantidad obtenida de Kefiran por gramo de granos de kéfir
Cabe mencionar que con ayuda del análisis termogravimétrico se pudo definir la cantidad de humedad
presente en las muestras de Kefiran, y teniendo en cuenta dicho porcentaje, se obtuvo la cantidad final total
de Kefiran (Tabla 7).
Tabla 7. Cantidad final de Kefiran teniendo en cuenta el porcentaje de humedad obtenida por medio de TGA
El Kefiran obtenido se caracterizó por medio de TGA, los resultados se graficaron junto a su derivada (Figura
13). Al observar los termogramas, se pueden distinguir dos regiones de pérdida de masa, la primera se da
entre 150 y 250°C, correspondiente a la evaporación del agua, y la segunda entre 280 y 350°C,
correspondiente a la degradación del polímero. Teniendo en cuenta el pico más alto de la derivada, se podría
decir que para el Kefiran obtenido a partir del cultivo con diferentes relaciones de C/N, son 306.74 ± 2.96°C,
310.53 ± 2.13°C, y 313.10 ± 0.24°C para las relaciones 2:1, 10:1 y 40:1, respectivamente.
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Figura 13. TGA y curva derivada de TGA del Kefiran obtenido utilizando suero como sustrato y diferentes radios C/N del medio
4.3. Evaluación del crecimiento de los granos de kéfir cultivados en leche, suero lácteo, y suero lácteo
enriquecido en la producción de Kefiran
Finalmente, se desea comparar el incremento másico de los granos de kéfir cultivados durante 12 días en
leche, suero, y suero enriquecido satisfaciendo la relación C/N de 2:1. Se desea determinar si el suero lácteo,
producto de bajo costo y que generalmente es un desecho y potencial contaminante de recursos hídricos,
puede ser implementado como medio de cultivo de los granos. Igualmente, se desea establecer si
enriqueciendo el suero lácteo se puede llegar a tener un rendimiento igual o mejor en la producción de Kefiran
que con la leche. En la Figura 14 se muestran los resultados del incremento de la masa de los granos después
del cultivo de aproximadamente 9.35 gramos de granos de kéfir en los diferentes medios a evaluar. Como se
puede observar, aunque el cultivo en suero lácteo enriquecido no alcanza la eficiencia del cultivo en leche,
en cuanto al crecimiento de los granos, sí mejora considerablemente la calidad del suero como sustrato.
Comparado al suero solo, con el suero enriquecido de triptona (relación C: N de 2:1) se puede llegar a tener
un incremento de masa mayor en un 111%. Adicionalmente, cabe mencionar que, utilizando leche como
sustrato, se alcanza un crecimiento de los granos de un 2.68% más que con el suero enriquecido. Como se ha
mencionado, dicho valor hace del suero enriquecido un buen medio de cultivo de los granos de kéfir.
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Figura 14. Incremento de masa de los granos de kéfir después de 12 días de cultivo utilizando diferentes tipos de medio
En la Figura 15 se muestra la producción de Kefiran a partir del cultivo de los granos de kéfir utilizando
diferentes tipos de sustrato. Observando los resultados, se evidencia que el suero enriquecido con una relación
de C/N de 2:1 es el mejor medio para la producción de Kefiran, llegando a producir un 61% más de Kefiran
en comparación al suero puro. Igualmente, con dicho medio se produjo un 13% más que con la leche,
haciendo del suero enriquecido un medio que aumenta significativamente la producción de Kefiran.
Figura 15. Producción final de Kefiran con diferentes tipos de medio de cultivo de los granos de kéfir
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A pesar de que los granos de kéfir tienen un mayor incremento en su masa utilizando leche como sustrato,
con el suero enriquecido se obtiene una mayor producción de Kefiran, lo cual se atribuye a que con el suero
enriquecido de tiene mayor rendimiento. Como se puede observar en la Figura 16, el rendimiento obtenido
utilizando como medio de cultivo suero enriquecido con una relación de carbono nitrógeno de 2:1 es 53%
mayor que el obtenido utilizando leche como sustrato y un 53% mayor que utilizando suero puro.
Figura 16. Cantidad obtenida de Kefiran por gramo de granos de kéfir
Comparando los termogramas mostrados en la Figura 17, se distinguen las dos regiones características que
se vieron en los casos anteriores. La primera correspondiente a la evaporación del agua, entre 150 y 250°C,
y la segunda de la degradación del polímero, entre los 280 y 350°C. La temperatura de degradación del
polímero se puede tomar como la mayor temperatura alcanzada por la curva de la derivada, obteniendo para
el Kefiran producido a partir del cultivo de los granos en leche, en suero puro y el suero enriquecido con una
relación C/N de 2, de 315.39, 314.94 y 304.47°C, respectivamente.
A partir de la misma figura (Figura 17), se puede determinar que la pureza del producto no se ve afectada por
el tipo de medio que se utilice.
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Figura 17. TGA y curva derivada de TGA del Kefiran obtenido utilizando diferentes tipos de medio
5. CONCLUSIONES
Factores como el tipo de medio, la frecuencia de cambio de medio y la relación entre las fuentes de carbono
y nitrógeno influyen de manera significativa en el crecimiento de los granos de kéfir, en la producción de
Kefiran y en el rendimiento. Con el presente trabajo se demostró que una aplicación del suero lácteo, que
cuenta con gran potencial, es su uso como sustrato microbiano. Evaluando la frecuencia de cambio de medio
de los granos, se obtuvo que con un periodo de 4 horas se obtiene hasta un 28% más de producción de Kefiran
que con un periodo de 24 horas. Sin embargo, el producto obtenido con un periodo de 4 horas tiene más
impurezas, requiriendo un proceso de purificación más exhaustivo.
Aunque el suero puro se puede utilizar como sustrato microbiano, su rendimiento es bajo en comparación a
la leche o al suero enriquecido con triptona como fuente de nitrógeno, donde la relación C/N sea baja, así
como una relación 2:1. El suero enriquecido puede llegar a producir una cantidad de Kefiran igual o mayor
a la producida a partir de leche como sustrato del cultivo de los granos. Adicional a esto se pudo evidenciar
que con la relación 2:1, se puede obtener mayor Kefiran por gramo de kéfir.
6. TRABAJO FUTURO
Como trabajo futuro se plantea realizar la réplica de la comparación del crecimiento de los granos de kéfir
utilizando diferentes sustratos como medios de cultivo. Igualmente, se espera aislar el Kefiran, determinar
qué tipo de medio permite un mayor rendimiento y caracterizarlo de modo que se puedan identificar
diferencias o similitudes en su estructura y pureza. Por otro lado, se espera evaluar el tiempo, el tipo de
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sustrato y el peso inicial de los granos, para determinar cuál de estos tiene mayor influencia sobre el
crecimiento de los granos, producción de Kefiran y rendimiento (Diseño factorial).
Se podrían estudiar relaciones de carbono nitrógeno donde el exceso de nitrógeno se haga más evidente, es
decir una relación más pequeña, para determinar si se puede llegar a obtener una cantidad similar, o mayor
de Kefiran que la obtenida a partir del suero enriquecido con una relación C/N de 2.
Finalmente, ya que el tiempo de fermentación del medio que permite mejorar el crecimiento de los granos de
kéfir, como la producción de Kefiran, es de 4 horas, se podría diseñar un reactor semi-batch que permita
realizar el cambio de medio con dicha constancia y si necesidad de una manipulación manual.
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Anexos
Anexo 1. Crecimiento de los granos de kéfir después de 14 días de cultivo con diferentes frecuencias de cambio de medio
Anexo 2. Curvas estándar HPLC de la glucosa, lactosa y galactosa
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Anexo 3. Crecimiento de los granos de kéfir después de 14 días de cultivo con diferentes relaciones C/N del medio
.
Anexo 4. Crecimiento de los granos de kéfir después de 12 días de cultivo con diferente tipo de medio
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