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Focus on your research Service for life science
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过氧化氢(H2O2)比色法测试盒
货号: E-BC-K102-S 方法:比色法
仪器:紫外 - 可见分光光度计(405 nm)
规格:50 assays(48 samples)/ 100 assays(96 samples)
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基本信息
本试剂盒适用于检测血清、血浆、培养液、动植物组织及培养细胞样
本中的 H2O2 含量。
检测范围:1.5-150 mmol/L灵敏度:1.5 mmol/L
用途
检测范围及灵敏度
背景介绍
检测原理
过氧化氢(H2O2)是一种活性氧代谢副产物,既是细胞内的信号分子,
又是氧化应激源。H2O2 是参与细胞增殖、分化、迁移过程的真核信号
转导的重要调节因子 [1-3]。然而,异常的 H2O2 会导致氧化细胞损伤和
疾病的发生,如癌症、动脉粥样硬化、骨质疏松和神经退化性疾病 [4,5]。
H2O2 与钼酸铵反应生成稳定的黄色络合物且在 405 nm 处有最大吸收,
黄色络合物的颜色深浅与 H2O2 的浓度在一定范围内具有线性关系。故
可以通过比色计算出 H2O2 的含量。
本试剂盒检测组织和细胞样本时,需测定总蛋白浓度,推荐使用考马
斯亮蓝法(货号:E-BC-K168-S)。
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耗材:
枪头(1000 μL,200 μL)、EP 管(5 mL,2 mL)、吸水纸、擦镜纸。
仪器:
紫外 - 可见分光光度计(405 nm)、涡旋混匀仪、微量移液器(1000 μL,200 μL)、37℃恒温箱。
所需自备物品
提供试剂和物品
编号 名称规格 1(size 1)(50 assays)
规格 2(size 2)(100 assays)
保存方式 (storage)
试剂一 (Reagent 1)
缓冲液 (Buffer Solution) 60 mL×1 瓶 60 mL×2 瓶 2-8℃保存 6 个月
试剂二 (Reagent 2)
钼酸铵试剂 (Ammonium
Molybdate Reagent)60 mL×1 瓶 60 mL×2 瓶 2-8℃保存 6 个月
试剂三 (Reagent 3)
1 mol/L H2O2 标准品(1 mol/L H2O2
Standard)12 mL×1 瓶 12 mL×1 瓶 2-8℃保存 6 个月
注:试剂严格按上表中的保存条件保存,不同批次试剂盒中的试剂不能混用。
配制试剂之前,请穿戴好防护装备。试剂盒中部分试剂含有危险性物
质。禁止食入,吸入,直接接触眼睛、皮肤和衣物。使用完后的试剂
瓶经彻底清洗后再处理。
安全提示
试剂:
双蒸水、生理盐水(0.9% NaCl)或 PBS(0.01 M,pH 7.4)。
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实验准备
由于过氧化氢非常不稳定,使用前需对其实际浓度进行校准,将试
剂盒中浓度约为 1 mol/L 的过氧化氢标准品贮备液用双蒸水稀释 100倍,使其浓度约为 10 mmol/L,在 240 nm 处,1 cm 光径石英比色皿,
用双蒸水调零,测定 A240,根据公式,试剂三的实际浓度(mol/L)
=22.94×A240×100 倍 ÷1000,计算出实际浓度,再配制标准品进行实验。
① 实验开始前将所有试剂平衡至室温。
② 试剂一使用前,放入 37℃恒温箱中,预热 10 min。
③ 60 mmol/L 标准品的配制:
根据公式计算,试剂三的实际浓度(mol/L)=22.94×A240×100 倍 ÷1000,将其用双蒸水稀释至 60 mmol/L。若试剂三的实际浓度为 1 mol/L,则按试剂三:双蒸水为 3:47 的体积比混匀,如取 60 μL 的试 剂三, 加 940 μL 的双蒸水中,混匀,即为 1 mL 的 60 mmol/L 的过氧 化氢。(标准品使用前,先校准,见实验关键点。)
实验关键点
试剂准备
① 样本处理 具体操作请参见附录 2。
② 样本的稀释 在正式检测前,需选择 2-3 个预期差异大的样本稀释成不同浓度 进行预实验,根据预实验的结果,结合本试剂盒的线性范围(1.5- 150 mmol/L),请参考下表稀释 :
样本准备
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H2O2 浓度(mmol/L) 样本与稀释液的体积比 稀释倍数
<150 不稀释 1
150-1500 1:9 10
注:稀释液为生理盐水或 PBS(0.01 M,pH 7.4)。
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操作过程
① 移液器取试剂前,请用该试剂平衡枪头(缓慢吸液,反复吹打三次)。
② 不能将枪头外壁上的液体加入到反应体系
微量移液器的注意事项
检测环境室内温度 25-30℃,最佳检测波长 405 nm。
操作步骤
① 向空白管、标准管和样本管中,各加入 1 mL 试剂一于 5 mL EP 管
中,置于 37℃恒温箱中,预热 10 min。
② 向空白管中加入 0.1 mL 双蒸水;
向标准管中加入 0.1 mL 60 mmol/L 过氧化氢标准品;
向样本管中加入 0.1 mL 的待测样本。
③ 向步骤②中的各管加入 1 mL 试剂二,涡旋混匀。
④ 405 nm,1 cm 光径石英比色皿,双蒸水调零,测定各管 OD 值。
操作表
非酶管 酶管 酶管
试剂一(mL) 1 1 1
37℃预热 10 min
双蒸水(mL) 0.1 -- --
60 mmol/L H2O2 标准品(mL) -- 0.1 --
待测样本(mL) -- -- 0.1
试剂二(mL) 1 1 1
混匀,405 nm,1 cm 光径石英比色皿,双蒸水调零,测定各管 OD 值。
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结果计算
血清(浆)、细胞上清 H2O2 浓度计算公式:
H2O2 浓度(mmol/L)= ∆A1 ÷ ∆A2 × c × f
细胞、组织 H2O2 浓度计算公式:
H2O2 浓度(mmol/gprot)= ∆A1 ÷ ∆A2 × c × f ÷ Cpr
注:
ΔA1:测定管 OD 值 - 空白管 OD 值
ΔA2:标准管 OD 值 - 空白管 OD 值
C: H2O2 标准品浓度(60 mmol/L)
f:样本加入检测体系前的稀释倍数
Cpr:待测样本的蛋白浓度(g/L)
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例如检测人血清:
取 0.1 mL 人血清,按说明书操作,结果如下:空白管平均 OD 值为 0.051,
标准管平均 OD 值为 0.422,测定管平均 OD 值为 0.445,计算结果为:
H2O2 浓度(mmol/L)=(0.445 - 0.051)÷(0.422 - 0.051)× 60 × 1 =63.72(mmol/L) 按照说明书操作,测定人血清(加样量 0.1 mL)、小鼠肝脏组织(2% 组
织匀浆的蛋白含量 1.82 g/L,加样量 0.1 mL)、青椒(10% 组织匀浆的蛋白
含量 1.99 g/L,加样量 0.1 mL)中 H2O2 含量(如下图)。
实例分析
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参考文献
1. Neill S J, Desikan R, Clarke A, et al. Hydrogen peroxide and nitric oxide as signalling molecules in plants. Journal of Experimental Botany, 2002, 53(372): 1237-1247.
2. Veal E A, Day A M, Morgan B A. Hydrogen peroxide sensing and signaling. Molecular Cell, 2007, 26(1): 1-14.
3. Marinho H S, Real C, Cyrne L, et al. Hydrogen peroxide sensing, signaling and regulation of transcription factors. Redox Biology, 2014, 2(2): 535-562.
4. Carnevale R, Nocella C, Pignatelli P, et al. Blood hydrogen peroxide break-down activity in healthy subjects and in patients at risk of cardiovascular events. Atherosclerosis, 2018, 274: 29-34.
5. Moloney J N, Cotter T G. ROS signalling in the biology of cancer. Seminars in Cell & Developmental Biology, 2018, 80: 50-64. opportunities. Antioxidants & Redox Signaling , 2011, 15(7): 1957- 1997.
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附录 1 关键数据
技术参数
检测范围 1.5-150 mmol/L 平均批间差 2.7%
灵敏度 1.5 mmol/L 平均批内差 1.3 %
平均回收率 98%
用三个不同生产批号的试剂盒,检测在检测范围内的高浓度样本、中
浓度样本和低浓度样本,每个批号每个浓度的样本重复测 3 次(n=3),
分别计算每个批号各浓度样本的均值,并按公式计算出各浓度样本的
相对偏差,最后得出平均批间差 2.7%
批间差
批内差
用一个试剂盒,检测在检测范围内的高浓度样本、中浓度样本和低浓
度样本,各个浓度的样本重复检测 6 次 (n=6),计算出平均批内差 1.3%
CV= × 100%sx s---Standard deviation
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标准曲线(数据仅供参考)
灵敏度
回收率
标准品加样量 0.1 mL,按照试剂盒操作规程测定标曲和 20 个空白的 OD值。绘制标准曲线,算出空白 OD 值的标准差。根据 IUPAC 公认的公式
3 倍的标准差除以标曲斜率计算出灵敏度 1.5 mmol/L
向样本中添加高、中、低三个浓度的标准品,每个浓度样本重复检测
3 次(n=3),做回收率实验,得出平均回收率 98%
①将 1 mol/L 的标准品稀释成以下不同浓度:
标准品浓度(mmol/L) 0 20 40 60 80 100 150
1 mol/L H2O2 (μL) 0 20 40 60 80 100 150
双蒸水 (μL) 1000 980 960 940 920 900 850
② 标准品加样量 0.1 mL,按照操作表步骤进行操作,读取数据,绘制标
曲 ( 如下图 )
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附录 2 样本制备
样本要求
① 在测试之前选择 2-3 个预期差异大的样本进行预实验。
血清样本
血浆样本
取新鲜血液,在 25℃条件下静置 30 min 使血液凝结。4℃,2000×g 离
心 15 min,取上层淡黄色澄清液体即为血清。血清置于冰上待测,若
不能当天检测,于 -80℃保存,可储存一个月。
取新鲜血液加入盛有抗凝剂的试管中,颠倒混匀,4℃,700-1000×g 离
心 10 min,取上层淡黄色透明液体即为血浆,不能吸取中间白色干扰
层(白细胞和血小板)。将血浆置于冰上待测,若不能当天检测,于 -80℃保存,可储存一个月。
注:抗凝剂种类及浓度
肝素:
常用的肝素抗凝剂是肝素的钠、钾、锂、铵盐,其中以肝素锂最好。
通常肝素抗凝剂量为 10.0-12.5 IU/mL 血液。
枸橼酸盐:
主要是枸橼酸钠,通常以二水合枸橼酸钠配置成 3.8% 或 3.2% 的水溶液,
与血液按照 1:9 的体积比混合抗凝。
乙二胺四乙酸盐(EDTA 盐):
常用的 EDTA 盐有钾、钠、锂盐,推荐使用 EDTA 钾盐(溶解度最高、
抗凝速度最快),通常配成 15% 的水溶液(质量分数),每 5 mL 血
液加 0.04 mL 15% EDTA 溶液抗凝。
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取 0.020-1 g 新鲜组织块,用 2-8℃的 PBS(0.01 M,pH 7.4)漂洗,去除血液,
滤纸吸干,称重,放入匀浆容器中,按照重量(g):体积(mL)=1:9的比例加入 2-8℃的匀浆介质,进行匀浆,4℃,10000×g 离心 10 min,
取上清置于冰上待测,若不能当天检测,于 -80℃保存,可保存一个月。
细胞样本
悬浮细胞:
4℃,1000×g 离心 10 min 收集细胞,按照 106 个细胞加入 300-500 μL 匀
浆介质的比例加入匀浆介质,进行机械匀浆,充分破碎(无明显的细
胞沉淀,可在显微镜下观察),4℃,10000×g 离心 10 min,取上清置
于冰上待测,若不能当天检测,于 -80℃保存,可保存一个月。
贴壁细胞:
吸弃培养液,用 PBS(0.01 M,pH 7.4)将细胞洗一遍。用细胞刮刮下
细胞(不能用胰酶和 EDTA 处理),加入 2-5 mL PBS(0.01 M,pH 7.4),
收集细胞悬液,后处理方法见悬液细胞处理方法。
10% 组织匀浆
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匀浆介质 : PBS(0.01 M,pH 7.4,含有 0.1 mM EDTA)。
匀浆方式 : 手工匀浆、机械匀浆、超声破碎
a. 手工匀浆:
将组织称重,剪碎呈 1 cm3 大小,倒入玻璃匀浆管中,加入匀浆介质,
左手持匀浆管将下端置于冰浴中,右手将捣杆垂直插入套管中,上下
转动研磨数十次(6 ~ 8 min),组织充分匀浆;或者倒入研钵中,加
入液氮进行研磨,充分研磨后,加入匀浆介质,再将制好的匀浆吸取
到 EP 管中备用。
b. 机械匀浆:
将已称重的组织装入 EP 管,加入匀浆介质,用组织匀浆机,在冰水
浴条件下,60 Hz,90 s 研磨制成组织匀浆,皮肤、肌肉组织及植物组
织等可适当延长匀浆时间。
c. 超声破碎:
冰水浴条件下,用超声波发生器以振幅 14 μm 超声处理 30 s,破碎细胞;
或者用超声波破碎仪,200 W,2 s/ 次,间隙 3 s,总时间 5 min
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附录 3 问题答疑
问题 可能原因 建议解决方案
测值不稳定,复孔差异大
微量移液器使用不熟练小心加样,避免液体溅到其它测样管中
未严格按照说明书操作 严格按照说明书操作
样本测不出值
样本稀释倍数太大 选择合适稀释倍数,重新检测
样本保存时间过长或者保存不当
取新鲜样本,重新检测
样本测量结果>150 mmol/L 样本浓度太高 选择合适稀释倍数,重新检测
标准品的值较低 过氧化氢部分分解使用前对过氧化氢的实际浓度进行校准
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