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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA
RITA DE CÁSSIA MARDEGAN Bióloga
ENZIMOTIPAGEM E GENOTIPAGEM DE ISOLADOS DE
Gandi da albicans DA CAVIDADE ORAL DE CRIANÇAS
CÁRIE ATIVAS E LIVRES DE CÁRIE.
Dissertação apresentada à F acuidade de
Odontologia de Piracicaba, da Universidade
Estadual de Campinas, para a obtenção do título de
Mestre em Biologia Buco Dental, Área de
Concentração em Microbiologia & Imunologia.
PIRACICABA 2003
RITA DE CÁSSIA MARDEGA,.N Bióloga
ENZIMOTIPAGEM E GENOTIPAGEM DE ISOLADOS DE
Candída albicans DA CAVIDADE ORAL DE CRIANÇAS
CÁRIE ATIVAS E LIVRES DE CÁRIE.
Dissertação apresentada à Faculdade de
Odontologia de Piracicaba, da Universidade
Estadual de Campinas, para a obtenção do título de
Mestre em Biologia Buco Dental, Área de
Concentração em Microbiologia & Imunologia.
Orientador: Prof. Dr. José Francisco Hõfling
Banca Examinadora:
Prof. Dr. José Francisco Hõfling
Prof. Dr. Reginaldo Bruno Gonçalves
Prof. Dra. Renata de Oliveira Mattos-Graner
PIRACICABA 2003
iii
UNIDADE
"'
N' CPD
M334e
Ficha Catalográfica
Mardegan, Rita de Cássia. Enzimotipagem e genotipagem de isolados de cándida albicans
da cavidade oral de crianças cárie ativas e livres de cárie. I Rita de Cássia Mardegan. -- Piracicaba, SP : [ s.n.], 2003.
xix, 132p. : il.
Orientador: Prof. Dr. José Francisco Hõfling. Dissertação (Mestrado) - Universidade Estadual de Campinas,
Faculdade de Odontologia de Piracicaba.
I. Candida albicans. 2. Fosfolipase. 3. Proteinase. 4. Cáries dentárias. L Hõfling, José Francisco. !I. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Odontologia de Piracicaba. III. Título.
Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca da Faculdade de Odontologia de Piracicaba- UNICAMP.
iv
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS UN!CAMP
A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa de Tese de MESTRADO, em
sessão pública realizada em 27 de Fevereiro de 2003, considerou a
candidata RIT~Z\ DE CÁSSIA IvtARDEGA.l-J aprovada.
1. Prof. Dr. JOSE FPA~CISCO HOFLING __ H~*---
2. Prof. Dr. REGINALDO BRUNO
3. Profa. Dra. REN}>~TA O. HATTOS
Dedicatória
ADeus
Por estar sempre no meu caminho
Obrigado Meu Deus!
Aos meus pais
Dirceu e Sônia, que muitas vezes, deixaram de realizar seus sonhos,
para realizar os meus. Minha eterna gratidão, pelo amor
incondicional, pelo carinho, apoio e incentivo.
Muito obrigado Pai! Muita obrigada llfãe!
Aos meus irmãos
Cintia, Junior, Amanda, companheiros de todos os momentos
de luta, sempre solícitos, que me deram incentivo para
continuar a caminhar em busca dos meus ideais.
Muito obrigado!
vi i
As minhas amigas
Marlise e Regianne, que sempre estiveram ao
meu lado, qjudaram-me a manter forte o
objetivo e vencer as barreiras ...
A vocês o meu muito obrigado!
Ao Eduardo Sucker
pela dedicação, carinho, compreensão e,
acima de tudo, amor e respeito.
Seu amor e seu incentivo fizeram-me confiante.
A você meu muito obrigado!
ix
Ao Pro f. Dr. Celso Paulino da Costa
"A morte não existe" ... O que se dá é apenas uma transformação em nossa maneira de ser.
Não espere que, depois desta, exista outra vida. Não! A vida é a mesma. A vida eterna já
está sendo vivida para todos nós. Depois da morte continuaremos ser o que já somos, por
que a morte não existe! Ao Sr. o meu muito obrigado!
Ao Pro f. Dr. José Francisco Hojling ,sempre solícito, a quem respeito e admiro, por
ter acreditado em meu potencial, pela orientação, pelo carinho e atenção sempre presentes
durante a realização deste trabalho. Ao Sr. o meu muito obrigado!
Ao Prof. Dr. Regina/do Bruno Gonçalves, por todas as oportunidades
que me foram dadas, proporcionando meu crescimento profissional e individual.
A você, o meu muito obrigado!
xi
AGRADECIMENTOS
A Faculdade de Odontologia de Piracicaba, Universidade Estadual de Campinas, na
pessoa do Prof. Dr. Thales Rocha de Mattos Filho (Diretor), pelo acolhimento e pela
oportunidade de aprimorar meus conhecimentos.
Aos Profs. Reginaldo Bruno Gonçalves, Antonio Olavo Cardoso Jorge e Renata de
Oliveira Mattos-Graner, por aceitarem compor a banca examinadora e avaliar este trabalho
de tese.
A Profa. Dra. Silvana Pereira Barros, coordenadora do curso de pós graduação em
Biologia e Patologia Buco-Dental da FOP-UNICAMP.
A Magda Elizabeth B. Gouvêa que coletou as amostras utilizadas neste estudo, e
que gentilmente nos concedeu para essa pesquisa.
A J anaina Rodrigues e Daniel Sai to pela participação neste estudo científico e
inspiração no início desta pesquisa.
Aos meus amigos de turma da Pós-Graduação Letizia, Ana Claudia, Marcelo
Boriollo, Vagner, Marcelo Napimoga, Marcelle, Iriana, Janaina, Rafael e Thais, pela
amizade e cumplicidade. A nossa convivência me proporcionou momentos de muita alegria
e amadurecimento pessoal.
xiii
Aos Funcionários do departamento de Microbiologia e Imunologia Anderson,
Vilma, e Flávia, pela amizade, colaboração e disposição durante nossa convivência e pelo
respeito que sempre me distinguiram.
Aos amigos Prof. Dr. Edvaldo A. R. Rosa e Rosemeire T. Rosa, obrigado pelos
ensinamentos, apoio e amizade sempre dispensados.
A minha amiga Heloisa Maria Ceccotti, pelo companherismo demonstrado a todo
instante, incentivo e amizade sempre presente em nossa convivência.
Aos amigos Marli Aparecida Barbosa, Núbia Medeiros, Vagner Rogério Romano,
André Chinelatto, Wilson de Almeida Junior, pela amizade e apoio dispensado nos
momentos oportunos, minha eterna gratidão.
A minha tia Ada e minha avó Irene, pela força e incentivo a todo o momento, meu
muito obrigado.
Ao meu primo Gustavo B. Camille, pelos momentos de alegria, que sempre me
proporciona. A você e a toda nossa família, eu dedico os frutos desse trabalho!
A CAPES, pelo apoio financeiro instituído pela concessão de bolsa.
XV
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS
LISTAS DE FIGURAS
LISTAS DE ABREVIATURAS E SIGLAS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUÇÃO
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 CARACTERÍSTICAS BIOLÓGICAS GER4IS DE CANDIDA
2.2 EsPÉCIES DE CANDIDA AssOCIADAS À CAVIDADE ORAL
2.3 IDADE Do HOSPEDEIRO E COLONIZAÇÃO POR ESPÉCIES DE CANDIDA
2. 4 AssOCIAÇÃO ENTRE CÁRIE E LEVEDURA
2.5 FATORES DE VIRULÊNCIA
2.6FOSFOLIPASE
2. 7 PROTEINASE
2.8 MÉTODOS PARA TIPAGEM MOLECULAR
3 PROPOSIÇÃO
xvii
1
3
5
7
9
11
15
15
16
18
20
23
24
29
35
41
4 METODOLOGIA 43
4.1 PROCEDÊNCIA DAS CEPAS 43
4.2 COLETA DAS A/vfOSTRAS 43
4. 3 PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS 44
4.4 lDENTIFICAÇÃO DAS ESPÉCIES DE C4NDIDA 45
4.5 CONSERVAÇÃO DAS AMOSTRAS 46
4.6 TESTE DE PROTEJNASE E FOSFOL!PASE 47
4. 7 EXTR4ÇÃO DO DNA 48
4.8 AP-PCR (REAÇ.40 EM CADEIA DA POLI/v!ERASE UTILIZANDO PRJMER 49
ARBITRAR!O)
5 RESULTADOS
6 DISCUSSÃO
7 CONCLUSÃO
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BIBLIOGRAFIA
ANEXOS
53
85
99
101
123
125
xix
Lísla de Tabelas
LISTA DE TABELAS
Tabela l- Medida da atividade enzimática 48
Tabela 2- Perfil da atividade enzimática da proteinase produzida por C. 56 albicans, nos grupos cárie ativos e livres de cárie
Tabela 3 - Perfil da atividade enzimática da fosfolipase produzida por C. 56 albicans, nos grupos cárie ativos e livres de cárie.
Tabela 4 - Número de ferfis genotípicos de C. albicans e número total de cepas 59 analisadas pela técnica AP-PCR, em indivíduos cárie ativos.
Tabela 5- Número de ferfis genotípicos de C. albicans e número total de cepas 59 analisadas pela técnica AP-PCR, em indivíduos livres de cárie.
Tabela 6- Perfis genotípicos e enzimático de amostras de C. albicans do 61 voluntário 7
Tabela 7- Perfis genotípicos e enzimático de amostras de C. albicans do 63 voluntário 8
Tabela 8- Perfis genotípicos e enzimático de amostras de C. albicans do 64 voluntário 15
Tabela 9- Perfis genotípicos e enzimático de amostras de C. albicans do 65 voluntário 28
Tabela l 0- Perfis genotípicos e enzimático de amostras de C. albicans do 66 voluntário 31
Tabela 11 - Perfis genotípicos e enzimático de amostras de C. albicans do 67 voluntário 32
Tabela 12- Perfis genotípicos e enzimático de amostras de C. albicans do 69 voluntário 33
1
Lista de Tabelas
Tabela 13- Perfis genotípicos e enzimático de amostras de C albicans do 70 voluntário 35
Tabela 14 - Perfis genotípicos e enzimático de amostras de C albicans do 71 voluntário 59
Tabela 15- Perfis genotípicos e enzimático de amostras de C albicans do 72 voluntário 63
Tabela 16- Perfis genotípicos e enzimático de amostras de C albicans do 74 voluntário 17
Tabela 17 - Perfis genotípicos e enzimático de amostras de C albicans do 75 voluntário 18
Tabela 18- Perfis genotípicos e enzimático de amostras de C albicans do 76 voluntário 34
Tabela 19- Perfis genotípicos e enzimático de amostras de C albicans do 76 voluntário 46
Tabela 20- Perfis genotípicos e enzimático de amostras de C albicans do 78 voluntário 56
Tabela 21 - Perfis genotípicos e enzimático de amostras de C albicans do 79 voluntário 60
Tabela 22 - Características fenotípicas e genotípicas do grupo cane ativo. 80 Relação entre o número de genótipos e fenótipos de um mesmo voluntário
Tabela 23 - Características fenotípicas e genotípicas do grupo livre de cárie. 81 Relação entre o número de genótipos e fenótipos de um mesmo voluntário
2
Lista deFiguras
USTA DE FIGURAS
Figura l - Ciclos do termociclador 50
Figura 2- Cultivo de 4 cepas de Candida albícans em Ágar proteinase (A) e de 8 53 cepas de C. albicans em Ágar fosfolipase (B). Após o período de icubação, pode-se observar zonas de degradação ao redor da colônias de leveduras.
Figura 3 - Cálculo utilizado para medir a atividade enzimática de colônias de 54 Candída albicans, descrito por Price et al., 1982.
Figura 4 - Freqüência de cepas de Candída albícans com atividade enzimática para 55 proteinase positiva, incluindo índices l e 2 e de cepas que apresentaram atividade enzimática negativa (índice O)
Figura 5 - Freqüência de cepas de Candída albícans com atividade enzimática para 55 fosfolipase positiva, incluindo índices 1 e 2 e de cepas que apresentaram atividade enzimática negativa (índice O)
Figura 6 - Porcentagem de cepas com atividade enzimática da proteinase positiva e 57 negativa, nos grupos cárie ativos e livres de cárie.
Figura 7 - Porcentagem de cepas com atividade enzimática da fosfolipase positiva e 57 negativa, nos grupos cárie ativos e livres de cárie.
Figura 8- Perfis eletroforéticos de Candída albícans da cavidade oral do voluntário 58 7, do grupo cárie ativo
Figura 9- Dendograma representativo do voluntário 7, grupo cárie ativo 60
Figura I O - Dendograma representativo do voluntário 8, grupo cárie ativo 62
Figura li - Dendograma representativo do voluntário 15, grupo cárie ativo 63
Figura 12- Dendograma representativo do voluntário 28, grupo cárie ativo 65
Figura 13 - Dendograma representativo do voluntário 31, grupo cárie ativo 66
3
Lista deFiguras
Figura 14 - Dendograma representativo do voluntário 32, grupo cárie ativo 67
Figura 15 - Dendograma representativo do voluntário 33, grupo cárie ativo 68
Figura J 6 - Dendograma representativo do voluntário 35, grupo cárie ativo 69
Figura 17- Dendograma representativo do voluntário 59, grupo cárie ativo 70
Figura 18- Dendograma representativo do voluntário 63, grupo cárie ativo 72
Figura 19- Dendograma representativo do voluntário 17, grupo livre de cárie 73
Figura 20 - Dendograma representativo do voluntário 18, grupo livre de cárie 74
Figura 21 - Dendograma representativo do voluntário 34, grupo livre de cárie 75
Figura 22 - Dendograma representativo do voluntário 46, grupo livre de cárie 76
Figura 23 - Dendograma representativo do voluntário 56, grupo livre de cárie 77
Figura 24 - Dendograma representativo do voluntário 60, grupo livre de cárie 78
Figura 25 - Média do número de linhagens clonais nos grupos cárie ativos e livres de 80 cárie
Figura 26 - Média do número de biótipos nos grupos cárie ativos e livres de cárie 80
Figura 27 - Média do número de linhagens clonais e biótipos no grupo cárie ativo 82
Figura 28 - Média do número de linhagens clonais e biótipos no grupo livre de cárie 82
Figura 29 - Dendograma representativo dos voluntários pertencentes ao grupo cárie 83 ativo
Figura 30 - Dendograma representativo dos voluntários pertencentes ao grupo livre de 84 cárie
4
Lista de Abreviaturas e Siglas
USTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AP-PCR
BSA
C. albicans
dATP
dCTP
dGTP
DNA
dTTP
et ai.
g
In vitro
In vivo
M
MCL
MgCb
Mg/mL
mL
mm
mM
Reação em Cadeia da Polimerase com Primers Arbitrários
Albumina do Soro Bovino
Candida albicans
deoxionucleosídeo adenina trifosfato
deoxionucleosídeo citosina trifosfato
deoxionucleosídeo guanina trifosfato
Ácido deoxiribonucleico
Deoxionucleosídeo timina trifosfato
E outros (abreviatura de "et allf')
Grama
conjunto de reações que se realizam em condições laboratoriais
Experimento realizado em seres vivos
molar
Meio completo para levedura
Cloreto de magnésio
Microgramas por mililitro
Mililitro
Milímetro
mil imolar
5
Na CL
ng
pb
PCR
pH
PZ
q.s.q
RAPD
rpm
TaqDNA
polimerase
TBE
TE
UFC
UPGMA
YPD
J.Lg/mL
J.LM
RFLP
RAPD
Lista de Abreviaturas e Siglas
Cloreto sódio
nano grama
grau Celsius
Pares de base de DNA
Reação em Cadeia da Polimerase
Potencial hidrogeniônico
Zona de precipitação
Quantidade suficiente para atingir determinado volume
Polimorfismo do DNA Amplificado ao Acaso
Rotação por minuto
Enzima DNA polimerase proveniente da Thermus aquaticus
Tampão Tris-borato-EDTA
Tampão Tris-EDT A
Unidade formadora de colônias
Unweighted pair-group method with mathematic average
Y est peptone dextrose
Microgramas por mililitro
micromolar
Restriction fragment length polymorphism
Randon amplification ofpolymorphic DNA
6
Resumo
RESUMO
Um total de 158 amostras de Candída albicans isoladas da cavidade oral de
crianças, com idades entre 24 e 36 meses, divididas em dois grupos: Cárie ativas (l 04
amostras) e Livres de Cárie (54 amostras) foram estudadas. Com base nos dados da
literatura, a proposição da presente pesquisa foi: 1) analisar e comparar a produção de
proteinases e fosfolipases de Candida albicans, entre os dois grupos; 2) relacionar a
diversidade fenotípica quanto à produção dessa enzima com o polimorfismo genético,
através da técnica de AP-PCR. As amostras isoladas e identificadas como Candida
albicans, foram processadas para cultivo em meio de cultura Ágar proteinase e Ágar
fosfolipase e incubadas a 37°C por 7 e 4 dias, respectivamente. Após esse período, foi
medida a atividade enzimática das cepas proteinase e fosfolipase positivas, classificando-as
com os índices, O (negativa), 1 (positiva) e 2 (positiva elevada). Todas as amostras foram
submetidas á técnica de AP-PCR, usando o "primer" arbitrário AP-3. As análises
enzimáticas revelaram não haver diferenças estatisticamente significativas entre os dois
grupos estudados. A técnica de AP-PCR foi eficaz em demonstrar o polimorfismo genético
de C. albicans intra indivíduos, revelando maior diversidade clonal em indivíduos cárie
ativos em relação aos livres de cárie e a construção de dendogramas de similaridade
demonstrou que linhagens clonais semelhantes ocorrem apenas intra indivíduos e não entre
indivíduos. Os resultados obtidos permitiram observar que o perfil enzimático independe
das características genotipicas das cepas.
7
Abstrac/
ABSTRACT
A total of !58 samples of Candida albicans isolated from the oral cavities of
healthy children, with ages ranging from 24 to 36 months divided in two groups, caries
active and caries free were studied. Based on the literature, the aims of the present study
were: 1) to analyze and to compare between the groups, proteinase and phospholipase
produced by Candida albicans; 2) to corre late the phenotypic diversity o f this enzyme with
the genetic polymorphism using the AP-PCR method. The samples isolated and identified
as C. albicans were inoculated in proteinase agar and phospholipase agar media and then
incubated at 37 °C for 7 days and 4 days respectively. After the incubation period, the
enzimatic activity of the positive proteinase and phospholipase strains was measured
according to the indexes O (zero) 1 (one) and 2 (two). Ali the samples were subjected to
AP-PCR method, using the arbitrary primer AP-3. The enzymatic analysis showed no
statistically significant differences between the groups studied. The AP-PCR method was
effective to demonstrate the genetic polymorphism in the C. albicans intra individually,
revealing a greater clonal diversity in caries actives children in relation to caries free, ones
the construction of dendograms o f similarity showed clonal lineage intra individual only.
The results allowed the observation that the enzimatic profile does not depend on the
genotypic characteristics o f the strains.
9
Introdução
1 INTRODUÇÃO
O gênero Candida, compreende um grupo de leveduras que se encontram
amplamente distribuídas na natureza, sendo que algumas espécies vivem como saprófitas
ou parasitas no homem e em outras espécies animais de sangue quente (BUDTZ
JÕRGENSEN, 1990).
A ocorrência de Candida na cavidade bucal se apresenta sob a forma
comensal e constitui parte da microbiota bucal residente. As razões para o estabelecimento
de infecções são fatores precipitadores, tais como, queda da imunidade do hospedeiro,
desordens endócrinas, lesões em mucosas, higiene oral deficiente, tratamento prolongado
com antibióticos, corticosteróides e outros. A cavidade bucal, ao contrário de outras
cavidades naturais, está constantemente exposta a estímulos mecânicos, térmicos e
químicos, em decorrência dos atos fisiológicos a ela inerentes, destacando-se a mastigação.
Desta forma, está propensa a apresentar com freqüência, modificações sistêmicas que
poderão concorrer para o rompimento do equilíbrio biológico entre população microbiana e
hospedeiro (LACAZ, 1980). As espécies de Candida se aderem as superficies do epitélio
oral (FUKA Y AMA & CALDERONE, 1991), a próteses e aparelhos ortodônticos
(BUDTZ- JÓRGENSEN et a!., 1975) e em menor intensidade a superficies dentais limpas,
mas ao passo em que se forma a película adquirida, essa colonização aumenta podendo
ocorrer tanto através da adesão direta aos receptores da película - atuando como
colonizador pioneiro - como indiretamente, pela coagregação a outros microrganismos já
aderidos ao biofilme dental ( HOLMES et a!., 1995; DE REPENTIGNY et al., 2000).
11
Introdução
Sendo que após esse evento, futuras interações podem ocorrer entre o hospedeiro e as
células fúngicas que são importantes para permanência ou remoção dessa levedura na
cavidade bucaL A espécie Candida albicans, considerada como uma das mais patogênicas é
a mais freqüente levedura isolada desse local (STENDERUP, 1990).
Leveduras pertencentes ao gênero Candida fazem parte da microbiota bucal
residente tanto de adultos, como de crianças, e a freqüência, intensidade e espécies
predominantes variam em função da idade do hospedeiro (KLEINEGGER et al., 1996), e
de condições variadas como: presença ou não de cárie (R.ADFORD et al., 2000), qualidade
da dieta (BASU et a!., J 961 ), higiene oral (JORGE et a!., 1987), alterações do fluxo salivar
e desordens sistêmicas (STENDERUP, 1990).
Para os mecanismos que determinam a patogênicidade do gênero Candida,
várias hipóteses têm sido sugeridas, como: capacidade de apresentar-se sob diversas
formas, chamadas de variações adaptativas, habilidade de formarem hifas, capacidade de
aderência às superfícies mucosas, .Produção de enzimas hidrolíticas, ou resposta
inflamatória aos antígenos de Candida (BUDTZ-JORGENSEN, 1980). Fungos patogênicos
como Candida albicans secretam enzimas que são consideradas essenciais para virulência.
Estas estão divididas em dois tipos principais: proteinases que hidrolisam peptídeos
vinculados à membrana (HUBE et al., 1998) e fosfolipases que hidrolisam fosfolipídios
(IBRAHIM et al., 1995). A produção de enzimas hidrolíticas é considerada como uma
importante característica de virulência e alguns pesquisadores têm sugerido que essa
propriedade pode ser explorada como um critério para biotipagem de Candida albicans
(PRlCE et a!., 1982; SAMARANA Y AKE et al., 1984; CANDIDO et al., 2000).
12
Introdução
Em adição a esses métodos fenotípicos, para determinação do potencial
patogênico, atualmente, tem se tomado importante o uso de métodos moleculares, visto
que, a capacidade de distinguir entre isolados distintos da mesma espécie é importante para
um melhor conhecimento dessa levedura. Esse tipo de análise pode promover informações
valiosas acerca da relação entre isolados da mesma espécie em diferentes sítios no mesmo
indivíduo ou em uma determinada população (MELO et ai., 1998).
Dentre os métodos moleculares, a técnica AP-PCR (Reação em cadeia da
polimerase com primers arbitrários) é bastante empregada em estudos sistemáticos ou
epidemiológicos. Nesse processo, somente um único primer arbitrário é empregado,
enquanto que no PCR clássico, dois primers que codificam uma seqüência conhecida são
utilizados (WELSH & McCLELLAND, 1990). Em estudos que aplicam essa técnica é
constatado que um ou mais perfis genéticos de Candida albicans podem ser encontrados
em um mesmo indivíduo (MELO et ai., 1998).
Pelo fato dos mecanismos de virulência de Candida albicans não estarem
totalmente esclarecidos, o propósito da presente pesquisa foi analisar o perfil fenotípico
(enzimático) e comparar com o perfil genotípico dessas amostras, o que poderá contribuir
para um melhor esclarecimento sobre as características patogênicas relacionada com a
diversidade genética dessa espécie.
13
Revisão da Literatura
2 REYISÃODALITERATURA
2.1 CARACTERÍSTICAS BIOLÓGICAS DE CANDIDA
As diferentes espécies que compõem o gênero Candida, estão distribuídas em
diferentes filos de acordo com as características sexuais de cada urna, podendo estar em
estados anamórficos, ou telemórficos. Existem ainda espécies que não apresentam estado
perfeito conhecido, corno é o caso de Candida albicans, principal espécie de interesse
médico, e de Candida tropicalis (LODDER, 1970). As leveduras desse gênero acham-se
amplamente distribuídas na natureza, sendo que algumas espécies vivem corno saprófitas
ou parasita no homem e em outras espécies animais de sangue quente (BUDTZ
JORGENSEN, 1990).
As espécies que fazem parte da microbiota normal da pele, boca e trato gastro
intestinal são a causa mais freqüente de infecções fúngicas humanas e além de estarem
presentes na cavidade bucal e peribucal, sua forma leveduriforme vive normalmente na
orofaringe, nas dobras da pele, em secreções brônquicas, trato genito-urinário e
gastrointestinal de humanos (LACAZ, 1980). Em condições normais, o hospedeiro mantém
esses microrganismos corno comensais, entretanto, alterações locais ou sistêmicas
favorecem o desenvolvimento de sua ação patogênica, causando danos para o homem,
particularmente a candidíase (AL Y et al., 1975).
15
Revisão da Literatura
Candida albicans é um dos poucos microrganismos eucariotos que desenvolveu
uma associação com o homem. Este fungo possui uma variedade de formas capazes de
auxiliar sua sobrevivência como microrganismo comensal, mas como e em que
circunstãncias os diferentes tipos morfológicos contribuem para sua patogênicidade ainda é
pouco conhecida (MICHAEL & STEPHEN, 1995).
2.2 ESPÉCIES DE CAJ\'DIDA ASSOCIADAS À CAVIDADE ORAL
A cavidade oral humana tem sido considerada um meio ambiente único, por
oferecer uma variedade de nichos ecológicos para colonização microbiana. Os fungos
pertencentes ao gênero Candida spp habitam diferentes superflcies epiteliais do corpo,
incluindo a mucosa oral, fazendo parte da microbiota residente (McCULLOUGH et al.,
1996). Além de Candida albicans, outras espécies têm sido isoladas, como Candida
tropicalis, Candida parapsilosis, Candida krusei, Candida kefyr, Candida glabrata,
Candida guilliermondii, Candida lusitaneae, Candida dubliniensis, e estudos relatam que
um único hospedeiro pode ser colonizado tanto por uma, como por múltiplas espécies de
Candida ou ainda por diferentes genótipos da mesma espécie, no mesmo ou em diferentes
sítios no organismo (XU et al., I 999).
Segundo STENDERUP (J 990) a espécie de maior importãncia médica, pelo fato
de ser agente etiológico de grande parte das infecções fúngicas ocorridas na cavidade oral,
é Candida albicans, e sua ocorrência neste local representa 60% a 70% dos isolados,
16
Revisão da Literatura
seguida de Candida glabrata, Candida tropicalis e outras espécies do gênero que ocorrem
de maneira mais rara e transitória.
Pelo fato da cavidade oral possuir diversos mecanismos de defesa, uma grande
variedade de microrganismos são repetidamente introduzidos e removidos, somente se
estabelecendo aqueles que possuem capacidade de aderência às superfícies da cavidade oral
ou que de alguma maneira permaneçam retidos. A aderência de Candida albicans às células
do epitélio oral representa um estado habitual de comensalismo, pois acredita-se que baixos
níveis dessa levedura façam pane da microbiota residente normal em humanos. Sendo esse
evento, importante para a colonização inicial e persistência dessa levedura (BRASSART et
al., 1991). Aderência a diferentes células do hospedeiro incluem: células do epitélio
(FUKAYAMA & CALDERONE, 1991), do endotélio (GHAJ\'NOUM et al., 1992), a
hidroxiapatita dos dentes (CANNON et al., 1999), a próteses e aparelhos ortodônticos
(BUDTZ-JÓRGENSEN et al., 1975).
Segundo LAMKIM & OPPE'Nl-IEIM (1993), Candida albicans adere pouco a
superfícies dentais limpas, mas à medida que se forma a película adquirida esse evento
aumenta, podendo colonizar o esmalte dos dentes e as superfícies radiculares, tanto através
da adesão direta aos receptores da película - atuando como colonizador pioneiro - como
indiretamente, pela coagregação a outros microrganismos já aderidos ao biofilme dental
(HOLMES et al., 1995; DE-REPENTIGNY et al., 2000). Além disso, interações
posteriores podem ocorrer entre o hospedeiro e as células fúngicas que são importantes para
permanência ou remoção dessa levedura na cavidade oral. SHERWOOD et al., 1992,
relatam, que a espécie Candida albicans é capaz de apresentar-se sob diversas formas,
17
Re1/isão da Literatura
chamadas de variações adaptativas, sendo que a forma hifal é mais virulenta e mms
aderente em relação à célula leveduriforme, dessa forma a capacidade de Candida albicans
de formar tubos germinativos parecem contribuir para sua virulência visto que amostras
obtidas de tecidos infectados em homens e animais a maioria das vezes contém hifas,
pseudo-hifas e células leveduriformes .
2.3 IDADE Do HOSPEDEIRO E COLONIZAÇÃO POR ESPÉCIES DE CANDIDA
Leveduras do gênero Candida tem demonstrado serem habitantes comuns da
cavidade oral tanto de adultos como de crianças (BARLOW & CHATTAWAY, 1969;
DARWAZEH & AL-BASHIR, 1995; HANNULA et al., 1999). A freqüência, intensidade
e espécies predominantes variam em função da idade do hospedeiro (KLEINEGGER et al.,
1996). Durante o período neonatal, as condições que predispõe a instalação de leveduras
são provavelmente a imaturidade do sistema imune e circunstâncias de desenvolvimento da
microbiota oral (OKSALA, 1990).
As potenciais fontes de leveduras para colonização primária da cavidade bucal
de bebês são pouco conhecidas. A cavidade bucal do neonato pode ser infectada por
leveduras do gênero Candida durante o parto normal. Estudos sobre transmissão horizontal
e vertical têm demonstrado que cepas de Candida de origem materna e de neonatos são de
origem idêntica em 14% das vezes, sendo que em tais ocasiões a espécie mais
freqüentemente encontrada é Candida albicans (W AGGONER-FONTAIN et al., 1996).
18
Revisão da Literatura
Segundo SAIMAN et a!., 2001, algumas horas após o nascimento, a cavidade
bucal do recém nascido adquire sua colonização pioneira e as possíveis fontes de
microrganismos para cavidade bucal deste, são as mãos, pele e cavidade bucal dos pais ou
de pessoas diretamente ligadas.
LA Y & RUSSEL (1977) salientam que 5% a 7% das crianças apresentam
Candida albicans durante as primeiras horas após o nascimento e decorrido uma semana,
esses valores chegam a 14%. BERDICEVSKY et al., 1984 mencionam a presença de
Candida spp em 49% das crianças entre 3 e 6 anos e em 65% delas entre 6 e 12 anos. Um
estudo longitudinal demonstrou a presença de espécies de Candida em torno de 5,7% nas
primeiras horas após o nascimento, aumentando para 82% em 4 semanas, e decrescendo
para 50% em torno de 1 ano de vida (RUSSEL & LA Y, 1973).
A recuperação de leveduras da cavidade bucal na infância, tem sido associada
ao uso de chupeta, deficiências nutricionais, irrompimento dos primeiros dentes, uso de
mamadeiras, múltiplas lesões de cárie, higiene bucal deficiente, terapia antibiótica, idade e
sexo (SEO et al., 1987; PIENIHAQQINEN et al., 1988; DARWAZEL & AL-BASHIR,
1995; OLLILA et al., 1997; HANNULA et al., 1999). Ao passo que em idosos ocorre um
aumento na colonização que pode ser devido ao uso de medicamentos e/ ou próteses
(ODDS, 1988).
Segundo HANNULA et al., 1999 em estudos para determinarem a ocorrência e
estabilidade da colonização bucal por diferentes espécies de Candida em 40 crianças
saudáveis durante 22 meses, os autores sugerem que em contraste com a colonização bucal
19
Revisão da Literatura
por Candida spp em adultos, a colonização em crianças parece ser inconsistente, sugerindo
que essas espécies são colonizadores transitórios nesta população.
Em um estudo feito por KLEINEGGER et al., 1996 comparando grupos de
indivíduos de diferentes idades, variando de 5 meses a 60 anos, demonstrou-se que a
freqüência e variações genéticas de Candida a/bicans é particular de cada idade. Mudanças
na prevalência de leveduras orais ao longo da primeira infância ocorre devido a mudanças
simultâneas no desenvolvimento da microbiota bucal (RUSSELL & LA Y, 1973)
2.4 ASSOCIAÇÃO ENTRE CÁRIE E LEVEDURA
A cárie dental é considerada uma doença infecciosa e multifatorial. Os
estreptococos do grupo mutans, principalmente Streptococcus mutans, são considerados os
principais agentes etiológicos da doença cárie, sendo que lactobacilos e outros
microrganismos participam da progressão da doença (LOESCHE, 1993).
Na dentição decídua, a cárie dental está entre os mais prevalentes problemas
relacionados à saúde de bebês e criança durante a primeira infância (SCHEMMEL et a/.,
1982).
No Brasil, a prevalência de cavidades de cárie em relação à idade das crianças
tem sido estimada em 10% aos 12 meses de idade; 50% aos 36 meses (MORlTA et a/.,
1993); 11% na faixa etária entre O e 2 anos e 26% na faixa etária entre 3 e 4 anos (TOMIT A
et a/., 1996). Ainda, em um estudo realizado com 322 crianças entre 6 e 36 meses de idade,
20
Revisão da Literatura
observou-se uma prevalência de cárie em 0% na faixa etária de 6 a 12 meses, 3% de 13 a 18
meses, 14% de 19 a 24 meses, 38% de 25 a 30 meses e 48,5% em crianças de 31 a 36
meses de idade (MATTOS-GRANER et al., l 996),
Leveduras são mais prevalentes na saliva e biofilme dental de indivíduos cárie
ativos, do que em livres de cárie (KRASSE l 954; HODSON & CRAIG, 1972; GÁBRJS et
al., 1999; RADFORD et al., 2000). Entretanto, não está estabelecido se leveduras orais
desempenham algum papel na etiologia da doença cárie.
A associação entre quantidade de fungos e atividade cariogênica foi amplamente
estudada por GLASS (1985); RUSSEL et al., 1991, e estes autores demonstram a presença
de espécies de Candida spp em cáries dentais e estruturas circunvizinhas, tais como
gengiva, placa e canal radicular. Com o intuito de avaliar a correlação de leveduras com o
risco de cárie, os mesmos constataram elevada freqüência de Candida spp em lesões de
cárie, sugerindo que tais eventos biológicos atuem como reservatório para essa levedura.
Múltiplas lesões de cárie dental podem representar um fator de risco adicional
para proliferação de leveduras na cavidade oral. HODSON & CRAIG, (1972) relataram
maior prevalência de Candida spp, em particular Candida albicans na presença de lesões
de cárie. No estudo de RADFORD et al., 2000 a freqüência de isolados de Streptococcus
mutans, lactobacilos e leveduras foi significativamente maior em crianças com cárie em
relação às livre de cárie.
MO ALI C et al., 2001, realizaram um estudo epidemiológico em 355 estudantes
com idade média de 21,3 anos, para determinarem a relação potencial entre a presença de
21
Revisão da Literatura
Candida albicans na cavidade bucal e o estado de saúde dental e encontraram uma relação
positiva entre a presença de cárie e a densidade de Candida albicans.
SAMARANA Y AKE et al., 1986 observaram que a redução do pH causada pela
produção de ácidos por Candida albicans ativa a produção de suas proteases ácidas,
fosfolipases e colagenases, enzimas estas que facilitam a aderência e possibilitam a
subseqüente invasão tecidual pelo fungo. Os ácidos produzidos por Candida spp são
acetato, piruvato, formato e propionato, os quais mostram toxidade tecidual direta.
KAMINISHI et al., 1986 relataram a produção de enzimas colageno!íticas por Candida
albicans e HAGIHARA et ai., !988 mostraram que tais enzimas podem estar envolvidas no
desenvolvimento da cárie.
A recuperação de Candida de indivíduos cárie ativos tem sido extensivamente
estudada em portaadores de doenças imunológicas, incluindo diversas síndromes, AIDS,
diabetes e câncer, já que essa população sofre freqüentemente de lesões buco-dentais, com
tendência a apresentarem múltiplas cavidades de cárie e maior prevalência de Candida spp
na cavidade bucal, favorecendo o surgimento de candidoses (JACOB et ai .. 1998). São
poucos os estudos que relacionam o saprofitismo bucal por espécies de Candida e o estado
de saúde dental em indivíduos saudáveis.
As causas para a presença de Candida spp em portadores sadios são ainda pouco
conhecidas. Vários fatores parecem contribuir para o surgimento intraoral dessas leveduras,
entre eles: qualidade da dieta (BASU et a!.. 1961 ), deficiências nutricionais (JENKINS et
a!., 1977), higiene oral (JORGE et al., 1987) alterações do fluxo salivar e desordens
22
Revisão da Literatura
sistêmicas (STENDERUP, 1990). Apesar do grande número de pesquisas sobre cárie, há
poucos registros sobre Candida spp na microbiota do biofilme dental (R.A..MS & SLOTS,
1991 ).
2.5 FATORES DE VIRULÊNCIA
Os mecanismos que determinam a patogenicidade do gênero Candida não estão
ainda totalmente esclarecidos. V árias hipóteses tem sido sugeridas: fatores intrínsecos das
espécies e amostras, aderência aos tecidos, dimorfismo, composição da parede celular e
produção de toxinas e enzimas proteolíticas (ODDS, 1987; GHANNOUM & ABBU
ELTEEN, 1990). A patogênicidade das espécies de Candida resultam de características
próprias das cepas em questão e do estado imunológico do hospedeiro, assim como as
condições locais dos sítios de infecção são de extrema importãncia (SAMARANA Y AK.E &
MacFARLANE, 1990; OKSALA, 1990).
Dentre as espécies de Candida, a reconhecida como mais patogênica é Candida
albicans, assim como outras espécies desse gênero, elas secretam enzimas proteolíticas que
podem degradar, destruir ou transformar constituintes da membrana celular do hospedeiro
induzindo a uma disfunção e ou destruição física, sendo que a invasão das células dos
tecidos do hospedeiro por tais microrganismos, implicam em penetração e danos ao
envelope externo celular sendo esse processo mediado por meios fisicos e enzimáticos ou
ainda pela combinação de ambos (SAL YES & WITT, 1994).
23
Revisão da Literatura
RUCHEL et a!., 1982 relataram que os fatores de virulência de Candida
albicans estão relacionados com a produção de hialuronidase, condroitina sulfatase,
proteinase e fosfolipase. Esses fatores podem ocorrer de maneira conjunta ou separada,
determinando a intensidade da virulência. Essas enzimas são consideradas essenciais para a
virulência, sendo as proteinases que hidrolisam peptídeos vinculados à membrana (HUBE,
1998) e fosfolipases que hidrolisam fosfolipídeos (!BRAHIM et al., 1995) as principais.
Tendo como componentes da membrana os fosfolipídeos e proteínas, essas enzimas, estão
provavelmente envolvidas na ruptura da membrana celular, processo que ocorre durante a
invasão das células ou tecidos do hospedeiro (MAHMOUD, 2000). Pelo fato de clivar os
fosfolipídeos, desestabilizam a membrana resultando em lise celular (SAL YERS & WITT,
1994).
2.6 FOSFOLIPASE
O termo fosfolipase refere-se a um grupo heterogêneo de enzimas com
capacidade de hidrolisar uma ou mais ligações ésteres nos glicerofosfolipídeos (ANSELL
& HA WTHORNE, 1966). Alguns estudos evidenciam que as fosfolipases também atuam
nos sinais de transdução, estimulação das células do hospedeiro em liberar citocinas e
influenciam na resposta inflamatória. Muitos lipídeos e produtos derivados causados pela
ação da fosfolipase em fosfolipídeos da membrana da célula do hospedeiro, são implicados
como mediadores ou segundo mensageiro dos sinais de transdução (DENNIS et a!., 1991;
SERHAN et al., 1996).
24
Revisão da Literatura
A produção de citocinas em resposta a enzimas como fosfolipase também
descrita por LEIDICH et a!., 1998, tem sido demonstrada como um potente agente
inflamatório, induzindo ao acúmulo de células inflamatórias, proteínas plasmáticas e na
liberação de vários mediadores inflamatórios "in vitro" (MEYERS & BERK, 1990).
Segundo PRICE & CA WSON, (1977) a fosfolipase comum em muitos animais,
plantas e células microbianas, são freqüentemente encontradas na membrana da célula ou
em vesículas ligadas às membranas.
PRICE et al., 1982, descreveram um método prático para a detecção de
fosfolipase produzida por C. albicans. Eles propuseram que a gema de ovo, um substrato
com grande quantidade de fosfolipídeos, fosse incorporado ao meio Agar-Sabouraud
dextrose. Quando os isolados de Candida fosfolipase positivos eram cultivados neste meio,
produziam uma zona de precipitação ao redor das colônias e para quantificar a atividade
enzimática, media-se o diãmetro da colônia e dividia-se pelo diãmetro da colônia mais a
zona de precipitação em tomo das colônias de Candida fosfolipase positiva. O halo de
degradação provavelmente se originaria da formação de complexos de cálcio que os ácidos
graxos realizam pela ação da fosfolipase sobre o fosfolipídeo presente na gema do ovo
(MacFARLANE & KNIGHT, 1941). Este método de cultivo das amostras tornou-se
tradicional para a determinação dessa enzima em espécies de Candida
(SAMARANAYAKE et al., 1984; WLLIAMSON et al., 1986; HÃNEL et al., 1988;
LANE & GARCIA 1991; CANDIDO et al., 2000).
25
Revisão da Literatura
SAMARANA Y AKE et al., 1984 demonstraram que o cultivo de Candida spp
em Ágar Sabouraud enriquecido com gema de ovo, a produção da fosfolipase é detectada
somente com limites de pH em torno de 3.6 a 4.7. O mesmo estudo, demonstrou que
ocorreu uma supressão na atividade dessa enzima quando foram adicionados ao meio de
cultura carboidratos como sucrose e galactose. Um terceiro carboidrato, a glucose, lambem
foi testado, o que resultou em zonas de precipitação indistinguíveis e num segundo
momento, quando aumentou a concentração desse carboidrato ocorreu um completo
desaparecimento das zonas de degradação de todos os isolados testados. Pelo fato da gema
de ovo acrescido ao meio conter substratos para fosfolipases, que quebram fosfolipídeos e
para lipases que quebram triglicerídeos, esse meio enriquecido não é específico e portanto
deve ser usado apenas em pesquisas iniciais (FU et al., 1997).
Sendo a capacidade de produzir fosfolipases considerada como uma importante
característica de patogenicidade, alguns pesquisadores têm sugerido que essa propriedade
pode ser explorada como um critério para biotipagem de Candida albicans (PRICE et al.,
1982; SAMARANA Y AKE et al., 1984; CANDIDO et al., 2000).
As quantidades de fosfolipases produzidas pelos isolados de C. albicans variam
bastante, em um estudo feito por WILLIAMSON et al., 1986 envolvendo 100 isolados
orais de C. albicans, apenas 6% não produziram fosfolipase enquanto que os demais
demonstraram vários níveis de atividade, variando os valores de PZ de 0,3 a 0,9. No de
SAMARANA Y AKE et al., 1984 avaliaram 41 isolados de Candida spp e constatou-se que
79% de cepas de C. albicans produziam essa enzima, enquanto que as cepas de C.
tropicalis, C. glabrata e C. parapsilosis não as produziam.
26
Revisão da Literatura
Analisando amostras de C. albicans isoladas de gestantes, MAFFEI (1996),
constatou que 51,1% das cepas eram fosfo1ipase positivas, SOUZA et al., 1990, analisando
amostras dessas levedura, sorotipos A e B, verificou que 73,3% das amostras testadas eram
produtoras dessa enzima e SHIMIZU (1989) pesquisando diversas espécies de Candida spp
verificou que 100% das cepas de C. albicans eram fosfolipase positivas. PENHA et ai.,
2000, verificaram que em cepas isoladas da cavidade oral de pacientes com e sem
estomatite de dentadura (DS), o índice de cepas com atividade enzimática positiva foi de
83,3%, sendo que não se encontrou diferença na produção dessa enzima em relação aos
aspectos clínicos observados nos dois grupos.
HANNULA et al., 2000 comparando fatores de virulência de C. albicans e C.
dubliniensis, isoladas de pacientes saudáveis e com candidíase crônica, verificaram que
52% e 60% dos isolados produziram fosfolipase respectivamente. CANDIDO (1991)
relatou que 96,6 % das amostras de Candida albicans da cavidade oral apresentam
atividade de fosfolipase e quando comparou amostras de pacientes com lesões bucais
características de candidose e de indivíduos clinicamente normais, verificou-se que 83,3% e
71,9% das amostras apresentaram atividade para fosfolipase em cepas isoladas de cavidade
oral com e sem lesões respectivamente.
Em um estudo de IBRAHIM et al., 1995 foram comparados 11 isolados de C.
albicans do sangue e 11 isolados da cavidade oral de indivíduos clinicamente sadios e
constatou-se uma produção significativamente maior de fosfolipase nos isolados do sangue
em relação aos demais analisados. Nesse mesmo estudo, para avaliar a correlação entre
atividade de fosfolipase e patogenicidade, foram testados 9 isolados de C. albicans do
27
Revisão da Literatura
sangue que expressavam fatores de virulência incluindo produção de fosfolipases,
proteinases, aderência, germinação, disseminação em ratos e habilidade de danificar células
endoteliais. Comparando a mortalidade de ratos infectados com cada um desses isolados,
foi determinado que somente a fosfolipase extracelular foi motivo de mortalidade.
As fosfolipases foram caracterizadas em A, B, C e D e usadas para indicar a
ligação específica que é quebrada na molécula de fosfolipídeo (ANSELL &
HAWTHORNE, 1964). Segundo NIEWERTH & KORT!NG (2001) diferentes grupos e
subgrupos de fosfolipases tem sido detectados e essas diferentes enzimas estão relacionadas
com vários tipos de agressão e ação defensiva do hospedeiro. Em Candida albicans vários
grupos de fosfolipase foram relatados, dentre eles a fosfolipase A, B, C, D, a lisofosfolipase
e a lisofosfolipase- transacilase.
O sitio de formação da fosfolipase A (PLA), sugere o papel desta enzima no
crescimento da célula e possivelmente na formação do tubo germinativo, por hidrolisar
fosfolipídeos da célula e da membrana intracelular (PUGH & CA WSON, 1975). A
produção desta enzima varia bastante durante o ciclo celular e está localizada na fração
microsomal da C. albicans (MAGO & KHULLER, 1990).
BANNO et al., 1985 detectou a presença de fosfolipase B (PLB) em filtrados
de cultura de C. albicans. O pH ótimo para sua atividade é em tomo de 4,0- 5,0 e ela pode
ser identificada como a principal fosfolipase secretada por cepas patogênicas dessa espécie
(IBRAHIM et al., I 995).
28
Revisão da Literatura
A fosfolipase C (PLC) tem atividade máxima em torno de um pH de 7,5 e
segundo BENNETT et al., 1998 sua atividade é maior na fase hifal em relação à fase
leveduriforme. A fosfolipase D (PLD) é estimulada quando cultivada em concentrações
elevadas de galactose ou acetato, mas é inibida quando em presença de glicerol. Sua
atividade é estimulada durante a fase de dimorfismo da célula (McLAIN & DOLAN,
!997). Já a lisofosfolipase tem como ação metabolizar a lisolecitina tóxica, produto da
fosfolipase sendo que sua maior atividade é na fase leveduriforme em comparação com a
fase micelial (BANNO et al., 1985) e a lisofosfolipase-transacilase é isolada de ambas as
formas, !eveduriforme e micelial, sendo que elevados níveis de produção desta enzima,
podem estar associados com o aumento da aderência dessa levedura em células do
hospedeiro.
Esse grupo de fosfolipases em C albicans, são fatores patogênicos de
importância multifatorial e a divisão em subgrupos de fosfolipase e seus efeitos particulares
promovem conhecimento em relação às suas funções, agressão versus fatores de defesa e
interação com tecidos do hospedeiro na infecção e invasão destes, gerando lesões
características de candidoses (NIEWERTH & KORTING, 2001).
2. 7 PROTEINASES
As proteinases produzidas por C albicans também são indicadas como um dos
principais fatores de virulência nas espécies patogênicas. Esta enzima pode ser secretada e
ou, pode apresentar-se como proteinase aspartil, associada à membrana da célula, a qual é
29
Revisão da Literatura
predominantemente expressa na maioria das espécies patogênicas do gênero Candida (RA Y
etal., 1991)
STRi\IB (1965), foi o primeiro a demonstrar a presença da proteinase ácida em
Candida albicans e, posteriormente REMOLD et al., 1968 conseguiram purificar essa
enzima. Esse mesmo autor também demonstrou aumento na virulência de cepas
proteolíticas em relação às não proteolíticas em experimentos com cobaias, promovendo a
primeira associação dessa enzima com cepas virulentas.
Vários estudos de caracterização e sistemas de purificação desta enzima tem
revelado que a atividade proteolítica ácida extracelular de C. albicans é atribuída à aspartil
proteinase ácida que é um polipeptídio único de cadeia manoproteina com massa molecular
de 41 kilodalton (entre 40 e 45) com atividade ótima em níveis de pH entre 2,2 e 4,0, sendo
que sua atividade máxima está em tomo de pH 5,5. Geralmente essa aspartil proteinase é
inativada em pH neutro e irreversivelmente desnaturada sob condições alcalinas (pH 7.5 a
8.5) e possui afinidade à diversos substratos como albumina, hemoglobina, caseína, IgA
(cadeia pesada) queratina e colágeno desnaturado (RUCHEL, 1981; NEGI et al., 1984;
RA Y & P A YNE, 1990). A aspartil proteinase secretada (SAP), é produzida pela maioria
das cepas de Candida albicans (RUCHEL et al., 1982) assim como por Candida
stellatoidea e Candida tropicalis e somente ocasionalmente e em menor quantidade, por
Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida glabrata e
Candida pseudotropicalis (MacDONALD, 1984; RUCHEL & BONING, 1983).
30
Revisão da Literatura
Para induzir a secreção dessas enzimas proteolíticas, vários meios de cultura
enriquecidos com diferentes proteínas foram sugeridos. A secreção é pequena em meios
contendo fontes de nitrogênio simples (aminoácidos ou sais de amônia), mas é elevada
quando a única fonte de nitrogênio é uma proteína. A glicólise das fontes de carbono
(açúcares) promovem acidificação no meio, gerando um pH ácido obrigatório para sua
atividade (RA Y & WUEPPER, 1976). As enzimas são secretadas "in vitro", quando os
microrganismos são cultivados na presença de proteínas exógenas (Albumina do Soro
Bovino- BSA é o mais utilizado) como fonte de nitrogênio (ANGIOLELLA et a!., 1996;
DOUGLAS, 1988; HOMMA et a!., 1992; RA Y & PA 1-'NE, 1990). Entretanto, essas
proteínas exógenas no meio de cultura, não são essenciais para indução das proteinases, o
pH do meio possui atividade direta sob a síntese dessas enzimas, e não um efeito
secundário (HOMMA et a!., 1992). Em alguns casos, a indução da SAP por Candida
albicans parecem envolver sinais de transdução, evento que ocorre a nível de membrana
plasmática (LERNER & GOLDMAN, 1993).
Dentre os métodos utilizados para analisar cepas virulentas, o método de cultivo
em placa, descrito por RUCHEL et a!., 1982, que consiste em cultivar as amostras em meio
sólido enriquecido com albumina, tem sido bastante usado em pesquisas científicas, visto
que a atividade enzimática das proteinases pode ser utilizada como marcador do potencial
de virulência (MacDONALD, 1984; SONO et a!., 1992; GRANNOUM & ABU-ELTEEN,
1986; PENHA et a!., 2000; CANDIDO et a!., 2000).
A frequência na produção de proteinases por cepas de C. albicans, pode variar
bastante. PENHA et al., 2000, analisando amostras dessa levedura proveniente da cavidade
31
Revisão da Literatura
oral verificou que 100% eram proteinases positivas. CHAK.RABARTI et ai .. 1991
trabalhando com amostras provenientes de diversos sítios anatômicos observou que a
atividade enzimática de cepas de C albicans para produção de proteinases, variavam de
44,4% a 84,6% dependendo do sítio de origem.
CANDIDO et a!., 2000 comparando a atividade enzimática de cepas de C
albicans isoladasda cavidade oral de pacientes com e sem lesões bucais características de
candidíase relataram que 66,7% e 68,7% foram positivas para proteinase respectivamente
nos grupos com e sem lesão.
WU et a!., 1996 reportam que C. albicans isoladas de pacientes com infecções
por HIV, foram mais proteoliticas do que aquelas provenientes de pacientes saudáveis. Da
mesma forma, isolados obtidos de pacientes com candidíase foram mais proteolíticos que
os provenientes do mesmo sítio de portadores assintomáticos (CASSONE et ai., 1995).
OLLERT et al., 1995 trabalhando com amostras da cavidade oral de voluntários HIV
positivos e HIV negativos, constataram que todos os isolados foram proteolíticos, embora
os valores de PZ, tenham demonstrado que isolados provenientes do primeiro grupo eram
mais proteolíticos em relação ao grupo controle.
Estudos com o genoma de C. albicans, demonstraram que essa levedura contém
pelo menos !O genes distintos que codificam a aspartil proteinase extracelular (MONOD et
a!., 1994; NIIMI et ai., 1997). Cada SAP parece ter um papel específico, ou uma fase em
que é mais ativa, assim. SAPS 1-3 contribuem em causar danos ao tecido do epitélio em
pacientes com candidíase oral e ou candidíase da orofaringe em pacientes infectados por
32
Revisão da Literatura
HIV (SCHALLER et a!., 1990; SCHALLER et a!., 1999). Os genes codificados como SAP
1 e 2, respectivamente são freqüentemente expressos na candidíase vaginal (DE
BERNARDIS et al., 1999), enquanto que experimentos com cepas mutantes de Candida
albicans - onde SAPs 4, 5 e 6 foram eliminadas- essas células mostraram maior facilidade
em serem fagocitadas por macrófagos em relação a cepas parentais (BORG-VON
ZEPELIN et al., 1998).
Em estudos feitos por HUBE et al., 1994 e WRITE & AGABIAN (1995),
observou-se que uma única isoenzima, SAP2 é necessária e suficiente para o crescimento
de Candida albicans em meio contendo proteína como única fonte de nitrogênio. Algumas
propriedades da SAP2 têm sido demonstrada "in vitro" e foi constatado que a matriz
extracelular e proteínas da superficie do hospedeiro, como, queratina, colágeno,
fibronectina e mucinas, são eficientemente degradadas por SAP2, assim como as proteínas
de defesa do hospedeiro, como lactoferrina da saliva e imunoglobulinas como IgA
secretora, que são resistentes a proteinases de muitas bactérias, podem também ser
hidrolizadas por SAP2 (RUCHEL et a!., 1992; HUBE, 1996; HUBE, 1998).
O papel das SAPs, pode ser unicamente digerir proteínas do hospedeiro para
promover nitrogênio para a célula. A SAP2, capacita o microrganismo a se desenvolver em
meios contendo albumina do soro ou outras proteínas como fonte de nitrogênio, o que
contribui para adesão aos tecidos do hospedeiro e invasão, por degradar proteínas da
membrana celular (HUBE & NAGLIK, 2001)
33
Revisão da Literatura
Diferentes SAPs possuem variações de pH-ótimo para sua atividade (BORG
VON ZEPELIN et ai., 1998), sendo que SAP2 atua melhor em pH ao redor de 4.0. SAPs 4
- 6 são significativamente ativas em pH fisiológico, já SAP3 é pouco ativa em pH 2.0,
sugerindo que essa variação na atividade proteolítica relacionada com variações de pH,
pode ser essencial para adaptação específica de SAPs de Candída a/bícans em diferentes
ambientes do hospedeiro. Além disso, a capacidade dessa espécie de produzir ácidos em
ambientes circunvizinhos, propicia micronichos com pH ótimo durante a infecção e essas
propriedades, podem ser essenciais para a atividade dessa levedura em infecções da mucosa
ou na cavidade ora! (HUBE & NAGLIK, 2001)
O fato dessa família de genes estar presente somente nas espécies mais
patogênicas de Candída spp, dentre elas: C. albícans (MAGOE et ai., 1993), C.
dubiíníensís (GILFILLAN et al., 1998), C. parapsílosís (MONOD et al., 1994) e ausente
em leveduras não patogênicas como S. cerevísíae, sustenta a hipótese dessas enzimas
estarem envolvidas no papel da virulência.
Estudos envolvendo analise enzimática utilizando-se dessas enzimas de
virulência, tem sido proposto para biotipagem de C. albícans (CANDIDO et al., 2000).
Atualmente, em adição a esses métodos tradicionais, tem se tornado importante a
genotipagem desses patógenos, através de métodos moleculares. Desta forma, a
patogenicidade, a transmissibilidade entre indivíduos, o desenvolvimento de resistência,
dentro de uma mesma linhagem, podem ser melhor definidos (BECKER, 2000; PF ALLER,
2000)
34
Revisão da Literatura
2.8 MÉTODOS PARA T!PAGEM MOLECULAR
Métodos quimiotaxonômicos buscam estabelecer as relações de afinidade entre
diferentes linhagens através da comparação das composições químicas de diversas
estruturas celulares, como: polissacarídeos, proteínas, ácidos nucléicos, enzimas, etc.
Entretanto, métodos com base na genética molecular objetivando genes específicos, têm
sido bastante usado em pesquisas com microrganismos para se ampliar a identificação
desses (CANGELOSI et ai., 1994). Dentre elas, a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
é uma técnica importante que envolve a síntese "in vitro" de milhões de cópias de um
segmento específico de DNA. A técnica de PCR é baseada na amplificação enzimática e
anelamento de "primers" (iniciadores a partir da terminação 5 ') que delimitam as
seqüências de DNA de dupla fita que se deseja amplificar (SAIKI et ai., 1988). Esses
"primers" são sintetizados artificialmente de modo que as seqüências de nucleotídeos sejam
complementares àquelas que flanqueiam a região que será amplificada. Os produtos de
amplificação, "amplicons", podem ser separados por eletroforese em gel de agarose ou
poliacrilamida.
Dentre as diferentes aplicações da PCR, a técnica de AP-PCR (Reação da
Cadeia em Polimerase com "Primers" arbitrários) é um método bastante empregado, em
estudos sistemáticos ou epidemiológicos. Nessa técnica, somente um único prímer arbitário
é empregado enquanto na técnica de PCR clássica dois prímers que codificam urna
seqüência conhecida são empregados (WELSH & McCLELLAND, 1990).
35
Revisão da Literatura
WILLIAMS et a/., 1990 relataram que a diferença de apenas um par de bases
(mutações pontuais) são suficientes para causar a não complementaridade do primer com a
fita molde, o que impede a amplificação do segmento. Outras fontes de polimorfismo
podem incluir deleções ou inserções nos sítios de ligação do primer que aumentam as
distâncias a serem percorridas pela Taq polimerase. Desta forma, o polimorfismo genético
detectado através dos marcadores AP-PCR (polimorfismo do DNA amplificado ao acaso)
tem uma natureza binária, podendo o segmento amplificado estar presente ou ausente. O
aparecimento de bandas e!etroforéticas permite a observação da natureza molecular do
polimorfismo genético pesquisado.
O poder de caracterização de linhagens de uma mesma espécie de Candida
através do uso de primers arbitrários, foi demonstrado por HOLMBERG & FEROZE
(1996), que obtiveram diferentes perfis de bandeamento e1etroforético, para "amplicons" de
diversas linhagens de Candida albicans. Em um estudo conduzido por MILAN et al., 1997
observou-se que diversos isolados clínicos presuntivamente identificados como C.
guilliermondii, na realidade apresentavam grande semelhança com C. fermentati. Esses
autores apontam para o fato de que a técnica de AP-PCR permite discriminações bastante
precisas na caracterização dessas leveduras ao nível de espécie.
A capacidade de distinguir entre isolados distintos da mesma espécie de
Candida é essencial para o conhecimento dos biótipos existentes e para fins
epidemiológicos. Esse tipo de análise pode promover informações valiosas acerca da
relação entre isolados da mesma espécie de Candida em diferentes sítios no mesmo
indivíduo ou em uma determinada população (MELO et al., 1998).
36
Revisão da Literatura
HANNULA et al., 2000, investigando clonalidade de C. albicans em pacientes
com e sem comprometimento imune, não verifica nenhuma diferença significativa na
distribuição dos genótipos entre pacientes saudáveis e doentes, sendo cada indivíduo
portador de apenas um único genótipo de C. albicans. Da mesma forma, XU et al .. 2000
usando a técnica PCR fingerprinting, com 5 primers diferentes, não encontraram diferença
genética significante entre o número de genótipos dos dois grupos HIV positivo e negativo,
no entanto, DIAS-GERRA et ai., 1997 através da cariotipagem, encontraram uma grande
diversidade clonal de C. albicans entre isolados provenientes da orofaringe de voluntários
HIV positivos que portavam candidíase.
KAM et ai., 2002 analisando cepas comensais provenientes de diferentes sítios
do corpo de indivíduos saudáveis a fim de avaliar o padrão de distribuição e de cepas destas
espécies intra e entre os indivíduos, verificou que um único hospedeiro pode portar
múltiplas espécies ou múltiplos genótipos da mesma espécie, no mesmo, ou em diferentes
sítios do corpo.
Para examinar os padrões de similaridade genética de cepas de C. a/bicans
patogênicas inter e intra grupo, mulheres HIV positivas, grávidas saudáveis e mulheres HIV
negativas, foram comparadas. Os três grupos demonstraram diversidade genotípica, no
entanto, não houve diferença significativa na média do número de linhagens clonais entre
os três grupos, independente das condições do hospedeiro, relatando que um único
hospedeiro pode ser colonizado com múltiplos genótipos da mesma espécie no mesmo sítio
ou em sítios diferentes, indicando um processo dinâmico de colonização por leveduras em
mulheres (XU et al., 1999).
37
Revisão da Literatura
No estudo de BOERLIN et al., 1996, isolados de C. albicans provenientes da
oro faringe de pacientes saudáveis e com HIV, foram tipados por multilocus enzime
eletrophoresis (MLEE) e os resultados obtidos mostraram que a maioria (exceto um
paciente) portavam uma única linhagem clonal de C. albicans na orofaringe. No entanto,
HOWELL et al ... !996 comparando a similaridade genética de C albicans proveniente de 4
pacientes usando as técnicas RFLP (restriction fragment length polymorphism) e RAPD
(Randon amplification of polymorphic DNA), observou a presença de mais de um genótipo
em alguns indivíduos.
Em um estudo epidemiológico, realizado por SCHIMJD et al., 1995 onde usou
se a sonda Ca3 para analisar 266 isolados de C albicans obtidos de infecções,
provenientes de 12 regiões geográficas específicas, em 6 países, encontraram que 37%
destes isolados formavam um único cluster geneticamente homogêneo e o restante dos
isolados foram geneticamente diversos. Esses autores sugerem a ocorrência de um
genótipo geograficamente disseminado que age como um agente etiológico predominante
em todas as formas de candidiase e em todas as categorias de pacientes. Já MEHTA et al.,
1999 analisaram 28 indivíduos sistemicamente saudáveis, pertencentes a 12 famílias em
relação à presença de C. albicans proveniente da cavidade oral e das fezes e através da
genotipagem dessas cepas por DNAfzngerprinting, demonstrou que diferentes famílias não
compartilhm as mesmas cepas, no entanto, dois ou mais membros da mesma família
comumente as compartilham.
A descoberta de um grupo de cepas de C. albicans geneticamente mais bem
sucedidos que outros genótipos, numa população variada de pacientes e tipos de infecção já
38
Revisão da Literatura
foi relatada por vários autores e não foi uma surpresa, dada as evidências do modo clonal
de reprodução de C. albicans (ODDS, 1988; CAUGANT & SANDVEN, 1993;
TIBA YRENC, 1997). A reprodução clonal de um organismo permite que ele se adapte ao
ambiente, linhagens clonais separadas podem evoluir, cada qual para uma adaptação em um
nicho ecológico particular, se tal nicho for estável. Em contraste a reprodução clonal deixa
o organismo exposto a freqüentes alterações em seu meio ambiente, que então, responde
com a evolução e seleção, baseado em sua adaptibilidade a uma variedade de nichos
(WHITTAM et al., 1983; TIBAYRENC & AYALA, 1988; FOX et al., 1996;
HERMANUTZ & WEAVER, 1996; JACOBSEN & FORBES, 1997; SEMLITSCH et al.,
1997).
Com base nos dados obtidos da literatura citada, estudos que venham a
relacionar fatores de virulência de Candida albicans em indivíduos cárie ativos e livres de
cárie, e relacionar características fenotípicas ( enzimotipagem) associadas a métodos de
ti pagem molecular, poderam contribuir para um maior conhecimento dessas enzimas como
fatores de virulência.
Cabe mencionar que a escassez de pesquisas envolvendo fatores de virulência e
genotipagem de Candida albicans em crianças cárie ativas e livres de cárie, limita maiores
especulações. Contudo, essa escassez de dados que envolvem a natureza destas
especulações, despertou nosso interesse e foi objetivo da nossa atual pesquisa.
39
Proposição
3 PROPOSiçA'o
O presente estudo tem como propósito:
• analisar e comparar a produção das enzimas fosfolipases e proteinases de
Candida albicans isoladas de crianças com faixa etária de 24 a 36 meses
divididas em dois grupos, cárie ativos e livres de cárie;
• comparar as características fenotípicas quanto a produção dessas enz1mas
(através da enzimotipagem) com a diversidade genotípica (através do método
molecular AP-PCR) entre os dois grupos estudados;
• verificar o comportamento dos diferentes genótipos quanto à produção de
proteinases e fosfolipases;
• analisar a diversidade genotípica intra indivíduos e entre indivíduos nos dois
grupos estudados.
41
Metodologia
4 METODOLOGIA
4.1 PROCEDÊNCIA DAS CEPAS
Na presente pesquisa, foram utilizadas cento e cinqüenta e oito (158) cepas de
Candida albicans isoladas da cavidade bucal de crianças do município de Piracicaba, S.P.
as quais foram submetidas a tratamento odontológico na Faculdade de Odontologia de
Piracicaba (FOP-UNICAMP).
O estudo envolveu amostras recém isoladas de crianças com idade variando
entre 24 e 36 meses, de ambos os sexos, divididos em dois grupos: Cárie ativas (1 O
pacientes-104 amostras) e Livres de cárie (6 pacientes-54 amostras). As amostras foram
coletadas da saliva (S), dorso da língua (L), mucosa do palato (PAL), mucosa jugal (B) e
biofilme dental (PL ). Estas crianças não haviam sido submetidas a nenhum tipo de
tratamento com antibiótico ou outros medicamentos nos últimos seis meses antecedentes a
coleta.
4.2 COLETA DAS AMOSTRAS
Amostras da saliva não estimulada foram coletadas de todas as cnanças
utilizando-se um swab de algodão estéril, mantendo-o I O segundos embaixo da língua
(OLLILA et al., 1997). Para coleta das amostras da mucosa bucal (dorso da língua, palato
duro e mucoda jugal) um swab de algodão estéril, previamente umedecido em salina estéril
foi passado várias vezes em movimentos rotatórios, sobre a superfície bucal em particular.
43
Afetodologia
Um "pool" do biofilme dental, foi coletado com o auxílio de uma haste de madeira
esterilizada, através da raspagem do terço gengiva! das faces vestibulares dos quatro
incisivos superiores anteriores irrompidos. Imediatamente após a coleta, cada swab e haste
de madeira foram colocados em tubos estéreis contendo 1 mL de solução salina estéril a
0,9%. As amostras foram processadas no Laboratório de Microbiologia e Imunologia do
Departamento de Diagnóstico Oral da Faculdade de Odontologia de Piracicaba,
UNICAMP, obedecendo ao limite de meia hora. As coletas se deram no período da manhã,
entre 8:00 e 11:00 horas.
4.3 PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras foram submetidas à agitação por 30 segundos em um agitador de
tubos (Phoenix A T 56), para obtenção de uma suspenção uniforme. Alíquotas de 1 00 11L
das amostras da saliva, superfícies mucosas e biofilme dental foram imediatamente diluídas
em série decimal de lO-Ja lO -l em solução salina estéril a 0,9% e alíquotas de 100 11L de
cada diluição foram inoculadas em duplicata, em placas de Petri, contendo meio de cultura
Sabouraud Agar Dextrose (S DA), acrescido de 0,1 mg/mL de cloranfenicol (Quemicetina
Succinato/Carlos Erba) e incubadas aerobicamente, a 37 °C por 2 a 4 dias. Placas que
apresentaram crescimento negativo foram submetidas à incubação por mais 72 horas e
então examinadas novamente antes de serem descartadas.
Após a incubação, foram utilizados como critério para obtenção de cultura pura
das colônias de Candida spp, as características culturais (morfologia das colônias em meio
de cultura) e as características celulares (investigada através de observação microscópica de
44
Metodologia
esfregaço da colônia, corado pelo Gram). Quando na microscopia foram foram observadas
células ovaladas, grandes, Gram-positivas, com ou sem brotamento, sugestivas de Candida
spp, as colônias representativas de cada tipo morfológico sobre o meio de cultura, foram
transferidas para dois meios de cultura, simultaneamente: o meio CHROMagar Candida
(Probac do Brasil), para identificação preliminar de Candida spp, dispensados em placas de
Petri e o meio de cultura DAS/Cioranfenicol, dispensados em tubos de ensaio com rosca
(13Xl00 mm), para armazenamento das amostras e posterior especiação. Foram isoladas
até 1 O colônias, quando presentes, de cada localização bucal da criança positiva para
Candida spp. As colônias repicadas em ambos os meios foram mantidas a 37 °C por 48
horas. Após esse período, foi adicionado óleo mineral estéril sobre as colônias isoladas em
meios de cultura DAS e os tubos de ensaio foram armazenados sob refrigeração ( -20 °C).
Foram observadas a coloração e morfologia das colônias crescidas sobre o CHROMagar
Candida (Meio de cultivo cromogênico para identificação inicial de espécies de Candida
spp).
4.4 IDENTIFICAÇÃO DAS ESPÉCIES DE CANDIDA
Além da utilização do meio de cultivo cromogênico CHROMagar Candida
(Probac do Brasil), para confirmação e maior segurança no processo de identificação, as
amostras foram analisadaas observando-se a produção de tubo germinativo em soro estéril
de coelho, a presença de hifas/pseudo-hifas, células leveduriformes e clamidósporos em
Agar-fubá-tween 80 e a fermentação e assimilação de carboidratos. Para identificação
45
Metodologia
presuntiva de Candida dubliniensis, todas as amostras identificadas como Candida albicans
foram submetidas à prova de termotolerância a 45 °C.
4.5 CONSERVAÇÃO DAS AMOSTRAS
As cepas de Candida albicans (anexo) utilizadas neste estudo foram coletadas,
processadas e identificadas em pesquisa anterior (Comitê de Ética em Pesquisa, processo
127/2000) e se encontram disponíveis na Micoteca do Laboratório de Microbiologia e
Imunologia, do Departamento de Diagnóstico Oral, na Faculdade de Odontologia de
Piracicaba, da Universidade Estadual de Campinas.
As amostras encontram-se mantidas em duas coleções:
a) em tubos de cultura (13xl00 mm) contendo meio completo para levedura
MCL (anexo) e recobertas com óleo mineral estéril em temperatura ambiente;
b) congeladas a -20°C em microtubos (1,5 ml) contendo 750 microlitros da
cultura de levedura e 750 microlitros de Yeast Peptone Dextrose- YPD-Glicerol a 30%
estéril (anexo), sendo que a concentração final de glicerol foi de 15%.
Nos dois casos, antes da utilização das amostras, foram feitos exames para o
reconhecimento da morfologia celular e colonial (aspectos micro e macroscópicos,
respectivamente) para detecção de possíveis contaminantes.
46
Metodologia
4.6 TESTEDEPROTEINASEE FOSFOLIPASE
Amostras de cultura, mantidas conforme o item b foram incubadas em frascos
contendo 5 mL de meio de cultura YPD (anexo) e incubadas a 37°C durante 18 horas.
Decorrido o tempo de incubação, l ,5 mL do cultivo da levedura foram transferidos para
tubos Eppendorf e centrifugados a 3.000 rpm, por 5 minutos. Os sedimentos obtidos foram
ressuspensos em solução salina (NaCI 0,9%) e centrifugados por mais duas vezes nas
mesmas condições para remoção dos restos de meio de cultivo. As concentrações das
suspensões das cepas foram padronizadas usando-se o índice 5 da escala MacF arland
(aproximadamente lxl 06 UFC/mL) e volumes de l ).lL foram inoculados em pontos
eqüidistantes, utilizando-se de um bastão de vidro previamente adaptado, respectivamente
nos meios Ágar Fosfolipase (anexo) e Ágar Proteinase (anexo). Os testes foram realizados
em duplicata. As placas contendo 4 inóculos de diferentes cepas para detecção de
proteinase foram incubadas a 37°C durante 7 dias (RUCHEL et al., 1982) e as usadas para
detectar fosfolipase contendo 6 inóculos, cultivadas por 4 dias a mesma temperatura
(PRICE et al., 1982). A presença da enzima fosfolipase foi observada pela formação de
uma zona opaca ao redor da colônia de levedura e a atividade enzimática (PZ) foi medida
dividindo-se o diâmetro da colônia pelo diâmetro da colônia mais a zona de precipitação.
PZ foi codificada com um dígito com valores iguais a O, I ou 2 (Tabela I). A presença da
enzima proteinase foi observada pela formação de um halo transparente ao redor da colônia
de levedura e a atividade enzimática (PZ) foi medida da mesma forma, conforme descrito
acima para fosfolipase.
47
Metodologia
TABELA 1 Medidas da atividade enzimática
Valores de PZ ' Atividade Enzimática Código!Indice I ' I
I PZ-1 Negativa o
PZ;:: 0,64 < 1 Positiva-Média
i 1
PZ- 0,63 Positiva-Elevada I 2
* A medida da atividade enzimática (PZ), proposta por PRlCE et a!,, 1982.
* Zona de Precipitação (PZ) é calculada, dividindo-se o diâmetro da colônia pelo diâmetro da colônia
mais a Zona de precipitação.
4. 7 EXTRAÇÃO DO DNA
As amostras mantidas conforme o item b, foram inoculadas em frascos com 5
mL de YPD e incubadas a 37°C por 18 horas. Após esse período, 1,5 mL da cultura foi
transferido para Eppendorf (1,5 mL) e centrifugadas (HAWK 15/5 Refrigerated Sanyo
MSE) a 3.000 rpm por 5 minutos. Os sedimentos obtidos foram posteriormente lavados por
duas vezes com Tampão TE- pH 8,0 (anexo) e iniciou-se o processo de extração do DNA.
Ao precipitado de células adicionou-se 700 11L de Tampão de extração (anexo),
homogeneizou-se ao vórtex e colocou-se em Banho Maria a 65 °C por 30 minutos, sendo
que a cada 1 O minutos as amostras eram homogeneizadas por inversão manual. A seguir,
acrescentou-se 650 !lL de clorofórmio:álcool:isoamílico (24: 1 ), seguida de homogenização
até formar uma emulsão, a qual foi centrifugada (12.000 rpm, 7 minutos). Após a
centrifugação, a fase aquosa foi transferida para um novo eppendorf ( 1 ,5 mL) e adicionou-
48
Metodologia
se 200 flL de Tampão de Extração sem Proteinase K (anexo) e 650 flL de clorofómio:álcool
isoamílico (24:1), esta mistura foi homogeneizada e centrifugada (12.000 rpm, 7 minutos).
Novamente a fase aquosa foi transferida para outro Eppendorf (1,5 mL) e
recebeu 650 flL de clorofórmio:álcool isoamílico (24: l ), seguida de centrifugação (12.000
rpm, 7 minutos). O sobrenadante foi retirado e transferido para outro Eppendorf (1,5 mL).
O DNA foi precipitado com 500 J.!L de isopropanol, homogeneizado e centrifugado por 4
minutos a 12.000 rpm.
A superfície do precipitado foi lavada com 250 1-1L de etano! a 70% e colocado
em uma estufa a 37 °C, para secar por 6 horas. Passando esse tempo ressuspendeu-se o
DNA com uma solução de 40 f!L de TE com 1 O f!glml de RNAse (Sigma). A concentração
de DNA e sua pureza foram verificadas através de leitura em espectrofotômetro a 260 I 280
nm (Genesys 1 OUV).
4.8 AP-PCR (REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE UTILIZANDO PRIMER
ARBITRÁRIO)
A reação de AP-PCR utilizando-se do pnmer arbitrário AP-3
(5TCACGATGCA3') descrito por SANZ et al.,1996 foi processada segundo SAARELA
et al., 1996 na qual, cerca de 300 ng de DNA foram adicionados a urna mistura de
reagentes contendo solução tampão (lüx Reaction Buffer Taq Polymerase), 3,5 mM de
MgCL2, 0,2 mM de cada dNTP- dATP, dCTP, dGTP, dTPT (100 mM dNTP Set, PCR
Grade Invitrogen TM}, 0,4 J.l.M de primer, 2,5 U de Taq DNA Polymerase (Invitrogen TM).
49
Metodologia
Em seguida essa mistura de reagentes foi submetida a um aparelho
termociclador convencional (GeneAmp PCR System 2400-Perkin Elmer) de acordo com a
seguinte programação: desnaturação inicial a 94 °C por 5 minutos, seguida de 35 ciclos
com desnaturação a 94 °( por J minuto, hibridização do primer a 36 °C por 2 minutos e
extensão a 72 °C por 2 minutos, concluindo com extensão a 72 °C por 5 minutos.
' ' 94°C ; 94°C 72°C: 72'C
' 36°C ' 5'~ 5' ' 1' 2' ' 2' O'
FIGURA 1 - Ciclos do termociclador, processado segundo SAARELA et al., 1996.
Os produtos resultantes da amplificação por AP-PCR foram conservados a -20
0( ou foram analisados imediatamente por eletroforese em gel de agarose 1% (90V por 120
min) em tampão Tris-Borato-EDTA -pH 8,0 (anexo), sendo incluído em cada gel um
padrão de peso molecular de I 00 pb (DNA Ladder- Invitrogen ™).
Após o término de cada corrida, o gel foi corado com brometo de etídio 0,5
11g/mL e as bandas observadas com o auxílio de um transluminador de luz ultravioleta
(Pharmacia LKB- MacroVue).
50
Metodologia
4.8.1 ANÁLISE Dos PADRÕES ELETROFORÉTICOS
Os géis obtidos como resultado da aplicação da técnica de AP-PCR, foram
fotografados pelo equipamento Image Master-VDS (Pharmacia Biotech) e as imagens
capturadas pelo programa computacional LISCAP. As imagens positivas e a demarcação
das bandas eletroforéticas foram processadas através do programa Sigma Gel (Jandel CO.)
que forneceu a mobilidade relativa de cada banda (valores de Rf.) em função dos valores
conhecidos dos padrões de massa molecular.
4.8.2 CONSTRUÇÃO DE MATRIZES E DENDOGRAMASDE SIMILARIDADE
As bandas eletroforéticas, representadas pelos valores de Rf tiveram suas
distâncias de migração convertidas em valores numéricos, que receberam representações 1
(um) para presença e O (zero) para a ausência de bandas, numa comparação entre as linhas.
O conjunto dessas informações gerou uma matriz de dados binários que foi plotada no
sistema NTS YS versão l. 70 ( Ap!lied Biostatistcs) empregando-se o programa
QUALITATIVE e o coeficiente de similaridade de DICE.
Utilizando o mesmo pacote estatístico, essas matrizes de similaridade foram
transferidas para o programa SHAN CLUSTERING, onde através do método de
agrupamento UPGMA (unweighted pair-group methods with mathematic averege) foram
gerados dendogramas que possibilitaram as avaliações dos graus de similaridade existentes
e o agrupamento das possíveis linhagens clonais obtidas entre as amostras de Candida
albicans.
51
Resultados
5 RESULTADOS
Um total de 158 cepas de Candida albicans foram utilizadas no presente estudo,
das quais 54, foram isoladas de indivíduos livres de cárie e l 04, isoladas de indivíduos
cárie ativos. Todos os isolados foram submetidos a testes de atividade enzimática em
relação as duas enzimas: l- fosfolipases e 2- proteinases (Fig. 2).
FIGURA 2 -Cultivo de 4 cepas de Candida albicans em Ágar proteinase (A) e de 8 cepas de
C albicans em Ágar tosfolipase (B); Após o período de incubação, pode-se
observar zonas de degradação (A) e ou precipitação (B) ao redor das colônias de
leveduras.
Para quantificar a atividade enzimática foi utilizado o cálculo proposto por Price et
ai., 1982, que consiste em dividir o diâmetro da colônia, pelo diâmetro da colônia mais a
zona de precipitação ao redor das colônias de leveduras (Fig. 3). Tanto para quantificar a
produção de proteinase, como para produção de fosfolipase, foram usados os índices O
(zero), para aquelas que não demonstraram atividade enzimática, l (um), para cepas com
i MP 53
Resultados
atividade enzimática positiva e 2 (dois), para cepas com atividade enzimática positiva
elevada.
Negativo Positivo
Col. + Z P Col. + Z P
ZP = DC/DC+ZP
PZ = l (negativa)
PZ ?: 0,64 até 0,99 (positiva)
PZ < 0,64 (positiva elevada)
FIGURA 3- Cálculo utilizado para medir a atividade enzimática de colônias de Candida albicans,
descrito por PRICE et ai., 1982
De todas as cepas testadas (158), de ambos os grupos, cárie ativos e livres de cárie,
94 % foram positivas para produção de proteinase (incluindo índices 1 e 2) e o restante, 6%
demostraram atividade enzimática negativa para essa enzima (Fig. 4). Em relação a
atividade enzimática da fosfolipase de todas as cepas analisada (158), de ambos os grupos,
um total de 95,2% foram positivas para produção dessa enzima (incluindo índices I e 2) e
4,8% demostraram atividade enzimática negativa (índice 0), como demonstrado na figura
5.
54
Resultados
100% 100% 90% 90% 80% 80%
E 70% E 70% <l) <l)
60% "' 60% "' "' 2l 50% c 50% c
"' "' 40% 2 40% 2 o o
30% [L 30% [L
20% 20% 4Jj% -
10% 10%
O% O%
Proteinase + Proteínase - Fosfolipase+ Fosfolipase-
FIGURA 4 - Frequência de cepas de Candida FIGURA 5 - Frequência de cepas de Candida
albicans com atividade
enzimática para proteinase
positiva, incluindo índices I e 2,
e de cepas que apresentaram
atividade enzimática negativa,
índice O,
albicans com atividade
enzimática para fosfolipase
positiva, incluindo índices I e 2,
e de cepas que apresentaram
atividade enzimática negativa,
índice O,
Analisando separadamente os grupos cárie ativos (l) e livres de cárie (2), em
relação ao perfil de atividade enzimática da proteinase, pôde-se observar que 87,5% das
104 amostras testadas obtiveram índice 2 (dois), 1,9% obtiveram índice l (um) e 10,6%,
índice O (zero) para o grupo L Em relação às cepas pertencentes ao grupo dois, 94,4% de
um total de 54 amostras, apresentaram índice 2 (dois), 3,7% obtiveram índice 1 (um) e
1,9% receberam índice O (zero), (Tab, 2), Através da análise estatística realizada pelo teste
Qui- quadrado (p = 0,0309) verifica-se uma diferença estatisticamente significante apenas
para o índice O (zero), que foi maior em indivíduos cárie ativos, Para os demais índices, 1 e
2, não se observou diferença estatisticamente significativa em relação á produção da
enzima proteinase,
55
Resultados
TABELA 2 Perfil da atividade enzimática da proteinase produzida por C. alhicans,
nos grupos cárie ativos e livres de cárie
Proteinase
Cárie ativos
Livres de cárie
teste-quíL
Índice O
10,6%
1,9%
0,0133
lndice 1
1,9%
3,7%
0,4528
* Índice de significância -teste-qui Quadrado p= 0,0309
Índice 2
87,5%
94,4%
0,6066
Os resultados obtidos em relação à enzima fosfolipase para os dois grupos
estudados, acham-se expressos na tabela 3. O teste aplicado Qui- quadrado (p = 0,1419)
revelou uma diferença estatisticamente significativa apenas para o índice O (zero), que foi
maior em amostras dos voluntários cárie ativos.
TABELA3 Perfil da atividade enzimática da fosfolipase produzida por C. alhicans,
nos grupos cárie ativos e livres de cárie
Fosfolipase
Cárie ativo
livres de cárie
teste-quí2
lndice O
7,7%
1,9%
0,0586
lndice 1
22,1%
25,9%
0,5824
* Índice de significância- teste-qui Quadrado p= O, 1419
lndice 2
70,2%
72,2%
0,8649
Pode-se constatar que 89,4% e 98% das amostras totais de indivíduos cárie ativos e
livres de cáries, respectivamente, foram positivas para produção da enzima proteinase
(índices I e 2), sendo que apenas I 0,6% e 2% das cepas apresentaram atividade enzimática
56
Resultados
negativas para os grupos cárie ativos e livres de cárie respectivamente, (Fig. 6). O teste t de
Student para duas amostras independentes revelou uma diferença estatisticamente
significativa (p ~0,0248) em relação às cepas proteinase negativa (índice 0), nos dois grupos
estudados.
Verifica-se que 92,3% das amostras totais de indivíduos cárie ativos e 98% de
livres de cárie foram positivas para produção de fostolipase (índices l e 2), enquanto que
7, 7% e 2% das amostras, demonstraram atividade enzimática negativa (índice O)
respectivamente. O teste t de Student revelou diferença estatisticamente significativa (p~
0,034) em relação ao índice O (zero), que foi mais freqüênte no grupo cárie ativo (Fig. 7).
120 ·r----------------------------, 120
100 89,4 98
100 92,3 98
80 80
60 60
40 40
20 _],7
2 2 o o ·--
Protei na se + Protei na se - Fosfolipase + Fosfolipase -
* Grupos #cárie ativos e # livres de cárie * Grupos #cárie ativos e# livres de cárie.
FIGURA 6 - Porcentagem de cepas com ativi- FIGURA 7 - Porcentagem de cepas com atividade
dade enzimática da proteinase
positivas e negativas, nos grupos
cárie ativos e livres de cárie.
57
enzimática da fosfolipase positivas e
negativas, nos grupos cárie ativos e
livres de cárie.
Resultados
A técnica de AP-PCR foi utilizada para analisar a variabilidade genética
existente entre cepas de Candida a!bicans provenientes do mesmo indivíduo. A
amplificação do DNA genômico desta espécie pelo "primer" AP-3 gerou produtos de AP-
PCR variando entre 2.1 a 0,5 pb (Fig. 8).
*l-Padrão de peso molecular de l 00 pb; 2 -20 amostras de diferentes si tios da cavidade oral.
FIGURA 8 - Perfis eletroforéticos de Candida a!bicans isoladas da cavidade oral do voluntário 7.
do grupo cárie ativo.
A Tabela 4, apresenta o número de perfis genéticos de C. a!bicans encontrados em
indivíduos cárie ativos. Comparando-se os voluntários 08 e 31, é possível observar que um
número maior de cepas analisadas não implica na obtenção de um polimorfismo genético
maior. O número de perfis genético variou de 02 a 06 entre os indivíduos deste grupo.
58
Resultados
Na Tabela 5, está representado o número de perfis genéticos de C. albicans
encontrados no grupo de voluntários livres de cárie, podendo-se notar que esses números
variaram entre O 1 e 03 entre os indivíduos. Comparando os voluntários 17 e 60, observar-
se que uma maior quantidade de cepas analisadas, não implica na obtenção de maiores
números de perfis genéticos.
TABELAS Número de perfis genotípicos de C. albicans e número de cepas analisadas pela
técnica de AP-PCR em indivíduos livre de cáries
Voluntários 17 18 34 46 56
Perfis genotípicos 02 01 01 01 03
Total de cepas 14 03 09 03 16
analisadas
59
60
02
08
Resultados
A utilização do coeficiente de associação de Dice possibilitou a construção de
matrizes de similaridade para as amostras. Essas matrizes, analisadas através do método de
agrupamento UPGMA, permitiram a obtenção dos dendogramas, os quais possibilitaram as
avaliações dos graus de similaridade existente entre os isolados de Candida albicans
provenientes do mesmo voluntário
Os dendogramas representativos do agrupamento de perfis genéticos de C.
albicans encontrados em cada voluntário, estão representados nas figuras 9 a 24. Na figura
9 pode-se observar a ocorrência simultânea de seis perfis genéticos de C. albicans
encontrados na cavidade bucal do voluntário 7, pertencente ao grupo cárie ativo. Os seis
"clusters" estão representados no dendograma de similaridade.
o. o 0.3 0.5 0.8 1.0 S! Cluster 1
L3c;,~~~~;2 sz· S3 St L2 Cluster 3 PL5 Plt
,---JPL3 PL2 L5 Pal6 Pal5 Palt Pal2 L6
L------------------c:==~~P~:~!::~: PL6 Çiú~iªi~
FIGURA 9- Dendograma representativo do voluntário 7, grupo cárie ativo.
60
Resultados
Dentre o extenso polimorfismo genético demonstrado neste voluntário, destaca-
se um grupo de linhagem clonal numericamente predominante (cluster 3), distribuído em
todos os sítios analisados; na saliva (S), no dorso da língua (L), em amostras da mucosa
(Pal) e da placa dental (PL). As demais variantes genéticas apresentaram-se com
localização sítio específica.
Comparando-se os perfis genotípicos e fenotípicos (Tab.6) das cepas deste
voluntário, podemos observar que a mesma linhagem clonal, representadas pelas amostras
L2, Pal2 e Pal4, expressam perfis diferentes para produção de fosfolipase. Da mesma
forma, linhagens clonais diferentes, podem apresentar o mesmo perfil enzimático (PL6,
PL2 e Pall). Neste voluntário a atividade enzimática das proteinases, foram iguais para
todas as amostras testadas. O enzimotipo predominante foi P2 F2 (Proteinase positiva
elevada e fosfolipase positiva elevada), seguido por P2 F 1 (Proteinase positiva elevada e
fosfolipase positiva) e Pz F o (Proteinase positiva elevada e fosfolipase negativa).
TABELA6 Perfis genotípicos e enzimáticos de amostras de C. albicans do voluntário 7
Pai Pai Pai Pai Pai PL PL PL PL PL PL S1 S2 S3 S4 L2 L3 L5 L6
1 2 4 5 6 1 2 3 4 5 6
Proteinase 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Fosfolipase o 2 2 2 o 2 2 2 2 1 2 1 1 o 2 1 2 1 2
Clusters 1 3 3 3 3 2 3 3 4 3 3 3 3 5 3 3 3 3 6
* S = Saliva; L= Dorso da língua; Pai =Mucosa; PL= Placa dental
61
Resultados
Entre as duas linhagens genéticas de Candida albicans isoladas da cavidade
bucal do voluntário 8, do grupo cárie ativo (Fig. I O) a que se apresenta como
predominante, encontrou-se dispersa nos diferentes sítios bucais analisados, uma segunda
linhagem clonal apresentou-se com localização sítio específica na placa dental.
0.0 0.3 0.5 0.8 1.0 PU __ ÇJ~?te!J PL2 L2 PL6 Pal6 p al5 Cluster 2 Pal4 Pal3
......_ ___________ -1Pal2 L6 L5 L4 L3 PL3 L1 PL4 PL5
FIGURA lO- Dendograma representativo do voluntário 8, grupo cárie ativo.
Comparando os perfis genotípicos e fenotípicos dessas cepas (Tab.7), podemos
observar que a mesma linhagem clonal apresenta perfis enzimáticos diferentes para
produção, tanto de fosfolipase, como de proteinase, que pode ser evidenciado, nas cepas
Pal2, Pal4 e Pal5. O único genótipo diferente ( cluster 1 ), demonstrou atividade enzimática
semelhante a algumas cepas pertencentes ao cluster 2. O enzimotipo predominante foi P2
F2 , seguido por Po F2 (proteinase negativa e fosfolipase positiva elevada) e em menor
número pode-se observar a ocorrência de P2 F 1•
62
Resultados
TABELA 7 Perfis genotípícos e enzimático de amostras de C albicans do voluntário 8
L1 L2 L3 L4 L5 L6 Pai Pai Pai Pai Pai PL PL PL PL PL PL
2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 Proteinase 2 2 2 2 o 2 o o 2 2 2 2 o 2 o 2 o Fosfolipase 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 2 2 2 2 2 1 2
clusters 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 2 2 2 2 2
*L- Dorso da língua; Pai- Mucosa; Pl- Placa dental.
Na cavidade bucal do voluntário 15, foi possível detectar 3 variantes genéticas
de C. albicans (Fig. ll) destacando-se um grupo de linhagem clonal numericamente
predominante ( cluster 2), distribuídos no dordo da língua (L), na placa dental (PL ), na
mucosa (Pai) e na saliva (S) e duas linhagens sítio específica LI e PL5, pertencentes aos
clusters 1 e 3 respectivamente.
0.0 0.3 0.5 0.8 1.0 ·~----------~----------~~--------~~------~==~Li-ê~~er1 L2 _______ _
L3 L5 L6 Plt Pl2 Cluster 2
'------lP!l Pal5 Palt Pal3 Pal2 Pall B5 -------
'-------------- PL5__QI~'}t_er}
FIGURA 11 - Dendograma representativo do voluntário 15, grupo cárie ativo
63
Resultados
Relacionando-se os perfis genotipicos e fenotípicos destas amostras (Tab. 8),
podemos observar que a mesma linhagem clonal possue perfis diferentes para produção de
fosfolipase (ex: L2, Pall e B5), mas não difere na produção de proteinase. Da mesma
forma, amostras geneticamente diferentes, podem apresentar o perfil enzimático
semelhante, que observa-se comparando Ll, PL4 e PLS. O enzimotipo predominante foi P2
TABELAS Perfis genotípicos e enzimático de amostras de C. albicans do voluntário 15
L1 L2 L3 L5 L6 85 Pai Pai Pai Pai Pai PL PL PL PL
1 2 3 4 5 1 2 4 5
Proteinase 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Fosfolipase 2 2 2 1 1 1 o 2 2 2 2 2 1 2 2
clusters 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3
* L- Dorso da língua; B - mucosa jugal; Pai- mucosa; PL- placa dental
As amostras de C. a/bicans, isoladas da cavidade bucal do voluntário 28
demonstraram polimorfismo genético e apresentaram-se em três linhagens clonais, sendo
que todas as cepas analisadas foram provenientes da placa dental (Fig. 12).
64
0.0 0.3 0.5 0.8
Resultados
1.0 Pu--------P L 5 Cluster 1
.-------------------~PL6
,--------J P L 3 L_ ______________ PL2- ê;~s~~;;-
'---------------PL 4 --------_cJ~~t_ef? __
FIGURA 12 - Dendograma representativo do voluntário 28, cárie ativo.
Na comparação entre o genótipo e as características fenotípicas desses isolados
(Tab.9), podemos observar que diferentes linhagens clonais possuem o perfil de atividade
enzimática semelhante (PL2 e PL4), e que a mesma linhagem clonal pode apresentar
atividade enzimática diferente, mesmo estando presente no mesmo sítio (PL 1 e PL5). Neste
voluntário o enzimotipo predominante foi P2 F2, seguido por P2 F 1•
TABELA9 Perfis genotípicos e enzimático de amostras de C albicans do voluntário 28
PL1 PL2 PL3 PL4 PL5 PL6
Proteína se 2 2 2 2 2 2
Fosfolípase 1 2 1 2 2 2
clusters 1 2 1 3 1 1
* PL -Placa dental
O total de cepas de C. albicans isoladas do voluntário 31, foram agrupados em
quatro clusters diferentes (Fig. 13). A linhagem clonal predominante esteve presente na
65
Resultados
placa dental e na mucosa jugal ( cluster 1) e as demais foram encontradas apenas na placa
dental.
0.0 0.3 0.5 0.8
31 B1 Cluster 1 r--131PL6
31PLB-------,__ 31 PU·-ÇLu_s!,.r_4_
,--------------------31 PLJ_~~u_s!':~~ L--------------------31 PL5 Cluster4
FIGURA 13 - Dendograma representativo do voluntário 31, grupo cárie ativo.
Analisando os perfis genotipicos e fenotípicos (Tab. I O) das amostras deste
voluntário, podemos observar que as atividades enzimáticas para proteinase e fosfolipase
foram semelhantes para todas as cepas testadas, independentemente das características
genotípicas. O único enzimotipo encontrado foi P2 F2.
TABELA 10 Perfis genotípicos e enzimáticos de amostras de C. albicans do voluntário 31
81 PL1 PL4 PL5 PL6 PLB
Proteinase 2 2 2 2 2 2
Fosfolipase 2 2 2 2 2 2
clusters 1 3 2 4 1 1
* B= mucosa jugal; PL= placa dental.
Na cavidade bucal do voluntário 32, o total de C. albicans isoladas apresentaram
quatro perfis genotípicos diferentes (Fig. 14).
66
0.0 0.3 0.5 0.8
FIGURA 14 - Dendograma representativo do voluntário 32, grupo cárie ativo.
Resultados
1.0 PL 1 r:llr~t""-r 1
I I
PL3 _______ _
PL6 r.h!c:ct<:)r?
PL8 _______ _ Pal7 li
I p a l 9 Cluster 3 PL 4---------PalB rhrdC~or.d Pall Pal2
As linhagens clonais agrupadas nos clusters 2 e 3 apresentaram-se com
localização sítio específica na placa dental (PL) e na mucosa (Pai) respectivamente. As
amostras agrupadas no cluster 4 estiveram presentes nos dois sítios estudados e uma única
linhagem clonal ( cluster 1) foi encontrada na placa dental. Através da análise dos perfis
genotípicos e fenotípicos (Tab. 11) observa-se que as cepas com características genotípicas
iguais, podem apresentar iguais ou diferentes perfis enzimáticos. Observa-se ainda, que
cepas geneticamente diferentes, podem ter o mesmo perfil enzimático. Neste voluntário o
enzimotipo predominante foi P2 F2, seguido por P2 F1 e P2 F o.
TABELA 11 Perfis genotípicos e enzimático de amostras de C. albicans do voluntário 32
PL1 PL3 PL4 PL6 PLB Pa/1 Pa/2 Pa/7 Pa/8 Pa/9
Proteinase 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Fosfolipase 1 2 o 2 2 o 2 1 2 2
clusters 1 2 4 2 2 4 4 3 4 3
* PL~ Placa dental; Pal~ Mucosa
67
Resultados
O polimorfismo genético demonstrado representativamente no dendograma de
similaridade (Fig. 15), destaca a ocorrência de três linhagens clonais, presentes na cavidade
bucal do voluntário 33, sendo que o grupo numéricamente predominante ( cluster 2) foi
encontrado em dois sítios analisados, placa dental e mucosa jugal. As linhagens clonais,
representadas (clusters l e 3), apresentaram-se com localização sítio específica na mucosa e
na placa dental respectivamente.
0.0 0.3 0.5 0.8 1.0 PAL6 Cluster 1 PL 1 ---------81 PL3
'------1 p L 8 Cluster 2
PL5 PL 4 --------·
L-----------PL2 Cluster 3 --------~
FIGURA 15 - Dendograma representativo do voluntário 33, grupo cárie ativo.
Comparando os perfis genotípicos e fenotípicos (Tab. 12), podemos observar
que todas as cepas apresentaram perfil enzimático para a produção de fosfolipase
semelhantes, independentemente da linhagem clonal a que pertencem. Em relação a
produção da enzima proteinase, cepas geneticamente iguais apresentaram diferentes perfis
enzimáticos, como pode ser observada nas amostras Bl, PL8 e PL4, e cepas geneticamente
diferentes apresentaram perfis enzimáticos idênticos, que pode ser observada comparando-
se as amostras B l e Pal6. Neste voluntário o enzimotipo predominante foi Po Fz, seguido
68
Resultados
TABELA12 Perfis genotípicos e enzimático de amostras de C. albicans do voluntário 33
81 Pa/6 PL1 PL2 PL3 PL4 PL5 PLB
Proteinase 1 1 o o o o o 2
Fosfolipase 2 2 2 2 2 2 2 2
clusters 2 1 2 3 2 2 2 2
* B= mucosajugal; Pal= mucosa; PL= placa dental
As amostras de C. albícans, isoladas da cavidade bucal do voluntário 35,
apresentaram duas linhagens genéticas diferentes, as agrupadas no cluster 2, encontraram-
se dispersas nos diferentes sítios analisados, e uma única cepa, geneticamente diferente das
demais ( cluster I) foi detectada na placa dental (Fig. 16).
0.0 0.3 0.5 0.8 1.0 PL2 Cluster1
---------PU
'---------------------i L l Cluster 2
s 1 ---------
FIGURA 16- Dendograma representativo do voluntário 35, grupo cárie ativo.
A relação entre os perfis genotipicos e fenotípicos (Tab. 13) demonstram que,
embora todas as cepas testadas apresentem o mesmo perfil enzimático para produção de
proteinase, em relação a produção da fosfolipase esses perfis diferem. Cepas geneticamente
iguais apresentam perfis enzimáticos distintos, e cepas geneticamente diferentes podem
apresentar o mesmo perfil enzimático, como pode ser observado comparando-se as
69
Resultados
amostras PLl e PL2. O enzimotipo predominante neste voluntário foi P2 F 1, seguido por P2
F o
TABELA 13 Perfis genotípicos e enzimático de amostras de C. albicans do voluntário 35
PL1 PL2 L1 S1
Proteinase 2 2 2 2
Fosfolipase 1 1 1 o clusters 2 1 2 2
* PL= placa dental; L= dorso da língua; S= saliva
O total de amostras de C. albicans, isoladas da cavidade bucal do voluntário 59,
foram agrupados em 3 clusters diferentes (Fig. 17).
0.0 0.3 0.5 0.8 1.0
~--------------------~
LT _______ _
L1 PL2 SI Pal3 Cluster 1
Pall
PL3 PL5 PLIO PL( ________ _
L---------------------- PaJ2Ciuster 2
L-------------------------------------- Paff êTuSiêiT
FIGURA 17-Dendograma representativo do voluntário 59, grupo cárie ativo.
70
Resultados
A linhagem clonal predominante ( cluster I), encontrou-se dispersa em todos os
sítios analisados, sendo que as outras duas linhagens clonais, enquadradas nos clusters 2 e
3, encontraram-se presentes na mucosa. Na relação entre a fenotipagem e a genotipagem
(Tab. 14), pode-se observar que o perfil enzimático para produção de proteinase foi
semelhante em todas as cepas analisadas, independente da linhagem clonal a que
pertencem. Em relação a produção da fosfolipase, a mesma linhagem clonal apresentou
diferentes perfis enzimáticos que podem ser observadas comparando-se as amostras S l e
Pall, e linhagens clonais diferentes apresentaram o mesmo perfil enzimático, como visto
nas amostras Pal2 e S l. O enzimotipo predominante neste voluntário foi P2 F2, seguido por
TABELA 14 Perfis genotípicos e enzimático de amostras de C. albicans do voluntário 59
L1 L2 PL2 PL3 PL5 PL7 PL10 Pa/1 Pa/2 Pa/3 Pa/4 S1
Proteinase 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Fosfolipase 2 2 2 2 2 2 2 2 1 2 o 1
clusters 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 3 1
* L~ dorso da língua; PL= placa dental; Pai= mucosa; S=saliva.
Na cavidade bucal do voluntário 63, embora todas as cepas sejam provenientes
do mesmo sítio (placa dental), pode-se verificar um polimorfismo genético, demonstrado
representativamente no dendograma de similaridade (Fig. 18), destacando-se uma linhagem
dona! numericamente predominante ( cluster 2) e duas outras, encontradas com menor
intensidade.
71
0.0 0.3
Resultados
0.5 0.8 1.0 1PL5
r-----------------11 PL l Cluster 1
----~----PL? ~-----------------lPL6 p L 2 Cluster 2
PL8 _______ _ L.-------------------PL3 Cluster3
FIGURA 18 - Dendograma representativo do voluntário 63, grupo cárie ativo.
Comparando os perfis genotipicos e fenotípicos (Tab. 15) das amostras deste
voluntário, podemos observar que as atividades enzimática para proteinase, foram iguais
para todas as cepas, independentemente da linhagem dona! a que pertencem, em relação a
enzima fosfolipase, observou-se variações em sua produção, entre cepas iguais
geneticamente, como pode ser observada comparando as amostras PL6 e PL7, e entre cepas
diferentes geneticamente como PL3 e PL5. Neste voluntário o enzimotipo predominante foi
Pz Fz, seguido por Pz F 1·
TABELA 15 Perfis genotípicos e enzimátic ode amostras de C. albicans do voluntário 63
Proteinase
Fosfolipase
clusters
*PL= placa dental.
PL 1 PL2 PL3 PL5 PL6 PU PL8
2
1
1
2
2
2
2
2
3
72
2 2
1 2
1 2
2
1
2
2
2
2
Resultados
Analisando os perfis genotípico e fenotípico de C. albicans dos voluntários
livres de cárie, pode-se constatar que no voluntário 17, duas linhagens genéticas foram
encontradas (Fig.l9). A numericamente predominante ( cluster l ), encontrou-se dispersa
em todos os diferentes sítios-bucais analisados, e uma segunda linhagem clonal (cluster 2),
foi encontrada na mucosa e na placa dental.
0.0 0.3 0.5 0.8 1.0 LT ______ _
L 4 Cluster 1
bl PL5 PL4
r----IPL! Pal6 b3 Pal3 b6 bL ______ _ Palt
L.---1 PL2 Cluster 2
PL3 ---------FIGURA 19- Dendograma representativo do voluntário 17, grupo livre de cárie.
Comparando os perfis genotipicos e fenotípicos (Tab.l6) das amostras deste
voluntário, podemos observar que a atividade enzimática para produção de proteinase foi
semelhante para todas as cepas testadas, independentemente da linhagem clonal a que
pertencem, já em relação à produção de fosfolipase, cepas iguais geneticamente
apresentaram perfis enzimáticos diferentes (ex: PL2 e PL3) e cepas diferentes
73
Resultados
geneticamente apresentaram perfis enzimáticos idênticos (ex: PL3 e PL4). O enzimotipo
predominante neste voluntário foi P2 F2, seguido em menor número por P2 F1
TABELA 16 Perfis genotípicos e enzimático de amostras de C. a/bicans do voluntário 17
L2 L4 81 83 84 86 Pa/3 Pa/4 Pa/6 PL1 PL2 PL3 PL4 PL5
Proteinase 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Fosfolípase 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1 2 2 2
clusters 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 2 2 1 1
*L- dorso da língua; B- mucosajugal; Pai-mucosa; PL-placa dental
As amostras de C. a/bicas, isoladas da cavidade bucal do voluntário 18,são
provenientes do mesmo sítio e encontraram-se agrupadas em um único cluster (Fig. 20).
0.0 0.3 0.5 0.8 1.0 Lr ____ _
---------------------------1L2 Cluster 1
Lt
FIGURA 20- Dendograma representativo do voluntário 18, grupo livre de cárie.
Comparando os perfis genotipicos e fenotípicos (Tab.17) das cepas de Candida
albicans deste voluntário, podemos observar que as atividades enzimáticas para cepas
geneticamente iguais, foram diferentes tanto para a produção de proteinase, como para a
produção de fosfolipase. Este voluntário apresentou 2 cepas com enzimotipo P1 F1 e uma
cepa Po F2.
74
Resultados
TABELA 17 Perfis genotípicos e enzimático de amostras de C. albicans do voluntário 18
L1 L2 L4
Proteinase 1 o 1 Fosfolipase 1 2 1
clusters 1 1
* L= dorso da língua
O total de amostras de C. a/bicans isoladas da cavidade bucal do voluntário 34,
foram provenientes do mesmo sítio, e apresentaram-se agrupados em um único cluster (Fig.
21).
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 ---------PL3 PL! PL4 PLIO
---------------------------1PL9Ciuster1
FIGURA 21 - Dendograma representativo do voluntário 34, grupo livre de cárie.
PL8 PL7 PL6 PL5
Relacionando os perfis genotipicos e fenotípicos (Tab.l8), podemos observar
que o perfil genético, assim como as atividades enzimáticas foram iguais para todas as
amostras testadas. O único enzimotipo encontrado neste voluntário foi P2 F2.
75
Resultados
TABELA 18 Perfis genotípicos e enzimático de amostras de C. albicans do voluntário 34
PL1 PL2 PL3 PL4 PL5 PL6 PL7 PL8 PL9 PL10
Proteinase 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Fosfolipase I 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
clusters I
1 1 1 1 1 1 1 1
* PL= placa dental
Dentre as amostras isoladas do voluntário 46, foi detectada cepas de C. albicans
pertencentes a uma única linhagem clonal (Fig. 22).
o •. ..;;o ____ __,;.o·..;.3 ____ __,;.o • ..;.5 ____ __,;.o • ..;.B ____ ....;;..;L o ________ _ PL2
------------------------------I PU Cluster 1
p~~-------
FIGURA 22 - Dendograma representativo do voluntário 46, grupo livre de cárie.
Relacionando os perfis genotipicos e fenotípicos (Tab. 19), observa-se que
embora as cepas sejam geneticamente iguaís, o perfil enzimático para produção da enzima
fosfolipase é diferente entre elas, que pode ser observado quando se comparam as cepas
PL2 e PL4. O enzimotipo predominante foi P2 F2.
TABELA 19 Perfis genotípicos e enzimático de amostras de C. a/bicans do voluntário 46
Proteinase
Fosfolipase
clusters
* PL= placa dental
PL1
2
2
1
76
PL2
2
2
1
PL4
2
o 1
Resultados
Dentre o polimorfismo genético de C. albicans, demonstrado
representativamente no dendograma de similaridade (Fig. 23) do voluntário 56, a linhagem
clonal, numericamente dominante ( cluster I), encontrou-se dispersa nos dois sítios-bucais
analisados. Uma segunda linhagem elo na! ( cluster 2), foi isolada da mucosa, e amostras de
outra linhagem clonal (cluster 3), foram isoladas da placa dental e da mucosa.
0.0 0.3 0.5 0.8
-
1.0 ---------IPLl PL3 Plt Pal8 Pal9 Cluster 1
r--~Pal7 PL5 Pal5 PUO Pal6 PLB PL6
'----Pai (Q.êí;,;;,t.;",2. ,PL7 '--------lj PL9 Cluster 3 PaJ3 ______ ---
FIGURA 23 - Dendograma representativo voluntário 56, grupo livre de cárie.
A análise genotípica e fenotípica (Tab. 20), demonstram que o perfil enzimático
para produção da enzima proteinase foi igual para todas as cepas testadas,
independentemente da linhagem clonal a que pertencem. Já o perfil enzimático da
fosfolipase, diferiu entre as cepas pertencentes à mesma linhagem clonal (ex: PaiS e Pal9)
assim como, cepas de linhagens clonais diferentes apresentaram perfis enzimáticos
semelhantes, que pode ser observada quando comparadas às cepas PL7 e PaiS. Neste
voluntário a freqüência dos enzimotipos P2 F2 e P2 F~, foram iguais.
77
Resultados
TABELA20 Perfis genotípicos e enzimático de amostras de C albicans do voluntário 56
PL PL PL PL PL PL PL PL PL Pai Pai Pai Pa Pai Pai Pai
1 3 4 5 6 7 8 9 10 3 5 6 7 8 9 10
Proteinase 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Fosfolipase 2 2 1 2 2 2 2 2 1 2 1 1 1 1
clusters 1 1 1 1 1 3 1 3 1 3 1 1 1 1 1 2
* PL= placa dental; Pai= mucosa
O total de amostras de C. albicans, isoladas da cavidade bucal do voluntário 60,
apresentam duas linhagens clonais (Fig. 24), destacando-se uma numericamente
predominante, representada pelo cluster 2, dispersas nos dois sítios analisados neste
contexto, e outra com colonização sítio específica na mucosa ( cluster 1 ), presente na
mucosa.
0.0 0.3 0.5 0.8 1.0 P al2Ciuster 1 PL 1--------PL4 PL6
L-----------------------~Pall PL? Cluster 2
PL5 PL3 _______ _
FIGURA 24- Dendograma representativo do voluntário 60, grupo livre de cárie.
Na análise dos perfis genotipicos e fenotípicos (Tab. 21), observa-se que a
atividade enzimática para produção de proteinase foi semelhante para todas as cepas
testadas, independentemente da linhagem clonal a que pertencem. Já em relação a produção
78
Resultados
da enzima fosfolipase, cepas diferentes genéticamente apresentaram o mesmo perfil
enzimático, assun como cepas iguais genéticamente apresentaram perfis enzimáticos
diferentes. O enzimotipo predominante foi P2 F2 seguido por P2 F 1.
TABELA2l Perfis genotípicos e enzimático de amostras de C. a/bicam· do voluntário 60
PL1 PL3 PL4 PL5 PL6 PL7 Pa/1 Pa/2
Proteinase 2 2 2 2 2 2 2 2
Fosfolipase 2 2 2 2 2 2 1
clusters 2 2 2 2 2 2 2 1
* PL~ placa dental; Pal~ mucosa.
Através da análise genotípica, obtida pela técnica de AP-PCR, foi possível
detectar o número de linhagens clonais presentes em cada voluntário. A média do número
de clones, dos dois grupos estudados (Fig. 25), demonstra uma maior quantidade de
linhagens clonais no grupo de voluntários cárie ativos, em relação ao grupo livre de cárie.
Através da análise pelo teste T de Student, (p= 0.4532), não observou-se diferença
estatisticamente significante entre a média do número de clones entre os dois grupos
estudados. A média do número de biótipos encontrados através da enzimotipagem, (Fig.
26), demonstra uma maior quantidade de biótipos no grupo carie ativo em relação ao grupo
livre de cárie. Da mesma forma, através da análise pelo teste T de Student, (p= 0.4555), não
observou-se diferença estatisticamente significante entre a média do número de biotipos
entre os dois grupos estudados.
79
Resultados
4 ,-----~~------------------,
3,5
3
o Cárie ativo Livre de cárie Cárie ativo Livre de cárie
FIGURA 25 Média do número de linhagens FIGURA 26 - Média do número de biótipos nos
clonais nos grupos cárie ativos
e livres de cárie,
grupos cárie ativos e livres de
cáne.
Ao correlacionar o agrupamento genotípico, obtido por AP-PCR, com o fenotípico,
obtido por enzimotipagem dos voluntários do grupo cárie ativo, pode-se observar que existe
uma diferença em relação ao número de genótipos e fenótipos em um mesmo voluntário, O
número de genótipos em voluntários cárie ativos variou de 02 a 06, e o número de fenótipos
de 01 a 03, no mesmo grupo (Tab, 22),
TABELA22 Características fenotípicas e genotípicas do grupo cárie ativo,
Relação entre o número de genótipos e fenótipos de um mesmo voluntário,
Voluntários 07 08 15 28 31 32 33 35 59 63
Genótipo AP-06 02 03 03 04 04 03 02 03 03
PCR
Fenótipo 03 03 03 03 01 03 03 02 03 02
FxPx
Cepas 19 17 15 06 06 lO 08 04 12 07
analisadas
80
Resultados
A figura 27, expressa a média do número de linhagens clonais e fenótipos de C.
albicans, nos voluntários cárie ativos, Se observa através da análise estatística realizada
pelo teste T de Student (p= l) que a média do número de clones obtidos através da técnica
molecular de AP-PCR, não seja estatisticamente diferente da média do número de
fenótipos, obtidos pela técnica de enzimotipagem.
A relação entre as características fenotípicas com as características genotipicas
do grupo de voluntários livre de cáries (Tab. 23), demonstram que existe uma diferença em
relação ao número de genótipos e fenótipos de um mesmo voluntário. O número de
genótipos neste grupo de voluntários, variou entre O I e 03 e o número de fenótipos (obtidos
pela enzimotipagem) entre OI e 02, no mesmo grupo.
A figura 28, demonstra a média do número de linhagens clonais e fenótipos de
C. albicans, nos voluntários livres de cárie, não revela indícios de que a média do número
de clones obtidos através da técnica molecular de AP-PCR, seja estatisticamente diferente
81
Resultados
da média do número de fenótipos, obtidos pela técnica de enzimotipagem, através do teste
T de Student (p= 0.07)
3,5 1.85
3 1.8 2,5
<f) 1.75 "' 2 .~ (\)
'6 "O 1,7 .., 1,5 •Q)
2 :2: 1,65
0,5 1,6
o 1,55
clones biotipos clones biotipos
FIGURA 27 - Média do número de linhagens FIGURA 28 - Média do número linhagens
clonais e biótipos no grupo cáne
ativo.
clonais e biótipos no grupo
livre de cárie.
Após a determinação dos perfis pela técnica da AP-PCR de Candida albicans de
todos os voluntários carie ativos, um representante de cada linhagem clonal foi utilizado para
se obter o dendograma apresentado na figura 29. O valor de similaridade máxima (S sM= 1,0)
não foi encontrado em nenhum tipo clonal oriundo de indivíduos diferentes.
Da mesma forma, após a determinação dos perfis AP-PCR de Candida albicans de
todos os voluntários livres de cárie, um representante de cada linhagem clonal !oi utilizado
para se obter o dendograma apresentado na tlgura 30. O valor de similaridade máxima (S sM=
1,0), também não foi encontrado em nenhuma linhagem clonal oriunda de indivíduos
diferentes.
82
0.0
r-
r--
'--
'---
-;--
I I
I I -
0.3 0.5
-1
I I
83
0.8
Resultados
1.0 lA 7B 2BB 32B BA 35A 2BA 35B 33A BB 33B 31B 63C 2BC 33C 31C 32A 63A 63B 59B 59C !5A !5B 31A 7C 70 7E 310 7F 59A 15C 32C 320
Resultados
FIGURA 29 - Dendograma representativo dos genótipos obtidos de todos os voluntários
pertencentes ao grupo cárie ativo.
0.0 0.3 0.5 0.8 1.0
...:.-----~~c=========================34A I 60A 1~------------------------------568
r-I.-----------------------------------56A ~~---------------------------56[
~-----------------------------608 ------c===l?A I 178 ~--~L~==============~~-18A 46A
FIGURA 30 - Dendograma representativo dos genótipos obtidos de todos os voluntários
pertencentes ao grupo livre de cárie.
84
Discussão
6 DISCUSSÃO
Os mecanismos que determinam a patogenicidade do gênero Candida spp, não
estão totalmente esclarecidos. V árias hipóteses tem sido sugeridas: fatores intrínsecos das
espécies ainda não determinados, aderência aos tecidos, dimorfismo, composição da parede
celular e produção de toxinas e enzimas hidrolíticas (ODDS, 1987; GRANNOUM &
ABBU-ELTEEN, 1990). Ainda a patogênicidade das espécies de Candida spp, resultam de
características próprias das amostras em questão, do estado imunológico do hospedeiro, e
das condições locais dos sítios de infecção (SAMARANA Y AKE & MacF ARLANE, 1990;
OKSALA, 1990).
Para auxiliar na invasão dos tecidos do hospedeiro, as células microbianas
possuem um conjunto de enzimas hidrolíticas que lesam ou destroem os constituintes das
membranas celulares, levando a uma disfunção e ou destruição física (SAL YES & WITT,
1994). Uma vez que as membranas são constituídas de lipídeos e proteínas, estes
constituintes bioquímicas podem servir como um receptor para enzimas microbianas.
Fungos patogênicos como Candida albicans, secretam enzimas que são consideradas
essenciais para sua patogenicidade, como proteinases (HUBE et al., 1998; HUBE 1998),
que hidrolisam ligações peptídicas e fosfolipases, que hidrolisam fosfolipídios (IBRAHIM
et al., !995).
O termo fosfolipase refere-se a um grupo heterogêneo de enzimas, com
capacidade de hidrolisar uma ou mais ligações ésteres nos glicerofosfolipídeos (ANSELL
85
Discussão
& HA WTHORNE, 1964), que através da clivagem de fosfolipídios, desestabilizam a
membrana, resultando em li se celular (SAL YERS & WITT, 1994 ). A quantidade de
fosfolipase produzida por C albicans varia conforme o isolado especifico e foi relacionada
aos sítios de infecção. Segundo PRICE et al., 1982, os isolados sanguíneos, geralmente
produzem maiores níveis de fosfolipase que os isolados da pele ou urina. Ainda
WILLIAMSON et al., 1986, envolvendo 100 isolados orais de C albicans verificou que
94% das amostras testadas eram fosfolipase positiva (PZ de 0,3 a 0,9).
SAMARANA Y AKE, et al., 1984 avaliaram isolados de Candida spp para detectar a
atividade enzimática e constatando-se que 79% das cepas de C a/bicans produziam
fosfolipase, enquanto, C tropicalis, C. glabrata e C parapsilosis não as produziam. Do
mesmo modo CANDIDO et al., 2000, relataram que 96% das amostras de C. albicans da
cavidade oral apresentaram atividade positiva em relação a fosfolipase. Alguns estudos
anteriores sobre fosfolipases já haviam demonstrado que 30% a I 00% das cepas de C.
albicans são produtoras dessa enzima (PRICE et al. 1982; SAMARANA YAKE et al.,
1984; SHIMIZU, 1989).
Pesquisadores brasileiros como MAFFEI (1996) analisando amostras de C.
albicans isoladas de gestantes, constatou que 51, 1% das cepas eram fosfolipase positivas.
No estudo de SOUZA et al., 1990 analisando amostras de C. albicans sorotipo A e B, esse
percentual atingiu 73,3%; no de CANDIDO, 1991, amostras de diferentes materiais
biológicos obtiveram um índice de 96,6%, e SHIMIZU (1989) analisando diversas espécies
de Candida spp encontrou que 1 00% das cepas de C albicans são produtoras de
86
Discussão
fosfolipase. PENHA et al., 2000, verificou que entre as cepas provenientes da cavidade
oral, 83,3% tiveram atividade enzimática positiva para essa enzima.
Os testes de atividade enzimática no presente trabalho, demonstraram que
95,2% das cepas de C albicans isoladas da cavidade oral possuem atividade enzimática
positiva para fosfolipase (PZ de 0,3 a 0,9), estando dentro dos parâmetros encontrados por
autores estrangeiros (PRICE et al., 1982; SAMARANA YAKE et al., 1984).
Nosso percentual, no entanto, foi maior do que o obtido por MAFFEl (1996) e
SOUZA et al., 1990, estando bem próximo dos resultados descritos por CANDIDO et al.,
1991 que foi de 96%; de SHIMIZU (1989) que foi 100% e de PENHA et al., 2000 que foi
de 83,3%.
Esses resultados sugerem em princípio, que espécies de C albicans são
fosfolipase positivas como um fator intrínsico dessa espécie, com graus variados de
atividade. A presença de isolados fosfolipase negativo neste trabalho foi muito pequena
(4,8%), quando comparada a um estudo anterior demonstrando que 23% dos isolados orais,
45% dos isolados de sangue, 50% dos isolados de lesões e 70% dos isolados de urina,
foram negativos (PRlCE et al., 1982).
As variações na atividade enzimática obtida nos diferentes trabalhos, podem ter
sido refletidas por variações de metodologias que envolvem o tratamento da amostragem de
modo geral.
87
Discussão
Comparando-se a atividade enzimática da fosfolipase de cepas provenientes da
cavidade oral nos dois grupos estudados, (um dos objetivos deste estudo), pode-se observar
que 92,3% das 104 amostras de voluntários cárie ativos e 98 % das 54 amostras de
voluntários livres de cárie, foram positivas para produção dessa enzima (incluindo índices l
e 2), enquanto que 7,7% e 2% respectivamente demonstraram atividade enzimática
negativa (índice 0). Entre os dois grupos estudados, houve diferença estatisticamente
significativa (p= 0,025) apenas em relação ao índice O (zero) que foi mais freqüente no
grupo cárie ativo.
Nossos resultados estão parcialmente de acordo com os encontrados por
PENHA et al., 2000 que ao avaliar a atividade enzimática da fosfolipase de isolados orais
de pacientes com e sem estomatite de dentadura (DS) sugere que não existe diferença na
produção dessa enzima em relação aos aspectos clínicos observados nos dois grupos
estudados, e com o de CANDIDO et al., 2000, que verificou que 83,3% e 71,9% das cepas
de C. albicans foram produtoras dessa enzima, quando isoladas de nichos com e sem lesões
caracteristicas de candidíase, respectivamente.
HANNULA et al., 2000, comparando fatores de virulência de C. albicans e C.
dubliniensis, isoladas de pacientes saudáveis e com candidíase crônica, verificou que 52%
das cepas de C. albicans isoladas de pacientes imunocomprometidos e 60% dos isolados de
pacientes saudáveis produziram fosfolipase.
Autores como IBRAHIM et al., 1995 os quais analisaram isolados clínicos de
sangue com isolados comensais da cavidade oral de voluntários clinicamente sadios,
88
Discussão
observaram que isolados do sangue eram mais produtores de fosfolipase que isolados orais,
sugerindo que essa enzima possa ser um fator de virulência de infecções disseminadas do
sangue.
Embora o número de amostras com atividade enzimática positiva tenha sido
maior em relação a alguns trabalhos, nossos resultados, no entanto confirmam os obtidos
por PENHA et al., 2000; CANDIDO et al., 2000 e HANNULA et al., 2000 que não
demonstraram diferenças na produção dessa enzima em relação as amostras clínicas da
cavidade oral divergindo portanto dos resultados de IBRAHIM et al., 1995. É possível que
amostras comensais expressem uma menor capacidade de produção dessas enzimas,
quando comparadas com isolados clínicos, permitindo a estes uma maior patogenicidade.
Diferenças nas técnicas de detecção destas enzimas, no entanto, não devem ser excluídas.
O fato de termos encontrado uma maior quantidade de cepas com atividade
enzimática negativa (índice 0), no grupo de voluntários cárie ativos, podem estar
relacionada ao tipo de dieta, que provavelmente é mais rica em açúcares. Segundo
SAMARANA Y AKE et al., 1984, a produção de fosfolipase por C. albicans "in vitro"
decresce com altas concentração de sacarose e galactose, e é totalmente inibida por uma
alta concentração de glicose. Em termos clínicos, elevada concentração intra-oral dessa
dieta rica em açúcares, pode suprir a formação da fosfolipase, reduzindo assim o potencial
patogênico dessa levedura. Em contraste, se esse efeito é benéfico para o hospedeiro, outro
efeito prejudicial como a dieta pode aumentar a proliferação de leveduras orais (KNIGHT
& FLETCHER, 1971) e aumentar sua adesão ao epitélio (SAMARANAYAKE &
MacFARLANE, 1982).
89
Discussão
A atividade enzimática das proteinases (Saps- proteinase aspartil secretora)
produzida por C. albicans, também é apontada como um indicador de cepas virulentas.
Esse grupo de enzimas exibe ampla especificidade por substratos e são capazes de degradar
muitas proteínas humanas encontradas nos sítios das lesões, como albumina, hemoglobina,
queratina, colágeno, mucinas e IgA secretora (COLINA et a!., 1996; HUBE, 1996;
RÜCHEL, 1984). A importância das proteinases secretadas como fatores de virulência de
C. albicans tem sido amplamente investigada em modelos de candidíase (AGATENSI et
al., 1991; CASSONE et al., 1995; DE BERNARDIS et al., 1995; HUBE, 1996;
SANGLARD et al., 1997).
A freqüência na produção de proteinases por cepas de C. albicans pode também
variar bastante. No presente estudo, do total de cepas analisadas nos dois grupos, 94%
foram positivas para produção dessa enzima e 6% demonstraram atividade enzimática
negativa. Esses dados se aproximam daqueles obtidos por PENHA et a!., 2000 que
analisando amostras de C. albicans da cavidade oral, verificaram que 1 00% dessas cepas
eram produtoras de proteinases. CHAKRABARTI et al., 1991 observando cepas de C.
albicans de diferentes sítios anatômicos, encontrou uma variação de 44,4% a 84,6% de
cepas com atividade enzimática positiva, dependendo do sítio de origem. Diferentes
ecossistemas, com suas características específicas, podem conter fatores presentes nestes
microambientes que limitem ou ampliem a expressão dessas enzimas, e conseqüentemente,
determinem graus variáveis de atividade enzimática.
Os diferentes padrões de produção de proteinases por cepas de C. albicans
provenientes de indivíduos pertencentes aos dois grupos, demonstraram que 98% e 89,4%
90
Discussão
das cepas dos grupos livre de cárie e cárie ativo respectivamente possuem atividade
enzimática positiva, enquanto que 10.6% obtiveram índice zero (negativa) no grupo carie
ativo e 2% no livre de carie. Houve uma diferença estatisticamente significante apenas para
o índice O (zero) que foi maior no grupo de voluntários cárie ativos. Esses resultados, foram
maiores do que os de CANDIDO et al., 2000, que comparando a atividade enzimática dessa
enzima em pacientes com lesões bucais características de candidose e clinicamente
saudáveis, relataram que 66,7% e 68,7% foram positivas para proteinase respectivamente,
dos grupos com e sem lesões, no entanto, concordam com nossos resultados, por não
apresentar diferença na atividade enzimática entre os dois grupos estudados.
Em contraposição, WU et al., 1996 reporta que C. albicans isoladas de pacientes
com infecções por HIV, foram significativamente mais proteolíticas do que aquelas
provenientes de sujeitos HIV negativos que apresentavam quielite angular. Do total de
amostras analisadas, I 00% e 56% demonstraram atividade enzimática positiva, para
pacientes HIV positivos e negativos respectivamente e CASSONE et al., !995 ao
correlacionarem proteinase e candidíase, demonstraram que isolados de C. albicans obtidos
de pacientes com candidíase vaginal foram mais proteolíticos que os proveníentes do
mesmo sitio de portadores assintomáticos.
Ainda OLLERT et al., 1995 analisando amostras da cavidade oral de
voluntários HIV positivos e HIV negativos, constataram que todos os isolados foram
proteolíticos, sendo que a atividade secretora (valores de PZ), revelou ainda que, isolados
provenientes de HIV positivos eram mais proteolíticos em relação ao grupo controle.
91
Discussão
Esses resultados, de modo geral, independe de pequenas variações, à
semelhança de outras enzimas, e indicam que amostras patogênicas podem apresentam uma
maior atividade enzimática, ou determinando grau de virulência em relação ao hospedeiro.
Assim a possibilidade de isolados de Candida spp passarem por alterações
fenotípicas e fisiológicas, e secretarem enzimas virulentas, podem promover a esse
organismo eucarioto, um grande potencial de adaptação. Mudanças fenotípicas podem
contribuir para o sucesso de Candida spp em se transformar de comensal para patogênica,
por gerarem uma diversidade necessária para adaptar-se aos diferentes ambientes e
mecanismos de defesa do hospedeiro (RA Y et al., 1991 ). O dimorfismo dessas cepas,
acontece devido a certas condições ambientais, como temperatura, pH, osmolaridade,
anaerobiose e ou fatores químicos (MEKALANOS, 1992; HOFLING et al., 2001). Em
relação a expressão dos fatores de virulência, não somente fatores dependentes do
microrganismo estão envolvidos, mas também outros que são fortemente dependentes do
hospedeiro, como diferenças específicas nos tecido, formação de hifas, que variam entre os
hospedeiros, devido a variações no meio ambiente, estado imunológico entre outros. Na
verdade a patogênicidade de C albicans, é um processo complexo, envolvendo diferentes
estágios, aderência, invasão, fagocitose, colonização, danos as células do hospedeiro e
outros. Todos os diferentes fatores, presentes nos tecidos ou órgãos, assim como a
competição com outros microrganismos do mesmo nicho, pode influenciar a colonização,
sobrevivência e o estado como comensal ou patogênico dessa levedura, induzindo a um
aumento ou diminuição do perfil enzimático desses microrganismos.
92
Discussão
A técnica da enzimotipagem tem sido sugerida por vários autores, como uma
forma para biotipagem de C albicans (CANDIDO et a!., 2000; SAMARANA YAKE et al.,
1984; PRICE et al., 1982.) mas outros autores no entanto, indicam que a atividade
enzimática pode ser apenas um indicador do potencial de virulência (CASSONE et a!,,
1968; REMOLD et al., 1968; HATTORJ et aL, 1984),
A comparação da diversidade fenotípica e genotípica de C albicans entre os
indivíduos com e sem cárie foi um dos propósitos deste trabalho, já que existem poucas
informações sobre o impacto da diversidade clonal de C albicans e os fatores de virulência.
Embora a enzimotipagem apresente algumas limitações e menor poder discriminatório,
quando comparada com alguns métodos de tipagem molecular, o número de genótipo e
fenótipos para cada grupo de amostragem se aproximaram, não demonstrando uma
diferença estatisticamente significativa entre a média do número de perfis genotípicos e
enzimáticos. Porém, a mesma linhagem clonal muitas vezes não demonstrou atividade
enzimática semelhante.
Através da técnica de genotipagem por AP-PCR pode-se observar maJOr
capacidade discriminatória para diferenciação das cepas em relação a enzimotipagem. O
número de linhagens clonais obtidas pela AP-PCR nos dois grupos, revelou uma média
maior no grupo cárie ativo em relação ao livre de cárie, embora estatisticamente não
significante.
Estes resultados estão parcialmente de acordo com os resultados de HANNULA
et al., 2000, que com o propósito de analisar diferenças clonais de C. albicans de pacientes
93
Discussão
com e sem comprometimento Imune, não verificou nenhuma diferença significativa na
distribuição dos genótipos entre pacientes saudáveis e doentes, abrigando apenas um único
genótipo de C. a/bicans por indivíduo. Em contraposição, nossos resultados demonstraram
em alguns pacientes múltiplos genótipos.
XU et ai., 2000 usando a técnica de PCR "fingerprinting ", com 5 primers
diferentes, também não encontraram diferença genética significante entre o número de
genótipos entre dois grupos HIV positivo e negativo. Já DIAS-GERRA et al., 1997 através
da cariotipagem, encontraram uma grande diversidade clonal de C. a/bicans, entre isolados
provenientes da orofaringe de voluntários HIV positivos que portavam candidíase. Do
mesmo modo KAM et al., 2002 analisando cepas comensais provenientes de diferentes
sítios do organismo de indivíduos saudáveis, verificaram que um único hospedeiro pode
portar múltiplas espécies ou múltiplos genótipos no mesmo, ou em diferentes sítios do
corpo. Nesta linha de investigação, XU et al., 1999, examinando os padrões de similaridade
genética de cepas de C. albicans patogênicas em mulheres HIV positivas, grávidas
saudáveis e HIV negativas, demonstraram nos três grupos diversidade genotípica, no
entanto, não houve diferença significativa na média do número de linhagens clonais entre
estes, independente das condições do hospedeiro, confirmando que um único hospedeiro
pode ser colonizado por múltiplos genótipos da mesma espécie no mesmo sítio ou em sítios
diferentes, indicando um processo dinâmico de colonização por leveduras em mulheres.
Ainda HOWELL et al., 1996 comparando a similaridade genética de C. albicans
proveniente de 4 pacientes observaram a presença de mais de um genótipo em alguns
indivíduos. As amostras foram comparadas por RFLP e por RAPD.
94
Discussão
Por outro lado, nas pesqmsas de BOERLIN et ai., I 996, isolados de C
albicans provenientes da orofaringe de pacientes saudáveis e com HIV, foram tipados por
MLEE, mostrando que a maioria (exceto um paciente) portava um único clone de C
albicans na orofaringe.
Esses dados quando analisados em conjunto demonstram que, pode um único
genótipo predominar em todos os sítios de um mesmo indivíduo (LOCKHART et ai .. I 996;
STEVENS et al., 1990), alguns pacientes podem apresentar isolados com reduzida
diversidade genética (HANNULA et al., 2000; XU et a!., 2000; BOERLIN et al., !996) e
outros pacientes ainda podem apresentar alterações na freqüência de fenótipos e genótipos
de C albicans (DlAS-GERRA et al., 1997; KAM et a!., 2002; XU et al., 1999; HOWELL
et a!., 1996), o que pode confirmar a existência de um processo dinâmico de colonização
dessas espécies por um lado, ou a impossibilidade de se estabelecer correlação definidas
pelos métodos ainda disponíveis.
Com o objetivo de se avaliar a presença ou não de cepas da mesma linhagem
clonal entre os voluntários do grupo cárie ativos e livTes de cárie, um representante de cada
linhagem foi selecionado para a construção de dendogramas representativos de cada grupo
de voluntários. Os dados obtidos demonstram que não houve nenhmna similaridade clonal
(S SM = 1,0) em indivíduos diferentes pertencentes ao mesmo grupo. Em contraposição
SCHIMID et a!., 1999 usando a sonda Ca3 para analisar 266 isolados de C. albicans
obtidos de infecções, provenientes de 12 regiões geográficas específicas, em 6 países,
demonstraram que 3 7% destes isolados formavam mn único cluster geneticamente
homogêneo e o restante dos isolados foram geneticamente diversos. Este fato evidencia a
95
Discussão
ocorrência de um genótipo geograficamente disseminado que age como um agente
etiológico predominante em todas as formas de candidíase e em todas as categorias de
pacientes.
Por outo lado, MEHT A et al., 1999 analiaram 28 indivíduos sistemicamente
saudáveis, pertencentes a 12 famílias em relação à presença de C. albicans proveniente da
cavidade oral e das fezes, e a genotipagem dessas cepas através de DN A "fingerprinting ",
demonstrou que diferentes famílias não compartilhavam as mesmas cepas, no entanto, dois
ou mais membros da mesma família comumente as compartilham.
As cnanças analisadas no presente estudo, não possuíam nenhum grau de
parentesco, e não partilhavam do mesmo ambiente. Esse fato pode ser essencial para
comprovar a diferença dos nossos resultados, com os obtidos por MEHTA et al., 1999 e a
concordância com os achados de DIAS-GUERRA et al., 1997, KAM et al., 2002; XU et
al., 1999 e HOWELL et al., 1996.
Alguns autores têm demonstrado que um único "cluster" geneticamente
relacionado à infecção por Candida albicans, usualmente predomina numa determinada
população de pacientes e em um dado local geográfico (SCHIMID et al., 1993, 1995 ;
HELLSTEIN et al., 1993; PFALLER et al., 1998). A descoberta de um grupo de cepas de
C. albicans geneticamente mais bem sucedidos que outros genótipos, numa população
variada de pacientes e tipos de infecção, já foi relatada por vários autores e não foi uma
surpresa, dada as evidências do modo clonal de reprodução de C. albicans (ODDS, 1988;
CAUGANT & SANDVEN, 1993; TIBA YRENC, 1997). A reprodução clonal de um
96
Discussão
organismo permite que ele se adapte ao ambiente, enquanto que linhagens clonais
separadas podem evoluir, cada qual, para uma adaptação em um nicho ecológico particular,
se tal nicho for estável. Em contraste a reprodução clonal deixa o organismo exposto a
freqüentes alterações em seu meio ambiente, que então, responde com a evolução e seleção,
baseado em sua adaptibilidade a uma variedade de nichos ecológicos, O tempo que a
espécie Candida albicans pode permanecer ocupando um nicho particular em um paciente
é limitado pelo tempo de vida e pelas alterações fisiológicas que ocorrem nesse indivíduo,
as quais podem alterar esse microambiente, O sucesso a longo prazo de uma dada cepa,
pode ser conseguido com uma ampla capacidade de adaptação (WHITTAM et al., 1983;
TIBA YRENC & A YALA, 1988; FOX et al., 1996 HERMANUTZ & WEA VER, 1996;
JACOBSEN & F ORBES, 1997; SEMLITSCH et al., 1997).
Embora diferentes pessoas possam abrigar o mesmo genótipo ou genótipos
muito semelhantes, os dados obtidos nesta pesquisa estão de acordo com a maioria dos
estudos citados, os quais demonstram que cepas de diferentes locais do corpo de um mesmo
indivíduo, possuem normalmente maior similaridade entre si, que aquelas provenientes de
diferentes hospedeiros.
Esses dados quando analisados em conjunto, demonstram que os mecanismos
que envolvem a patogênicidade dessa espécie, necessitam ainda maiores esclarecimentos,
os quais serão provavelmente obtidos em pesquisas diversificadas, que permitam um maior
entendimentos das relações destes parasitas oportunistas com os hospedeiros. É preciso
considerar que, a atividade enzimática expressa por esses microrganismos, é um elemento
parcial de sua capacidade patogênica e que outros fatores já descritos, que determinam a
97
Discussão
sua virulência, devem ser incluídos, o que toma o fenômeno ainda mais complexo. Há
ainda poucos dados disponíveis em relação ao grupo cárie ativo e livres de cárie. Os
resultados aqui obtidos, abrem perspectivas de novas pesquisas que vizem estabelecer e
ampliar o conhecimento destas relações através do estudo de um maior número de amostras
e o emprego de outras técnicas moleculares, que permitam um maior discernimento entre as
condições genotípicas deste organismo e seu perfil enzimático.
98
Conclusão
7 CONCLUSÃO
Sob as condições experimentais utilizadas nesse estudo, é válido concluir que:
a) As amostras de C albicans provenientes da cavidade oral possuem uma
evidente atividade enzimática para proteinases e fosfolipases.
b) As amostras provenientes dos grupos cárie ativos e livres de cárie, não são
diferentes em relação à produção de proteinases e fosfolipases.
c) O perfil de produção enzimática independe das características genotípicas. O
mesmo genótipo pode possuir diferentes perfis enzimáticos.
d) Um único ou múltiplos genótipos de C. albicans estão presentes na cavidade
oral de um indivíduo.
e) Linhagens clonais semelhantes estão presentes no mesmo indivíduo e não
entre indivíduos nos dois grupos estudados.
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123
ANEXOS
~ MEIOS DE CULTURA
Meio Completo para Levedura
Peptona
Extrato de Levedura
Fosfato di básico de potássio
Glicose
Agar
Água destilada
Autoclavar por 15 minutos a 121 °C.
Yest Peptone Dextrose (YPD)
Extrato de Levedura
Peptona
Glicose
Água destilada
Autoclavar por 15 minutos a 121 °C.
lüg
10g
O,Sg
20g
20g
q.s.p. 1000mL
lüg
10g
20g
q.s.p. 1 OOOmL
Yest Peptone Dextrose com glicerol a 15% (YPD-glicerol)
Y est Peptone Dextrose
Glicerol
Autoclavarpor 15 minutos a 121 °C.
125
700ml
300mL
Anexos
Ágar Fosfolipase (com emulsão de ovo 50% em solução fisiológica)
Peptona lOg
Glicose
Cloreto de Sódio
Cloreto de Cálcio
Ágar
Água destilada
30g
57,3g
0,55g
20g
q.s.p. l OOOmL
Emulsão de ovo a 50% (Egg Yolk enrichement-Laborclin) 1 Oüml
Anexos
Autoclavar por 15 minutos a 121 °C. todos os itens acima citados, exceto a emulsão de ovo,
que será acrescentada após autoclavação, quando o meio atingir uma temperatura de 45 °C.
Ágar Proteinase
Albumina do Soro Bovino (BSA-Fração V)
Yest Nitrogen Base (w/o amino acids ammonium sulfate)
Glucose
Ágar
Água destilada
2g
1,45g
20g
20g
q.s.p. I OOOmL
Autoclavar por 15 minutos a 121 °C, a Glucose, o Agar e a Água destilada. Quando o meio
atingir uma temperatura aproximada de 45 °C, acrescentar BSA e YNB, previamente
esterilizados em membrana 0,22 fim.
126
..:>- SOLUÇÕES UTILIZADAS PARA EXTRAÇÃO DE DNA
Tampão de extração de DNA (para 12 amostras)
NaCl-l.4M
Tris-HCL, pH 8,0, 100 mM
EDTA, pH 8,0. 0,20 mM
Polivinilpirrolidona (PVP-40), 1%
CTAB, 2%
Proteinase K, 1 OOf!g/mL
Beta-Mercaptanol, 0,2%
Água Milli-Q
(3,36 ml de 5M)
(!,2 mL de lM)
(0,48 mL de 500 mM)
120mg
(2,4 mL de 10%)
(60 f!L de 20 mg/mL)
24 f!L
4,476mL
Misturar todos os reagentes em recipiente previamente esterilizado.
Tampão de extração de DNA sem proteinase K (para 12 amostras)
NaCl- 1.4 M (3,36 ml de 5M)
Tris-HCL, pH 8,0, 100 mM
EDTA, pH 8,0. 0,20 mM
Polivinilpirrolidona (PVP-40), 1%
CTAB,2%
Beta-Mercaptanol, 0,2%
Água Milli-Q
(!,2 mL de IM)
(0,48 mL de 500 mM)
120mg
(2,4 mL de 10%)
24 f!L
4,476mL
Misturar todos os reagentes em recipiente previamente esterilizado.
127
Anexos
-9- SOLUÇÕES UTILIZADAS PARA AP-PCR E ELETROFORESE
Tampão Tris-Borato-EDTA (TBE) SX
Tris HC!
Ácido Bórico
EDTA (0,5M I pH 8,0)
Água destilada
54g
27,5g
20mL
q.s.p. l OOOmL
Anexos
Misturar 20 mL de EDT A com 500mL de água deatilada e dissolver os outros reagentes.
Adicionar a água até commpletar o volume de 1 litro. Acertar o pH final para 8,0
adicionando HCl.
Solução Trabalho- TBE JX- Utilizada para preparar o gel de agarose e preencher a cuba
eletroforética.
Diluir o tampão TBE 5X- Cfx V f= Ci x Vi.
Corante Azul (Lowading buffer ou Tampão de corrida)
Bromofenol Blue 0,125g
Xilene Cyanol 0,125g
Glicerol l5mL
Água destilada
Adicionar 20 mL de água destilada aos 15 mL de glicerol e misturar os solutos. Completar
com água até atingir o volume final de 50 mL.
Solução TE (Tris-EDTA) O,OlM/pH 8,0- Utilizada para diluição de primers e
DNA (extração).
Tris HCl (IM I pH 8,0)
EDTA (0,5M I pH 8,0)
Água destilada
5mL
lmL
q.s.q 500mL
Misturar os reagentes e completar com água destilada até atingir o volume final de 500mL.
Acertar o pH final para 8,0 adicionando Na OH concentrado.
128
Anexos
Brometo de Etídio (10 mg/mL)- Utilizado para corar o gel de agarose.
Brometo de Etídio 10 mg/mL 2001-!L
Água destilada 400mL
Misturar os reagentes. Concentração final da solução: 0,5 11g/mL.
129
I '
I
I
I
Anexos
~ TABELAS
TABELA24 Relação e código das amostras de Candida albicans isoladas ca cavidade oral de
crianças cárie ativas utilizadas nos experimentos
Nt.'Paciente grupo e N Paciente grupo e N Paciente grupo e
I
N°Paciente grupo e
código da amostra código da amostra código da amostra código da amostra
7-CA-S l 8-CA-Pal3 28-CA-PL2 33-CA-PL4
7-CA-S2 8-CA-Pal4 28-CA-PL3 33-CA-PLS
7-CA-S3 8-CA-Pal5 28-CA-PL4 33-CA-PLS
7-CA-S4 8-CA-Pal6 28-CA-PL5 35-CA-PL I
7-CA-L2 I 8-CA-PLI 28-CA-PL6 35-CA-PL2
7-CA-L3 ' 8-CA-PL2 31-CA-BI I 35-CA-L 1 I
7-CA-L5 8-CA-PL3 I 31-CA-PL l I 3 5-CA-S I I
7-CA-L6 8-CA-PL4 I 31-CA-PL4 59-CA-L I
7-CA-Pall 8-C.A.-PLS 31-CA-PL5 59-CA-L2
7-CA-Pal2 8-CA-PL6 I 31-CA-PL6 59-CA-PL2 I 7 -CA-Pal4 15-CA-Ll 31-CA-PL8 59-CA-PL3
7-CA-Pal5 15-CA-L2 32-CA-PL I 59-CA-PLS
7-CA-Pal6 15-CA-L3 32-CA-PL3 59-CA-PL 7
7-CA-PL 1 15-CA-L5 32-CA-PL4 59-CA-PL I O
7-CA-PL2 15-CA-L6 32-CA-PL6 59-CA-Pall
7-CA-PL3 15-CA-B5 32-CA-PL8 59-CA-Pal2
7-CA-PL4 15-CA-Pall 32-CA-Pall 59-CA-Pal3
7-CA-PL5 15-CA-Pal2 32-CA-Pal2 59-CA-Pal4
7-CA-PL6 15-CA-Pal3 32-CA-Pal7 59-CA-SI
8-CA-L I 15-CA-Pal4 32-CA-Pal8 63-CA-PL I
8-CA-L2 15-CA-Pal5 32-CA-Pal9 63-CA-PL2
8-CA-L3 15-CA-PLI 33-CA-B I 63-CA-PL3
8-CA-L4 15-CA-PL2 33-CA-Pal6 63-CA-PLS
8-CA-L5 15-CA-PL4 33-CA-PL I 63-CA-PL6
8-CA-L6 15-CA-PLS 33-CA-PL2 63-CA-PL 7
8-CA-Pal2 28-CA-PL I 33-CA-PL3 63-CA-PL8
* Os cod1gos das amostras correspondem ao numero do voluntano, grupo a que pertence (CA - Cárie ativo) e local de procedência, sendo: saliva (S), mucosa do palato (Pai), mucosa jugal (B), biofilme dental (PL) e dorso da língua (L).
130
I
i
I
I I
Anexos
TABELA25 Relação e código das amostras de Candida albicans isoladas cavidade oral de
crianças livres de cárie utilizadas nos experimentos:
N\)Paciente grupo e
I
N Paciente grupo e I N Paciente grupo e
I NuPaciente grupo e
código da amostra código da amostra I código da amostra código da amostra
l7-LC-L2 18-LC-Ll 46-LC-PL2 56-LC-PL6
!7-LC-L4 I 18-LC-L2 46-LC-PL4 56-LC-PL7
17-LC-B1 l8-LC-L4 60-LC-PLJ 56-LC-PLS
l7-LC-B3 34-LC-PLJ 60-LC-PL3 56-LC-PL9
l7-LC-B4 I 34-LC-PL2 60-LC-PL4 56-LC-PLJO
l7-LC-B6 34-LC-PL3 60-LC-PLS 56-LC-Pal3
l7-LC-Pal3 34-LC-PL4 60-LC-PL6 56-LC-Pal5
l7-LC-Pal4 34-LC-PL5 60-LC-PL7 56-LC-Pa16
l7-LC-Pal6 34-LC-PL6 60-LC-Pall 56-LC-Pal7
17-LC-PLl 34-LC-PL7 60-LC-Pal2 56-LC-Pal8
J7-LC-PL2 34-LC-PLS 56-LC-PLJ 56-LC-Pal9
17-LC-PL3 34-LC-PL9 56-LC-PL3 56-LC-Pall O
l7-LC-PL4 34-LC-PLJO 56-LC-PL4
17-LC-PL5 46-LC-PLJ 56-LC-PLS ' . * Os codtgos das amostras correspondem ao numero do voluntano, grupo a que pertence
(LC -Livre de Cárie) e local de procedência, sendo: saliva (S), mucosa do palato (Pai), mucosa jugal (B), biofilme dental (PL) e dorso da língua (L),
131
6 t;)
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I ~t. COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA llliiil a. UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
I •• ,.. FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA
i UNICAMP CERTIFICADO
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certificamos que o Projeto de pesquisa Intitulado 'Secreção de protéli.ases por espécies de cand1dá Isoladas da cavidade bocal de <Jianças livre de cárle e cárte ativas", sob o protocolo n• 021/2002, da. Pesquisadora Rita de Cá!IS/11 Mllrdegan, sob a respoosabllldade do Prol. Dr. José Frallds<:O Htilllng, está de acordo cóm a Resolução !96/96 do Conselho Nacional de Sawe/MS, de I0/10/96, tendo sido aprovado pelo Comlt~ de Ética em Pesquisa - FOP.
Plrlldcaba, 06 de março de 2002
we à!rtlfy that tl10 research project with tide "Protelnases seaetion by Cl!ndlda spedes ISOlated from tha oral cavíty carles free and canes actívlty dtlldren', protocol n• 021/2002, by Researctter Rita de CIÍSSIII Mllrdeg;:m, responslblllty by Prol. Dr. José Fral\d$0(1 H6fling, I$ In agreement wi\h the ResoluUon !96/96 from National Commltiee oi Health/Health Department (BR) and was approved by the Ethk:al Commltiee In Resarch at tha Pirad<aba Dentlstry Schooi/UNICAMP (State Unlverslty of campinas).
IA (}e 9! .f e-vct '"' 1, . (]>róf IDr. dPeáro Luiz (j(psakn
Secretário CEP/FOP/UNlCAMP
Plradcaba, SP, 6ratll, March 06 2002
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CEP/FOP/UNICAMP
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