ENZIMAS. Relembrando... Estrutura de um átomo Átomos apresentam capacidade de ganhar ou perder...

ENZIMAS

Relembrando...

Estrutura de um átomo

Átomos apresentam capacidade de ganhar ou perder elétrons, formando novos sistemas eletricamente carregados, determinados ÍONS

ÍONS: espécie química que apresenta o número de prótons diferente do número de elétrons

Íons positivos: cátionsÍons negativos: ânions

Ligação iônica Ligação Iônica A BTendência ceder elétrons receber elétrons

Classificação metais H, semi e ametais

Interação cátions ânions

e-

Na Cl

1s2 2s2 2p6 3s1 1s2 2s2 2p6 3s2 3p5

p= 11n=12e= 11

p= 17n=18e= 17

Ligação Covalente A BTendência receber elétrons receber elétrons

Classificação H, semi e ametais H, semi e ametais

Interação Par de elétrons compartilhados

Ligação covalente

X X

A manutenção da vida depende de um conjunto de reações químicas que devem atender duas exigências fundamentais:

•precisam ser altamente específicas de modo a gerar produtos definidos;•devem ocorrer a velocidades adequadas à fisiologia da célula

C12H22O12 + 12O2 11H2O + 12CO2

Energia

Precisam ser catalisadas para ocorrer de forma rápida

?Energia

Características importantes

•Alto grau de especificidade por seu substrato;

•Aceleram reações químicas;

•Funcionam em soluções aquosas;

•A maioria funcionam em pH e temperatura fisiológicas

ENZIMASCatalisadores - aceleram a velocidade de uma reação química sem serem consumidos no processo. Como suas concentrações permanecem constantes eles são eficientes em pequenas quantidades.

+ +Enzima Substrato Produto Enzima

• Enzimas são catalisadores que aumentam a velocidade da reação de 5 à 17 ordens de grandeza.

Estrutura das enzimas

•Quase todas as enzimas são proteínas, como tal sua função depende da sua estrutura.

•A estrutura da enzima dependerá da sequência primária; secundária; terciária e quartenária.

Algumas enzimas requerem um co-fator

•Metais

• Moléculas orgânicas (coenzimas)

Coenzimas: Transportadores transitórios de grupos funcionais

• Quando o cofator está ligado fortemente a parte proteica da enzima ele é chamado de grupo prostético

• holoenzima: enzima cataliticamente ativa completa, juntamente com sua coenzima e/ou íon metálico ligado;

• Apoenzima ou apoproteína – parte protéica de uma enzima sem quaisquer co-fatores ou grupos prostéticos;

• Sítio ativo – região que forma a maquinaria para a reação química de catálise, é constituída por grupo de aminoácidos.

HOLOENZIMA

Íons metálico

sMoléculas orgânicas

Coenzimas

Porção protéicaAPOENZIMA

CofatorCofator

Durante a catálise coenzima e substrato estão alojados no sítio ativo da enzima onde ocorre a remoção de um grupo determinado do substratoe sua transferência para a enzima.

Quando o substrato sofre novas alterações nas reações metabólicas subsequente, a coenzima através de outra reação é reciclada.

Essa reciclagem permanente das coenzimas implica que a suas concentrações intracelular possam ser bastante reduzidas bem menor que a concentração em substrato.

Muitas coenzimas apresentam na sua estrutura um componente que não pode ser sintetizado pelo organismo. O precursor deve então ser obtido através da dieta = vitaminas

Classificação das enzimas

As enzimas são classificadas de acordo com o tipo de reação que catalisam.

• Oxido-redutases – enzimas que catalisam reações de óxido-redução, transferência de elétrons.

lactato piruvato

lactato desidrogenas

e

• Transferases – catalisam a transferência de um grupamento de uma molécula a outra.

alaninaα-

cetoglutarato L-glutamato

piruvato

alanina aminotransfera

se

• Hidrolases – catalisam a reação de hidrólise de uma única ou várias ligações covalentes por introdução de uma molécula de água.

peptidase

• Liases – catalisam reações adicionando ou removendo grupamentos.

piruvato

acetaldeído

piruvato carboxilase

H2O

• Isomerases – catalisam reações transferindo grupos dentro da mesma molécula formando isômeros.

Fosfoglicose isomerase

• Ligases – catalisam reações que ligam 2 moléculas

+

Acetil-CoA

acetil CoA carboxilase

Importância clínica das enzimas

• Deficiências – desordens, doenças

TirosinemiaEnzimas responsáveis pela degradação da tirosina. Acúmulo tirosina ou metabólitos tóxicos : fígado, rins e sistema nervoso central. Sintomas: Retardo mental associado à microcefalia, hiperatividade, distúrbios motores e no desenvolvimento da fala, lesões oculares e lesões cutâneas.

Fenilcetonúria (PKU) Maior prevalência mundial. Enzima: fenilalanina hidroxilase (conversão de fenilalanina em tirosina). Acúmulo tecidual de fenilalanina e seus metabólitos.Sintoma: retardo mental, eczemas, dermatites, despigmentação da pele, odor característico na urina e suor.Detectada a partir do teste do pezinho.

GalactosemiaEnzima: galactose-1-fosfato uridil-transferase, (que converte a galactose em glicose), Sintomas: anorexia, vômitos, catarata, hemorragia, letargia e atraso de desenvolvimento.

Intolerância a lactose

Não é degradada

Fermentadas por bactérias intestinais Gases, diarréia

FrutosemiaEnzima Aldolase B, (metabolismo frutose) Sintomas: convulsões, coma, hipoglicemia e enjôos frequentes após o consumo de frutose.

PorfiriasDeficiências enzimáticas na biossíntese do heme

• Diagnósticos – marcadores teciduais

Infarto do miocárdio

A e B precisam colidir em uma orientação favorável

O complexo A+B precisa atingir um certo nível de energia necessário para que a reação ocorra: ENERGIA DE ATIVAÇÂO

A + B C + D

Como as enzimas funcionam?

• As enzimas aceleram as reações pela facilitação da formação do estado de transição

• Ligam – se ao substrato de forma com que estes se disponham na orientação correta

• Estabilizam o estado de transição

E + S ES E + PComplexos de transição

A + B C + D

E + S ES E + P

• Reduzem a energia de ativação necessária para atingir o estado de transição

• As enzimas aceleram as reações pela facilitação da formação do estado de transição

• Como a energia de ativação é menor, um maior número de moléculas têm a energia necessária para atingir o estado de transição.

• Alteram a velocidade, não o equilíbrio da reação

• A primeira etapa da catálise enzimática é a formação do complexo enzima-substrato

O substrato se liga ao sítio ativo da enzima.

O sítio ativo é uma fenda tridimensional que possui aminoácidos que participam diretamente na geração e quebra de ligações.

Os substratos se ligam à enzima por vários tipos de interações fracas

• Especificidade com substrato: depende da estrutura em 3 dimensões - microambiente específico.

• Modelo chave e fechadura – o sítio catalítico é rígido e complementar à forma e ao tamanho do substrato.

• Modelo encaixe induzido – o sítio catalítico não está totalmente pré-formado, a enzima se ajustaria ao substrato.

A energia de ligação liberada para a formação das interações supre parte da energia necessária para chegar ao estágio de transição

E + S ES E + P

Mecanismos principais através dos quais as enzimas aceleram uma reação

• Catálise Ácido-Base

• Catálise Covalente

• Catalise por íon metálico

• Catálise Ácido-Base – que ocorre com a participação de aminoácidos com cadeias laterais ionizáveis, capazes de doar ou liberar prótons durante a catálise para estabilizar os intermediários (H+, OH-).

• Catálise Covalente – Neste tipo de catálise é formado uma ligação covalente transitória entre a enzima e o substrato.

• Catálise por íons metálicos – metais firmemente ligados ao sítio catalítico interage entre a enzima e o substrato estabilizando o estado de transição.

Cinética enzimática

Estudo da velocidade de uma reação e como ela altera frente as mudanças dos parâmetros

A velocidade da reação pode ser medida por:

•Quantidade de produto formado por unidade de tempo

•Quantidade de substrato consumido por unidade de tempo

Atividade enzimática pode ser medida pela velocidade da reação catalisada

tempo

[pro

duto

]

[S]

Velo

cida

de d

a re

ação

Um dos principais fatores que alteram a velocidade de uma reação é a concentração de substrato.

Em baixas [S], a velocidade aumenta quase que linearmente. Com o aumento de [S], a velocidade aumenta cada vez menos.

Para: S PΚ

V = [S]Κ

Como medir a influência do substrato na velocidade da reação?

Pela medida de V0 ou velocidade inicial

Para uma determinada [S] inicial, haverá um intervalo de tempo em que a velocidade da reação será relativamente constante, chamada de Vinicial, V0

ou simplesmente V da reação

Velocidade a reação é proporcional a S

Substrato satura todasAs enzimas

Representação de uma reação enzimática em 2 etapas

Primeira reação: mais curta. Estabilidade dinâmica entre [E+S] e

[ES] é rapidamente alcançada

Segunda reação: mais lenta. É a etapa limitante. Velocidade da

reação deve ser proporcional a [ES]

E + S ES E + Pk1

k-1

k2

A velocidade máxima ( Vmax) da reação é atingida quando todas as enzimas estiverem no complexo [ES].

Neste momento a enzima está saturada e a velocidade não aumenta.

A [S] em que atinge metade da Vmax é Km

A relação entre [S] e V0 da reação pode ser expressa algebricamente pela equação de Michalis e Menten.

Velocidadeinicial

Concentração substrato

Constante de Michaelis

Considerações

Vmax – Toda enzima em forma de ES

Quando ocorre, alcança estado estacionário: [ES] é constante

[E] = [Et]-[ES] V0 = k2 [ES]

E + S ES E + Pk1

k-1

k2

Estado estacionário : [ES] constante

Então no estado estacionário: Formação de [ES] = Degradação de [ES]

Velocidade de Formação de ES = K1 [E] [S]

Velocidade de degradação de ES = K –1[ES] + K2 [ES]

E + S ES E + Pk1

k-1

k2

K1 ([Et]-[ES]) [S] = K –1[ES] + K2 [ES]

K1[S][Et] - K1[S][ES] = (K –1+ K2) [ES]

Já que Formação de [ES] = Degradação de [ES]

[ES] = [Et] [S]

[S] + (K –1+ K2) / k1)

Km

[ES] = [Et] [S]

Km + [S]

Equação de Michaelis-Menten

[ES] = [Et] [S]

Km + [S] Se V0 = k2 [ES]

Em Vmax : [Et] = [ES]

Então Vmax = k2 [Et]

Então: V0 = k2 [Et] [S]

Km + [S]

Sendo assim Vo = Vmax [S]

Km +[S]

E + S ES E + Pk1

k-1

k2

2

Km= [S]2 . [S] - [S] Km =

Uma propriedade importante:

Quando V = Vm Vm = 2

Vm . [S]

Km +[S]2 [S]Km + [S] =

Propriedades importantes de Km É numericamente igual a [S] na qual a velocidade da reação é metade da Vmax.

Característico de cada enzima.

Reflete a afinidade da enzima pelo seu substrato.

Km = [S]

1

[S]

1

v

-1

Km

11

VmaxVmax

Gráfico Linewevear-Burk: Linearizando a equação de Michaelis e Menten

Consequências importantes de Km

Km Afinidade da enzima pelo substrato

Km Afinidade da enzima pelo substrato

Vmáx

v

V/2

1/V

Km Km -1/Km -1/Km1/s[S]

Fatores que afetam a velocidade enzimática

pH Temperatura Concentração de substratos Concentração de cofatores Presença de Inibidores e/ou ativadores Modificações químicas: fosforilações, adenilações, etc Concentração de enzima

Pepsina pH ótimo 1,5

Tripsina pH ótimo 7,7

pH

• pH do meio esta ácido;• excesso de íons H+ no meio;• os aa recebem H+, ficando

eletricamente positivo.

A ionização de aa pode provocar modificações na conformação da enzima.

• pH do meio esta alcalino;• concentração reduzida de íons

H+ no meio;• os aa liberam H+, ficando

eletricamente negativo.

Temperatura Temperatura ótima da reação

A velocidade de reação aumenta junto com a temperatura, como se observa na maioria das reações químicas;

Após atingir uma temperatura crítica, a estabilidade da proteína decresce devido a desnaturação térmica.

Concentração de Enzima e substrato

A velocidade máxima da reação é uma função da quantidade de enzima disponível (se há substrato em excesso).

Reações enzimáticas com mais de um substrato

Sequencial (formação do complexo ternário)

Pingue-pongue ou duplo deslocamento

Inibição enzimática

InibidoresReversíveis

IrreversíveisInib. Competitiva (freqüente)

Inib. Não-competitiva

Inib. acompetitiva (quando o inibidor liga-se ao complexo ES , mas não a enzima livre)

Inibidores de enzimas são moléculas que interferem com a catálise diminuindo ou interrompendo as reações enzimáticas. Quanto ao tipo de inibição:

inibição inespecífica: diminuição da atividade de todas as enzimas por temperatura, pH ou agentes desnaturantes (ex. uréia).

inibição específica: agente inibidor diminui a atividade de uma enzima específica ou de um grupo restrito de enzimas. A inibição pode ser irreversível ou reversível.

Inibidor irreversível

Intoxicação por carbamatos ou organofosforados

Liga - se a enzima levando a sua inativação definitiva

Chumbinho

Acetil colina (Ach)

Acetil colinesterase

Colina

Acetato

Carbmatos

Inibidores reversíveis1) Inibidor Competitivo

Inibidor análogo não metabolizável do substrato compete com o mesmo pelo sítio catalítico da enzima livre.

É necessário [S] maior para deslocar o inibidor.

Semelhança estrutural entre S e I

1- sem inibidor 2- com inibidor [ I ] 3- com inibidor 2 [ I ]

Inibidor Competitivo

Km é modificado, mas Vmáx não é alterada.

2) Inibidor Não-Competitivo

Inibidor se liga numa região deferente do sítio catalítico da enzima.

[S] maior não diminui a inibição.

Não há semelhança estrutural entre S e I

1- sem inibidor2- com inibidor [ I ]3- com inibidor 2[ I ]

Vmáx diminui, mas o Km não é alterado.

Inibidor Não-Competitivo

3) Inibidor acompetitivo

O inibidor se liga somente no complexo ES em sítio próprio.

Inibidor não possui semelhança estrutural com o substrato.

Não há semelhança estrutural entre S e I

Km e Vmáx da enzima diminuem.1- sem inibidor2- com inibidor [ I ]3- com inibidor 2 [ I ]

Inibidor Acompetitivo

Regulação de perfusão renalAgregação plaquetáriaProtetora de mucosa gástrica

Inflamação

Inibidores das COX – Antiinflamatórios Não Esteroidais (AINES)

Inibidor irreversível da COX Ligação covalente

Ácido acetil salicílico

Inibidor competitivo e reversível da COXInteração iônica

Dipirona sódica

Inibidor competitivo e reversível da COX-2

Meloxicam

Inibidor competitivo e reversível (alta afinidade) da COX-2

Celecoxib

Regulação da atividade enzimática

Alostérica: Funcionam através da ligação não-covalente e reversível de um metabólito regulador (modulador)

Covalente: Regulação da atividade enzimática por modificação covalente reversível

Proteolítica: O precursor inativo (zimogênio) é clivado para formar a enzima ativa

Um organismo regula a atividade de algumas enzimas para coordenar seus processos metabólicos

Enzimas alostéricasSão maiores e mais complexas, possuem duas ou mais cadeias

polipeptídicas.

Não obedecem a cinética de Michaelis-Menten.

Tipos de enzimas alostéricas: homotrópica (modulador é idêntico

ao substrato); heterotrópica (modulador é diferente do substrato)

A ligação entre o modulador e o enzima é não-covalente e o local

de modulação é especifico para cada modulador, no caso dos

enzimas heterotrópicos

Modulador alostérico

Positivo(ativam a enzima)

Negativo(inibem a enzima)

Heterotropismo(o modulador é diferente do

substrato)

Homotropismo(o modulador é igual ao

substrato)

Enzimas homotrópicas: pequenas variações na concentração do modulador podem provocar grande variações na atividade do enzima.

Enzimas heterotrópicas: Apresentam uma grande variabilidade no comportamento.

Induz

Modificações conformacionais na estrutura

espacial do enzima

Modifica a afinidade do enzima para com os seus

substratos

A B C D E-

Feedback negativo

Coordena o fluxo de enzimas por uma via

metabólica.

Um modelo muito comum de regulação alostérica é a inibição por

retroalimentação, onde o próprio produto da reacção actua como modulador da

enzima que a catalisa.

Regulação por modificação covalente

A regulação enzimática pode passar ainda pela existência de um precursor, sem capacidade catalítica, que, no caso

das proteases, são chamados zimogênios.

Zimogênio Clivagem proteolítica

Enzima ativa

Ativação proteolítica