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Diagnóstico microbiológico de las infecciones por micobacterias

Juan Carlos Rodríguez

S. Microbiología

Hospital General

Universitario de Alicante

Características de los microorganismos

Características de los microorganismos del

género Mycobacterium � Bacterias aerobias� Bacilos curvados� No se tiñen por la coloración de Gram� Tienen ácidos micólicos en la pared, por lo que son ácido-alcohol resistentes

� Crecimiento lento (tiempo de generación entre 2 y 20 horas)

� El género incluye más de 60 especies, algunas patógenas y otras saprófitas

� Necesitan tratamientos especiales y no responden a los antibióticos habituales

Características de los microorganismos del

género Mycobacterium

� No crecen en los medios de cultivo habitualmente utilizados en los laboratorios de Microbiología. ¡¡Hay que solicitar expresamente su aislamiento!!

� Mediante la tinción de Gram no se visualizan, ¡hay que hacer tinciones especiales!

� Los cultivos tardan semanas

Mycobacterium tuberculosis complex

� El complejo está formado por varias especies:� M. tuberculosis (causa la mayoría de los casos)

� M. bovis: Se transmite además, por leche de vaca con tuberculosis. Resistente a pirazinamida

� M. africanum

Mycobacterium

Mycobacterium

Características de la tuberculosis

Características clínicas de la tuberculosis� Fue descrita por Koch en 1886� Generalmente se contagia por inhalación, en pocas ocasiones por ingestión y excepcionalmente por inoculación cutánea

� En pacientes inmunocompetentes, afectación pulmonar en el 80% de los casos y extrapulmonar en el 20%

� En pacientes con HIV se produce afectación extrapulmonar en el 30-60% de los pacientes

Distribución de la tuberculosis extrapulmonar

� Linfática: 30%� Pleural: 23%� Genitourinaria: 12%� Osea: 10%� Miliar: 7%� Meningea: 5%� Peritoneal:3%� Otras: 10%

Patogenia de la tuberculosis-1� Cuando nos infectamos, el microorganismo llega al pulmón

� Se produce una bacteriemia� El sistema inmune reacciona y generalmente controla la infección, quedando los microorganismos acantonados en algunas células humanas (persiste intracelularmente durante largos periodos de latencia).

� La activación del sistema inmune se produce la positividad del Mantoux

Patogenia de la tuberculosis-2� Si el sistema inmune no controla la infección, se desencadena la enfermedad clínica llamada TBC primaria (generalmente en los dos primeros años).

� Puede haber reactivaciones cuando se deteriora el sistema inmune, muchos años después de la infección:

SIDA, ancianos, inmuno-

deprimidos

Transmisión de la tuberculosis

� Sólo son infecciosos los pacientes con tuberculosis pulmonar

� Se puede adquirir la enfermedad tras un contacto ocasional con un paciente tuberculoso, pero generalmente es necesario un contacto prolongado (familiares, etc.)

Diagnóstico de la tuberculosis

Prueba de Mantoux� También llamado, prueba de la tuberculina, útil para

el diagnóstico de la tuberculosis latente� Es una intradermorreacción tras inoculación de un

extracto antigénico de M. tuberculosis� Si el paciente ha estado en contacto con el

microorganismo, se desencadena una reacción del sistema inmune que produce induración

� El Mantoux positivo indica contacto con el microorganismo, pero no siempre se asocia a enfermedad

Prueba de Mantoux

Quantiferon TB� Nueva alternativa al Mantoux, ya que éste presenta reacciones cruzadas con otras micobacterias y con la vacunación

� Se basa en que dos proteínas de M. tuberculosis (ESAT-6 y CFP-10) estimulan al sistema inmune e inducen una fuerte producción de IFN-gamma por las células CD4

� Estos antígenos están ausentes en la mayoría de las micobacterias, incluído BCG, excepto M. kansasii, M. marinum y M. szulgai

Quantiferon TB

� La sangre del paciente se incuba toda la noche con los antígenos (obtenidos de forma sintética)

� Se detecta la presencia de interferon

Muestras a procesar� Pulmonar: 3 muestras de esputo, BAS, BAL, aspirados gástricos

� Linfática: Punción del ganglio � Pleural: Líquido o biopsia pleural� Genitourinaria: 3 muestras de orina de tres días (más de 25 ml)

� Osea: Material quirúrgico� Miliar: Muestras respiratorias, orina, sangre y otras muestras

� Meningea: LCR

Diagnóstico de la tuberculosis pulmonar� La muestra más utilizada es el esputo� Es necesario procesar tres esputos, obtenidos en días distintos (el primero de la mañana)

� Procesar esputos de calidad, no saliva� Un elevado porcentaje de enfermos (30-40%) pueden tener tb pulmonar y tinción negativa

� En niños o adultos que no expectoran puede utilizarse el jugo gástrico (añadir carbonato sódico para neutralizar el ácido del estómago), pero puede haber micobacterias no tuberculosas

Diagnóstico de la tuberculosis pulmonar� También pueden utilizarse muestras invasivas:� Aspirado bronquial (BAS)� Lavado broncoalveolar (BAL)� Cepillado bronquial� Biopsia transbronquial� Aspirado transtraqueal� Biopsia pulmonar, obtenida quirúrgicamente

� Los esputos obtenidos en los dias siguientes a estos procedimientos son muy rentables

Tuberculosis extrapulmonar

� En general hay pocas micobacterias, por lo que hay que procesar la mayor cantidad de muestra posible, por tanto, las muestras en torunda no son útiles

� La tinción suele tener escasa rentabilidad

� Diagnóstico semejante a la tb pulmonar

Tuberculosis genitourinaria

� Es necesario procesar al menos tres muestras de tres días distintos

� Es más rentable la primera orina de la mañana, ya que es la que está más tiempo en contacto con la pared de la vejiga

� Es necesario procesar 25 ml como mínimo

Cultivo de heces

� En la flora gastrointestinal puede haber micobacterias no tuberculosas como flora saprofita

� Sólo es útil cultivar las heces en pacientes con HIV para aislar M. avium-intracelullare

� Si se aísla en heces, hay más riesgo de tener una bacteriemia por este patógeno

Lisis-centrifugación

� Util para el diagnóstico de las infecciones por micobacterias en muestras de sangre

� La sangre se extrae en un tubo especial con saponinas que lisan las células sanguineas y permiten la salida de las micobacterias

� Se centrifuga y le sedimento se procesa como el resto de las muestras para micobacterias (medios líquidos y sólidos)

Lisis-centrifugación

Tinción� Se basa en demostrar la existencia de bacilos ácido-alcohol resistentes en la muestra

� La tinción de Ziehl Neelsen utiliza fuschina y azul de metileno y se observa a 1000 aumentos en microscopio óptico

� La tinción de auramina se observa a 200 aumentos en microscopio de fluorescencia

� La sensibilidad es de 50-75% dependiendo de la calidad de la muestra

� No diferencia las especies del género

Ziehl Neelsen

Densidad de la población bacilar en función de la localización

LESION Nº BACTERIAS

Nódulos 100-1.000

Gánglios 100-100.000

Riñón 100.000

Cavernas pulmonares 10-100.000 millones

Meninge y pleura 100-100.000

Hueso 1-100.000 millones

Tinción positiva Mas de 100.000

Tinción negativa 100-100.000

Cultivo� Puede hacerse en medios sólidos o líquidos� Se incuban 2 meses, aunque suelen ser positivos

entre 2 y 4 semanas. El rango de crecimiento está entre 2 días y 8 semanas.

� Se incuban a 37ºC salvo algunas excepciones� Los medios sólidos se leen cada semana, mientras

que los líquidos tienen lectura diaria automatizada� Siempre hay que hacer cultivo porque mejora la

sensibilidad, la especificidad y permite estudiar la sensibilidad de la cepa

Cultivo en medio sólido� Cultivos con base de huevo:

� Lowenstein Jensen� Coletsos� Petragnani

� Cultivos con base de agar:� Middelbrook 7H10� Middelbrook 7H11

� Medios selectivos:� Adición de antibióticos

Cultivo sólido

Colonias de Mycobacterium

Cultivo en medio líquido� Clásicos:

� Middlebrook 7H9� Dubos

� Semiautomáticos: Detectan el metabolismo bacteriano mediante el estudio del consumo de oxígeno y la producción de anhídrido carbónico� BACTEC� ESP� MGIT

Cultivos líquidos semiautomáticos� Utilizan caldo Middlebrook � La positividad de la máquina debe confirmarse mediante tinción y cultivo en medio sólido

� Detecta la presencia de micobacterias en menos tiempo que en medio sólido

� Es más sensible que el medio sólido, por lo que es útil en muestras con pocas bacterias (tuberculosis extrapulmonar)

Medios líquidos

Nuevos métodos diagnósticos

� Recientemente se han desarrollado métodos diagnósticos rápidos basados en la reacción en la cadena de la polimerasa (PCR)

� Utiles en muestras respiratorias con tinción negativa y alta sospecha clínica

� Más útiles en muestras con pocas bacterias, como las extrapulmonares

PCR

PCR a tiempo real

Sensibilidad antibiótica

Estudios de sensibilidad

� Tratan de predecir la eficacia de un fármaco frente a la cepa del enfermo

� Es necesaria la cepa, luego debe hacerse siempre cultivo de las muestras de los pacientes

� Puede hacerse por métodos clásicos o mediante técnicas de biología molecular

Estudios in vitro

� Antibiograma:� Se realiza con medios sólidos o líquidos con antibióticos incorporados. Los antibióticos activos no dejaran crecer al microorganismo

� Detección de genes de resistencia: � Puede detectarse la presencia de mutaciones de algunos genes por biología molecular, como el que codifica resistencia a rifampicina o a las fluoroquinolonas

Estudios in vitro

Fármacos antituberculosos

� 1ª línea: Isoniacida, rifampicina, etambutol, pirazinamida

� 2ª línea: Estreptomicina, ofloxacino, levofloxacino, moxifloxacino, linezolid, ácido paraaminosalicílico (PAS), capreomicina, kanamicina, etionamida, cicloserina, etc.

Isoniacida y rifampicina

� Son los fármacos mejores� Bactericidas� Se toleran bien en dosis única diaria por vía oral

� Baratos� Pocos efectos secundarios� Difunden bien a todos los órganos y tejidos

Mutantes resistentes a los fármacos

FARMACO Nº BACILOS

Isoniacida 100.000-1 millón

Rifampicina 10-100 millones

Etambutol 1 millón

Estreptomicina 100.000- 1 millón

Pirazinamida 100-10.000

INH+RMP+ETB 1019 bacilos

INH+RMP+PZ 1016 bacilos

Resistencias� Dentro de una cepa existen microorganismos

intrínsecamente resistentes a los antibióticos, por lo que nunca se puede emplear la monoterapia y se debe controlar la adherencia al tratamiento

� Puede aparecer resistencias primarias (la cepa era resistente cuando infectó al enfermo) o secundarias (por mal cumplimiento del tratamiento, la cepa se hace resistente)

� Se considera que un microorganismo es multirresistente (MDR-TB) si presenta resistencia a isoniacida y a rifampicina; si además es resistente a fluoroquinolonas y a uno de los fármacos inyectables (amikacina, kanamicina, capreomicina) se llama XDR

� Recientemente se han descrito los TDR

Resistencias

Tuberculosis en EspañaIncidencia estimada/

100.000 h

Resistencias primarias a isoniacida

España 25-49 Barcelona: 3,5

Madrid: 2,7-4

Guipuzcoa <3

Colombia

Perú

25-49

100-300

8,5

9,0

Marruecos

Nigeria

100-300

>300

7,8

5,6-16,5

India

China

100-300

100-300

15,4

6,1-24

Rusia

Italia

100-300

25-49

19,4

5,6

Otras especies del género

Identificación de los microorganismos� Crecimiento lento y no cromógenas (>7 días): M. tuberculosis, M. bovis, M. avium intracellulare, M. malmoense

� Crecimiento lento y fotocromógenas: M.kansasii y M. marinum

� Crecimiento lento y escotocromógenas: M. gordonae, M. scrofulaceum

� Crecimiento rápido (< 7 días): M. fortuitum, M. chelonae

Pruebas bioquímicas� Es un método lento y difícil de poner a punto en los laboratorios

� Están siendo desplazadas por las técnicas de biología molecular

� Las más importantes son:� Producción de niacina� Producción de nitratos� Producción de catalasa� Hidrólisis del tween

Cultivo sólido

Colonias de Mycobacterium cromógenas

Técnicas moleculares� Rotura de la bacteria (sonicación y calor)� El DNA extraído se pone en contacto con unos cebadores (primers) especificos de todas las especies del género Mycobacterium

� El termociclador amplifica las secuencias si hay DNA de este género

� El amplificado se pone en contacto con una membrana de nylon en la que hay fijadas unas sondas específicas de las principales especies de micobacterias

� Aparece una banda en la especie que hibrida

Amplificación y detección mediante sondas (LIPA)

LIPA

Secuenciación del 16 S� Este fragmento del DNA bacteriano tiene extremos comunes a todas las bacterias y un fragmento medio característico de cada especie bacteriana

� Se hace una PCR con cebadores que se unen a la zona estable de los extremos

� Se secuencia las bases de la zona media� Se envía a secuencia de bases a Gen Bank por internet

� La base de datos responde con el nombre de la especie bacteriana

Secuenciación del 16 S

Secuenciación del 16 S

Secuenciación del 16 S

Secuenciación del 16 S

Secuenciación del 16 S

Mycobacterium leprae� Bacilo de Hansen� Produce la lepra� En el diagnóstico son muy importantes los datos clínicos y epidemiológicos

� No crece en medios de cultivo artificiales, por lo que sólo se puede diagnosticar por tinción

� Biopsias cutáneas, moco nasal o biopsia de tronco nervioso engrosado

� Dapsona, rifampicina, acedapsona, clofazimida

Mycobacterium leprae

Mycobacterium leprae

Micobacterias ambientales oportunistas

� Responsables de las micobacteriosis� Afectan principalmente a pacientes inmunodeficientes, niños y pacientes con procesos pulmonares crónicos

� Reservorios: Agua, suelo, aves y otros animales

� No hay transmisión interhumana

Micobacterias ambientales oportunistas

Infección pulmonar Avium, Kansasii, Malmoense, Fortuitum

Diseminada en inmunodeprimidos

Avium, genavense

Linfadenitis en niños Avium, kansasii, scrofulaceum, haemophylum, abscessus

Piel y partes blandas Fortuitum, peregrinum, chelonae, abscessus, marinum, kansasii

Osteoarticulares Fortuitum, mucogenicum, peregrinum, chelonae, abscessus, marinum

Asociada a catéteres Chelonae, mucogenicum

M. avium-intracellulare

� Produce enfermedades diseminadas, diarreas y cuadros pulmonares en pacientes con HIV

� También infección de ganglios linfáticos en inmunocompetentes,frecuentemente en niños

� Muestras a procesar: sangre, médula ósea, heces, esputos

� Claritromicina, etambutol, rifabutina, azitromicina, ciprofloxacino, amikacina

M. fortuitum complex� Lesiones cutáneas y de tejidos blandos, queratitis e infecciones de prótesis

� Crecimiento rápido� Crece en medios habituales de las otras bacterias (agar sangre y agar chocolate)

� M. fortuitum, M. chelonae, M. abscessus, M. mucogenicum

� Amikacina, cefoxitina, ciprofloxacino, claritromicina

M. kansasii

� Clínica semejante a la tuberculosis, con formas pulmonares y extrapulmonares

� Infecciones diseminadas en inmunodeprimidos

� Isoniacida, rifampicina, etambutol, estreptomicina

M. genavense

� No crece en medios sólidos, sólo en medios líquidos

� Infecciones sistémicas en pacientes con HIV, semejantes a las infecciones por M. avium

� Etambutol, rifampicina, rifabutina, clofazimida, claritromicina

M. marinum

� Crece mejor a 30ºC, por lo que se debe indicar cuando haya sospecha clínica

� Lesiones de tejidos blandos asociadas a lesiones con espinas de pesado, acuarios, agua de mar, etc.

� Claritromicina, minociclina, cotrimoxazol,rifampicina, etambutol

M. marinum