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Curso Básico de Cromatografía de Líquidos
de Alta ResoluciónHPLC
(High Pressure Liquid Chromatography)(High Performance Liquid
Chromatography)(High Priced Liquid Chromatography!!!!)
BUAP-CUV Sep.,12, 2008
2
Definición.
Cromatografía es una técnica analítica basada en la separación parcial o total de los componentes de una mezcla como consecuencia de su migración diferencial en un sistema dinámico formado por una fase estacionaria y una fase móvil.
3
Inyección Migración Elución
Separación de los componentes de una muestra
Fase móvil
Proceso de separación cromatográfica
Fase estacionaria
Mezcla
4
Etimología
El botánico ruso Mikhail Semyonovich
Tswett (1872-1920), es conocido como el
“padre de la cromatografía”, como
resultado de sus experimentos en los
cuales usó columnas tipo gis “chalk” para
separar pigmentos extraídos de hojas.
Tswet presentó los principios básicos de
su método de separación en 1902,
después publicó dos artículos en 1906
en los cuales llamó al método
cromatografía.
5
Clasificación
De acuerdo a la naturaleza de la fase móvil, la cromatografía se clasifica en :
CROMATOGRAFIA DE GASES (Gas)
CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS (Líquido)
En ambos casos , la fase estacionaria se encuentra contenida en una tubería llamada COLUMNA.
6
Cromatografía
LSC
Partición (Reparto)
Exclusión portamaño.
Intercambio iónico.
GSC
Empacada
Capilar
GLC
Empacada
Capilar
Clasificación
7
Mecanismos de Separación
INTERCAMBIO IÓNICO
EXCLUSIÓN
PARTICIÓNXm
S ADSORCION
8
Aplicaciones Generales
Forense
Agropecuaria
Alimentos y Bebidas
Ambiental y Forestal
Farmacéutica
ClínicaBioquimica Polímeros
9
Aplicaciones Generales
Insecticidas: carbamatos, organofosforados
Fungicidas: benzimidazoles, carbamatos
Herbicidas y reguladores del crecimiento: ureas,
fenilureas, triazinas, glifosatos( diquat/paraquat)
Aflatoxinas: B1, B2, G1, G2
Micotoxinas: deoxinivalenol (DNO)
Acidos Fenólicos, Carbohidratos
Proteínas, Aminoácidos
Antocianinas
Vitaminas Liposolubles e Hidrosolubles
Drogas de Abuso
Antibióticos,Esteroides,Analgésicos
10
Sistema Cromatográfico,
FASE MÓVIL
BOMBAINYECTOR
CO
LU
MN
A
DETECTOR SISTEMA DE DATOS
11
Proceso de separación cromatográfica
12
Tiempo de Retención
to= tiempo muerto
tr= tiempo de retención absoluto
t´r= tiempo de retención relativo
tR
t´r= tr-to
´ < 20
13
Factor de Capacidad
14
Resolución (R)
• Mide la separación entre dos picos
• Considera la distancia y el ancho entre dos picos adyacentes
15
Resolución (R)
R = ___( tr2-tr1)___
1/2(W1 + W2)
tr2,tr1= tiempos de retención de ambos picos
W1,W2= anchos de pico en la base
16
Resolución (R)
Resolución vs Concentra-ción.•Para columnas nuevas es recomendable que R> 1.5
17
Resolución (R)
La curva Gaussiana representa la distribución estadistica resultante de las moléculas en el espacio que ocupan
18
Resolución (R)
Existen tres fuentes que contribuyen al ensanchamiento de bandas:
La eficiencia de la columna es una función de la longitud de la columna y del tamaño y uniformidad de las partículas
19
Resolución (R)
Existen tres fuentes que contribuyen al ensanchamiento de bandas:
20
• Mide los efectos de ensanchamiento de pico que se presentan cuando un componente migra a través de la columna
Eficiencia (N) [número de platos teóricos]
21
Altura Equivalente de un Plato Teórico (HETP)
• La HETP relaciona la longitud de la columna con el número de platos teóricos.
• Valores de HETP más pequeños -> columna más eficiente.
22
Altura Equivalente de un Plato Teórico (HETP)
• La Ecuación de Van Deemter es una expresión teorica que define la eficiencia de la columna. Es la suma de los tres elementos que contribuyen al ensanchamiento de las bandas
23
Altura Equivalente de un Plato Teórico (HETP)
A = Difusión de Eddy
B = Difusión Longitudinal
C = Resistencia a la
transferencia de masa
µ = Flujo de fase móvil
24
Eficiencia (N, Número de Platos teóricos )
• Número de veces que un componente presenta un estado de equilibrio entre las dos fases
• Se expresa cuantitativamente como el Número de Platos Teóricos
25
Selectividad, α
• Selectividad es la medida de que una columna pueda distinguir entre dos componentes
Se ajusta al hacer cambios de fase móvil y fase estacionaria
26
Resolución vs Selectividad, Capacidad y Eficiencia
27
Resolución vs Selectividad, Capacidad y Eficiencia
• Rs = 0.8
• N = 7000
• α = 2.1
• .´~1
28
Teória en práctica
• pico1 Tr=5.0
• pico2 Tr=6.2
• To=1.3
• W1=0.13
• W2=0.15
• L=25cm
• Calcular:.´, α, R, N y HETP
29
Definiciones en Resumen
Eficiencia• Cuan estrechos son los picos
– Medida del desempeño de la columna/fase estacionaria
Factor de Capacidad• Cuan bien es retenido un compuesto
Selectividad• La retención relativa de 2 compuestos
Resolución• La separación relativa de 2 compuestos
• Evalua la separación en su totalidad
30
Optimización de una Separación – Factor de Capacidad
Para optimizar el Factor de Capacidad:
Ajustar la fuerza del solvente
Cambiar la fase estacionaria (columna)
31
Optimización de una Separación– Selectividad
Para optimizar la Selectividad (separación):
Cambiar la composición de la fase móvil
Usar aditivos en la fase móvil
Cambiar la fase estacionaria
Cambiar el pH y/o la temperatura
32
Optimización de una Separación– Eficiencia
Para optimizar la eficiencia de la columna :Disminuir el tamaño de partícula
Emplear el flujo acorde al mínimo de la grafica HETP
Emplear un solvente menos viscoso
Incrementar la temperatura de la columna
Incrementar la uniformidad de la partícula
33
II. Instrumentación
2.1 Fase móvil
2.2 Sistema de bombeo
2.3 Inyectores
2.4 Columnas
2.5 Detectores
34
FASE MÓVIL
BOMBAINYECTOR
CO
LU
MN
A
DETECTOR SISTEMA DE DATOS
SISTEMA CROMATOGRAFICO
35
Preparación de la Fase Móvil
Seleccionando la Fase móvil correcta• La consideración principal al elegir un sistema de
solventes es seleccionar uno que separe adecuadamente los analitos. Además de la calidad en la separación, la fase móvil debe:
• No alterar la columna ni sus características
• Ser compatible con el detector
• Disolver la muestra
• Tener una viscosidad baja
• Permitir la recuperación fácil de la muestra, si es necesario.
• Ser de pureza elevada y no tóxico
• Ser comercialmente disponible a un precio razonable
2.1 Fase Móvil - Caracteristicas
36
A) FILTRACIÓN
MEMBRANAS
Material
Tamaño de Poro
2.1 Fase Móvil - Preparación
37
B) DESGASIFICACIÓN
Gas Inerte
2.1 Fase Móvil - Preparación
He
Ultrasonido
Agitación y vacío
38
B) DEGASIFICACIÓN
2.1 Fase Móvil - Preparación
39
C) PREMEZCLADO
2.1 Fase Móvil - Preparación
Es recomendable medir los volumenes individuales y mezclarlos en un reservorio comun.
Cuando se mezclan solventes orgánicos con agua siempre se obtiene un V de mezcla negativo.
Para preparar MeOH/Agua 50/50, no se debe colocar 500 ml de metanol en el matraz aforado y añadir 500 ml de agua porque no serian suficientes para llevar al aforo.
40
D) BUFFERS
2.1 Fase Móvil - Preparación
Los buffers seran necesarios cuando se analicen muestras que contengan analitos ácidos o básicos.
Las concentraciones recomendadas son del orden de 10 a 20 mM; de ser necesaria una mayor concentración asegurarse que no se presente precipitación.
Recordar que el intervalo de amortiguamiento es de máximo +/-1.5 unidades en torno al valor de pka (ver tabla).
El pH debera ajustarse en el buffer acuoso (teniendo considerado la modificación del pH por el solvente orgánico).
41
D) BUFFERS
2.1 Fase Móvil - Preparación
Recordar que el intervalo de amortiguamiento es de máximo +/-1.5 unidades en torno al valor de pka (ver tabla).
42
D) BUFFERS
2.1 Fase Móvil - Preparación
43
ACERO INOXIDABLE
PEEK
2.1 Fase Móvil – Mantenimiento Preventivo
P/N: 28-211524-00 SOLVENT BOTTLE FILTER 10 µM, TITANIUM
P/N: 27-180387-00 SOLVENT RESERVOIR FILTER, 10 UM, SS
44
Pureza de disolventes
Verifique con los proveedores el rango apropiado de trabajo en UV de los disolventes
•El oxígeno disuelto incrementa la abs en la región del UV lejano.Esnecesario desgasificar para lograr alta sensibilidad en esta región.•La absorción del oxígeno causará drift y ruido. Depende de la temperatura
•Las sales de par iónico (TMA) pueden contener impurezas que absorben en la región UV. Usar de la más alta pureza
45
Preparación de la Fase Móvil
Filtración• Mantener los reservorios tapados.
Cuidados con disolventes
46
Preparación de la Fase Móvil
Solventes para fase inversa• La mayoría de la LC por fase reversa utiliza agua
como el componente principal de la fase móvil
• El agua es el líquido polar más común
• Casi todos todos los compuestos, excepto los más polares o más iónicos, experimentan una fuerza hidrofóbica fuerte que los conduce a la fase estacionaria y causa su retención
• Se debe utilizar siempre agua grado hplc
Solventes
47
Preparación de la Fase Móvil
Solventes para fase inversa• El ajuste de la concentración orgánica del modificador
B es el medio primario de cambiar la retención
• Los tres más comunes son acetonitrilo, metanol y tetrahidrofurano
Solventes
48
Preparación de la Fase Móvil
Solventes para cromatografia de iones• La cromatografía en fase normal utiliza mezclas.
• utiliza un buffer acuoso a un pH que mantenga a los analitos con carga.
• Para los ácidos, el pH debe ser mayor a 5
• Para las bases, el pH debe ser menor a 5
• Mientras que la concentración del buffer aumenta, aumenta la fuerza solvente y la retención disminuye
• Se puede agregar solvente orgánico para cambiar la retención y la selectividad
• El metanol se elige generalmente porque proporciona una mejor solubilidad
Solventes
49
Preparación de la Fase Móvil
Solventes para cromatografia de iones• El reactivo de par iónico es generalmente un ion de
cadena corta
• Para la separación de bases protonadas se utiliza el pentan sulfonato, hexan sulfonato, o el heptan sulfonato
• Para la separación de ácidos ionizados, se emplea el tetraetil-amonio o el tetrabutil-amonio
Solventes
50
Preparación de la Fase Móvil
Programación de Solventes• Las condiciones a considerar cuando se elige la fuerza
óptima de fase móvil son resolución, duración del análisis y el factor de la capacidad
• La resolución debe siempre ser por lo menos 1.5 para análisis de cuantificación
• Tiempos de análisis más cortos pueden ser alcanzadas usando un solvente más fuerte para los picos suficientemente resueltos
• Una buena referencia es hacer que todos los picos se eluyan con con valores de k ' entre 1-20
Solventes
51
Operar a presiones elevadas
Libre de pulsaciones
Inerte
Operar con gradiente de solventes
2.1 Bombas - Caracteristicas
52
Objetivo de la Bomba
En la cromatografía clásica, la separación se realiza por efecto de la gravedad (Tamaño de partícula 50-100 micrometros, tiempo de separación de una a varias horas)
La disminución de tamaño de partícula como soporte de la fase estacionaria (3, 5 o10 micras) exige forzar al líquido a cruzar a través de la columna por medio de una bomba.
Las bombas comerciales basan su diseño en pistones reciprocantes
53
FASE MÓVIL
FASE MÓVIL
Funcionamiento de la Bomba
54
•El disolvente es entregado por la bomba con el pistón reciprocante.(10 μL/min -10 mL/min)
•El diseño del pistón con un control electrónico de su movimiento (stroke) proporciona un flujo ligeramente pulsante.
•Un damper reduce la pulsación del flujo.
•Una cámara de mezclado proporciona una homogenización de los disolventes atras del punto de inyeccion de la muestra.
•Un transductor de presión convierte la presión del sistema en una salida eléctrica que se despliega en la pantalla
Funcionamiento de la Bomba
55
Funcionamiento de la Bomba
•El movimiento del pistón es controlado por la rotación de la leva (cam).
•Un ciclo completo en la bomba consiste del movimiento del pistón para llenar el cabezal, en el cual el pistón viaja en reversa (alejandose del cabezal de la bomba) y un movimiento de entrega , en la cual el pistón viaja en el sentido del cabezal de la bomba.
•Durante el movimiento de entrega, el disolvente es descargado a través de la vávula check.
•La rotación de la leva (cam) es determinado por un software de control del motor.
56
Mala repetibilidad de tiempos de reten-ción:
- Fugas (visibles o no visibles)
SELLOS
PISTÓN
Mantenimiento Preventivo en Bomba
Válvulas check
Solución: Cambio de pieza dañada
57
Co
mp
osi
ció
n
Tiempo
% B
Isocrática
Gradiente
2.1 Bombas– Tipos de Bombas
58
Estabilidad en la línea base
Tiempo de análisis largo
Presión Constante
Resolución limitada
2.1 Bombas– Análisis Isocratico
59
Preparación de la Fase Móvil
Separación isocratica o por gradiente• La fase móvil isócratica no puede resolver todas las
separaciones
• Algunas muestras son demasiado complejas
• Resolución pobre de picos tempranos
• Ensanchamiento de picos y coleo de los picos finales
• En la elución por gradiente de solventes, la fuerza de la fase móvil se incrementa por cambio de la composición de los solventes en un cierto tiempo
• Elegido para una amplia gama de muestras o de biopolímeros
• Limpia la columna durante cada corrida
• Empleada para estimar condiciones isocraticas óptimas
Solventes
60
Resolución de Mezclas Complejas
Tiempo de Análisis Corto
Variación de la Presión
Inestabilidad de Línea Base
Vida útil de la Columna Limitada
2.1 Bombas– Análisis con Gradiente
61
2.1 Bombas– Análisis con Gradiente
Tiempo
% B
Co
mp
osi
ció
n
62
Cond. InicialGra
diente
Equilibrio
2.1 Bombas– Desarrollo de un Gradiente
Tiempo (min)
%A %B
0 100 0
20 80 20
30 80 20
35 100 0
40 100 0
Etapa
Prerun
Gradiente
Isocratico
Cond. Inicial
Equilibrio
Isocratico
63
2.3 Inyector Manual - Caracteristicas
Válvula de 6 puertos
2 posiciones: carga e inyección
Utiliza un loop / requiere cambio de loop para inyectar diferentes volumenes
Jeringa para introducir la muestra
Limpieza manual de línea de inyección
64
2.3 Inyector Manual - Funcionamiento
65
Filtración de la Muestra
Jeringa (aguja) apropiada
Loop correcto
Limpieza correcta del inyector
2.3 Inyector Manual - Mantenimiento Preventivo
66
2.3 Inyector Automatico – características
Válvula de 6 puertos / 2 posiciones
Utiliza un loop / no requiere de cambio de loop para volumenes menores
2 posiciones: carga e inyección
Aguja / Jeringa para introducir muestra en forma programada
Limpieza automática de la línea de inyección.
67
2.3 Inyector Automatico- Consideraciones de
Operación
Jeringa
El vólumen de muestra es medido con una jeringa de 250 uL.
El interior de la jeringa debe estar libre de burbujas.
De observarse burbujas:
Verificar la degasificación del solvente de enjuague.
Verificar el buen estado de la punta del émbolo.
Verificar que la aguja no este tapada.
Es necesario verificar que no se presenten fugas provenientes del émbolo de la jeringa.
68
2.3 Inyector Automatico- Consideraciones de
Operación
Válvula de Inyección
La muestra es introducida por una válvula automática de seis puertos.
Emplea tambien un sello/rotor que puede rallarse. (mala repetibilidad de áreas)
La falla se evidencia cuando se observan gotas de líquido en la punta de la aguja, crecen y se desprenden.
Y además, un incremento en la presión tambien incrementa la intensidad del goteo.
69
2.3 Inyector Automatico- Resumen de
funcionamiento
Importante
Jeringa y tuberia libre de burbujas.
No fugas en jeringa.
Presurización de vial solo funciona si HeadSpace Pressure esta habilitado.
Recomendado solo con septas nuevas.
La aguja de aire es insertada hasta la parte superior del vial, por lo que los viales solo llenarlos hasta 2/3 de alto (Contaminación Cruzada). 2/3 máximo
70
Factores que afectan la Repetibilidad de Areas
A. MUESTRA
B. MODOS DE INYECCIÓN
C. LOOP
D. EFECTO MEMORIA (Contaminación cruzada)
2.3 Inyector Automatico- Mantenimiento Preventivo
71
A) CONSIDERACIONES DE LA MUESTRA
Compatible (soluble) con la fase móvil.
Disuelta en un solvente de la misma polaridad (o más debil que la fase móvil).
Libre de partículas suspendidas (Filtrada)
2.3 Inyector Automatico- Mantenimiento Preventivo
72
Modo ParcialHasta el 50 % del volumen del loop
Toma de 3 a 2 veces el volumen del loop
B) MODOS DE INYECCIÓN
Modo Total
2.3 Inyector Automatico- Mantenimiento Preventivo
73
C) Material y tamaño del LOOP
Tamaño:
5, 10, 20, 50, 100,200, 500 (l),1, 2,5 (ml)
Material:
Acero Inoxidable, Titanio,PEEK
2.3 Inyector Automatico- Mantenimiento Preventivo
74
D) EFECTO MEMORIA Contaminación cruzada
2.3 Inyector Automatico- Mantenimiento Preventivo
Son residuos de muestra (o estándar) de la inyección anterior.
Se evidencia en la inyección de un blanco inmediato posterior.
75
Diagrama
2.4 Columnas para HPLC
76
¿Cómo funcionan?
2.4 Columnas para HPLC
La fase estacionaria esta empacada dentro la columna no se mueve.
La fase móvil esta circulando dentro la columna a una velocidad regulada (flujo constante) arrastrando a la muestra.
77
¿Cómo funcionan?
2.4 Columnas para HPLC
Si el analito es más soluble en la fase móvil que en la fase estacionaria, el analito migrará dentro de la columna con poca interacción con la fase estacionaria.
78
¿Cómo funcionan?
2.4 Columnas para HPLC
Si el analito es más soluble en la fase estacionaria, migrará más lentamente dentro de la columna, y dependiendo de la magnitud de la interacción, el tiempo invertido será más o menos grande.
79
Clasificación por Dimensiones
Modern HPLC for Practicing Scientists, Michael W. Dong, Wiley – Interscience, 2006
2.4 Columnas para HPLC
80
Efecto del cambio en la longitud de la columna
2.4 Columnas para HPLC
Modern HPLC for Practicing Scientists, Michael W. Dong, Wiley – Interscience, 2006
81
Longitud 3, 5, 10, 15, 25 cm)
Diámetro Interno (1, 2, 4, 4.6 mm)
•Tipo de soporte• Silica, polimero.
•Grupo químico enlazado• C18, C8, C4, CN, NH2, Si
•Tamaño de partícula• 2, 3, 5, 10 um
•Tamaño de poro y Area Superficial(60 ~ 200 A) (100 ~ 500 m2/g)
•Densidad de ligando• 2 ~ 4 mol /m2
Clasificación por Características
2.4 Columnas para HPLC
82
•Tipo de soporte
• Silica (SiO2) es el material dominante. Posee una alta resistencia mecánica y permite fabricar partículas uniformes.
Clasificación por Características
2.4 Columnas para HPLC
83
•Tipo de soporte
• Silica (SiO2) posee una superficie polar que permite ser modificada para darle propiedades no polares por tratamiento químico.
• Tiene como limitante el que se degrada fuera del intervalo de pH de 2 a 8.
Clasificación por Características
2.4 Columnas para HPLC
84
•Tipo de soporte
La Silica (SiO2) tiene como limitante el degradarse fuera del intervalo de pH de 2 a 8.
Clasificación por Características
2.4 Columnas para HPLC
85
•Tipo de soporte
• Polímero. Poliestireno divinil benceno entrecruzado, polieteres y metacrilatos son los más comunes.
• Tienen como desventaja que regularmente poseen menos eficiencia comparadas con las columnas de Si.
• Tienen como ventaja la operación en el intervalo de pH de 1 a 14.
• Existen nuevos materiales como son la Zirconia que permiten operar a temperaturas elevadas.
Clasificación por Características
2.4 Columnas para HPLC
86
Grupo químico enlazado• C18 C8 C4 CN Ph NH2 Si
Clasificación por Características
2.4 Columnas para HPLC
No Polar Polar
Fase Reversa Fase Normal
87
Grupo químico enlazado
• C18 C8 C4 CN Ph NH2 Si
Clasificación por Características
2.4 Columnas para HPLC
C18: Muy hidrofobica, estable y primer elección.C8: Menos hidrofobica, requiere menos solvente orgánico.CN: La menos hidrofobica, no muy estable.Ph: Para compuestos de mediana polaridad. Recomendada para aromáticos.C4: Recomendadas para análisis de proteinas.NH2: Recomendada para carbohidratos.Si: Adecuada para compuestos orgánicos de polaridad media
88
Tamaño de poro y Area Superficial• 200 ~ 60 A Area Superficial (100 a 500 m2)• Mayor densidad en fase
enlazada • Mayor retención (más
hidrofóbica)• No recomendado para
biomoleculas.
Clasificación por Características
2.4 Columnas para HPLC
89
Densidad de ligando (Carga de carbono [peso Fase Enlas/peso Silica])• 2 ~ 4 mol/m2
Clasificación por Características
2.4 Columnas para HPLC
90
Clasificación por tecnologia (Pureza de SiO2)
Modern HPLC for Practicing Scientists, Michael W. Dong, Wiley – Interscience, 2006
2.4 Columnas para HPLC
91
Clasificación por tecnologia(Pureza de SiO2)
Modern HPLC for Practicing Scientists, Michael W. Dong, Wiley – Interscience, 2006
2.4 Columnas para HPLC
92
Clasificación por tecnología(Fase estacionaria modificada)
2.4 Columnas para HPLC
93
Clasificación por Tecnología
(Resumen 1)
2.4 Columnas para HPLC
94
Resumen
2.4 Columnas para HPLC
95
2.4 Columna – Mecanismos de Separación Tipo de interacciones
No polares - fuerzas de van der Walls
covalentes – Formación de puentes moleculares
Polar - dipolares y puentes de hidrógeno
Ionicas - cationicas y anionicas
96
SELECCIONAR LA COLUMNA ESPECIFICA
METODO EXISTENTE SATISFACTORIO
SELECCIONAR COLUMNA NUEVA
MUESTRA
PESO MOLECULAR > 2000
SOLUBLE EN ORGÁNICO
SOLUBLE EN AGUA
EXCLUSIÓN
PERMEACIÓN
EXCLUSIÓN
FILTRACIÓN
PESO MOLECULAR < 2000
SOLUBLE EN ORGÁNICO
SOLUBLE EN
HEXANO
SOLUBLE EN METANOL
ADSORCIÓN FASE ENLAZADA NORMAL
FASE ENLAZADA REVERSA
SOLUBLE EN AGUA
INTERCAMBIO IÓNICO
2.4 Columna – Selección de Columnas
97
Mercanismos de adsorción
Dependiente de la concentración de soluto y la temperatura (Isotermas de adsorción)
Retención de Compuestos polares
Orden de elución: menor polaridad más rápido
Columnas: sílica & alumina
98
2.4 Columna – Adsorción
99
K = Cs Cm
S
m
Fase enlazada
Normal
Reversa
2.4 Columna – Partición
100
2.4 Columna – Fase Normal enlazada
101
Características del mecanismo
Interacciones:
Polares (puentes de H2, fuerzas de van Der Walls).
Retención:
Favorecida por disolventes no polares.
Elución:
Fuerza de disolvente aumenta con la polaridad
(hasta disolvente medianamente polares)
Columnas : Ciano y amino
102
2.4 Columna – Fase Normal
103
2.4 Columna – Fase Reversa
104
Caracteristicas del mecanismo
Interacciones:
No polares (inducción de dipolo, dipolo-dipolo)
Retención:
Favorecida con disolventes polares
Elución.
Fuerza de disolvente aumenta disminuyendo polaridad
105
2.4 Columna – Fase Reversa
Es la técnica de HPLC más popular:• Las columnas son estables y de rápido equilibrio.• El orden de elución es predecible: Si más
hidrofobico el soluto -> mayor retención.• Agua es uno de los solventes más importantes• Permite cambios en la selectividad por la adición
de modificadores• Fase reversa incluye algunas variantes: • Regular, supresión de iones, ionización
controlada, par iónico y formación de quelatos metálicos.
106
2.4 Columna – Fase Reversa
107
Mecanismos de fase reversa: Fase reversa clásica
Los solutos no polares son retenidos por la fase
estacionaria .
La elución se logra por cambio en la polaridad de la
fase móvil (disminución de polaridad)
Fase reversa clásica
108
2.4 Columna – Fase Reversa Fase reversa clásica
109
Mecanismos de fase reversa: Control de la ionización
•Algunos solutos presentan ionización a un valor determinado de pH.•Los solutos en forma no ionizable son retenidos por la fase estacionaria. Al cambiar a su forma ionizable eluyen de la columna.•Se emplean soluciones de fosfatos, boratos, citratos.•Concentración máxima (recomendada) 0.01M•Compatibilidad de solubilidad con la fase orgánica•Compatibilidad con el detector
110
carga fijaIón de la muestra
resina
+
+-
contraión
Catiónico
Aniónico
2.4 Columna – Intercambio Ionico
111
2.4 Columna – Intercambio Ionico
112
Base sílica
Base polímero
2.4 Columna – Intercambio Ionico
113
SOLUBILIDAD ENAGUA (GFC)
SOLUBILIDAD EN ORGÁNICO (GPC)
2.4 Columna – Exclusión
114
Fase móvilBomba
Detector
Sistema de datos
Banco de columnas
2.4 Columna – Exclusión
115
Uso:
• Almacenar la columna en un solvente recomendado por el fabricante.
• Colocar tapones durante no-uso.
• Siempre “lavar” columna con un solvente fuerte.
• Siempre utilizar guardacolumna o filtro en línea
2.4 Columnas – Uso, Mantenimiento y Cuidados
116
Precauciones:
• No exceder rango de pH de la columna.
• No exceder rango de temperatura de la columna.
• Nunca guardar la columna con sales o buffer dentro de ella.
• Permitir que la columna se enfrie antes de detener el flujo.
2.4 Columnas – Uso, Mantenimiento y Cuidados
117
Mantenimiento y Regeneración:
• Tiempo de vida desde 3 hasta 24 meses o de 1000 a 3000 inyecciones.
• El desempeño disminuye con el uso (incremento en la presión y coleo de picos).
• Monitorear presión (¡¡bitacoras!!), probar invertir columna.
• Regenerar la columna con una serie de solventes de débil a fuerte y
viceversa en forma gradual.
2.4 Columnas – Uso, Mantenimiento y Cuidados
118
SILICA
50 ml de hexano
50 ml de cloruro de metileno 50 ml de isopropanol 30 ml de cloruro de metileno 25 ml de fase móvil Probar la columna
FASE NORMAL
50 ml de cloroformo50 ml de cloruro de metileno50 ml de isopropanol30 ml de cloruro de metileno25 ml de fase móvil Probar la columna
2.4 Columnas – Uso, Mantenimiento, Cuidados y Regeneración
Consultar siempre folleto del fabricante
119
FASE REVERSA
50 ml agua caliente
( 55 ºC) 50 ml de metanol 50 ml de acetonitrilo 30 ml de THF 25 ml de metanol 25 ml de fase móvil
50 ml de agua caliente
(55 ºC)50 ml de metanol50 ml de acetonitrilo25 ml de cloruro de metileno25 ml de metanol25 ml de fase móvil
INTERCAMBIO IÓNICO
2.4 Columna – Regeneración
Consultar siempre folleto del fabricante
120
Fase móvil
GuardaColumna
DetectorSistema de datos
Bomba
Inyector
Co
lum
na2.4 Columna – Guardacolumna
121
2.4 Columna – Horno
Objetivos
Aumentar la solubilidad de la
muestra Disminuir la presión de la
columna Disminuir la selectividad Disminuir el tiempo de análisis
122
2.5 Detectores
Uv-vis ( fija)
Uv-vis (Arreglo de diodos)
Fluorescencia
Indice de Refracción
ELSD
123
Indice de Refracción
a) Universal
b) Mide el cambio de índice de refracción entre la celda de muestra y la celda de referencia.
c) No destructivo de la muestra
d) Baja sensibilidad : %w
e) No compatible con gradiente
f) Sensible a la temperatura ambiente
2.5 Detectores - ProStar 350 Características
124
No recomendados • Haluros , Formato de Amonio, CCl4
Utilizables abajo del 10%• Acido Bórico, Anhidro Acetico, KOH• Sales de Formato de Amonio, perclorato, HPO4
2-
• Sales de bicarbonato, clorato y nitratoUtilizables abajo de 30%
• Acido Citrico, NaOH, Sales de Citrato de Amonio, oxalato, sulfato, H2PO4
-
Utilizables abajo de 50%• Acido Acetico, Acido lactico, Hidrazina,
Nitrato de Amonio, K2CO3, Formato de Sodio
2.5 Detectores - Indice de Refracción ProStar 350 -Restricciones de Solventes
125
Ultravioleta Visible
a) Alta sensibilidad
b) Mide la absorción de la luz UV o Visible en el eluyente del HPLC.
c) No destructivo de la muestra
d) Selectivo
e) Rango 190-900 nm
f) Compatible con gradiente
2.5 Detectores- Ultravioleta Visible PS-325 Características
126
2.5 Detectores-Ultravioleta Visible PS-325 Recomendaciones de Operación
• Encender la lámpara por lo menos 15 minutos antes del análisis.
• Configurar longitud de onda y tiempo de respuesta.• La duración de las lámparas es de aprox 2000 hrs, pero pueden fallar antes o después.
127
2.5 Detectores- Arreglo de Diodos PS-335 Características
a) Sensibilidad similar a UV-VIS
b) Mide la absorción de la luz UV o Visible en el eluyente del HPLC.
c) No destructivo de la muestra
d) Selectivo
e) Rango 190-900 nm
f) Compatible con gradiente
128
• Espectro de cada Compuesto, comparación de Espectros
• Parámetro de Pureza
• Biblioteca de Espectros
• Cromatogramas a diferentes .
Arreglo de diodos
2.5 Detectores- PS-335 Resultados
129
2.5 Detectores - Arreglo de Diodos PS-335 Recomendaciones de Operación
• Encender la lámpara por lo menos 15 minutos antes del análisis.
• Configurar longitud de onda y tiempo de respuesta.• Configurar rango de longitudes de onda para desarrollo de métodos, y porque sea necesario en trabajo de rutina. Los archivos son muy grandes.• La duración de las lámparas es de aprox 2000 hrs, pero pueden fallar antes o después.
130
• Alta sensibilidad (100 a 1000x)
• Compatible con gradiente
• Selectivo: excitación, emisión
• Rango de s: Ex: 200-850nm y Em:200-900 nm
• Formación de derivados: Precolumna y Post
columna
• Puede trabajar con la lámpara apagada (Chemiluminescencia, Bioluminescencia)
• GLP integradas (horas de la lampara)
2.5 Detectores- Fluorescencia PS-363 - Características
131
2.5 Detectores- Fluorescencia PS-363 – Lámpara de Xe.
• Duración aprox de 500 hrs
• Contiene gas Xe presurizado. Manejese con cuidado.
• La radiación emitida es muy intensa.
132
2.5 Detectores- Fluorescencia PS-363 - Areas de aplicación
Mercado Farmaceutico / Bioquimico
– Catecholes e Indoles– Vitaminas– Derivados OPA de amino ácidos – Derivados FMOC de amino ácidos – Marcadores Fluorescentes
Mercado Ambiental – Carbamatos, Glifosatos– PNAs
133
3.1 Por ciento área
3.2 Área Normalizada
3.3 Estándar Externo
3.4 Estándar Interno
3.0 Analisis Cuantitativo
tr1
tr2 tr3
A1 A2
tr4
A4
A3
Area
Co
nc
entr
ació
n
134
1. Inyectar la Muestra ProblemaDatos
A2
A1
A3
A4
tr1
tr2 tr3
A1 A2
tr4
A4
A3
3.0 Analisis Cuantitativo- Por ciento Area
2. Calcular el % A:
%A = Ai x 100 Ai
135
3.0 Analisis Cuantitativo- Por Ciento
Area Normalizada1. Preparar una mezcla estándar de
concentración
conocida
2. Inyectar la mezcla estándar de calibración
3. Obtener el cromatograma , así como las áreas:
tr1
tr2 tr3
A1 A2
tr4
A4
A3
pico de referencia
Datos
A2
A1
A3
A4
C1
C2
C3
C4
136
4. Calcular los Factores de respuesta Fr:
a) Seleccionar un pico de referencia y asignarle un valor de Fr = 1
b) Calcular los Fr de los demas Picos:
Fri = A ref x Ci
C ref x Ai
Fr i = Factor de respuesta del pico de interésA ref = Area del pico de referencia
Ci = Concentración del pico de interésAi = Area del pico de interés
C ref = Concentración del pico de referencia
3.0 Analisis Cuantitativo- Por Ciento
Area Normalizada
137
5. Inyectar la muestra problema, obtener el cromatograma, asi como sus áreas:
tr1
tr2 tr3
A1 A2
tr4
A4
A3
Datos
A2
A1
A3
A4
6. Calcular las concentraciones de cada uno de los componentes, en unidades relativas: %w, %v,
% mol
3.0 Analisis Cuantitativo- Por Ciento
Area Normalizada
138
%Ci = Ai x Fri x 100
(Ai Fri)
Ci = Concentración del pico de interés en la muestra
Ai = Área del pico de interés en la muestra
Fri = Factor de respuesta del pico de interés
3.0 Analisis Cuantitativo- Por Ciento
Area Normalizada
139
3.0 Analisis Cuantitativo- Estandar Externo1. Preparar una mezcla de estándares de
concentración conocida con los componentes de
interés
2. Inyectar la mezcla de estándares
3. Obtener el cromatograma, así como sus
respectivas áreas
tr1
tr2 tr3
A1 A2
tr4
A4
A3
Datos
A2
A1
A3
A4
C1
C2
C3
C4
140
4. Calcular los factores de respuesta de cada uno de los picos:
Fri = Ci
Ai
5. Inyectar la muestra problema, obtener el cromatograma , así como las áreas:
3.0 Analisis Cuantitativo- Estandar Externo
141
tr1
tr2 tr3
A1 A2
tr4
A4
A3
Datos
A2
A1
A3
A4
6. Calcular la concentración de cada uno de los componentes:
Ci = Ai Fri
Ci = Concentración del pico de interés en la muestra
Ai = Área del pico de interés en la muestra
Fri = Factor de respuesta del pico de interés
3.0 Analisis Cuantitativo- Estandar Externo
142
• Alta pureza
• Estable químicamente y térmicamente
• Estructura química semejante a los componentes de interés
• Separado e identificado de los componentes de la muestra
3.0 Analisis Cuantitativo- Estandar Interno
Requisitos del Estándar Interno
143
1. Preparar una mezcla de calibración que contenga los componentes de interés, asi como
el componente que servirá como estándar interno
2. Inyectar la mezcla de calibración, obtener el cromatograma y las áreas
tr1
tr2 tr3
A1 A2
tr4
A4
A3
Datos
A2
A1
A3
A4
C1
C2
C3
C4
Est. Interno
3.0 Analisis Cuantitativo- Estandar Interno
144
3. Calcular los Fr tomando como referencia el pico del estándar interno, es decir asignarle un Fr = 1
Fri = Ci X A std int
Ai X C std int
Fri = Factor de respuesta del pico de interés
Ci = Concentración del pico de interes
Astd int = Área del estándar interno
Ai = Área del pico de interés
C std int = Concentración del estándar interno
3.0 Analisis Cuantitativo- Estandar Interno
145
4. Inyectar la muestra problema y obtener las áreas:
tr1
tr2 tr3
A1 A2
tr4
A4
A3
Datos
A2
A1
A3
A4
C2
5. Calcular la concentración de cada uno de los componentes tomando como referencia el pico del estándar
interno
3.0 Analisis Cuantitativo- Estandar Interno
146
Ci= Ai Fri C std int
A std int
Ci = Concentración del pico de interés
Ai = Área del pico de interés
Fri = Factor del pico de interés
Cstd int = Concentración del estándar interno
Astd int = Área del estándar interno
3.0 Analisis Cuantitativo- Estandar Interno
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