View
219
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
Cromatografia Liquida - CLAE
UNISULANÁLISE INSTRUMENTAL
Profa. Denise Esteves Moritz
O que é Cromatografia ?
Definição:
A cromatografia é uma técnica de separação na qual os componentes a serem separados de uma mistura migram entre duas fases sendo uma fase móvel e a outra estacionária.
A natureza química e física dos componentes da mistura definem o grau de afinidade entre as duas fases, acontecendo o fenômeno de migração diferencial .
O que é Cromatografia a Líquido HPLC?
Definição: Na técnica de cromatografia a líquido a
fase móvel é um líquido e a fase estacionária é um sólido .
O processo cromatográfico acontece na fase líquida , sendo que os componentes da amostras devem estar dissolvidos.
Instrumentação para HPLC
CLAE -HPLC
Fase móvel(amostra)
Fase estacionária(Componentes retidos)
Migrações diferenciais
Analitomov ⇋ Analitoest
K = Analitoest / Analitomov= coeficiente de partição
INSTRUMENTAÇÃO
pumpinjector
columnoven
detector
One pump used to control 4 reservoirs; mixing is donebefore pump.
MIXER
data processor
Fase móvel
Instrumentação para HPLC
PURGAINJETOR
COLUNAFM
BOMBA
DETECTOR
Componentes de um Cromatógrafo a Líquido HPLC
Um cromatógrafo a líquido é composto de 3 partes principais :
Injetor : É o dispositivo que tem a função de introduzir a
amostra na fase móvel ; Coluna cromatografia :
É o dispositivo que tem a função de separar os componentes da amostra ;
Detector :É o dispositivo que tem a função de detectar os
componentes eluídos da coluna cromatográficas
Componentes auxiliares de um HPLC
Bomba :
É o dispositivo que bombeia e controla o fluxo e a pressão da fase móvel ( solvente );
É composta de um ou mais pistão acoplados a um sistema de válvulas.
Fornece uma alta pressão.
BOMBA
- Fluxo deve ser constante (0,01-10 mL/min)
- Opções: Simples, gradiente binário, quaternário
- Mede a pressão sobre o sistema
- Manutenção preventiva (selos, pistões, check valves, etc.)
Componentes auxiliares de um HPLC
Válvula de purga: É o dispositivo que permite a troca rápida de
solvente desviando o fluxo de solvente para o dreno.
Misturador: É o dispositivo que homogeneíza a mistura de
solventes quando operando com gradiente de eluição .
Fase estacionária
Colunas Cromatográficas
Fases estacionárias :
Sílica- C8
Sílica- C18
Sílica- C18 ( ODS)
Sílica- NH2
Sílica- Diol
Sílica
Troca Iônica
Resinas DVB-ST Sulfonadas Ca
Resinas DVB-ST porosas
Pré-Coluna:
É o uma pequena coluna instalada a montante da coluna analítica .
Tem como objetivo reter sólidos e em muitos casos reter materiais que por reações químicas podem precipitar sobre a fase estacionária.
SÍLICA (suporte + usado):
- Resistência mecânica- Variedade de forma, tamanho de partículas e poros
- Instabilidade frente a fases móveis ácidas ou básicas - Superfície não homogênea
COLUNAS CROMATOGRÁFICAS
Si
OH
SiHO OH
Si
OH
Si
OH
SÍLICA – GRUPOS SILANÓIS
LIVRES GEMINAL VICINAIS
influenciam no grau de acidez da sílica
Fase Estacionária
A fase estacionária mais utilizada é composta de partículas microporosas de sílica.
São permeáveis ao solvente e possuem uma área superficial de varias centenas de metros por gramas.
Não deve ser utilizada em sistemas com pH acima de 8,0.
MODIFICAÇÃO SUPERFICIAL
- QUIMICAMENTE LIGADAS
- HÍBRIDAS
- RECOBERTAS COM POLÍMEROS ORGÂNICOS
Fases Quimicamente Ligadas
C18 (ODS)
forte
C8
amostra
amostra
amostra
C4
média
fraca
POLIMÉRICAS
Pré-hidrólise do agente silanizante
- Rede tridimensional mais espessa- Maior estabilidade
- Dificuldade de controlar reações entrecruzamento
FASES ESTACIONÁRIAS HÍBRIDAS
Matriz orgânica-inorgânica
- Mais estáveis do que as quim. ligadas convencionais- Menor quantidade de grupos de silanóis- Ultra-fast cromatografia
Tetraalcoxissilano alquiltrialcoxissilano
(RO)4Si + n(RO)3SiR’ + (1,5n+2)H2O SiO2 (R’SiO1,5)0,5 + (3n+4)ROH
RECOBRIMENTO COM POLÍMEROS
-RESISTÊNCIA MECÂNICA DA MATRIZ INORGÂNICA
- SELETIVIDADE E INÉRCIA QUÍMICA DOS POLÍMEROS ORGÂNICOS
- Maior recobrimento dos sítios ativos do suporte- Maior seletividade (natureza e quantidade dos grupos funcionais nas cadeias dos polímeros, espessura dos filmes, área superficial e estrutura de poros do suporte)
• Poli(etileno)• Poli(butadieno)• Poli(estireno)• Poli(dimetilsiloxano)• Poli(metiloctilsiloxano)• Poli(metiloctadecilsiloxano)• Poliéteres• Polissacarídeos• Poliaminas• Polinucleotídeos• Poliamidas• Proteínas
SílicaZircôniaTitâniaAlumina
PRINCÍPIOS DE SEPARAÇÃO
INTERAÇÃO DO SOLUTO NAS 2 FASES (EQUILÍBRIO)
INTERAÇÕES DE VAN DER VALLS
LIGAÇÕES DE HIDROGÊNIO
INTERAÇÕES DIPOLO-DIPOLO
ATRAÇÃO ELETROSTÁTICA
Fases estacionárias Interações
C8
PH
C2
van der Waals
van der Waals
van der Waals
Si
Si
Si
Fases estacionárias Interações
CN
NH2
2OH
Dipolo/Dipolo
OH
Si NH
H
OSi
OH
OOH
H
SiN
OH
C
Ligação de hidrogênio
Ligação de hidrogênio
Fase Estacionária
PRS
CBA
SAX
Eletrostática
Eletrostática
Eletrostática
H3+N
SO3-Si
Si
H3+N
O-
O
N+(CH3)3Si
-O3S
Fases estacionárias
Interações
Fase Estacionária
Processo de Eluição
Definição:
Pode ser descrita como deslocamento do soluto na fase estacionária.
Série eluotrópica
Ordena os solventes de acordo com suas habilidades relativas de deslocar soluto de um dado adsorvente.
Força eluente:
É uma medida da energia de adsorção do solvente
Cromatografia com fase normal:
Utiliza uma fase estacionária polar e um solvente menos polar.
Cromatografia com fase reversa:
Utiliza uma fase estacionária apolar ou fracamente polar e um solvente polar.
DETECTORES - Classificação
UNIVERSAIS:Geram sinal para qualquer
substância eluída.
SELETIVOS:Detectam apenas substânciascom determinada propriedade
físico-química.
Dispositivos que geram um sinal elétrico proporcional à quantidade eluída de um analito
DETECTORES
UV
FLUORESCÊNCIA
MS
ELETROQUÍMICO
IR
POLARÍMETRO
É mais comum, usado na CLAE.
Porque muitos solutos absorvem a luz ultravioleta.
São bons para a eluição por gradiente com solventes não-absorventes.
Detectores Detectores Ultra violeta:Ultra violeta:
Princípio: Absorção de luz ultravioleta ou visível pela amostra, quando nela passa radiação eletromagnética.
- Seletivo (moléculas com cromóforos)
- Comprimento de onda (λ) fixo
- λ pode ser selecionado (190 – 600 nm)
- Varredura (DAD)
- Solventes também absorvem
Ultra violeta (UV-visível):
ÁguaMeOHACNAcetonaHexanoClorofórmioTHF
190 210 200 330 200 245 215
λ nmSolvente
Princípio: Emissão de energia fluorescente de um soluto que foi excitado por radiação UV
- Seletivo (moléculas que fluorescem)
- Exemplo: Aromáticos policíclicos e duplas ligações conjugadas
- Mais sensível que UV por ser emissão
- Podem ser feitas reações de derivação pré ou pós-coluna para que o analito se torne fluorescente.
- Reagentes de derivatização comuns: fluorescamina e cloreto de dansila
Fluorescência:
Detectores por Índice de RefraçãoDetectores por Índice de Refração::
Princípio: Mede a diferença no índice de refração da fase móvel e do eluente vindo da coluna
- Não- seletivo
- Sensível a variações de:- Temperatura- Pressão- Fluxo- Composição fase móvel
- Baixa sensibilidade e difícil de estabilizar
- Muito usado em cromatografia preparativa
Indice de refração:
Princípio: Determinação da massa de solutos através da ionização e determinação da relação massa-carga (m/z)
- Destrutivo
- Pode ser extremamente seletivo (SIM e massas tandem MS/MS)
- Interfaces de ionização mais comuns: ESI, ApCI
- Análise de micro e macromoléculas.
- Alta sensibilidade
Espectrometria de massas:
MODOS DE SEPARAÇÃO
NORMAL
REVERSO
TROCA IÔNICA
MODO NORMAL
MECANISMO DE INTERAÇÃO:
ADSORÇÃO
Fase estacionária: + POLAR que a fase móvel
Fase móvel: mistura de solventes orgânicos
Colunas: Sílica, Ciano, fenil, amino
MODO REVERSO
INTERAÇÃO DA PARTE NÃO POLAR DOSOLUTO E A FASE ESTACIONÁRIA
HIDROFOBICIDADE
Fase estacionária: APOLARFase móvel: H2O, MeOH, CH3CN
ÁREA DE C SOLUTO RETENÇÃO
Tempo de Retenção e Hidrofobicidade
OH
OH
C18 (ODS)
forte
Interaçãofraca
HidrofobicidadeHidrofobicidade
Se a amostra possui CH3CH2CH2--- : cadeia carbônica : grupo aromático
Se a amostra possui -COOH : grupo
carboxílico -NH2 : grupo amino -OH : grupo hidróxi
A hidrofobicidade
será forte
A hidrofobicidade
será fraca
TROCA IÔNICA
MECANISMO DE INTERAÇÃO :
ATRAÇÃO ELETROSTÁTICA
Fase estacionária: Resinas trocadoras de íons (catiônicas / aniônicas)
Fase móvel: Tampão (pH, , força iônica, temperatura)
Aniônicas: amônio quaternário, aminasCatiônicas: ácido sulfônico, ácido carboxílico
Microsseringas para Injeção
LÍQUIDOS Capacidades típicas: 1 L, 5 L e 10 L
êmbolo
corpo (pirex)
agulha (inox 316)
Obs: Seringa de HPLC
Seqüência
Lavagem da coluna -MeOH por 30 minutos Condicionamento da coluna com fase móvel Monitoramento da linha de base Injeção das amostras
PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS
FATOR DE RETENÇÃO (k)
FATOR DE SEPARAÇÃO ()
NÚMERO DE PRATOS (N)
Cromatograma
tR
tM
TEMPO
SIN
AL
tR = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a injeção e o ápice do pico cromatográfico)
tM (tempo morto) = Tempo de Retenção do Composto Não-Retido (tempo mínimo para um
composto que não interaja com a FE atravesse a coluna)
A migração de um analito pela coluna provoca inevitavelmente o alargamento da sua banda:
TEMPO
Efeitos do alargamento excessivo de picos:
EFICIÊNCIA Capacidade de eluição com o mínimo de dispersão do analito.
w2 na linha de base
BANDA CROMATOGRÁFICA
Representa a capacidade de distribuição do soluto nas fasesNão leva em conta o tempo morto da coluna
FATOR DE RETENÇÃO (k)
tr – tok =to
tr = tempo retenção analito
to = tempo morto da coluna
t r o
ok = t t
Se: t0 = 1,5 mint1 = 3,5 mint2 = 4,2 min
k1 = 1,3
k2 = 1,8
FATOR DE SEPARAÇÃO ()
k2
=k1
AVALIA A SELETIVIDADE
Se:
k1 = 1,3 k2 = 1,8
= 1,38
k1 = 1,3
k2 = 1,8
k2=
k1
= 1 não houve separação
NÚMERO DE PRATOS (N)
Mede a eficiência do sistemaDepende da coluna, da amostra e do fluxo da fase móvel
trN = 5,54w0,5
2
Resolução
é função da
Seletividade ()Eficiência da coluna (N)
Fator de retenção (k)
Resolução
Rs = 0.8 Rs = 1.25Rs = 1.05
FASE MÓVEL
- Solvente grau HPLC (alta pureza)
- Filtração (membrana 0.45 μm)
- Degaseificação do solvente (ultrassom, borbulhamento de He ou automático)
- Purgar os solventes
MODOS DE ELUIÇÃO ISOCRÁTICO:
Uma única composição de fase móvel ao longo da corrida; a composição ds FM é CONSTANTE.
GRADIENTE: - Variação da composição da fase móvel (FM)
ao longo da corrida.- Amostras com ampla faixa de k (0,5 < k < 20)
Mudança no modificador orgânico
ab
cd
ab
cd
[ MeOH/H2O ]par crítico : c,d
[ THF/H2O ]par crítico : a,b
ab
cd [ MeOH/THF/H2O ]
1) COLETA/OBTENÇÃO (QUANTIDADE, LUGAR, ETC..)
2) ESTOCAGEM E PREPARAÇÃO (ESTABILIDADE)
3) EXTRAÇÃO:
- LÍQUIDO-LÍQUIDO - LÍQUIDO-SÓLIDO - SOXHLET - FLUÍDO SUPER CRÍTICO - EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (EFS / SPE)
PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
Filtração
É necessária, previamente à injeção, usualmente com membranas de 0.45 m mesh para a remoção do material insolúvel.
DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO
Fixas as condições operacionais, o tempo de retenção ajustado de um analito é uma constante
AMOSTRA
PADRÃO
Comparação de cromatogramas da amostra e de uma solução padrão do
analito suspeito
ANÁLISE QUANTITATIVA
A área do pico é proporcional a massa que passa pelo detector
Cálculo de área:
ANÁLISE QUANTITATIVA
Se ambos os compostosrespondessem igualmente aodetector poderíamos usar a relação:
Massa A Área AMassa B Área B
No entanto, a mesma massa de compostos diferentes nos dá áreas diferentes, em função da resposta ao detector.
PADRONIZAÇÃO EXTERNA
Este método baseia-se na comparação de uma certa substância presente na amostra com seu respectivo padrão.
Primeiramente deve-se construir um gráfico de (área x concentração) da substância padrão:
PADRONIZAÇÃO EXTERNA
Em seguida, injeta-se a amostra, e a partir da área obtida no cromatograma tira-se do gráfico traçado a concentração dessa substância na amostra.
É importante salientar que o gráfico deve ser construído com concentrações próximas da concentração esperada na amostra. Outro fator muito importante é que o volume injetado do padrão tem de ser exatamente igual ao volume injetado de amostra. Por esta razão este tipo de padronização é mais conveniente quando se utiliza válvulas para injeção da amostra, que reproduzem fielmente o volume injetado.
Neste método não são usados fatores de correção para corrigir as áreas, por haver comparação da mesma substância
PADRONIZAÇÃO INTERNA
Uma quantidade de amostra é pesada juntamente com um padrão de massa conhecida. Esta mistura é injetada e, a partir dos dados obtidos no cromatograma, compara-se a área corrigida de cada componente que se deseja determinar com a área corrigida do padrão adicionado, do qual se conhece a concentração.
Mx = massa do componente xMa = massa da amostraMp = massa do padrãoAp = área do padrãoAx = área corrigida do componente x
PADRONIZAÇÃO INTERNA
A escolha do padrão deve ser feita, sempre que possível, entre compostos semelhantes aos que existem na amostra, não devendo coincidir com nenhum composto da mesma, e estar próximo ou entre os picos da amostra. Deve ser também uma substância pura para que apresente apenas um pico no cromatograma, e para que esse pico possa ser relacionado à massa pesada
Este método possibilita a determinação de apenas um dos componentes de uma mistura, sem haver necessidade de conhecer os outros componentes.
APLICAÇÕES
APLICAÇÕES cont…
APLICAÇÕES cont…
TRINDADE, Magno Aparecido Gonçalves; RINALDO, Daniel; VILEGAS, Wagner and ZANONI, Maria Valnice Boldrin. Determinação de corantes marcadores do tipo azo e antraquinona em combustíveis por cromatografia líquida com detecção eletroquímica. Quím. Nova [online]. 2010, vol.33, n.1, pp. 146-150. ISSN 0100-4042.
AFLATOXINAS EM ALIMENTOS DESTINADOS A BOVINOS E EM AMOSTRAS DE LEITE DA REGIÃO DE LAVRAS, MINAS GERAIS – BRASIL - Maria Marlucia Gomes Pereira1, Eliana Pinheiro de Carvalho2, Guilherme Prado3, Carlos Alberto da Rocha Rosa4, Thaís Veloso5, Leandro Augusto Ferreira de Souza5,Jéssika Mara Martins Ribeiro6
Recommended