View
228
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
CAMERA SEPARATORIA previously POST PY CHROMATOGRAFII Volume 3, Number 1 / June 2011, 87-99
Grzegorz BOCZKAJ1, Mariusz JASZCZO T1, Agata LEMAN1, Anita SKRZYPCZAK1, Aleksandra KRÓLICKA2, Marian KAMI SKI1* 1 Politechnika Gda ska, Wydzia Chemiczny,
Katedra In ynierii Chemicznej i Procesowej, ul. G. Narutowicza 11/12, 80-233 Gda sk e-mail: mknkj@chem.pg.gda.pl* 2 Zak ad Ochrony i Biotechnologii Ro lin,
Mi dzyuczelniany Wydzia Biotechnologii UG-GUMed, ul. K adki 24, 80-822 Gda sk
Zastosowanie chromatografii cieczowej w odwróconym uk adzie faz (RP-LC) w rozdzielaniu i oznaczaniu polifenoli i naftochinonów w materia ach ro linnych
Reversed phase liquid chromatography (RP-LC) for separation and quantitative determination of polyphenols and naphtoquinones in plant materials Streszczenie: W pracy przedstawiono przegl d metod rozdzielania i oznaczania naftochinonów i polifenoli pochodz cych z materia u ro linnego, z wykorzystaniem technik chromatografii w uk adzie faz odwróconych – RP-TLC (Reversed-Phase Thin Layer Chromatography) oraz RP-HPLC (Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography).
Uwzgl dniono procedury przygotowania próbki, etap rozdzielania, a tak e kontroli czy-sto ci zbieranych frakcji. Próbki materia u ro linnego s z regu y ekstrahowane rozpuszczalni-kami organicznymi dla wydzielania sk adników nisko- i redniopolarnych, albo wod dla wyod-r bniania sk adników polarnych. Proces ekstrakcji najcz ciej jest wspomagany ultrad wi kami. W ostatnich latach stosowane s do rozdzielania naftochinonów i polifenoli fazy stacjonarne ty-pu RP18 oraz eluenty w postaci mieszaniny wody i metanolu lub acetonitrylu. W przypadku roz-dzielania polifenoli, cz ciej ni przy rozdzielaniu naftochinonów, stosuje si elucj gradiento-w . Zastosowanie ortogonalnego rozdzielania, realizowanego poprzez rozdzielanie technik TLC w uk adzie faz normalnych lub HILIC, sk adników frakcji uzyskanych technik RP-HPLC, pozwala skutecznie kontrolowa efektywno rozdzielania oraz czysto frakcji. S owa kluczowe: cienkowarstwowa chromatografia cieczowa TLC, wysokosprawna kolumno-wa chromatografia cieczowa HPLC, naftochinony, polifenole, ekstrakty, metabolity ro linne, od-wrócone uk ady faz RP Abstract: The paper presents a review of naphtoquinones and polyphenols separation and quantitative determination methods using reversed phase chromatographic techniques – Re-versed-Phase Thin Layer Chromatography (RP-TLC) and Reversed-Phase High Performance Column Liquid Chromatography (RP-HPLC).
The procedures of sample preparation, chromatographic separation, as well as fraction purity control, are described in details. Samples of the plant material are mostly extracted with organic solvents or with water. The extraction processes are usually assisted by sonication. The most popular separation systems include a RP18 stationary phase and eluent which con-sists water and methanol or acetonitrile. In the case of polyphenols separations, much more of-
G. Boczkaj, M. Jaszczo t, A.Leman, A. Skrzypczak, A. Królicka, M. Kami ski
Camera Separatoria Vol. 3, No 1/2011
88
ten than during naphtoquinones separations, the gradient elution is used. The use of orthogonal separations by NP-TLC or HILIC-TLC separation of the fractions collected during RP-HPLC, gives a possibility for the separation effectiveness and fraction purity control.
Key words: Thin Layer Chromatography TLC, Reversed-Phase High Performance Column Liq-uid Chromatography RP HPLC, naphtoquinones, polyphenols, extracts, plant metabolites
1. Wst p (Introduction)
Kolumnowa chromatografia cieczowa - HPLC i chromatografia cien-kowarstwowa TLC, s najwa niejszymi technikami rozdzielania wykorzy-stywanymi w fitochemii [1]. Metabolity wtórne s zwi zkami chemicznymi, cz sto o skomplikowanej strukturze i o niezbyt wysokich masach molekular-nych. Nie odgrywaj one roli w podstawowym metabolizmie ro lin, jednak maj ogromne znaczenie w przystosowaniu si ro liny do funkcjonowania w danym rodowisku. W ro linach leczniczych metabolity wtórne pe ni rol substancji czynnych. Do tej pory na wiecie uda o si ju wyizolowa kilka-na cie tysi cy metabolitów wtórnych. Ze wzgl du na struktur , metabolity wtórne podzielono na trzy grupy: terpeny, metabolity fenolowe oraz metabo-lity zawieraj ce azot. Z tych ostatnich uda o si opisa ju 14000 substancji, nale cych do grup, takich jak: aminy, aminokwasy niebia kowe, alkaloidy, glikozydy cyjanogenne i glukozynolaty.
Metabolity wtórne w ro linnych tkankach wyst puj w bardzo niewiel-kich st eniach i akumulowane s w wakuolach. W ro linach ich g ówn funkcj jest obrona przed szkodnikami i patogenami.
Przyk ady takich farmakologicznie czynnych zwi zków naturalnych, którymi s metabolity wtórne ro lin, to [2]:
terpenoidy - monoterpeny, sekwiterpeny – kamfora - diterpeny, tetraterpeny – taksol, karotenoidy - triterpeny – glikozydy nasercowe - wieloterpeny – kauczuk
alkaloidy - indolowe – winkrystyna - tropanowe – atropina, skopolamina - pirydynowe i purynowe – nikotyna, kofeina
zwi zki fenolowe - proste fenole – kw. cynamonowy - fenole dwupier cieniowe – flawony, flawonole, flawonoidy,
antocyjany - wielopier cieniowe – garbniki - kumaryny - furanokumaryny
chinony - naftochinony – szikonina, plumbagina, juglon.
Zastosowanie chromatografii cieczowej w odwróconym uk adzie faz (RP-LC)…
Vol. 3, No 1/2011 Camera Separatoria
89
Rozdzielanie i oznaczanie naftochinonów z zastosowaniem chromatografii cieczowej w uk adzie faz odwróconych
W tabelach 1 i 2 zestawiono warunki chromatograficzne zastosowane do rozdzielania naftochinonów w ekstraktach wybranych materia ów pocho-dzenia ro linnego z wykorzystaniem odpowiednio TLC i HPLC.
Jak wynika z danych przedstawionych w tabeli 1, najcz ciej do roz-dzielania zwi zków z grupy naftochinonów z zastosowaniem chromatografii cienkowarstwowej w uk adzie faz odwróconych (RP-TLC) stosuje si p ytki z faz stacjonarn typu C18 [3], a eluent stanowi wodne roztwory metanolu lub kwasu mrówkowego. Detekcj plamek prowadzi si wietle UV.
W przypadku zastosowania wysokosprawnej chromatografii cieczowej (tabela 2) w odwróconym uk adzie faz, faz stacjonarn , podobnie jak w przy-padku TLC, stanowi el krzemionkowy modyfikowany grupami oktadecylowymi [4-8, 10], cz sto dla wyeliminowania powierzchniowych oddzia ywa z grupami OH wykorzystywane s kolumny „encappowane” RP18e [9]. Dobry efekt roz-dzielczy uzyskano tak e z zastosowaniem krótszych a cuchów w glowodoro-wych – faza stacjonarna C8 [10]. W przewa aj cej ilo ci metodyk stosowana jest elucja izokratyczna [4-8, 10] z eluentem w postaci wodnych roztworów ace-tonitrylu [6-8] lub metanolu [4-5, 9-10] z dodatkiem kwasu octowego lub mrów-kowego. Do detekcji substancji z grupy naftochinonów powszechnie stosowane s detektory spektrofotometryczne UV-VIS, korzystnie z matryc fotodiodow (DAD) [4, 6-10], a tak e detektor fluorescencyjny [5].
Zastosowanie elucji izokratycznej jest korzystne z punktu widzenia zastosowania opracowanych metodyk do preparatywnego lub procesowego otrzymywania frakcji substancji z zastosowaniem techniki chromatografii cie-czowej. Takie podej cie pozwala na atwiejszy odzysk sk adników eluentu, co czyni zaprojektowany proces rozdzielczy bardziej ekonomicznym. Rozdzielanie i oznaczanie polifenoli z zastosowaniem chromatografii czieczowej w uk adzie faz odwróconych
W tabelach 3 i 4 zestawiono warunki chromatograficzne zastosowane do rozdzielania polifenoli w ekstraktach wybranych materia ów pochodzenia ro linnego z wykorzystaniem odpowiednio TLC i HPLC.
W poni szych tabelach opisano tak e metodyki nie zaliczane do uk a-du faz odwróconych, ale stosowanych jako jeden z etapów przygotowania próbki lub uzupe niaj co, w pracach, w których na etapie „w a ciwego” roz-dzielania polifenoli stosowano RP. Ma to miejsce szczególnie w przypadku rozdzielania polifenoli z zastosowaniem cienkowarstwowej chromatografii cieczowej. W przypadku zbierania frakcji polifenoli rozdzielanych z zastoso-waniem RP-HPLC, na etapie kontroli czysto ci frakcji, przewa nie, stosowa-no TLC w uk adzie faz normalnych lub z zastosowaniem chromatografii oddzia ywa hydrofilowych (ang. Hydrophilic interaction chromatography - HILIC) [11-13]. Zastosowanie warunków rozdzielania ortogonalnego, po-zwala na skuteczn kontrol czysto ci zbieranej frakcji na etapie RP-HPLC, poprzez zastosowanie odmiennego mechanizmu separacyjnego na etapie kontrolnym realizowanego z wykorzystaniem TLC.
90
Tab
ela
1.
Ze
sta
wie
nie
wa
runków
rozdzie
lan
ia n
afto
ch
ino
nów
te
chn
ik T
LC
T
ab
le 1
.
A c
om
pa
riso
n o
f th
e s
ep
ara
tio
n c
ond
itio
ns o
f n
ap
hto
quin
on
es b
y T
LC
te
chniq
ue
Lp
. N
r M
ate
ria
ro
linny
(Pla
nt
mate
rial)
Analiz
ow
ane s
ubsta
ncje
(A
naly
zed s
ubsta
nces)
Faza
sta
cjo
narn
a
(Sta
tio
na
ry
ph
ase)
Elu
en
t W
art
oci
(Valu
es)
Rf
Wa
runki D
ete
kcji
(Dete
ction c
onditio
ns)
Uw
agi
(Com
ments
) L
it.
1.
Dro
sera
ro
tun
difo
lia,
Dro
sera
in
term
edia
1)
4-O
-glu
ko
zyd
7-m
ety
loh
ydro
juglo
nu
2)
4-O
-glu
ko
zyd h
yd
ro-
plu
mbagin
y
C18
MeO
H:H
2O
1
:1 (
v/v
) 1
) 0,3
8
2)
0,4
8
UV
prz
y 3
65 n
m
Kolo
r pla
mek:
1)
fiole
tow
o-n
iebie
ski
2)
nie
bie
ska
Wid
zia
lne r
ów
nie
w
w
ietle
dzie
nnym
po
kilk
u
godzin
ach –
br
zow
ienie
na
skute
k r
ozk
adu p
od w
py-
wem
po
wie
trza.
Cze
rwon
y k
olo
r zaró
wn
o p
od
U
V jak i w
w
ietle d
zie
nnym
p
o w
cze
nie
jszym
dzia
aniu
1%
AlC
l 3.
W p
en
i ro
zw
ini
t
D.
rotu
nd
ifo
lia o
trzy-
mano z
kultury
in
vitro
poprz
ez n
am
no
enie
na p
od
ou M
S i n
a
pod
ou
Rein
ert
-Mohr’a.
D.
inte
rme
dia
uzyska
no
rów
nie
na p
od
ou
Rein
ert
-Mohr’a.
wie
e r
olin
y e
kstr
a-
how
ano m
eta
nole
m.
[3]
2.
Ko
rze
nie
E
ch
ium
ita
licu
m L
.
1)
szik
on
ina
2)
alk
an
ina
3
) p
rod
ukty
sa
po
nifik
acji
chiraln
a faza
sta
cjo
narn
a
do
RP
- im
-pre
gnow
ana
nanokrz
em
ia-
nem
z d
odat-
kie
m C
u2+
z s
ekto
rem
chiraln
ym
MeO
H:H
CO
OH
2
0:1
(v/v
) S
zik
onin
a
0,7
A
lkanin
a
0,6
8
Pro
du
kty
sa
po
nifik
a-
cji
0,7
Dokum
enta
cja
pyte
k T
LC
zo
sta
a p
rze
pro
wa
dzo
na 1
2-
bito
w k
am
er
CC
D p
o-
czon
z
syste
mem
doku-
menta
cji
D
igiS
tore
2 (
Cam
ag)
Ko
rze
poddano lio
fili-
zacji,
a n
askóre
k o
d-
dzie
lon
o o
d r
dze
nia
ko-
rzenia
i s
pro
szkow
ano.
Na
ftoch
ino
ny e
kstr
a-
how
ano z
e s
pro
szko-
wan
ych
ko
rze
ni u
yw
a-
jc h
eksanu.
Rozpuszczaln
ik u
suni
-to
pod z
mnie
jszonym
ci
nie
nie
m.
Pozosta
-o
rozp
uszczo
no w
M
eO
H,
wytr
co
ne
wo-
ski o
dfiltro
wa
no
. R
oz-
puszczaln
ik o
dparo
wa-
no p
od z
mnie
jszonym
ci
nie
nie
m.
P
ozosta
o r
ozp
usz-
czon
o w
heksa
nie
.
[4]
G. Boczkaj, M. Jaszczo t, A.Leman, A. Skrzypczak, A. Królicka, M. Kami ski
Camera Separatoria Vol. 3, No 1/2011
Vo
l. 3
, N
o 1
/20
11
C
am
era
Se
pa
rato
ria
91
Tab
ela
2.
Ze
sta
wie
nie
w
aru
nków
ro
zdzie
lan
ia n
afto
ch
inon
ów
te
chn
ik w
yso
kospra
wn
ej
ch
rom
ato
gra
fii
ko
lum
now
ej
–
HP
LC
T
ab
le 2
.
A c
om
pa
rison
of
the
sep
ara
tio
n c
on
ditio
ns o
f n
ap
hto
qu
ino
nes b
y H
igh
Pe
rform
an
ce
Co
lum
n C
hro
ma
tog
raph
y
tech
niq
ue
– H
PL
C
Lp
. N
r
Mate
ria
ro
linny
(Pla
nt
m
ate
rial)
Analiz
ow
ane s
ubsta
ncje
(A
naly
zed s
ubsta
nces)
Kolu
mna
(Colu
mn)
Elu
ent/
pro
gra
m e
lucji;
N
at
enie
prz
ep
yw
u
(elu
tio
n p
rogra
m,
flo
w r
ate
)
Dete
kto
r (D
ete
cto
r)
Uw
agi
(Com
ments
) L
it.
1.
Pom
idor,
gro
ch,
Rzo
dkie
wnik
p
osp
olit
y,
kukury
dza, ry
, m
arc
he
w,
zie
mn
iaki.
1)f
iloch
ino
n
(wit.
K1)
2)m
enachin
on-4
(K
2)
Dis
covery
C18
250x4.6
mm
,
5
m S
upelc
o
MeO
H:E
tOH
8
0:2
0,
v/v
(+
1 m
M C
H3C
OO
Na,
+
2 m
M C
H3C
OO
H,
+ 2
mM
ZnC
l 2)
Elu
cja
izo
kra
tyczn
a
Obj
tocio
we n
at
enie
prz
ep
yw
u
elu
entu
: 1 m
l/m
in
Flu
ore
scencyjn
y:
ex:
23
8 n
m,
em:
426 n
m.
tka
nki w
arz
yw
po
bie
ran
o
be
zp
ore
dn
io p
rzed
eks-
trakcj
(E
tOH
:H2O
95
:5).
Czas o
d p
obra
nia
pró
bki
do
za
ko
czenia
ekstr
akcji
wynosi
30
s.
[5]
2.
Lithosperm
um
ery
thro
rhiz
on
Sie
b.
et
Zucc.
(hodow
la k
om
ó-
rek i k
orz
eni)
de
oksyszik
on
ina;
szik
on
ina
; a
ce
tylo
szik
on
ina;
izo
buty
loszik
on
ina;
,-d
ime
tylk
oakry
loszik
on
ina
; iz
ow
are
lyro
szik
on
ina;
-mety
lo-n
-buty
loszik
onin
a;
8-h
yd
roksyiz
ow
are
lyro
szik
on
ina.
LS
-410 O
DS
S
il.,
(Toyo-
soda C
o.,
Ltd
.)
CH
3C
N:H
2O
:TE
A:C
H3C
OO
H
70
:30:0
,3:0
,3 (
v/v
/v/v
) E
lucja
izo
kra
tyczn
a.
Obj
tocio
we n
at
enie
prz
ep
yw
u
elu
entu
: 1,1
ml/m
in
Dete
cto
r U
V-V
IS -
520 n
m
Szik
on
iny e
kstr
ah
ow
an
o
Et 2
O p
rzez o
kre
s
3 h
w a
pa
racie
So
xhle
ta.
Et 2
O u
suni
to w
pró
ni.
Po
zosta
o s
uszon
o,
a
nast
pnie
rozpu
szczo
-no w
CH
3C
N.
[6-7
]
3.
Angelic
a r
adix
Lithosperm
um
ra
dix
C
era
fla
va
A
deps s
uill
us
Szik
on
ina;
Acety
loszik
on
ina;
,-d
imety
loakry
loszik
onin
a;
izo
buty
loszik
on
ina;
de
oksyszik
on
ina;
izo
wa
rely
roszik
on
ina;
kw
as f
eru
low
y.
Therm
oQ
uest
C18
CH
3C
N:
(H2O
+ C
H3C
OO
H)
47
:53 (
v/v
) (p
H 2
,56)
Elu
cja
izo
kra
tyczn
a.
Obj
tocio
we n
at
enie
prz
ep
yw
u
elu
entu
: 1,0
ml/m
in
Dete
kto
r U
V-V
IS -
280 n
m
Spro
szkow
an
y A
ng
elic
a
radix
do
da
no d
o w
cze
-n
iej zm
iesza
nych
i s
to-
pio
nych
w 1
30
-14
0°C
:
15 g
ole
ju s
ezam
ow
ego,
12
,5 g
sm
alc
u
i 7
,5 g
ó
tego w
osku
. G
dy k
olo
r do
da
ne
go
ko-
rze
nia
sta
si
br
zow
aw
y
i utr
zym
yw
a s
i d
uej
ni
15 m
inut
dodano
5 g
Lithosperm
um
radix
. O
trzym
an
y p
rod
ukt filtro
-w
ano n
a g
or
co
.
[7-8
]
Zastosowanie chromatografii cieczowej w odwróconym uk adzie faz (RP-LC)…
Vol. 3, No 1/2011 Camera Separatoria
92
4.
Wókna
teksty
lne
law
so
n (
2-h
ydro
ksy-1
,4-n
afto
chin
on
);
jug
lon
(5-h
ydro
ksy-1
,4-n
aft
och
ino
n);
la
pachol (2
-hydro
ksy-3
-(3-m
ety
lobut-
2-
en
ylo
)-1
,4-n
afr
och
ino
n);
a
ntr
ach
ino
ny.
Pu
rosp
her
RP
18e (
5
m)
(Merc
k),
w
ym. 125x4
mm
MeO
H:H
2O
P
rog
ram
elu
cji:
3
min
– e
lucja
izo
kra
tyczn
a 4
0%
M
eO
H (
v/v
) N
ast
pnie
gra
die
nt do 9
5%
MeO
H
prz
ez 1
5 m
in
Obj
tocio
we n
at
enie
prz
ep
yw
u
elu
entu
: 0,6
ml/m
in
Dete
kto
r U
V-V
IS-
DA
D -
monitoro
wa-
na d
. fa
li 2
70 n
m
Wókna e
kstr
ahow
ano
prz
ez 1
0 m
inut p
od
ch
odnic
zw
rotn
HC
l-H
2O
-MeO
H (
2:1
:1, v/v
/v).
Do H
PLC
wykorz
ysta
no
supern
ata
nt
po w
irow
aniu
ekstr
aktu
.
[9]
5.
Dzb
an
eczn
ik
law
so
n;
1,4
-naft
och
ino
n;
jug
lon
; plu
mbagin
a;
2,2
’-(3
-hydro
ksy)-
1,4
-bin
aft
och
ino
n;
C8 i C
18
0,1
ml/l C
H3C
OO
H:
MeO
H
35
:65 (
%,
v/v
) E
lucja
izo
kra
tyczn
a.
Obj
tocio
we n
at
enie
prz
ep
yw
u
elu
entu
: 0,7
5 m
l/m
in
Dete
kto
r U
V-V
IS -
260 n
m
An
aliz
a H
PL
C e
kstr
aktó
w
dzb
an
eczn
ika
.
[10
]
6.
Ko
rze
nie
E
ch
ium
ita
licu
m L
.
szik
on
ina
; a
ce
tylo
szik
on
ina;
pro
pio
nylo
szik
on
ina;
izo
buty
loszik
on
ina;
3,3
-dim
ety
loa
kry
loszik
on
ina;
2-m
ety
lo-n
-bu
tyry
loszik
on
ina
; Iz
ow
are
lyro
szik
on
ina;
Alk
an
ina.
Kolu
mna
ze s
tali
nie
rdzew
nej
BD
S H
ypers
il C
18
250×
10 m
m
I.D
., 5
m
(T
herm
o,
US
A)
TH
F:C
H3C
N:H
2O
:HC
OO
H
30
:20:5
0:0
.5,
(v/v
/v/v
) E
lucja
izo
kra
tyczn
a.
Obj
tocio
we n
at
enie
prz
ep
yw
u
elu
entu
: 3,5
ml/m
in
Dete
kto
r U
V-V
IS-
DA
D –
monitoro
-w
ana d
. fa
li
518 n
m
Jak o
pis
ano p
ow
yej d
la
TLC
.
[4]
G. Boczkaj, M. Jaszczo t, A.Leman, A. Skrzypczak, A. Królicka, M. Kami ski
Camera Separatoria Vol. 3, No 1/2011
Za
sto
so
wa
nie
ch
rom
ato
gra
fii cie
czo
wej w
odw
róco
nym
uk
ad
zie
fa
z (
RP
-LC
)…
Tab
ela
3.
Ze
sta
wie
nie
wa
runków
rozdzie
lan
ia p
olif
en
oli
techn
ik c
hro
mato
gra
fii cie
nkow
ars
twow
ej T
LC
T
ab
le 3
.
A c
om
parison o
f th
e s
ep
ara
tion c
ond
itio
ns o
f p
oly
pheno
ls b
y T
LC
techniq
ue
L
p.
Ma
teria
ro
linn
y
An
aliz
ow
an
e
su
bsta
ncje
F
aza
sta
cjo
na
rna
E
lue
nt
Wart
oci R
f W
aru
nki D
ete
kcji
Uw
agi
Lit.
1.
ura
win
a
glik
ozyd
ßa
wo
no
lu;
ga
lakto
zyd
;
kw
erc
ety
ny;
a
rab
ino
zy;
kw
erc
ety
ny.
el
krz
em
ion
ko
wy
Octa
n e
tylu
B
rak d
an
ych
L
am
pa
UV
O
wo
ce
u
raw
iny m
acero
wa
no
w 7
0%
wo
dn
ym
ro
ztw
orz
e m
eta
-n
olu
, a
na
st
pn
ie o
trzym
an
za
-w
iesin
filt
row
an
o.
Ro
zp
uszcza
lnik
u
su
ni
to w
wyp
arc
e o
bro
tow
ej.
Wodn
y r
oztw
ór
ekstr
ah
ow
an
o
dw
ukro
tnie
ete
rem
nafto
wym
. F
rakcje
ete
ru e
tylo
we
go
po
czo
-n
o, filtro
wa
no
, a
na
st
pn
ie z
a-
gszczo
no
w w
yp
arc
e o
bro
tow
ej.
TL
C –
su
yo
wy
czn
ie d
o
wst
pn
ego
wyd
zie
len
ia f
rakcji.
D
als
ze
ro
zd
zie
lan
ia p
row
ad
zo
no
te
ch
nik
HP
LC
.
[11
]
2.
Zie
lon
a
he
rba
ta
(-)e
pik
ate
ch
ina
; (-
)ep
iga
lloka
tech
ina;
(-)g
alu
sa
n-3
-ep
ika
tech
iny;
(-)g
alu
sa
n-3
-ep
iga
llokate
ch
iny.
el
krz
em
ion
ko
wy
CH
Cl 3
:Me
OH
: H
2O
6
5:3
5:1
0,
(v/v
/v)
- e
pik
ate
ch
ina -
0,3
9
- e
pig
allo
ka
tech
ina
- 0
,28
- g
alu
sa
n-3
-ep
ikate
ch
iny -
0,3
- g
alu
sa
n-3
-e
pig
allo
ka
tech
iny -
0,1
9
Re
akcja
ba
rwn
a
wyw
oa
na
od
-czyn
nik
iem
va
ni-
lina
+kw
as s
oln
y
Ka
tech
iny z
su
row
ej h
erb
aty
eks-
tra
ho
wa
no
wo
d w
tem
pe
ratu
rze
8
0°C
. E
kstr
akt
rozd
zie
lan
o z
za
-sto
so
wa
nie
m k
olu
mnow
ej ch
rom
a-
togra
fii cie
czo
we
j.
TL
C –
za
sto
so
wa
no
w c
elu
uzy-
ska
nia
do
da
tko
wych
in
form
acji
nt.
fr
akcji
uzyskiw
an
ych
w R
P-H
PL
C.
[12
]
3.
Trz
cin
a
cu
kro
wa
Fla
wo
no
idy,
C
-glik
ozyd
y:
wite
ksyn
a;
orie
nty
na
; a
glik
on
y;
fla
wo
no
ido
we
.
el
krz
em
ion
ko
wy
Octa
n e
tylu
: kw
as m
rów
ko
-w
y:w
od
a
6:1
:1 (
v/v
/v)
Bra
k d
an
ych
R
ea
kcja
ba
rwn
a
z e
str
em
-
am
i-n
oe
tylo
wym
kw
asu
dife
nylo
-b
oro
we
go
(flu
-o
ryzu
jce
pla
my
w
wie
tle
UV
p
rzy 3
60
nm
)
Wyto
ki z t
rzcin
y c
ukro
we
j p
od
da
-n
o m
ace
racji
wsp
om
aga
ne
j p
ro-
mie
nio
wa
nie
m u
ltra
dw
iko
wym
w
ro
ztw
orz
e m
eta
no
l:w
od
a
(1:1
, v/v
) p
rze
z 1
,5 m
in
w t
em
pe
ratu
rze
po
ko
jow
ej. N
a-
st
pn
ie e
kstr
akt
oczyszcza
no
z z
asto
so
wa
nie
m S
PE
, fr
akcj
fla
-w
on
oid
ów
elu
ow
an
y m
eta
no
lem
.
TL
C –
za
sto
so
wa
no
w c
elu
kon
tro
-li
efe
kty
wn
oci o
czyszcze
nia
eks-
tra
ktu
na
SP
E o
raz p
otw
ierd
ze
nia
o
be
cn
oci fla
wo
no
idów
.
[13
]
Vol. 3, No 1/2011 Camera Separatoria
Zastosowanie chromatografii cieczowej w odwróconym uk adzie faz (RP-LC)… 93
G
. B
oczka
j, M
. Ja
szczo
t, A
.Le
man,
A.
Skrz
ypcza
k,
A.
Kró
licka
, M
. K
am
iski
94
Tab
ela
4.
Ze
sta
wie
nie
wa
runków
rozdzie
lan
ia p
olif
en
oli
techn
ik H
PL
C
Tab
le 4
.
A c
om
parison o
f th
e s
ep
ara
tion c
ond
itio
ns o
f p
oly
pheno
ls b
y H
TLC
te
chniq
ue
L
p.
Ma
teria
ro
linn
y
An
aliz
ow
an
e s
ub
sta
ncje
K
olu
mn
a
Elu
en
t/p
rogra
m e
lucji;
N
at
en
ie p
rze
pyw
u
De
tekto
r U
wa
gi
Lit.
1.
Ja
bka
kw
. ch
loro
ge
no
wy;
(+)k
ate
ch
ina
; (-
)ep
ika
tech
ina
; flo
ren
tyn
a;
pro
cyja
nid
B1
; p
rocyja
nid
B2
; p
rocyja
nid
C1
.
Inte
rsil
OD
S-3
(G
L S
cie
nce
s In
c.
Ja
pon
ia)
wym
. 2
50
x4
,6 m
m i.d
.
A:
10
mM
KH
2P
O4
(pH
2,0
) B
: M
eO
H
Elu
cja
gra
die
nto
wa
: 1
0%
B –
10
min
1
0-5
0%
B –
40 m
in
50
% B
– 1
5 m
in
10
% B
– 1
0 m
in
Ob
jto
cio
we
na
te
nie
prz
e-
pyw
u e
lue
ntu
: 1,0
ml/m
in
De
tekto
r U
V-V
IS -
2
80
nm
Prz
ez r
ozd
rob
nio
ne
ow
oce
prz
ep
uszczo
no
1
0%
Na
2S
2O
5,
za
sto
sow
an
o e
nzym
y p
rote
oli-
tyczn
e w
ce
lu s
kla
row
an
ia s
oku
po
czym
mie
-sza
nin
od
wiro
wa
no
i o
czyszcza
no
z z
asto
-so
wa
nie
m z
iem
i o
krz
em
ko
we
j.
[1
4]
2.
Ja
bka
(w
ino
ja
bko
we
C
yd
r)
(+)k
ate
ch
ina
; (-
)ep
ika
tech
ina
; ty
rozo
l;
ka
techo
l;
kw
. b
en
zo
eso
we
; kw
. h
yd
roksycyn
am
ono
we
; kw
. fe
rulo
wy;
kw
. ch
loro
ge
no
wy;
glik
ozyd
y k
we
rcyty
no
we
.
Nu
cle
osil
120
C1
8 3
m
w
ym
. 2
50
x4
,6 m
m i.d
.,
(Te
kno
kro
ma
, B
arc
elo
-n
a,
His
zp
an
ia)
A:
uw
od
nio
ny 2
% C
H3C
OO
H
B:
10
0%
MeO
H
Elu
cja
gra
die
nto
wa
: 0
-45
% B
– 5
5 m
in
Da
lej E
lucja
izo
kra
tyczn
a
prz
ez 2
0 m
in
Ob
jto
cio
we
na
te
nie
prz
e-
pyw
u e
lue
ntu
: 0,8
ml/m
in
De
tekto
r U
V-V
IS
DA
D m
on
ito
row
a-
ne
d. fa
li: 2
80 n
m,
31
3 n
m,
35
5 n
m
Pró
bki 8
His
zp
askic
h w
in ja
bko
wych
od
ga
-zo
wa
no
w a
ni u
ltra
dw
iko
we
j p
rze
z
10
min
, filtro
wa
no p
rze
z f
iltr
z o
cta
nu
ce
lulo
zy
(0,4
5
m).
F
iltra
t d
ozo
wa
no
be
zpo
red
nio
do H
PL
C.
[15
]
3.
Win
ogro
na
cv.
Re
bu
la
estr
y k
wa
só
w h
yd
roksycyn
a-
mo
no
wych
C
18
Lu
na 3
m
(P
he
-n
om
ene
x)
wym
.15
0x2
mm
,
A:
2,3
% H
CO
OH
, p
H 2
,1
B:
ace
ton
itry
l E
lucja
gra
die
nto
wa
: 0
min
– 1
2%
B
15
min
– 2
2%
B
20
min
– 5
5%
B
25
min
– 1
2%
B
50
min
– 1
2%
B
Ob
jto
cio
we
na
te
nie
prz
e-
pyw
u e
lue
ntu
: 1,3
ml/m
in
De
tekto
r U
V-V
IS
DA
D,
mon
ito
row
a-
na
d. fa
li -
32
0 n
m
Do
win
ogro
n d
od
an
o 2
g p
iro
sia
rcza
nu
po
tasu
w
ce
lu z
ah
am
ow
an
ia o
ksyd
azy p
olif
eno
low
ej.
Wyci
ni
to s
ok z
win
ogro
n,
a s
kó
rki e
kstr
ah
o-
wa
no
3 r
azy p
o 1
0 m
in 6
0 m
l kw
asu
nad
ch
lo-
row
ego
o s
te
niu
6%
.
So
k i e
kstr
akty
po
czo
no
a n
ast
pn
ie s
czo
-
no
prz
ez f
iltr
PT
FE
0,4
5
m (
Ch
rom
afil).
[16
]
4.
Win
ogro
na
cis
-re
sw
era
tro
l;
tra
ns-r
esw
era
tro
l;
kw
erc
yty
na
; ru
tyn
a.
Hyp
ers
il O
DS
5 µ
m
wym
. 1
50
x4
.6 m
m,
(
Te
ch
no
ch
rom
a,
His
z-
pa
nia
)
A:
ace
ton
itry
l B
: H
2O
:CH
3C
OO
H:
CH
3C
N 8
7:3
:10
, (v
/v/v
) E
lucja
gra
die
nto
wa
: 5
% A
– 0
min
2
5%
A –
25
min
O
bj
tocio
we
na
te
nie
prz
e-
pyw
u e
lue
ntu
:
1,0
ml/m
in
de
tekto
r U
V-V
IS-
DA
D m
on
ito
row
a-
na
d. fa
li -
30
6 n
m
An
aliz
a H
PL
C e
kstr
aktó
w m
eta
no
low
ych
.
[17
]
Camera Separatoria Vol. 3, No 1/2011
Z G. Boczkaj, M. Jaszczo t, A.Leman, A. Skrzypczak, A. Królicka, M. Kami ski
Vo
l. 3
, N
o 1
/20
11
C
am
era
Se
pa
rato
ria
95
Se
mip
rep
ara
tyw
ne
H
PL
C:
Su
pe
lco
sil
L
C-S
i 5
µm
w
ym
. 2
50
x2
1,2
mm
CH
2C
l 2:M
eO
H:
HC
OO
H:H
2O
A
: 5
:43
:1:1
(v/v
/v/v
) B
: 41
:7:1
:1 (
v/v
/v/v
) E
lucja
gra
die
nto
wa
: 0
-20
% A
– 4
0 m
in
20
-100
% A
5 m
in
Ob
jto
cio
we
na
te
nie
prz
e-
pyw
u e
lue
ntu
: 20
ml/m
in
De
tekto
r
UV
- 2
80 n
m
5.
M
iazga
ka
ka
o
(-)e
pik
ate
ch
ina
; (+
)ka
tech
ina
; fla
wa
n-3
-ol;
pro
cyja
nid
B2
; p
rocyja
nid
C1
; p
ro a
nto
cyja
ny.
An
aliz
a k
ate
ch
in:
De
ve
losil
OD
S H
G-5
(N
om
ura
Chem
ica
l C
o.
Ltd
., A
ich
i, J
apo
nia
) 2
50
x4
,6 m
m
I.D
. 5
µm
A:
0,1
% T
FA
w
CH
3C
N
B:
0,1
% T
FA
w
H2O
E
lucja
gra
die
nto
wa
: 0
-10
% A
– 5
min
1
0-2
5%
A –
25 m
in
25
-100
% A
– 5
min
O
bj
tocio
we
na
te
nie
prz
e-
pyw
u e
lue
ntu
: 0,8
ml/m
in
De
tekto
r
UV
- 2
80 n
m
Mia
zg
z z
iare
ne
k k
aka
o p
odd
ano
3-k
rotn
ej
ekstr
akcji
n-h
eksa
ne
m
w t
em
p. p
oko
jow
ej p
rze
z
30
min
ut, w
ce
lu u
sun
icia
tu
szczy.
0
,5 g
od
tu
szczo
ne
j m
iazgi
3-k
rotn
ie e
kstr
aho
wa
no
80
% a
ce
ton
em
.
[18
]
6.
Ka
ka
o (
sp
rosz-
ko
wa
ne
ka
kao
C
oco
anO
X)
pro
cyja
nid
y (
mo
no
-,
di- i t
rim
ery
);
(-)e
pik
ate
ch
ina
; (+
)ka
tech
ina
.
Zo
rba
x
Eclip
se
XD
B-C
18
1
50
x2
.1 m
m,
5
m
A:
H2O
:HC
OO
H 9
9,9
:0,1
(v/v
) B
: C
H3C
N
Elu
cja
gra
die
nto
wa
: 2
0 m
in -
6-1
0%
B
5 m
in –
10
-13
% B
5
min
- 1
3-1
5%
B
10
min
– 1
5-1
0%
B
5 m
in –
10
-6%
B
Ob
jto
cio
we
na
te
nie
prz
e-
pyw
u e
lue
ntu
: 0,6
ml/m
in
De
tekto
r U
V-V
IS
DA
D -
28
0 n
m
Ekstr
akcja
mie
sza
nin
Me
OH
:HC
l, 9
9,7
:0,2
2
(v/v
), w
iro
wa
nie
, za
ta
nie
po
d z
mn
iejs
zo
nym
ci
nie
nie
m.
Po
zo
sta
y e
kstr
akt
rozcie
czo
no
w
od
i f
iltro
wa
no
(filtr
0,4
5
m P
TF
E).
[19
]
7.
He
rba
ta
Ka
tech
ina
; G
alu
san
; ep
ika
tech
iny;
Ga
lusan
; ep
iga
lloka
tech
iny;
Ep
ika
tech
ina;
Ep
iga
lloka
tech
ina
.
Ko
lum
na Z
orb
ax
SB
-C1
8 2
50
x4
.6 m
m
I.D
. 5
µm
H2O
:Me
OH
: C
H3C
OO
H
70
:30
:0,1
(v/v
/v)
Elu
cja
izo
kra
tyczn
a.
Ob
jto
cio
we
na
te
nie
prz
e-
pyw
u e
lue
ntu
: 1,0
ml/m
in
De
tekto
r U
V –
VIS
2
70
nm
P
rób
ki su
ch
ej he
rba
ty e
kstr
ah
ow
an
o w
rzca
w
od
prz
ez 1
go
dzin
. N
ast
pn
ie r
oztw
ór
fil-
tro
wa
no
(filtr
mem
bra
no
wy 0
,45
µm
).
[20
]
8.
He
rba
ta
(-)e
pik
ate
ch
ina
; (-
) e
pig
allo
ka
tech
ina
; (-
)ga
lusa
n-3
-ep
ika
tech
iny;
(-)g
alu
sa
n-3
- -e
pig
allo
ka
tech
iny.
Hilb
ar
RT
25
0 x
10 m
m
z L
ichro
sorb
RP
-18 7
m
(Me
rck,
Da
rmsta
dt,
N
iem
cy)
H2O
:CH
3C
N:M
eO
H:C
H3C
OO
H
79
,5:1
8:2
:0,5
(v/v
/v/v
) E
lucja
izo
kra
tyczn
a.
Ob
jto
cio
we
na
te
nie
prz
e-
pyw
u e
lue
ntu
: 3 m
l/m
in
De
tekto
r U
V-V
IS
K
ate
ch
iny w
ye
kstr
ah
ow
an
o z
Ch
iskie
j zie
lo-
ne
j he
rba
ty p
rzy u
yciu
wo
dy o
te
mpe
ratu
rze
8
0 o
C w
ci
gu
1 h
(m
iesza
nie
ci
ge
). O
czysz-
cza
nie
ekstr
aktu
z z
asto
so
wa
nie
m S
PE
.
[12
]
Vol. 3, No 1/2011 Camera Separatoria
Zastosowanie chromatografii cieczowej w odwróconym uk adzie faz (RP-LC)…
Z G. Boczkaj, M. Jaszczo t, A.Leman, A. Skrzypczak, A. Królicka, M. Kami ski
Vol. 3, No 1/2011 Camera Separatoria
96
Rozdzielanie polifenoli obecnych w ekstraktach ro linnych technik HPLC w warunkach RP realizowane jest z zastosowaniem typowych uk a-dów chromatograficznych, tj. fazy stacjonarnej któr stanowi z elem krze-mionkowym modyfikowanym grupami oktadecylowymi (C18) [12, 14-20] oraz eluentów sk adaj cych si z wody oraz metanolu [14-15, 20] lub acetonitrylu [16-19]. W wi kszo ci przypadków stosowano elucj gradientow [14-19], rzadziej izokratyczn [20]. Powszechnie stosowanym w tego typu badaniach jest detektor UV, cz sto z matryc fotodiodow (DAD).
2. Podsumowanie
Warunki rozdzielania substancji z grupy naftochinonów oraz polifenoli s stosunkowo dobrze opracowane. Odpowiednia procedura przygotowania próbki do analizy chromatograficznej pozwala na zastosowanie typowych uk adów separacyjnych stosowanych w RP.
Dobór optymalnych technik oraz warunków przygotowania próbki jest podyktowany typem ro liny (zawarto ci t uszczów [18], obecno ci kutykuli, budowy tkanek), z jakiej prowadzona b dzie izolacja substancji, a tak e od rodzaju metabolitów wtórnych w niej zawartych - ich w a ciwo ci fizykoche-micznych i struktury.
Powszechnie stosowan technik izolacji substancji z materia u ro-linnego do analizy naftochinonów i polifenoli jest ekstrakcja ciecz , cz sto z
zastosowaniem aparatu Soxhleta [6-7], albo z maceracj [11]. Do ekstrakcji polifenoli z herbaty zastosowano gor c wod [12, 20], co jest rozwi zaniem korzystnym z punktu widzenia zielonej chemii, a przede wszystkim ekono-micznym. Wysok efektywno ekstrakcji uzyskiwano w przypadku zasto-sowania, jako czynnika wspomagaj cego, ultrad wi ków [13, 15, 21]. Uzy-skane ekstrakty poddawano wirowaniu, a uzyskany supernatant poddawano dalszemu oczyszczaniu, g ównie z zastosowaniem SPE [12-13], lub dodat-kowo filtrowano i poddawano analizie HPLC lub TLC. W przypadku analizy próbek ciek ych, tj. soków, wina, stosowano wy cznie filtracj próbki, któr bezpo rednio analizowano z zastosowaniem technik chromatografii cieczo-wej [15].
Ogólny schemat etapów procedury przygotowania próbki, rozdzielania i oznaczania polifenoli i naftochinonów przedstawiono na rysunku 1.
Zastosowanie chromatografii cieczowej w odwróconym uk adzie faz (RP-LC)…
Vol. 3, No 1/2011 Camera Separatoria
97
Rys.
1.
Eta
py a
na
lizy e
kstr
aktó
w ro
linn
ych
z za
sto
so
wa
nie
m ch
rom
ato
gra
fii
cie
czo
we
j ja
ko
te
ch
nik
i ro
zd
zie
lan
ia i
ozn
acza
nia
Fig
. 1
. S
tep
s o
f a
na
lysis
of
the
pla
nt
extr
acts
with
th
e u
se
of
liqu
id c
hro
ma
tog
rap
hy a
s a
se
pa
ratio
n a
nd
qu
an
tita
tive
de
term
ina
tio
n t
ech
niq
ue
G. Boczkaj, M. Jaszczo t, A.Leman, A. Skrzypczak, A. Królicka, M. Kami ski
Camera Separatoria Vol. 3, No 1/2011
98
Conclusions A conditions for separation of naphthoquinone or polyphenol groups of
compounds are quite good developed. An appropriate procedure of the sample preparation for chromatographic analysis, allows to use a typical chromatographic Reversed Phase conditions.
The selection of optimal technique and conditions of sample prepara-tion regards to the type of plant (a lipids or cuticula content [8],the tissue composition) from which the isolation will be made as well as to the type of secondary metabolites which are included in the plant – its physiochemical properties and structure.
A technique commonly used for isolation of the compounds from the plant material for naphthoquinones and polyphenols analysis is liquid extrac-tion, often in the Soxhlet Apparatus [6-7] or with maceration [11]. The extrac-tion of polyphenols from tea was made by extraction with hot water [12, 20], which is a valuable solution form the green chemistry point of view and also very economical. A high effectiveness of the extraction was achieved in the case of the ultra-wave extraction [13, 15, 21]. The extracts were then centri-fuged, and the supernatant was purified with another processes, often by SPE [12, 13] or additionally filtrated and than analyzed by HPLC or TLC. In the case of the liquid samples analysis i.e. juices, vines, only filtration of the sample was used before the chromatographic process made by LC [15].
A general scheme describing the steps of sample preparation, separa-tion and determination of polyphenols and naphthoquinones procedure is presented in figure 1. 3. Podzi kowania (Acknowledgements)
Praca wspó finansowana przez Uni Europejsk w ramach Europej-skiego Funduszu Spo ecznego. Projekt systemowy Województwa Pomor-skiego pn. „InnoDoktorant – stypendia dla doktorantów”, II edycja. Literatura (Literature) 1. A. Marston, Role of advances in chromatographic techniques in phyto-
chemistry, Phytochem., 68(2007)2785. 2. E. Leistner, Biosynthesis of plant quinones. The biochemistry of plants.
Secondary plant products. (red. E.E. Conn), Academic Press, 7(1981)413.
3. J. Budzianowski, Naphthohydroquinone glucoside od Drosera rotundifo-lia and D. intermedia drom in vitro cultures, Psychochem., 42(1996)1145.
4. A. Albrehta, I. Vovka, B. Simonovskaa, M. Srbinoska, IdentiÞcation of shikonin and its ester derivatives from the roots of Echium Italicum L., J. Chromatogr. A, 1216(2009)3156.
Zastosowanie chromatografii cieczowej w odwróconym uk adzie faz (RP-LC)…
Vol. 3, No 1/2011 Camera Separatoria
99
5. C. Oostende, J. R. Widhalm, G.J.C. Basset, Detection and quantiÞ- cation of vitamin K1 quinol in leaf tissues, Phytochem., 69(2008)2457.
6. Y. Fujita, Y. Maeda, C. Suga, T. Morimoto, Production of shikonin de-rivatives by cell suspension cultures of lithospermum erythrorhizon. Comparison of shikonin derivatives of cultured cells and ko-shikon, Plant Cell Reports, 2(1983)192.
7. B. Hazra, M. Das Sarma, U. Sanyal, Separation methods of quinonoids constituents of plants used in Oriental traditional medicines, J. Chroma-togr. B, 812(2004)259.
8. P.C. Wu, Y.B. Huang, I.C. Lin, Y.H. Tsai, A rapid, simple high perform-ance liquid chromatography method for the determination of traditional chinese medicine ointment Shiunko, J. Food Drug Anal., 12(2004)311.
9. P. Novotna, V. Pacáková, Z. Bosáková, K. Štulìk, High-performance liquid chromatographic determination of some anthraquinone and naph-thoquinone dyes occurring in historical textiles, J. Chromatogr. A, 863(1999)235.
10. P. Babula, V. Adam, L. Havel, R. Kizek, Noteworthy secondary me-tabolites naphthoquinones – their occurrence, pharmacological proper-ties and analysis, Cur. Pharm. Anal., 5(2009)47.
11. H. Chen, Y. Zuo, IdentiÞcation of ßavonol glycosides in American cran-berry fruit, Food Chem., 101(2007)1374.
12. R. Amarowicz, F. Shahidi, A rapid chromatographic method for separa-tion of individual catechins from green tea, Food Res. Intern., 29(1996)71.
13. R. Colombo, F.M. Lancas, J.H. Yariwake, Determination of ßavonoids in cultivated sugarcane leaves, bagasse, juice and in transgenic sugar-cane by liquid chromatography-UV detection, J. Chromatogr. A, 1103(2006)118.
14. T. Shoji, Y. Akazome, T. Kanda, M. Ikeda, The toxicology and safety of apple polyphenol extract, Food Chem. Toxicol., 42(2004)959.
15. B. Suárez, N. Palacios, N. Fraga, R. Rodríguez, Liquid chromatographic method for quantifying polyphenols in ciders by direct injection, J. Chromatogr. A, 1066(2005)105.
16. B. Mozeti , I. Tomaži , A. Škvar , P. Trebše, Determination of polyphe-nols in white grape berries cv. Rebula, Acta Chim. Slov., 53(2006)58.
17. O. Palomino, M.P. Gómez-Serranillos, K. Slowing, E. Carretero, A. Vil-lar, Study of polyphenols in grape berries by reversed-phase high-performance liquid chromatography, J. Chromatogr. A, 870(2000)449.
18. M. Natsume, N. Osakabe, M. Yamagishi, T. Takizawa, T. Nakamura, H. Miyatake, T. Hatano, T. Yoshida, Analyses of polyphenols in cacao liquor, cocoa, and chocolate by normal-phase and reversed-phase HPLC, Biosci. Biotechnol. Biochem., 64(2000)2581.
19. E. Cienfuegos-Jovellanos, M. del Mar Quiñones, B. Muguerza, L.Moulay, M. Miguel, A. Aleixandre, Antihypertensive effect of a poly-phenol-rich cocoa powder industrially processed to preserve the original flavonoids of the cocoa beans, J. Agric. Food Chem., 57(2009)6156.
G. Boczkaj, M. Jaszczo t, A.Leman, A. Skrzypczak, A. Królicka, M. Kami ski
Camera Separatoria Vol. 3, No 1/2011
100
20. M. Ding, H. Yang, S. Xiao, Rapid, direct determination of polyphenols in tea by reversed-phase column liquid chromatography, J. Chromatogr. A, 849(1999)637.
21. D. Ko odziejski, praca magisterska, „Porównanie efektywno ci wybra-nych technik ekstrakcji/ ugowania metabolitów wtórnych z suchego ma-teria u ro lin owado ernych”, An effectiveness comparison of selected techniques for extraction/leaching of secondary metabolities for dry in-sectivorous plant material, Politechnika Gda ska, Gda sk 2010.
Recommended