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Biotecnología Vegetal Transformación génica en plantas. Biotecnología Vegetal. La biotecnología consiste en la utilización de organismos vivos con fines industriales. - PowerPoint PPT Presentation
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Biotecnología Vegetal Transformación génica en
plantas
Biotecnología Vegetal
• La biotecnología consiste en la utilización de organismos vivos con fines industriales
• Conjunto de técnicas que utilizan organismos vivos o parte de ellos para obtener productos o modificarlos, para mejorar plantas o animales, o para desarrollar microorganismos con fines determinados
• Se utilizan las técnicas de ingeniería genética y cultivo de tejidos vegetales in vitro
• Sistemas de transferencia de ADN basados en vectores biológicos
- Sistemas basados en Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes.
- Sistemas basados en virus vegetales.
• Sistemas de transferencia directa de ADN
- Transferencia por biobalística (micropartículas de oro o tungsteno que tiene aglomerado el DNA foráneo).
- Transferencia mediada por cationes divalentes y/o electroporación
- Transferencia por microinyección.
Sistemas de transformacióngenéticaen plantas
Planta transgénica
Se introduce un DNA foráneo en el genoma de sus células, este DNA se expresa y confiere a la planta un carácter o unos caracteres nuevos
¿Para qué plantas transgénicas?
• Rendimiento y calidad nutricional
• Biorreactores
• Estudio de procesos biológicos
Rasgos introducidos
• Resistencia a:– insectos– herbicidas– virus, hongos, bacterias
• Retraso de senescencia, tolerancia a estrés
• Mejora del valor biológico (proteínas, lípidos)
• Producción de polipéptidos de uso farmacológico.
Biotecnologías de apoyo al Biotecnologías de apoyo al mejoramiento de plantasmejoramiento de plantas
•Cultivo de tejidos•Rescate de embriones•Embriogénesis somática•Organogénesis somática•Producción de haploides •Fusión de protoplastos
•Trasformación genética•Agrobacterium tumefaciens•Agrobacterium rhizogenes•Métodos directos •Métodos Indirectos
Cultivo de tejidos Factores comunes
Composición general de medios de cultivo:• Fuente de Carbono (azúcares)• Macronutrientes (N, K, etc)• Micronutrientes (Fe, Cl, etc)• Vitaminas• Agente gelificante (para medios sólidos)• Reguladores de crecimiento (hormonas vegetales)• Otros compuestos (ej: agentes quelantes)
asepciaasepcia
cultivocultivo
aambientacimbientaciónón
Cultivo de tejidos: Rescate de embriones
Cultivo de tejidos: Embriogénesis somática
Cultivo de tejidos: Organogénesis somática
Propagación masiva •Flores•Frutales•Árboles forestales
Cultivo de meristemas•Saneamiento de virus•Rejuvenecimiento
Cultivo de tejidos: Producción de haploides
Cultivo de tejidos: Fusión de protoplastos
Transformación genética Técnicas básicas
• Enzimas de restricción• Clonación de genes• Secuenciación• Electroforesis de Proteínas, ARN y ADN• Hibridación con anticuerpos (western blot)• Hibridación de ácidos nucleicos (southern, northern)
• Reacción de la polimerasa en cadena (pcr)
Transformación genética Técnicas básicas
Enzimas de restricción
Clonación en plásmidos (vectores)
Transformación genética Técnicas básicas
Clonación en plásmidos (vectores)
Transformación genética Técnicas básicas
Secuenciación
A C G T
Transformación genética Técnicas básicas: Secuenciación
Transformación genética Técnicas básicas
Electroforesis (DNA, RNA,proteinas)
southern
northern
western
Transformación genética Técnicas básicas
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Métodos indirectos
• Agrobacterium tumefaciens
• Agrobacterium rhizogenes
Transformación genética:A. tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens
Tumor de tallo provocadopor Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens
Bacteria del suelo Gram (-)
Agallas en corona
Agrobacterium tumefaciens
Bacteria Gram negativa que infecta a las plantas en lugares donde hay heridas y produce la enfermedad de las agallas en
corona, fundamentalmente en Dicoteledóneas.
Las agallas son protuberancias formadas por conglomerados de células indeferenciadas
El plásmido Ti (tumor-inducing) es el responsable de la inducción de tumores, durante la infección se transfiere una porción definida de este plásmido: T-DNA (DNA de
transferencia)
La integración y expresión de ciertos genes del T-DNA (oncogenes) hace que las células transformadas se dividan sin control. Codifican para la síntesis de fitohormonas (auxinas y
citoquininas) y de opinas (fuente de C y N para la bacteria).
¿Qué son los genes vir?
• Codifican factores esenciales para la transferencia e integración del T-DNA dentro del genoma de la planta.
• Están ubicados en una regíón de 35 kb del plásmido Ti fuera de la región del T-DNA.
• Hay 25 genes vir distribuídos en 7 operones.
• Responden a un metabolito secundario exudado por las plantas cuando se les provoca una herida (acetosiringona)
Transformación genética:A. tumefaciens
Vectores derivados del plásmido Ti
• Componentes necesarios:– Marcador de selección (resistencia a kanamicina)– Origen de replicación (para que se replique en E.coli)– Borde derecho de la secuencia T-DNA– Polylinker (región de multiple clonaje)
• Tipos:– binarios– cointegrados
Transformación genética:A. tumefaciens
Se inocula con Agrobacterium desarmada que contenga un vector de transformación. El T-DNA contiene un módulo de expresión y el gen de resistencia a la kanamicina
El medio además de hormonas debe contener el antibiótico cefotaxima (para controlar el crecimiento de Agrobacterium) y kanamicina (antibiótico de selección)
Cultivo de raíces de tabaco transformadaspor Agrobacterium rhizogenes
Fenotipo Ri en plantas de Brassica napus
Gentileza del Dr. Mark Tepfer
Agrobacterium rhizogenes
En este caso se utiliza como vector de transformación la bacteria con su plásmido Ri intacto y además se introduce otro plásmido que contiene los genes quiméricos dentro del T-DNA. Puede dar fenotipos aberrantes en la parte aérea de la planta
Métodos directos
• Bombardeo de partículas (biobalistica)
• Electroformación de Protoplasto
• Fibras de carburo de silicio “Whiskers”
• Transformación mediada por Glicol de polietileno (PEG)
Transformación genética:Biobalística
Manipulación de la expresión génica
• Promotores:– constitutivos (35S del virus del mosaico del
coliflor)
– tejido específicos (FBPasa - Rubiscom)
– inducibles
• Secuencias “enhancer”• Intrones que estabilizan el mRNA producido• Secuencia terminadora (nopalina sintasa)
Manipulación posttranscripcional
• Antisentido– Se transfiere un gen que codifica para un RNA
complementario (asRNA) al mRNA de interés.– Al transcribirse ambos genes se forma un
híbrido asRNA-mRNA que impide la traducción del último.
GENES UTILIZADOS Y CARACTER CONFERIDO EN
PLANTAS TRANSGÉNICASTipo de gen utilizado en
transgénesisCaracter que confiere a la
planta
Toxina de Bacillus thuringensis
Proteína de la cubierta viral
Quitinasas, glucanasas de plantas y de otros organismos
Lisozima humana y de cerdo. Otros péptidos bactericidas
Genes cuyos productos afectan la biosíntesis de aminoácidos, o la fotosíntesis
Genes cuyos productos afectan la biosíntesis del etileno, o la formación de pared celular
Resistencia a Insectos
Resistencia a Virus
Resistencia a Hongos
Resistencia a Bacterias
Resistencia a Herbicidas
Retraso maduración de frutos
ALGUNAS LIBERACIONES COMERCIALES DE PLANTAS TRANSGÉNICAS (Birch, 1997)
Cultivo (Fecha liberación)
Nombre Compañía Caraterísticas
Tomate (1994) Flavr Savr Calgene Savor de madurez en rama, largavida
Tomate (1995) Zeneca Consistencia de pasta de tomate
AlgodónPapasMaiz (1996-97)
BollgardNewLeafYieldGuard
MonsantoToxina deBacillus thuringiensis para resistencia insectos
SoyaRapsAlgodón (95-96)
Roundup Ready
MonsantoResistencia a Glifosato (herbicida)
OTRAS PLANTAS QUE HAN SIDO GENÉTICAMENTE MODIFICADAS
AbetoAcelgaAlfalfaAlgodónAlamoArabidopsisArrozArvejaCamoteCaña de azucarCebadaCentenoClavelCrisantemoEspárrago
EucalyptusFrambuesaFrutillaKiwiLechugaLirioMaízManíManzanaMaravillaOrquideaPapaPapayaPetuniaPera
PinoPlátanoPorotoPoroto de soyaRemolachaRepolloRosaSorgoTabacoTomateTulipánTrigoVidesZanahoriaZapallo
Transformación de Plantas
Biobalística o
Agrobacterium
Mejoramiento Genético
Color Postcosecha
Resistencia a Patógenos
MEJORAMIENTO GENÉTICO DE PLANTAS CON TRANSFORMACIÓN GENÉTICA
Insectos
Resistencia a Herbicidas
Esterilidad Sexual
Calidad del Producto
Hongos BacteriasMaterna
Paterna
Roundup
Listo
Glifosato
Bromoxinil
Glifosato
Asignacion
• Definicion• Rescate de embriones• Embriogénesis somática• Organogénesis somática• Producción de haploides • Fusión de protoplastos• Plasticidad• Totipotencia• Monocotiledodeas• Dicotiledoneas
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