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26/9/2012
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Biomarcadores, Danos em Lipideos e Proteínas, Reparo
18/Set/2012
Biomarcadores
Biomarcadores ou marcadores biológicos
são entidades que podem ser medidas
experimentalmente e indicam a ocorrência
de uma determinada função normal ou
patológica de um organismo.
Os biomarcadores podem ser de diversos
tipos. Podem ser células específicas,
moléculas, genes, enzimas ou hormônios.
Fonte:http://www.roche.pt/portugal/index.cfm/investigacao_ps/no
vos-desafios---biomarcadores/ “Fingerprinting”
Para espécies reativas, mede-se biomarcadores de danos oxidativos.
Mede-se produtos oxidados.
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Biomarcador de Dano Oxidativo “Ideal”
• Representativo do dano a ser monitorado
• Específico
• Estável (não ser degradadado ou formado durante a estocagem da amostra)
• Método deve ser sensível, específico e preciso
• Ensaio validado (baixo coeficiente de variação, reprodutível) para uso em estudos in vitro e in vivo.
• Medidas em amostras biológicas de fácil obtenção. Por exemplo, fluidos corporais (p. ex.: urina, sangue, saliva, cabelo, unha).
• Ensaio de baixo custo econômico.
Enzimático Não-Enzimático
Oxidação de
Lipídeos
Mecanismos de oxidação de lipídeos
COX
LOX
Espécies Reativas
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Peroxidação Lipídica
X
XH
X
XH
O2O2LH
L
LH
L
OO
OO
H
X = OH, RO, ROO, CO3
LH L LOO LOOH
ONOO-,
Produto Primário
O O
O
O
OH
Aldehydes
O
O
R
R
Cyclic peroxides
IsoprostanesNeuroprostanes
Produtos Secundários
Fonte: Miyamoto et al Chapter 2
Biomarkers for Antioxidant Defense and Oxidative Damage:
Principles and Practical Applications
Edited by Giancarlo Aldini, Kyung-Jin Yeum, Estuo Niki, and
Robert M. Russell ©2010 Blackwell Publishing Ltd.
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Peroxidação Lipídica
H H
H
R
RH
OOO2
HOO
LH
L
LOO
LOOH
L
LH
O
O
R
R
O OO
Fe2+
Fe3+
O O
O
O
OH
LO
LOO
Aldehydes
Cyclic peroxides
IsoprostanesNeuroprostanes
E0’ PUFA/PUFA = 0.6 V
R1 R2
H H
HH H H
H H
HH
H bis-alílico (75 kcal/mol)
H mono-alílico (88 kcal/mol)
C-H Bond Dissociation Energy (BDE)
Venkataraman et al 2004 Antioxid. Red. Signal.6, 631
H alquílico (101 kcal/mol)
A remoção do H-bis-alílico exige menor energia. Portanto a remoção deste H é mais favorável termodinamicamente.
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Velocidade de Propagação da
Peroxidação Lipídica
H bis-alílicos
2
6
8
10
dx.doi.org/10.1021/cr200084z | Yin et al. Chem. Rev. 2011, 111, 5944–5972
O kp aumenta com aumento do número de H bis-alílicos. Isso se reflete em uma velocidade maior de oxidação.
H H
H
R
RH
OOO2
HOO
LH
L
LOO
LOOH
L
LH
O
O
R
R
O OO
Fe2+
Fe3+
O O
O
O
OH
LO
LOO
Aldehydes
Cyclic peroxides
IsoprostanesNeuroprostanes
Ensaios para quantificação da Peroxidação Lipídica in vitro & in vivo??
1) Consumo do substrato
2) Detecção de radicais
intermediários
3) Detecção de produtos finais
Biomarcadores
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F2-Isoprostanos (IP)
Dr. Sean S. Davies Dr. L. Jackson Roberts Dr. Jason Morrow
• F2 isoprastanes são compostos similares à PGF2
• Formado pela oxidação não-enzimática do ácido araquidônico
– F2 isoprostanos podem ser gerados em fosfolipídeos e hidrolisados por fosfolipases
• Gerado em grandes quantidades in vivo
• Considerado o “melhor” biomarcador de dano oxidativo a lipídeos
F2-IsoPs como biomarcador
• BOSS study (2005)-IsoPs most accurate measure of oxidant stress in CCl4-treated rats.
• Deficiencies in antioxidants in vivo are associated with increased IsoP formation.
• Antioxidants decrease IsoP levels in animals and humans.
• IsoP levels are increased in animal models of human diseases and human disorders associated with oxidant stress.
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Biomarkers of Oxidative Stress Study (BOSS Study, 2005)
dx.doi.org/10.1021/cr200160h | Milne et al. Chem. Rev. 2011, 111, 5973–5996
dx.doi.org/10.1021/cr2002992 | Smith et al. Chem. Rev. 2011, 111, 5821–5865
Oxidação enzimática & não-enzimática do ácido araquidônico
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Espécies Reativas Produtos da Lipoperoxidação
Danos em
Proteínas
Danos oxidativos em proteínas
Dano direto Dano indireto
Reversíveis/Irreversíveis
Danos em Proteínas
Aminoácidos facilmente oxidáveis em proteínas:
-Tirosina, Fenilalanina, Triptofano
- Lisina, Arginina
- Cisteína e Metionina
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o,o’-dityrosine
+
NH 3 +
COO –
O •
NH 3 +
COO –
OH
NH 3
COO –
OH
NH 3 +
COO –
OH
NO2•
Tyr•
Ox
Ox
Tyrosine Tyrosyl radical
NH 3 +
COO –
OH
Cl
3-Cl-tyrosine (RHS)
NH 3 +
COO –
OH
NO2
3-NO2-tyrosine (RNS)
NH 3 +
COO –
OH
OH
3,4,-diOH-Phe (DOPA)
Tirosina é alvo preferencial de modificação em proteínas
Stable oxidation markers:
HOCl, Cl2
Dímero
Produto
Nitrado Produto
Clorado
Produto
Hidroxilado
Triptofano
Fonte: Thornalley and Rabbani Chapter 9
Biomarkers for Antioxidant Defense and Oxidative
Damage: Principles and Practical Applications
Edited by Giancarlo Aldini, Kyung-Jin Yeum, Estuo
Niki, and Robert M. Russell
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Msr: Metionina Sulfóxido Redutase. Enzima de reparo para metionina sulfóxido.
Metionina
Camundongos transgênicos sem Msr tem tempo de vida reduzido em 40% e apresentam disfunção do cerebelo. (vide Fig. 4.10 Augusto, O.) Bacteria sem Msr é hipersensível à H2O2. Drosophila com Msr superexpressa vive mais.
Oxidação metionina à metionina sulfóxido é um evento muito comum in vivo. (Augusto, O. p. 94)
Oxidação Não-Reparável
Fonte: Thornalley and Rabbani Chapter 9
Biomarkers for Antioxidant Defense and Oxidative Damage:
Principles and Practical Applications
Edited by Giancarlo Aldini, Kyung-Jin Yeum, Estuo Niki, and
Robert M. Russell
Cisteína
Não-Reparável
Reparo de sulfênico e sulfínico na presença de redutores (GSH, Tioredoxina e/ou Glutaredoxina)
Sulfênico reage com tiois livres formando disulfetos (intra ou intermoleculares), os quais são reduzidos de volta na presença de redutores.
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DalleDone et al 2007
Free Radic. Biol. Med. 43, 883
Cisteína
É muito comum também ocorrer a formação de disulfetos mistos envovendo cisteínas livres ou GSH (glutationilação de proteínas)
Fonte: Uchida, K. In Biomarkers for Antioxidant Defense and Oxidative Damage: Principles and Practical
Applications. Edited by G Aldini, K Yeum, E Niki, and R M. Russell
Modificação de Lisina por aldeídos da peroxidação lipídica: Formação de Base de Schiff
Lisina
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Modificação de Lisina, Cisteína e Histidina por HNE: Adição de Michael
Fonte: Uchida, K. In Biomarkers for Antioxidant Defense and Oxidative Damage: Principles and Practical
Applications. Edited by G Aldini, K Yeum, E Niki, and R M. Russell
Lisina
Cisteína
Histidina
Danos em
Proteínas
Danos oxidativos em proteínas
Reversíveis / Irreversíveis
Reparados por enzimas de reparo. Até o momento são reparáveis apenas oxidações em metionina (metionina sulfóxido) e cisteína (sulfênico e sulfínico)
Oxidações de aminoácidos além de cisteína e meitionina não são, até o momento, reparáveis por enzimas. Proteínas modificadas são encaminhadas para o “desmonte” (proteólise), via proteassoma. Muitas proteínas modificadas são propensas à agregação. Esses agregados podem se acumular formando fibrilas insolúveis.
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Degradação/Remoção de Proteínas danificadas
Proteínas danificadas Lisossomos/Hidrólise de proteínas
Proteassomo (20S e 26S) Fig. 4.11 Livro Ohara p. 95
Agregação
Formação de precipitados/fibrilas insolúveis
Métodos para monitorar danos oxidativos em proteínas
1) Consumo do substrato (aminoácido)
Perda de tióis
Perda da fluorescência do triptofano
2) Medida de radicais intermediários
Ex. Radical tirosil
3) Medida de produtos finais
Análise de produtos/aminoácidos oxidados específicos
Ex. 3-nitrotirosina, 3-clorotirosina, N-formilkinurenina, etc.
Proteínas carboniladas
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Proteínas Carboniladas
• Proteínas carboniladas são relativamente estáveis
• Formadas in vitro por diversos agentes oxidantes (reações catalisadas por metais, radiações ionizantes, HOCl, ozonio, 1O2, produtos da oxidação de lipídeos)
• Facilmente detectados utilizando-se o reagente DNPH (ensaios colorimétricos e imunológicos)
Vias de formação de proteínas carboniladas
1- Oxidação direta de aminoácidos, em particular por Fenton (ver Fig. 4.6 Livro Ohara)
2- Quebra da ligação peptídica
3- Reação de Lys, His, Cys com aldeídos da peroxidação lipídica
4- Reação de Lys com açucares redutores ou seus compostos de oxidação
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