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Paris, 1er février 2012
Marie-Anne Loriot
INSERM UMR-S 775,Université Paris Descartes
UF Pharmacogénétique et Oncologie Moléculaire,
Hôpital Européen Georges Pompidou
Approches méthodologiques en pharmacogénétique
IDENTIFICATION DE SOUS-POPULATIONSen fonction de la réponse et de la toxicité
Non toxique
Toxique
Inefficace Efficace
Variabilité interindividuelle dans la réponse auxmédicaments
Médicament
REPONSE
EFFICACITE/TOLERANCEINEFFICACITE/TOXICITE
Facteurs acquis- Age, sexe
- Comorbidités
- Alimentation
- Interactions
médicamenteuses
Facteurs génétiquesPolymorphismes génétiques
- métabolisme- transport - cible pharmacologique- immunité (HLA)
Médecineprédictive
etpersonnalisée
OBJECTIF:
Facteurs génétiques
Pharmacogénomique
Etude des conséquences des variations de l’ADN et de l’ARN sur laréponse aux médicaments
Pharmacogénétique
Influence des variations de la séquence en ADN sur la réponseaux médicaments
Qu’est-ce qu’un polymorphisme?
• Phénotype d’un individu (grec phanein, f anei n se manifester) = ensemble descaractéristiques visibles (traits physiques) et invisibles (biologiques);
• Le phénotype est sous-tendu par des variations individuelles dans la séquence del’ADN génomique dont l’ensemble est appelé génotype;
• Polymorphisme génétique : variation individuelle de la séquence nucléotidique(substitution -SNP-, délétions et amplifications –CNV-, répétitions…)
Existence au même locus d’au moins 2 formes différentes de la séquence,appelés allèles
Fréquence > 1% dans la population• SNPs très fréquents au sein du génome
environ 10 millions de SNPs soit θ≈ 1 /300 bases
SNP= Single Nucleotide PolymorphismCNV= Copy Variation Number
( )n
Gène défectueux, « non fonctionnel » (délétion, mutation inactivatrice)Gène actif, « normal »
( )n Amplification du gène actif
pas de gène actif
métaboliseursLENTS
1 gène actif
métaboliseursRAPIDES OU
INTERMEDIAIRES
2 gènes actifs
métaboliseursRAPIDES
plus de 2 gènes actifs
métaboliseursULTRARAPIDES
Bases moléculaires de la variabilité génétique: Polymorphismes génétiques
D’après de Chaisemartin et Loriot, PatholBiol (Paris), 2005
Génotype
Phénotype
Principaux mécanismes moléculaires des modifications de l’activitédes EMX
Séquence non codante Séquence codante
Jonctionsexon/intron
5 ’NC5 ’ 3 ’
5 ’ 3 ’
5 ’ 3 ’
5 ’ 3 ’
5 ’ 3 ’
Modificationde la
quantitéd’enzyme
Enzymeabsente
ou inactive
Enzymeabsente
ARNm
Enzymeinstable
Altérationspécificitéde substrat
Quantitéd’enzymeaugmentée
Diminutionde l’activité
Effet surl’inductibilité
Métabolismeréduit
ou absent
Métabolismemodifié
Métabolismeaugmenté
FREQUENCE DES POLYMORPHISMES GENETIQUESDES ENZYMES DU METABOLISME DES XENOBIOTIQUES
CYP 1A1 (induction ~ 10%)CYP 2A6* (5%)CYP 1A2 (10%)CYP 2C9 (2-3%)CYP 2C19 (5-20%)CYP 2D6* (5-7%)CYP 2E1 (>1%)CYP 3A4/5 (?)
GSTM1* (50%)GSTT1 (10-20%)GSTP1 (10%)UGT1A1 (10-15%)NAT2 (50%)EH (<5%)TPMT(<1%)MDR1 (25%)
* : gènes pour lesquels une duplication est connue
Phase III: transporteurs ABC type MDR1 (ABCB1),, SLC, OAT…
Phase I Phase II
POLYMORPHISMES GÉNÉTIQUES DES ENZYMES DU MÉTABOLISME DES MÉDICAMENTS
Variations interindividuelles dans la réponse aux médicaments
Interactions: médicamenteuses,médicaments-aliments
Absorption/Excrétion*:ex. MDR1 lente/rapide
* variabilité génétique
Métabolisme*: ex. CYP450lent, rapide, ultrarapide
Interactions avec cible pharmacologique*:faible/forte
Fonction rénale
Interactionsmédicamenteuses
Conséquences de la variabilité génétiquePhénotype Effet sur [médicament] Conséquence clinique
tps
[méd
i]
Indexthérapeutique
tps
[méd
i]
Indexthérapeutique
tps
[méd
i]
Indexthérapeutique
métaboliseurlent
métaboliseurrapide
métaboliseurultrarapide
• toxicité
• efficacitéthérapeutique
• inefficacitéthérapeutique
*Les variations du métabolisme, du transport et des cibles pharmacologiques ont des conséquences:
- pharmacocinétiques- pharmacodynamiques- toxiques
* Rôle important quand:- fenêtre thérapeutique étroite- efficacité difficile à évaluer rapidement- efficacités voisines avec profils de tolérance variable
* Il est possible de prédire le métabolisme- génotypage- phénotypage
INTERET DE LA PHARMACOGENETIQUE
Phénotype:
- activité réelle- quantifiable- mise en oeuvre plus difficile (in vivo, in vitro, ex vivo)- variations (xénobiotiques, pathologies)- pas permanent
Génotype:
- facile- permanent- pas quantifiable- pas activité réelle
EXEMPLES DE PHENOTYPAGE in vivo
CYP 1A1 : induction lymphocytes ERODCYP 1A2 : caféine sang PX/C (NAT2)CYP 2A6 : CoumarineCYP 2C9 : DiclofenacCYP 2C19: Méphénytoïne, Proguanil,
OméprazoleCYP 2D6 : Debrisoquine, Spartéine,
DextromethorphaneCYP 2E1 : ChlorzoxasoneCYP 3A4 : 6-ß-OH-Cortisol (induction),
13, 14 (C)Erythromycine,Midazolam, Dapsone,Dextromethorphane
GENOTYPAGE : outils
* Méthodes fondées sur la PCR : RFLP, PCR allèle-spécifique, OLA ..(spécifiques) séquençage
* Méthodes non spécifiques: SSCP, DGGE
D-HPLC :
==> détection de nouveaux polymorphismes
* « Carte génétique » : puces à ADN
Intérêt pour les études sans à priori
Relation génotype phénotype
Exemple de la TPMT
UtilisationsGastro-entérologie, cancérologie, transplantation,dermatologie….
Indications dans les maladies inflammatoireschroniques de l’intestin (MICI) de l’adulte et de l’enfant:- maintien de la rémission clinique (taux de réponse 50%)- sevrage des patients cortico-dépendants- prévention des rechutes post-opératoires
Efficacité à long terme (taux de rechute 5-10% par an)
Délai d’efficacité: 12 à 18 semaines
MEDICAMENTS THIOPURINIQUES:AZATHIOPRINE ET 6-MERCAPTOPURINE
THIOPURINE METHYL-TRANSFERASE (TPMT) :THIOPURINE METHYL-TRANSFERASE (TPMT) :métabolisme des métabolisme des thiopurinesthiopurines
AZATHIOPRINEImurel ®
6-MERCAPTOPURINE (6-MP)
TPMT HGPRT XO
6-MMP6-THIOGUANINES
ACIDE THIOURIQUE
ACTIFSImmunosuppresseursMaladie de CrohnLeucémie aigue lymphoblastique
TOXIQUES(dose dépendant)Hématotoxicité
Myélosuppression
ACTIVITE TPMT : DISTRIBUTION TRIMODALE
M/M
M/Wt
Wt/Wt
METABOLISME DE L’AZA ET LA 6-MP
AZA = azathioprine ; 6-MP = 6-mercaptopurine ; 6-TIMP = 6-thioinosine monophosphate ; 6-TGN = 6-thioguanine nucléotides;6-MMP = 6-méthylmercaptopurine ; 6-TA = acide thiourique ; 6-MeTIMP = 6-méthylthioinosine monophosphate;6-MMP(R) = 6-méthylmercaptopurine ribonucléotides ;HGPRT = Hypoxanthine guanine phosphoribosyltransférase;XO = xanthine oxydase ; IMPDH = inosine monophosphatedéshydrogénase
CONSEQUENCES DES VARIATIONS DE L’ACTIVITE TPMT
Toxicité hématologique:Corrélation entre taux de 6-TGN et activité TPMT: lien avecla myélotoxicitéDéficit en TPMT: dans 1/3 des cas de toxicités
Toxicité hépatique:Dérivés méthylés hépatotoxiquesRapport 6-TGN/6-MMPEn cas d’activité TPMT élevée production accrue de 6-MMP
Résistance pharmacologiqueEn cas d’activité élevée: seuil d’activité à définir
Adaptation de posologieEn fonction du génotype ou du phénotype
Principales mutations
ATG Stop
5 ’ 3 ’
Structure du gène
POLYMORPHISME DE LA TPMT
TPMT* 2 : G238C Ala Pro
TPMT*3A : G460A Ala Thr
A719G Tyr Cys
TPMT*3B : G460A Ala Thr
TPMT*3C : A419G Tyr Cys
7 %
78 %
< 1%
5%
Répartition des allèles variants:
PHENOTYPAGE TPMTPHENOTYPAGE TPMT
Cytosolsérythrocytaires
Activité érythrocytaire = reflet de la TPMT hépatique
Réaction enzymatique: 6-MP 6-MMP
Mesure radiométrique ouSéparation par HPLC
CORRÉLATIONGÉNOTYPE/PHÉNOTYPE
Identification de biomarqueursApproche gène candidat
Exemple des anticoagulants oraux
PROBLEME DE SANTE PUBLIQUE
PROBLEMESLIES AUX
TRAITEMENTSAVK
18 000hospitalisations
par an
Première caused’accidents iatrogènes Près de 900 000
patients traités
≈ 5000 décès par an
Coumadine® (warfarine)cp à 2 et à 5 mg
Préviscan® (fluindione)cp à 20 mg
AVK EN FRANCE
Sintrom® Mini-Sintrom®
cp à 4 et à 1 mg (acénocoumarol)
4-OH-Coumarine et ses dérivés :Acénocoumarol Sintrom®Warfarine Coumadine ®Tioclomarol Apegmone ®
Indane-dione et ses dérivés :Fluindione Previscan ®Phenindione Pindione ®
O
O
R
O
O H
O
R
État d’hypocoagulabilité
LES MÉDICAMENTS ANTI-VITAMINE K
Cycle de lavitamine K
Synthèse de facteursnon fonctionnels
X
II
IXVII
Observance du traitement
Alimentation (vit. K)
Situation physiopathologiqueInteractions médicamenteuses
Facteurs génétiques
Risque
hémorragique
VARIABILITEDANSLAREPONSEVARIABILITEDANSLAREPONSE
Risque
thrombotique
Nb de
patients
Doses de warfarine (mg/semaine)
HYPERSENSIBILITE RESISTANCE
METABOLISME
des AVK
O
O
R
O
O
R
Dans le foie:
6 and 7hydroxylationpar CYP2C9
ELIMINATION(biliaire et rénale)
↑ hydrophile
METABOLISMEDESAVK
Super-famille d‘enzymes essentiellespour le métabolisme desmédicaments
17 familles de CYPs comprenant environ 50isoformes identifiées chez l‘Homme
classification: CYP 2 C 9
famille> 40% homologie
de séquence sous-famille> 55% homologie
de séquence
isoenzyme
*1
allèle
Variations environnementales: inhibition/induction
Polymorphismes génétiques
VARIABILITE DANS L’ACTIVITE DU CYP 2C9
Variants alléliques
CYP2C9*1
CYP2C9*2 (Cys144Arg)
CYP2C9*3 (Leu359Ileu)
Fréquence Allélique
0,79-0,86
0,08-0,19
0,06-0,1
Activité
100 %
12 %
5 %
24 variants alléliqueshttp://www.imm.ki.se/CYPalleles/cyp2c9.htm
Populations caucasiennes
CIBLE PHARMACOLOGIQUE des AVK
AVK
CYP2C9VKOR
VKOR =Vitamine K
époxyderéductase
inactif
Facteurs Vit K dépendantsinactifs
Facteurs Vit K dépendantsactifs
VIT Koxydée
VIT Kréduite
GGC GGC=γ-glutamylcarboxylase
Cycle de la
vitamine K
CYP2C9 explique 21% de la variabilitéVKORC1 explique 13% de la variabilité
VKORC1 DOSE 95% CI p n PATIENTS
CC 6,2 5-7,3 Ref 54
CT 4,8 3,8-5,9 0,002 69
TT 3,5 2,2-4,8 0,001 24
Relation entre SNP 1173C>T (intron 1) et
dose de warfarine à l’équilibre
« A polymorphism in VKORC1 gene is associated with aninter-individual variability in the dose-anticoagulant effect
of warfarin »D'Andrea, Blood. 2004
Àpartird’uneétudechezdesvolontairessains(n=230)recevantunedoseuniqued’acénocoumarol
déterminationdelapartgénétiquedanslavariabilitédelaréponsepharmacologique
Collaboration CIC St Antoine, Pr Laurent BecquemontINSERM U525, David-Alexandre Trégouët
Génotype *1/*1 *1/*2 *1/*3 *2/*2 *2/*3 *3/*3
Nombre 143 44 30 4 8 1
Data allèle*2-Rapport
*1/* 1*1/*2 *2/*2
0
25
50
75
100
CYP2C9 genotype
FVII ratio (%)
Data allèle*3-Rapport
*1/*1 *1/* 3*3/* 3
0
25
50
75
100
CYP2C9 genotype
FVII ratio (%)
Effets des allèles CYP 2C9*2 et *3 sur la réponse à l’acénocoumarol
(« ratio facteur VII » = J0/J24 x100 )
RESULTATS CYP 2C9 (région codante)
CYP 2C9 *2 CYP 2C9 *3
Répartition des génotypes:
NS 14% de la variabilité
P< 0.001
ANALYSE PAR SNP ou PAR HAPLOTYPE
Gène X
Réponse
SNP 1
SNP 2
Gène XSNP 3
Gène X
SNP 1 SNP 2
Gène XSNP 1 SNP 3
Gène XSNP 2 SNP 3
Gène X
= haplotype 1
= haplotype 2
= haplotype 3
Réponse
1 gène, plusieurs SNPs
ANALYSE PAR SNP ou PAR HAPLOTYPE
SNP 1 SNP 2
Gène BSNP 1 SNP 3
Gène BSNP 2 SNP 3
Gène B
= haplotype 1
= haplotype 2
= haplotype 3
Réponse
SNP 1 SNP 2
Gène ASNP 1 SNP 3
Gène ASNP 2 SNP 3
Gène A
= haplotype 1
= haplotype 2
= haplotype 3
≥ 2 gènes, plusieurs SNPs
7 haplotypes déterminés par 4 Tags (2-4-6-7)
Marqueurs Fréquences
T C C A A G C 0.286
T C C A G G T 0.242
C A T C A G T 0.231
T A C A A G T 0.089
T C C C A G T 0.048
T A C A A G C 0.030
T A C A A A T 0.010
Intérêt des Tag SNP
HA
PLO
TYPE
S
région 5’Flanquante and promoteur Région codante région 3’non traduite
STRATEGIE UTILISEE POUR ETUDEHAPLOTYPIQUE DE VKORC1
http://pga.gs.washington.edu/data/vkorc1/welcome.html
29 SNPs répartis sur 10 kb
17 SNPs avec fréquence > 5%
-4931 T>C -4451 C>A -2659 G>C -1877 A>G -1639 G>A 497T>G 698C>T 1173C>T 1542G>C 3730G>A 4901 A>C 5113 G>A 5408 G>C2255C>T
-4931 T>C -4451 C>A -2659 G>C -1877 A>G -1639 G>A 497 T>G 1173 C>T
Sélection des «Tag »SNPs
in silico
STRATEGIE UTILISEE POUR L’ANALYSE DU GENE VKORC1
6 Tag SNPs (5 dans la région 5’, 1 dans l’intron 1)
95 % de la diversité haplotypique
ANALYSE HAPLOTYPIQUE DES POLYMORPHISMESDU GENE VKORC1 EN RELATION AVEC LA
REPONSE PHARMACOLOGIQUE
7 haplotypes: SNP -1639G>A =« marqueur des haplotypes »
Base de données => SNPs : reconstruction des haplotypes corrélation avec variation du facteur VII
SNPs Effet haplotypique
-4931T> C -4451C>A -2659G>C -1639G>A 497T>G FréquenceVariation du Factor VII (%) (95% CI)
C C G A G 0.27 18.9 (16.7-21.1)
C C G A T 0.12 18.6 (14.0-23.2)
T C G A G 0.019 19.2 (7.5-30.9)
18.9 (16.9-20.9)
T C G G T 0.23 34.3 (32.4-37.2)
T A C G T 0.21 36.8 (33.6-39.9)
T A G G T 0.11 37.6 (32.8-42.3)
C C G G T 0.017 41.5 (22.3-60.7)
36.0 (34.2-37.8)
EFFET DE LA MUTATION VKORC1 –1639G>A SUR LAREPONSE A L’ACENOCOUMAROL
GG GA AA
0
50
100*** **yyy****
*** ***
-1639G>A
Factor VII ratio (%)
Variation Facteur VII
Génotype VKORC1
37% de la variabilité
P<0.001
Bodin Blood 2005
Identification de biomarqueurs
Approche GWAS« Genome Wide Association
study »
Les études d'associationLes études d'association
Mettre en évidence le rôle de gènes/régions "candidats" dans la
variabilité d'un phénotype
Comment ?Comment ?
Tester l'association statistique entre des polymorphismes
(marqueurs) et le phénotype d'intérêt
Puces à ADN
Marquage fluorescent de sondes Hybridation spécifique sur ADN de patientsGrande capacité de génotypage:densité variable, jusqu’à 1 milllion de SNPsLecture automatisée sur plate-forme dédiée
P-values for each GWAS SNP tested for association with warfarin dose.Horizontal axis shows SNP location and vertical axis is -log10(p-value) for each SNP tested by univariate regression (A) or multivariate regression (B). Red dots and red lettering show SNPs and implicated genes with p-values beyond the genome-wide significance threshold (1.5×10-7) which is denoted by a horizontal line. (A) Univariate regression shows genome-wide significant association to SNPs clustering near the warfarin drug target VKORC1 (e.g., P = 5.4×10-78, rs9923231) and near the warfarin-metabolizing gene CYP2C9 (P = 4.5×10-17 for non-synonymous *3 SNP rs1057910, P = 8.8×10-13 for non-synonymous *2 SNP rs1799853, P = 3.1×10-31 for *2*3 “composite” SNP rs4917639). (B) Multivariate regression adjusting for the contributions of VKORC1 and CYP2C9 had greater power than univariate regression and detected genome-wide significant association to the CYP4F2 gene (P = 8.3×10-10, non-synonymous SNP rs2108622).
Résultats de l’étude d’association avec l’hépatotoxicité de la flucloxacilline
Nature genetics 200951 cas/282 témoins, puce Illumina Human1MRéplication dans étude indépendante (23 cas)
• Pic d’association p=8.7x10-33• Chromosome 6 = région MHC• Identification d’un marqueur en déséquilibre de liaison avec HLA-B*5701
CONCLUSION GENERALE
Bon usage de la pharmacogénétique va permettre:
Meilleure adéquation malade-traitement
Moins d’effets secondaires
Traitement plus efficace et à moindre coût
Phases de Développement Du Médicament
Utilisation en routine clinique
Ce qu’il faut retenir
• Il existe une grande variabilité interindividuelle dans la réponseaux médicaments;
• Les facteurs génétiques expliquent une part de cette variabilité;• Il est possible de prédire la réponse aux médicaments:
génotypage, phénotypage, corrélation génotype-phénotype;• Pour le génotypage: nécessité d’avoir des populations
homogènes (influence de l’ethnie sur la fréquence des SNPs)• Etudes cliniques ou chez le volontaire sain• Approches gènes candidats ou études pangénomiques «Genome
Wide Association Study »• Etudes en combinaison de SNP ou d’allèles: approche
haplotypique
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