View
219
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a Státním rozpočtem ČR InoBio – CZ.1.07/2.2.00/28.0018
Aplikace DNA markerů
v mykologii a molekulárni
taxonomii
Mendelova genetika v příkladech
doc. RNDr. Michal Tomšovský, Ph.D.,
Ústav ochrany lesů a myslivosti, LDF MENDELU, Brno
Co je taxonomie?
Dvě pojetí:
A) Taxonomie = popis, klasifikace, a kategorizace organizmů podle pravidel nomenklatury.
Systematika = taxonomie + evoluční vztahy mezi organizmy + biodiverzita
B) Taxonomie = Systematika
Nomenklatura = soubor pravidel, jak pojmenovávat a třídit organizmy – binomická nomenklatura (Linné, Systema Naturae 1758) obsažen v International Code of Nomenclature.
Existují kódy nomenklatury botanické, zoologické a n. prokaryot.
Proč molekulární taxonomie?
Základem klasifikace organizmu by měla být rekonstruovaná
fylogeneze dané vývojové linie – taxonomický systém by měl být
přirozený.
Podobnost ≠ Příbuznost
Vodní obratlovce s hydrodynamickým tělem lze rozlišit podle anatomických znaků. U některých skupin organizmů anatomii použít nelze.
Pojetí druhu
Dvě odlišné lidské kultury (domorodý národ a euroamerická
vědecká komunita) rozlišují přibližně stejný počet druhů ptáků na
Papue N. Guineji [Novotný V.: Papuánské (polo)pravdy 2004]
Intuitivní rozlišování druhů na základě vnější podobnosti.
Druh - základní taxonomická jednotka, ± přirozená
Jaká kritéria se používají pro rozlišování druhů?
Kritéria pro rozlišování druhů
Typologická definice druhu – druh vymezen nomenklatorickým
typem (typový exemplář) podle pravidel nomenklatury na
základě morfologických znaků (popis morfologických znaků).
Definice biologického druhu (Mayr 1982) – zástupci jednoho druhu
se mezi sebou pohlavně rozmnožují, zástupci jiných druhů se
nerozmnožují (špatně se to zjišťuje v praxi).
Představy o evoluční historii organizmů Pojetí druhu založené na historii
Původní představy byly analogické ke genealogickým Stromům šlechtických rodů.
Kladistika
Přirozený systém na základě genealogické příbuznosti = kladogeneze (Hennig 1966) Kladogeneze = postupné odvětvování vývojových linií v rámci linií existujících → hierarchické uspořádání taxonů do vzájemně vnořených skupin. Kladisté nepovažují přítomnost rozlišovacích znaků (anageneze – evoluční novinky specifické pro nové vývojové větve) za důležité. Nevycházejí ze standardních taxonomických kategorií Kladistický druh vzniká odštěpením (speciací) a zaniká vymřením (extinkcí)
Evoluční systematika Spojuje požadavek na vývojovou příbuznost taxonů
s požadavkem na přítomnost rozlišovacích znaků. Nepřípustné
polyfyletické taxony, parafyletické taxony ± přípustné (nepřípustné
v kladistice)
Polyfyletický taxon – potomci různých předků
Parafyletický taxon – někteří potomci jednoho
předka
Monofyletický taxon – všichni potomci jednoho
předka
Definice fylogenetického druhu
Požadavek na monofyletičnost daného druhu a přítomnost
diagnostického znaku (nebo kombinace více znaků) vhodného k
rozlišení od jiných druhů.
Fylogeneze = vznik a vývoj jednotlivých evolučních linií je
předmětem fylogenetiky
Nejčastější metodou fylogenetiky je analýza sekvencí DNA
Vznik nových druhů - speciace
Alopatrická speciace – genetické rozdíly (reprodukční izolace) mezi druhy vzniknou díky geografické bariéře. Peripatrická s. – část populace druhu osídlí nově vzniklou ekologickou niku (ostrov). Parapatrická s. – část populace málo pohyblivých druhů se nekříží se zbytkem populace a vzniknou genetické rozdíly - reprodukční izolace. Tento typ speciace bývá zpochybňován. Sympatrická s. – nový druh se formuje na stejném území. Polyploidizační speciace u rostlin.
Molekulární znaky v taxonomii
Výhody:
Velké množství znaků (sekvence velkého množství genů)
Sekvence různých genů bývají na sobě nezávislé.
Znaky jsou často selekčně neutrální = nehrozí nebezpečí vzniku
podobných znaků nepříbuzných taxonů na základě selekčního
tlaku.
Univerzální použitelnost a relativní dostupnost PCR a
sekvenování DNA.
Molekulární znaky v taxonomii
Příklady využití:
1) Testování morfologického pojetí druhu – vztahy mezi variabilitou morfologickou a molekulární.
2) Testování biologického pojetí druhu – míra genetické příbuznosti kryptických druhů (druhy morfologicky podobné, ale vzájemně se nerozmnožující).
3) Výzkum vzájemných vývojových vztahů dobře odlišitelných druhů podle tradičních kritérií.
Jak se pracuje s DNA?
Izolace DNA z houbových buněk –mechanické
drcení, extrakce DNA pomocí komerčních kitů
(cena cca 100 Kč = 4 Eura / vzorek).
Z celkové DNA je třeba namnožit požadovaný úsek
genomu.
metoda PCR – Polymerase Chain Reaction
(= Polymerázová řetězová reakce)
Sekvenace DNA: Zjištění pořadí nukleotidů v daném úseku DNA
DNA sekvence je užitečná pro identifikaci neznámého
organizmu = DNA barcoding.
Pro identifikaci organizmu na úrovni biologického druhu je třeba
zvolit tzv. konzervativní oblast DNA
U hub často sekvenována tzv. ITS oblast ribozomální DNA
(rDNA). Neznámou sekvenci DNA lze srovnat s údaji
v internetové databázi GenBank pomocí webové aplikace BLAST
www. ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html
Rozvíjí se databáze UNITE (http://unite.ut.ee/)
… ATATATAGGCAAGGAATCTCTATTATTAAATCATT…
Sekvenace DNA
18S 28S 5.8S
Ribozomální DNA
Různé podjednotky rDNA (18S, 28S), resp. úsek mezi nimi - tzv. ITS oblast
– bývají často sekvenovány.
Sekvence pro srovnání jsou volně přístupné na internetu www.
ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html .
ITS oblast
18S (SSU) a 28S (LSU) – malá a velká podjednotka jsou konzervativnější
než ITS1 a ITS2.
V taxonomii hub hlavně jaderná LSU (D1/D2 doména) a mitochondriální SSU
Kódující sekvence
Zpravidla se používají paralelně s ITS.
Úseky obsahují exony i introny
• translační elongační faktor 1-alfa (EF1a;tefa)
• beta tubulin (tub)
• RNA polymeráza II, podjednotky 1 a 2 (RPB1, RPB2)
• glyceraldehyd 3-fosfát dehydrogenáza (GDH)
• mitochondriální ATP syntáza, 6 podjednotka (ATP6)
Fylogenetické stromy
Diagramy znázorňující podobnost sekvencí =
příbuznost zkoumaných jedinců.
Různé metody zpracování stromů:
Distanční metody – převod sekvencí
na koeficienty podobnost (např. Neighbor-joining)
Znakové metody – pracují s jednotlivými bázemi
jako se samostatnými znaky
a) Maximální parsimonie (PAUP -
placený software; MEGA, PhyML - freeware).
Metodicky jde o hledání nejjednoduššího řešení a preferování
jednodušších hypotéz před složitějšími.
b) Maximální věrohodnost - Maximum Likelihood (PAUP;
PhyML – freeware)
c) Bayesovská analýza (Mr.Bayes - freeware)
Různé druhy fylogenetických stromů:
• Kladogram (z řec. klados = větev) je základní typ stromu, který popisuje příslušnou hypotézu o příbuznosti, aniž by řešil, kdy došlo k štěpení jednotlivých linií a do jaké míry se jednotlivé evoluční linie liší.
• Fylogram podává dodatečné (aditivní) informace ve formě délky větví. Délka větve tak odpovídá množství prodělaných evolučních změn. Rychlost mutací a vzniku evolučních novinek totiž není konstantní . Záleží na prostředí, délce trvání generačního intervalu a jiných faktorech.
• Dendrogram představuje další formu grafického znázornění kdy koncové uzly představující recentní druhy jsou ve stejné rovině (představující současnost), stejně vzdálené od společného předka. Dendrogram ( z řec. dendron = strom) popisuje průběh evolučních změn v čase, z polohy uzlů lze odečíst kdy došlo ke štěpení jednotlivých evolučních linií.
Dendrogramy se pužívají při populačních studiích na vnitrodruhové úrovni
Fylogenetické stromy
Upraveno podle:
http://www.zoologie.frasma.cz/fylogeneze
Spongipellis – příkladová studie
http://mykoweb.prf.jcu.cz/polypores/photos/spongipellis_lits
chaueri1.jpg
V Evropě 4 druhy. Někteří autoři nerozlišují S. litschaueri od S. delectans – ITS a LSU sekvence obou druhů se liší = jsou to odlišné druhy. Vztahy mezi S. litschaueri a S. unicolor ze Severní Ameriky: V USA 2 druhy – západní druh má shodnou ITS sekvenci s S. litschaueri (možná totožný druh). Východní druh = S. unicolor. Oba druhy se liší i velikostí výtrusů.
Fylogram ITS
Spongipellis
LSU fylogram – založený na sekvencích velké podjednotky genu pro ribozomální RNA
S. spumeus – typový druh rodu je evolučně vzdálený od ostatních druhů rodu.
Úskalí molekulární taxonomie
Molekulární metody umožňují zkoumat problematiku i biologům
bez osobní zkušenosti s danou skupinou organizmů:
Práce s herbářovými položkami a jiným archivovaným
biologickým materiálem.
Může dojít k chybné interpretaci výsledků,
pokud chybí detailní znalost problematiky.
Řešení: spolupráce mezi „klasickými“ taxonomy
a molekulárními fylogenetiky.
Motto na konec
..Skutečnost, že sýkora koňadra má v pozici 30 cytochrom C-oxidasy aminokyselinu valin, zatímco sýkora modřinka má ve stejné pozici leucin, může pomocí vhodného technického vybavení zjistit a publikovat i člověk, který se jinak v rybách vůbec nevyzná….
J. Flegr, Evoluční biologie 2005
Děkuji Vám za pozornost
Recommended