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Durchführung und Ergebnisse des Ringversuchs
„Salmonella - Nachweis in Geflügelkot“ 2009
Alexandra Friedrich, Christina Dorn, Christine Sommerfeld, Burkhard Malorny
und Reiner Helmuth
Dr. Alexandra Friedrich et al. 22.06.2010 Fachgespräch Salmonellen-Ringversuche Page 2
Salmonella-Ringversuch 2009: Ziel des Ringversuchs
• Kompetenznachweis der beteiligten Laboratorien
• Nachweis der Labore, dass sie in der Lage sind, mit der Methodik der ISO 6579:2002/Amd1 2007 Annex D Salmonellen aus Geflügelkot zu isolieren und somit an denBekämpfungsprogrammen gemäß VO (EG) Nr. 2160/2003 teilzunehmen.
• Ringversuche werden in VO (EG) Nr. 2160/2003 gefordert
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Gesetzliche Vorgaben zur Durchführung von Ringversuchen
• Anhang H der DIN EN ISO 16140:2003-9Mikrobiologie von Lebens- und Futtermitteln –Arbeitsvorschrift für die Validierung alternativer Verfahren
• DIN-Entwurf NA 057-01-06 N 967 Leitfaden für Laborvergleiche
• ISO/IEC 17043 Conformity assessment – General requirements for proficiencytesting
• Amtliche Sammlung nach § 64 LFBG 00.00-4-20, auf Grundlage von DIN EN 12827 (Sept. 1998), die auf der ISO 6579 basiert
• SOP 064-3 des BfR (Organisierung von Ringversuchen zur Durchführung von Laborvergleichsuntersuchungen/Eignungs-prüfungstests und zur Methodenvalidierung)
• Richtlinien der Bundesärztekammer zur Qualitätssicherung in der Mikrobiologie, Teil A und B (Dt. Ärzteblatt 91, s. 211 - 212 vom 28.1.1994)
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Vorgaben der DIN EN ISO 16140 : 2003, Anhang H
1. Anforderungen an die Matrix (Geflügelkot)
• Salmonella negativ • homogen• stabil nach dem Einfrieren
Untersuchung nach Anhang I mindestens sechs Proben vor Versuchsbeginn und weitere Negativproben während des Versuchs werden untersucht – deren Anzahl wird durch die Versuchsvorschrift bestimmt.
Am NRL-Salm liefen seit Juli/August 2009 die Vorversuche zur Stabilität und zum negativen Salmonella-Status von Geflügelkot aus dem Zentrum für experimentelle Tierhaltung des BfR
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Vorversuche am NRL-Salm
ISO 6579:2002/Amd1 2007 Annex D
Salmonellapositive
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Vorgaben der DIN EN ISO 16140 : 2003, Anhang H
2. Dotierungsmaterial (Tabletten):
• Hersteller der Tabletten: Health Protection Agency in Newcastle
• Referenzstamm: Salmonella Enteritidis NCTC 6676
• Salmonella-Gehalt: - 0 KBE- 15 KBE (8 - 23 KBE)- 529 KBE (500 - 590 KBE)
• Lieferung an das BfR am 05.08.2009 auf Trockeneis
• Lagerung erfolgte bei - 27°C
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Vorgaben der DIN EN ISO 16140 : 2003, Anhang H
3. Rechtzeitig versenden vor Versuchsbeginn
• Arbeitsvorschrift: entsprechend ISO 6579:2002/ A1 2007
• Auswahl der Nährmedien
• Ergebnisprotokoll
4. Transport
• Transport mit TNT
• Der Versand der Pakete für die Ringversuche fand am 15.10.09 statt, die Materialien wurden in einem Paket auf Trockeneis transportiert.
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Vorgaben der DIN EN ISO 16140 : 2003, Anhang H
5. Qualifikationsnachweis
Nachweis der Qualifikation vor dem Versuch feststellen
z.B. Akkreditierungsnachweise
6. Proben in den Ringversuchen
• fünffache Wiederholungen
• drei Konzentrationen (0, 15, 529 KBE) = 15zu untersuchende Proben
• vier testinterne Kontrollen (Proben Nr. 16 bis 19)
Der Ringversuch zum Salmonellennachweis in Geflügelkot fand in der Woche vom 02.11.-13.11.2009 statt.
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Vorgaben der DIN EN ISO 16140 : 2003, Anhang H
7. Teilnehmerzahl
VORGABE: Anzahl der teilnehmenden Labore mindestens 10, möglichst 25
Ringversuch Salmonellennachweis in Geflügelkot:
51 Labore nahmen 2009 teil
8. Statistische Auswertung
• nach Anhang L der DIN ISO 16140:2003
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Durchführung des Ringversuchs 2009
Gefordert: Selektivanreicherung mit MSRV (ISO 6579:2002/Amd1 2007 Annex D)
Optional zusätzlich: zweite Anreicherung (RV, MKTTn)PCR
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Ergebnisse nach 6579:2002/Amd1 2007 Annex D
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Ergebnisse Salmonella-Ringversuch 2009 Geflügelkot (MSRV)Anzahl der richtigen (grün) und falschen (rot) Ergebnisse
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1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51
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Ergebnisse des RV 2009 (MSRV)
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0 bzw. 1 Fehler 2 bzw. 3 Fehler >3 < 6 Fehler
83 %
14 %
4 %
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Vergleich der Ergebnisse aus den Jahren 2008 und 2009
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0 und 1 Fehler 2 und 3 Fehler > 3 Fehler < 7 Fehler
Pro
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der
Lab
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2008
2009
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Salmonella-Ringversuch 2009 GeflügelkotFehlerquoten der Selektivanreicherungen in % je Konzentrationsstufe
Pro
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0 KBE 15 KBE 529 KBE
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Fehlerquoten der Jahre 2008 und 2009 im Vergleich
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0 KBE 15 KBE 529 KBE
20082009
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Ergebnisse Salmonella-Ringversuch 2009 Geflügelkotmit zweiter Anreicherung bzw. PCR
2. Anreicherung: 19 Labore
PCR : 12 Labore
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Vergleich der MSRV und 2. optionale Anreicherung
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0 und 1 Fehler 2 und 3 Fehler > 3 Fehler < 7 Fehler
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2. AnreicherungMSRV
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Salmonella-Ringversuch 2009 GeflügelkotFehlerquoten der Selektivanreicherungen in %
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MSRV 2. Anreicherung
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Ergebnisse des Ringversuchs mit PCR
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0 Fehler 1 Fehler 2 Fehler
Pro
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Lab
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Salmonella-Ringversuch 2009 GeflügelkotStatistische Auswertungen (Frau Sommerfeld)
Sensitivität : = Zahl der positiv bestimmten Proben x 100 in %Zahl der real positiven Proben
Spezifität : = Zahl der negativ bestimmten Proben x 100 in %Zahl der real negativen Proben
Genauigkeit : = Zahl der positiv+negativ bestimmten Proben x 100 in %Gesamtzahl der Proben
Übereinstimmung : = Maßzahl für die Qualität der Arbeit in einem Labor
Konkordanz : = Maßzahl zum Vergleich zwischen Laboren
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Salmonella-Ringversuch 2009 GeflügelkotSensitivität und Spezifität der Isolierungsmethoden in %
Anreicherung Sensitivität„+“
Sensitivität„++“
Spezifität„0“
Genauigkeitgesamt
MSRV, gesamt 94,4 99,6 96,2
MSRV 92,2 96,7
2. Anr., gesamt 83,4 96,5 87,8
2. Anr. 81,0 85,9
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Salmonella-Ringversuch 2009 Geflügelkot (MSRV)Übereinstimmung und Konkordanz in und zwischen den Laboren in %
Übereinstimmung(innerhalb Labor)
Konkordanz(zwischen Laboren)
gesamt 93,3 92,6
blank99,2 99,2
+88,2 85,5
++94,3 93,7
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Schlussfolgerungen
• Die Labore waren in der Lage, mit der vorgegebenen Methodik nach ISO 6579 Salmonellen aus Geflügelkot zu isolieren.
• Durchschnittlich bessere Ergebnisse als 2008.
• Der Ringversuch 2009 zeigt stabile Isolierungsergebnisse, d. h. einen sicheren Umgang der Labore mit der ISO und eine gute Nachweissicherheit.
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Ausblick für 2010
• Ringversuch Nachweis von Salmonellen im Geflügelkot:
Durchführung 20.-24.September 2010 (38. KW)
• Änderung im Vergleich zum Vorjahr:
Konservierung der isolierten Salmonellen
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Wir danken folgenden Kollegen für ihre tatkräftige Mitarbeit:
NRL-Salm : Frau Dr. Christina DornFrau Cornelia Bunge-CroissantFrau Manuela JaberFrau Martha BromFrau Johanna Ledwolorz
Fachgebiet 95: Frau Heidemarie Lochotzke
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Bundesinstitut für Risikobewertung Thielallee 88-92 D-14195 BerlinTel. +49 30-8412-1450 Fax +49 30-8412-2953
alexandra.friedrich@bfr.bund.de www.bfr.bund.de
Danke für Ihre Aufmerksamkeit!
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