Запрограммированная смерть одноклеточных эукариот

Запрограммированная смерть одноклеточных эукариот.

Федор СеверинНИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского, МГУ

severin@mail.genebee.msu.ruhttp://yeastmolbiol.belozersky.msu.ru

почему этой проблемой стоит заниматься?

почему этой проблемой стоит заниматься?

- практический аспект: борьба с одноклеточными патогенами

почему этой проблемой стоит заниматься?

- практический аспект: борьба с одноклеточными патогенами

- моделирование апоптоза у высших организмов

почему этой проблемой стоит заниматься?

- практический аспект: борьба с одноклеточными патогенами

- моделирование апоптоза у высших организмов

- моделирование феноптоза высших организмов (?)

зачем нужна запрограммированная смерть одноклеточных эукариотам?

зачем нужна запрограммированная смерть одноклеточных эукариотам?

- при истощении питания часть клеток умирает, их содержимым питаются остальные.

Durand PM, Rashidi A, Michod RE: How an organism diesaffects the fitness of its neighbors. Am Nat 2011, 177:224-232:Запрограммированная смерть Chlamydomonasreinhardtii полезна для выживших, простой лизис - нет

зачем нужна запрограммированная смерть одноклеточных эукариотам?

- при истощении питания часть клеток умирает, их содержимым питаются остальные.

Durand PM, Rashidi A, Michod RE: How an organism diesaffects the fitness of its neighbors. Am Nat 2011, 177:224-232:Запрограммированная смерть Chlamydomonasreinhardtii полезна для выживших, простой лизис – нет

- важно для паразитов: чтоб не убить хозяина слишком рано

зачем нужна запрограммированная смерть одноклеточных эукариотам?

- при истощении питания часть клеток умирает, их содержимым питаются остальные.

Durand PM, Rashidi A, Michod RE: How an organism diesaffects the fitness of its neighbors. Am Nat 2011, 177:224-232:Запрограммированная смерть Chlamydomonasreinhardtii полезна для выживших, простой лизис – нет

- важно для паразитов: чтоб не убить хозяина слишком рано

- очистка популяции от «слабых» (?)

клетка клетка

Неблагоприятные условия

клетка

Неблагоприятные условияклетка

“Альтруистическая смерть”В окружении других клеток

Оторванная от коллектива

Истощение среды роста

У слизистого гриба Dictyostelium discoideum переход к многоклеточному образу жизни индуцируется голоданием и начинается с агрегации отдельных амеб

Слизевики

цАМФ

Плодовое тело

споры

сытые

голодныесмерть

“Альтруистическая смерть”

1) Истощение среды роста

2) Выяснение кто слабый

3) Слабые жертвуют себя в пользу сильных

Высокая плотность клеток

Как возникла запрограммированная смерть одноклеточных впроцессе эволюции?

«классический» апоптоз:- Сигнал (повреждение ДНК, гормон….)- Увеличение проницаемости внешней мембраны митохондрий- Выход цитохрома с и других факторов из межмембранного пространства- цитохром с связывется с APAF- APAF активирует каспазы

Как возникла запрограммированная смерть одноклеточных впроцессе эволюции?

Taylor-Brown and Hurd, Parasites & Vectors 2013, 6:108

- внутривидовая борьба

- эгоистическая плазмида

-токсин устойчивее ингибитора:смерть при снижении скорости белка, следовательно, смерть «слабых».

Запрограммированная смерть почкующихся дрожжейSaccharomyces cerevisiae

Дрожжи Маркеры апоптоза, обнаруженные у дрожжей

1. Образование АФК (активных форм кислорода)

2. Выход цитохрома с из митохондрий3. Фрагментация ДНК на ранних этапах4. Переход фосфатидилсерина из

внутреннего в наружный монослой цитоплазматической мембраны

5. Чувствительность к ингибиторам синтеза белка

6. Участие в процессе белков, гомологичным апоптотическим белкам животных :

- метакаспаза- AIF

Saccharomyces cerevisiae

Наиболее изученные индукторы запрограммированной смерти дрожжей: перекись водорода, уксусная кислота, осмотический стресс и т.п., а также хронологическое и репликативное старение

5 мкм

хронологическое и репликативное старение:

Хронологическое старение: клетки в жидкой культуре растут до стационарной плотности, живут 2 – 3 недели, потом умирают. - Хронологическое старение - модель старения высших организмов?

Хронологическое старение: клетки в жидкой культуре растут до стационарной плотности, живут 2 – 3 недели, потом умирают. - Хронологическое старение - модель старения высших организмов?- много работ типа: ограничение по калориям, усиление антиоксидантной защиты, мутации по гомологам/ортологам апоптозных генов млекопитающихпродлевали жизнь в этой модели

Хронологическое старение: клетки в жидкой культуре растут до стационарной плотности, живут 2 – 3 недели, потом умирают. - Хронологическое старение - модель старения высших организмов?- много работ типа: ограничение по калориям, усиление антиоксидантной защиты, мутации по гомологам/ортологам апоптозных генов млекопитающихпродлевали жизнь в этой модели

но: - в воде живут годами

Хронологическое старение: клетки в жидкой культуре растут до стационарной плотности, живут 2 – 3 недели, потом умирают. - Хронологическое старение - модель старения высших организмов?- много работ типа: ограничение по калориям, усиление антиоксидантной защиты, мутации по гомологам-ортологам апоптозных генов млекопитающихпродлевали жизнь в этой модели

но: - в воде живут годами-в среде со стабилизированным pH –тоже.

все дело – в отравлении уксусной кислотой!

Дрожжи Маркеры апоптоза, обнаруженные у дрожжей

1. Образование АФК (активных форм кислорода)

2. Выход цитохрома с из митохондрий3. Фрагментация ДНК на ранних этапах4. Переход фосфатидилсерина из

внутреннего в наружный монослой цитоплазматической мембраны

5. Чувствительность к ингибиторам синтеза белка

6. Участие в процессе белков, гомологичным апоптотическим белкам животных :

- метакаспаза- AIF

Saccharomyces cerevisiae

Наиболее изученные индукторы запрограммированной смерти дрожжей: перекись водорода, уксусная кислота, осмотический стресс и т.п., а также хронологическое и репликативное старение

5 мкм

Saccharomyces cerevisiae

α альфа

феромоны

α

Альфа-фактор

α

б Было известно: большие дозы альфа-фактора токсичны для дрожжей.

Вопрос: не связано ли это с индукцией запрограммированной клеточной смерти

АФК Фаза Флоксин Б (мертвые клетки)

Дрожжи а-типа, обработанные высокой (100х) дозой альфа-фактора

-феромон

+феромон

мутант ste20+ феромон

Насколько физиологична 100-кратная доза феромона?

Смесь а- и альфа-клеток: эффект вещества, тормозящегослияние клеточных стенок

без добавок + хлорохин

Окраска флоксином Б

Вывод: при задержке спаривания естественные концентрации феромоновдостигают смертельных значений

Феромоновую смерть можно снизить добавлением антиоксидантов или нокаутом белка Ysp1

Это указывает на то, что феромон – зависимая смерть – не просто пассивный лизис клеток, а активный каскад

Изучение механизма феромон-зависимой смерти:опосредована повышением концетрации кальция в цитозоле.Для повышения эффективности экспериментальной модели вместо Феромона использовали искусственный индуктор повышения концетрации кальция

«пет» - петитная форма дрожжей (без мито-ДНК)«миксо» - миксотиазол, ингибитор дыхательной цепи«ysp1» - нокаут гена, найденного в скрининге «F» - FCCP, протонофор (разобщитель)

Амиодарон, 80 мкМ

Почему FCCP в небольшой концентрации спасает от смерти?

Дыхательная цепь

АТФ-синтаза“протечка”

H+

H+

FCCP

почему снижение сопротивления мембраны может быть полезным?

Гиперполяризация митохондрий вызывает генерацию АФК

Sergey S. Korshunov, Vladimir P. Skulachev, Anatoly A. Starkov FEBS Lett. 1997

Феромон, как и амиодарон, вызывает гипер-поляризацию митохондрий

Дыхательная цепь

АТФ-синтаза“протечка”

H+

H+

FCCPолигомицин

Каков механизм гипер-поляризации, вызванной амиодароном?

Кон

цен

трац

ия

кисл

ород

а

Вывод: амиодарон увеличивает сопротивление мембраны

Оценка уровня гипер-поляризации митохондрий и АФК методом проточной флуорометрии (FACS)

FCCP снижает оба параметра, а нокаут YSP1 – не снижает.Почему нокаут улучшает выживание?

10 мкм

нокаут YSP1 и N-ацетил-цистеин препятствуют фрагментации митохондрий

реконструкция структуры митохондрий путем объединения 20 оптических срезов через клетку

5 мкм

Модель амиодароновой смерти использовали для поиска участников каскада -с помощью скринирования делеционной библиотеки

Найден ген YSP2 – как и YSP1, мембранный белок без очевидных гомологий

почему ингибирование фрагментации митохондрий защищает клеткуот смерти?

почему ингибирование фрагментации митохондрий защищает клеткуот смерти?

набухание матрикса приводит к разрыву наружной мембраны митохондрий

возможно, в нокаутах по YSP1 и YSP2

фрагментируется только внутренняя мембрана митохондрий?

При этом площадь поверхности не изменяется, а максимальный суммарный объем уменьшается

Inactivation of YSP2 protects cells from amiodarone induced death AND increases number of cells with "mosaic" pattern of mitochondria staining

WT

Δysp2

Normal mitochondria network

Mosaic stainingDepolarized mitochondria

(dead cells)

1% 11% 88%

2% 35% 63%

JC-1 staining of amiodarone treated cells

laser laser

Laser hit experiments

ЛАЗЕР??

Wild-type cells

Beforelaser

Afterlaser

5 min 10 min

ysp2-delta cellsA

Электронная микроскопия: митохондрия в ysp2 мутанте

феромон

рецептор амиодарон

∆ste20 подъем [Ca] в цитоплазме

синтез белка

циклогексимид

подъемуровня сопряжения

подъем ∆Ψ

АФК

Ysp1, Ysp2-зависимаяфрагментация митохондрий

падение ∆Ψ, выходцитохрома ц

смерть клетки

низкий FCCPмиксотиазол

NAC, токоферол

∆ysp1, ∆ysp2

мит

охон

дрия

(2)

(1)

(3) (4)

(1а)(5) (6)

(7)

(8)

(9)

(10)

Модель каскада феромон-зависимой смерти

Гиперполяризация митохондрий вызывает генерацию АФК

Sergey S. Korshunov, Vladimir P. Skulachev, Anatoly A. Starkov FEBS Lett. 1997

как снизить мембранный потенциал «мягким» образом?

Б

- использовать протонофор, который будет ингибировать собственное действие при повышении концентрации

C12TPP

SkQ1

Положительно-заряженныепротонофоры (ионы класса SkQ)

Б

Положительно-заряженныепротонофоры (ионы класса SkQ)

- использовать протонофор, который будет ингибировать собственное действие при повышении концентрации

C12TPP

SkQ1

Низкий pH в цитоплазме тормозит дыхательную цепь.Поэтому при закислении средыдобавка FCCP не стимулирует потребление кислорода

В отличии от FCCP, положительно-заряженный протонофор ускоряетдыхание даже при pH=3 в среде

С12TPP – мягкий митохондриально-адресованный протонофор. Перспективное вещество для применения в медицине. Сейчас идутиспытания на мышах

C12-TPP

Стимуляция дыхания

Grande

растут на несбраживаемом источнике углерода

petite

не растут на несбраживаемом источнике углерода

Клетки S. сerevisiae часто мутируют или теряют митохондриальную ДНК

Клетки petite растут медленно, но устойчивы к стрессам.Устойчивость к митохондриальным ядам; активация retrograde response и, как следствие, экспрессия MDR.

Немного на тему митоптоза (не путать с апоптозом)

- является ли переход в petite активным процессом, типа перехода в persister у бактерий?

Переход в persister обратим. Возможен ли переход из petite в Grande?

HaploidGrande

Haploidpetite

survivalin unfavorableconditions

Haploidpetite

HaploidGrande

DiploidGrande

Diploidpetite

meiosis

10-2

10-4

degradation

Очень многие стрессы во много раз увеличивают вероятность перехода в petite. Этот факт – в пользу активной программы

Erythromycin (Er) protects the cells from EtBr-induced petite transformation.

- один из продуктов митохондриальной трансляции разрушает мито-ДНК при стрессе?

случайное наблюдение:

Var1, кодируется геномом митохондрий,белок митохондриальных рибосом

аргинины, лизины

Var1

глутамины, аспарагины

- положительно заряжен и легко агрегирует

Erythromycin (Er) protects the control but not Var1u cells from EtBr-induced petite transformation.

Var1u – клетки, экспрессирующие модифицированный Var1 в ядре.

Erythromycin protects control but not Var1u cells from heat shock-induced petite transformation.

Nuclear expression of Var1 decreases cellular content of DNA-positive structures after heat shock.

DNase affects Var1 content in purified nucleoids. Nucleoids were purified on a discontinuous sucrose gradient with or without DNase addition. Four nucleoid fractions were collected from each sample

Допустим, переход в petite - активная программа.

Зачем избавляться от ДНК? Можно вместо этого, например, заглушить митохондриальную транскрипцию

Клетки переходят в petite при старении

Veatch JR, McMurray MA, Nelson ZW, Gottschling DE.Mitochondrial dysfunction leads to nuclear genome instability via an iron-sulfur cluster defectCell. 2009, 137(7):1247-58.

Переход сопровождается паузой: клетки ищут способы усиления работы митоАТФ-азы и, возможно, других дефектов энергетического обмена.

Допустим, переход в petite - активная программа.

Зачем избавляться от ДНК? Можно вместо этого, например, заглушить митохондриальную транскрипцию

Избавление от ДНК – более радикально (долговременно). Вынуждает оптимизировать некоторые параметры энергетического обмена

Механизм токсичности агрегации белков, вызванной удлиненными полиглутаминами (полиQ). Экспрессия полиQ-CFP в дрожжах.

CFP- синий цвет, иодид пропидия (мертвые клетки) – красный, FITC-VAD-fmk (детекция каспазной активности) – зеленый.

ко-л

окал

изац

ия, %

103Q накапливается в ядре, делеция дрожжевого гомолога каспаз предотвращает это накопление.

Следовательно, 103Q-зависимая смерть – активный процесс. Значит, можно пытаться прервать каскад нокаутом гена.

Отн

ошен

ие р

азм

еров

кол

оний

при

и б

ез и

ндук

ции

103Q

, %

Дикийтип

нокауты гипер-экспрессия

Ase1 – субстрат циклосомы

циклины Cdk1 этапы фаза деления

циклосома (APC-Cdc20 и APC-Cdh1) поли-убиквитинирование циклинов деградация циклинов в протеасоме переход в G0/G1

регуляция клеточного цикла

рабочая модель:

Отн

ошен

ие р

азм

еров

кол

оний

при

и б

ез и

ндук

ции

103Q

, %

Дикийтип

нокауты гипер-экспрессия

контроль 103Q Δclb6 Δclb6,103Q

- накопление субстратов циклосомы (циклины, Ase1) являются лимитирующим в клетках, экспрессирующих 103Q.

контроль 103Q Δclb6 Δclb6,103Q

- накопление субстратов циклосомы (циклины, Ase1) являются лимитирующим в клетках, экспрессирующих 103Q.

а какова ситуация при нейродегенеративных заболеваниях?

репликативное старение: клетки генерируют 20 – 30 дочек,и только потом умирают.

SIR2 – ген семейства сиртуинов• Гомологи SIR2 встречаются у C. elegans, дрозофилы, у

млекопитающих

• SIR2 продлевает репликативную продолжительность жизни дрожжей и тормозит старение высших организмов

Guarante L. (2013) Methods Mol Biol. ; Kaeberlein M et al. (1999) Genes Dev.

♦ - wt▲- sir2Δ

× - sir2Δ SIR2■ - SIR2 SIR2

♦ - wt▲- sir2Δ

× - sir2Δ SIR2■ - SIR2 SIR2

репликативное старение: клетки генерируют 20 – 30 дочек,и только потом умирают. Почему так много?

- возможно, функциональная готовность дрожжей снижается значительнораньше, чем средняя продолжительность жизни (как и у людей)

Заключение

Sorokin et al., 2014