Оценка эффективности трансплантации клеток

Биологический факультет

Московского Государственного Университета имени М.В.Ломоносова

кафедра эмбриологии

Сергеев Сергей Александрович

ОРГАНОТИПИЧЕСКАЯ КУЛЬТУРА СЕТЧАТКИ

ГЛАЗА КАК МОДЕЛЬ IN VTRO

ТРАНСПЛАНТАЦИИ КЛЕТОК

Целью работы являлось создание модели нейросетчатки in vitro

на базе органотипической эксплантационной культуры,

пригодной для исследования распределения и дифференцировки

различных типов клеток после их трансплантации и для оценки

возможности функционального восстановления сетчатки при ее

патологических изменениях.

Были поставлены следующие задачи:

1) Получить долгосрочно-переживающие культуры нейросетчатки глаза

крыс и показать их эквивалентность сетчатке in vivo.

2) Продемонстрировать адекватность полученной модели на примере

исследования реакций эксплантатов сетчатки на трофические факторы (BDNF,

PEDF, эритропоэтин, ангиопоэтин) и препараты (Авастин, Церебролизин).

3) Получить культуры EGFP+ клеток (ММСК, НСПК, ПЭ) мышей линии

С57BL/6-Tg(ACTB-EGFP)/Osb/J и провести их трансплантацию in vitro в

интактные эксплантаты сетчатки с последующей оценкой миграции,

распределения, и дифференцировки трансплантированных клеток на различных

сроках после инъекции.

4) Разработать систему контролируемого лазерного повреждения сетчатки

in vitro и оценить его влияние на поведение трансплантированных НСПК и

ММСК, на основе чего провести оптимизацию способов трансплантации

клеточного материала в поврежденную сетчатку глаза с целью наиболее

эффективной репарации дефектов.

5) Исследовать процессы восстановления поврежденной нейросетчатки на

функциональном уровне с применением НСПК и ММСК, оценить возможность

функциональной интеграции трансплантированных клеток в поврежденную

сетчатку глаза.

Получение эксплантатов сетчатки глаза

Kretc et al., 2007

Окраска гематоксилин-эозин

Поперечные срезы сетчатки. Поддержание

цитоархитектоники ткани in vitro

Нативная сетчатка глаза крысы Органотипическая культура 10 суток

Масштабный отрезок 100 мкм

Поперечные срезы культивируемых эксплантатов

Формирование слоев сетчатки de novo

1-е сутки в культуре (4d in vivo) 10 суток в культуре (14d in vivo)

Окраска гематоксилин-эозин

Морфология края разрастания эксплантата СЭМ

Морфология клеток, выселяющихся из эксплантата

Масштабный отрезок 100 мкм

фибробласты

клетки, сходные с микроглией

олигодендроциты астроцитоподобные клетки

нейроны эндотелий-подобные клетки

Плексусный и ганглионарный уровни

саморганизации нейронов эксплантата сетчатки

– повторение эмбрио- и фило- генеза in vitro

Диффузный плексус Микроганглии из 2-5 нейронов

Масштабный отрезок 25 мкм

BDNF

(нейротрофический

фактор мозга) 100 нг/мл

PEDF

(фактор роста

пигментного

эпителия) 5 нг/мл

Комплекс Авастина (Ig G)

c VEGF (фактор роста эндотелия)

2.5 нг/мл

Трофические факторы, используемые в работе

Ангиопоэтин

50 нг/мл

Эритропоэтин

50 нг/мл

Морфологические изменения края разрастания

эксплантата при добавлении трофических факторов

GFAP

Изменение индекса площади при культивировании эксплантатов в

присутствии 100нг/мл BDNF и различных концентраций

Церебролизина

---Статистически достоверно отличающиеся значения P<0,05

Стимуляция миграции клеток, образования ими нейритоподобных

отростков и ассоциатов под действием факторов роста

Масштабный отрезок А-В,Д-50мкм, Г-10мкм, Е-100 мкм.

BDNF Авастин Церебролизин

Эритропоэтин PEDF PEDF

А-В.-BDNF (β-III-тубулин; GFAP); Г- PEDF; (β-III-тубулин; GFAP);

Д- Церебролизин (GSL-IB4; GFAP); E-Авастин (β-III-тубулин).

Масштабный отрезок А-В-10мкм, Г-100мкм, Д,Е-30мкм.

Анализ маркеров дифференцировки клеток эксплантатов

Изменение соотношения экспрессии GFAP и GP45

при различной концентрации Церебролизина

Масштабный отрезок 50 мкм

А - 10нг/мл ; Б - 50нг/мл ; В - 100нг/мл; Г - контроль

Нейропротекторное действие ангиогенных

факторов в культуре сетчатки

- Статистически достоверно

отличающиеся значения,

p<0,05

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

ангиопоэтин эритропоэтин контроль

22,25%

48,75%

94,25% %

по

гиб

ши

х к

ле

то

к

Схема трансплантации клеток в сетчатку in vivo

Для введения клеточного материала и проведения электроретинографии (ЭРГ) у

животных в возрасте 25-30 дней предварительно было разработано специальное

техническое оборудование, отработана адаптированная к крысам линии

Campbell методика введения наркоза.

Показаны дегенеративные изменения в ONL (уменьшение

толщины на 20%-30% к 28 дню, на 50% к 35 дню и на 80%-90% к

60-му) сетчатки крыс линии Campbell

На основании ЭРГ установлено, что клетки пигментного эпителия

(ПЭ) как при интравитриальной (60 000-100 000 в 2мкл), так и при

ретробульбарной (300 000 в10мкл) трансплантации через 4 и 6 дней

оказывают слабоположительное влияние на функциональное

состояние сетчатки крыс Campbell возраста 25 дней

Трансплантация 100 000 клеток ПЭ позволяет сохранить

функциональную активность сетчатки у крыс до 36 дней

Статистически достоверно увеличивается толщина наружного

ядерного слоя (ONL) у опытных животных 27-го и 43-го дня

При супрахориоидальной трансплантации клеток ПЭ (300 000 в 2мкл;

150 000 в 1мкл) отмечено выраженное стабилизирующее влияние на

процессы дегенерации, развивающиеся в ONL у крыс Campbell и

сохранение высокого уровня функциональной активности сетчатки.

При супрахориоидальной трансплантации НСПК (300 000 в 2мкл; 150

000 в 1мкл) функциональная активность сетчатки животных была в

3 раза ниже, чем при аналогичной трансплантации клеток ПЭ,

несмотря на статистически неразличимые морфологические данные

толщины ONL.

Введение 2 мкл кондицонированной клетками среды имитирует

положительное воздействие клеточной трансплантации

Инъекция клеток in vitro - в эксплантат сетчатки

Ø капилляра 30 мкм

Схема трансплантации клеток в сетчатку in vitro

ММСК НСПК

ПЭ

Динамика выживаемости клеток в течение 6-ти

суток после инъекции in vitro

0

20

40

60

80

100

120

1 2 3 4 5 6

пр

оц

ен

т в

ыж

ив

ши

х к

лето

к

Сутки с момента инъекции

Процентная динамика численности трансплантированных клеток

ММСК

НСПК

ПЭ

P<0,05

ММСК

НСПК

1 сут. 2 сут. 3 сут.

1 сут. 2 сут. 3 сут.

Масштабный отрезок 200 мкм

Миграция трансплантированных клеток

EGFP

Миграция НСПК трансплантированных нейросфер в эксплантате на

7-е сутки и ее отсутствие при поверхностном нанесении клеток

Масштабный отрезок 50мкм EGFP

Поверхностное нанесение ММСК и культура агрегатов сетчатки

контроль НСПК ММСК

Масштабный отрезок 200 мкм

Di-I

EGFP

Hoechst

GFAP

Β-III- тубулин

Поведение трансплантированных in vitro ММСК в первые 4 часа

после инъекции в эксплантат

EGFP

Поведение трансплантированных in vitro НСПК в первые 4 часа

после инъекции в эксплантат

EGFP

Поведение трансплантированных in vitro ПЭ в первые 4 часа после

нанесения на поверхность эксплантата

EGFP

Распределение клеток ПЭ

на 3-и сутки после нанесения суспензии клеток на

поверхность эксплантата сетчатки

Масштабный отрезок 100 мкм EGFP

А Б В

Е Д Г

Изменение морфологии инъецированных клеток

EGFP А-В – ММСК; Г-Е - НСПК

Экспрессия нейрональных и глиальных маркеров

трансплантированными клетками на 14 сутки

после инъекции in vitro

Β-III-тубулин+ НСПК GFAP+ ММСК

Повреждение сетчатки лазером

PI

EGFP+ НСПК 100 мкм

Изменение интенсивности миграции EGFP+ НСПК в течение 14-ти

суток после инъекции

Масштабный отрезок 300мкм. EGFP

А

Г В

Б

А – 24 часа; Б – 3-е суток; В – 7 суток; Г – 14 суток

Миграция EGFP+ НСПК от зоны инъекции к

области травмы

EGFP А- Б – направленный рост отростков к зоне повреждения;

В- заселение зоны повреждения ; Г - контроль

P<0,05

Поведение трансплантированных НСПК при

наличии нескольких зон повреждения

0

5

10

15

20

25

30

35К

о

л

-

в

о

к

л

е

т

о

к

Воздействие лазера

контроль

0

10

20

30

40

50100%

56%

27%

К

о

л

-

в

о

к

л

е

т

о

к

600 мкм 1000 мкм 3000 мкм

Изменение морфологии трансплантированных ММСК

EGFP А-Г – нейроноподобная морфологии; Д-Е - глиеподобная морфология

Атомно-силовая микроскопия – возможность

прижизненного исследования ультраструктуры

поверхности клеток

Общий вид края разрастания эксплантата сетчатки и отдельных

клеток, подвергаемых АСМ исследованию

Образование синапсов трансплантированными in vitro ММСК

Соотношение высот отростков клеток эксплантата сетчатки и

трансплантированных ММСК на 14 сутки сокультивирования

Прижизненное АСМ исследование края разрастания

эксплантата.

А – распределение высот отростков глиальных клеток,

выселяющихся из края разрастания эксплантата

сетчатки.

Б – распределение высот нейритов, образуемых

нейронами сетчатки.

В – распределение высот отростков

трансплантированных ММСК, изменивших свою

морфологию на нейроноподобную.

Г – распределение высот в области синапса,

образованного нейронами эксплантата сетчатки.

Д, Е – распределение высот в области синапса,

образованного трансплантированными ММСК и

нейронами сетчатки.

Сравнение толщины отростков между

трансплантированными ММСК и глиальными

компонентами эксплантата сетчатки

ММСК, изменившие

морфологию

Глиальные

мигрирующие клетки

ММСК vs глия ММСК vs нейроны

3D ACM реконструкция формы трансплантированных

ММСК, изменивших морфологию

P<0,05

Регистрация деполяризации мембраны

трансплантированных ММСК

А – полная деполяризация мембраны 0,1% ММСК; Б – контроль –

деполяризация мембраны нейронов; В – частичная деполяризация;

Г – отсутствие ответа Масштабный отрезок 50мкм

1. Получены эксплантационные культуры сетчатки, которые сохраняют гистотипическую организацию ткани и ее клеточный состав при культивировании in vitro до 2-х месяцев.

2. Эксплантаты сетчатки реагируют на введение трофических факторов (BDNF, PEDF, эритропоэтина, ангиопоэтина) и препаратов (Авастина, Церебролизина) усилением процессов миграции клеток края разрастания, ускорением их дифференцировки, увеличением жизнеспособности нейрональных клеток и самоорганизацией выселившихся нейронов в примитивные нервные сети.

3. При трансплантации in vitro ММСК, НСПК и клеток ПЭ в эксплантаты сетчатки с первых часов до 3-х суток наблюдается активная миграция инъецированных клеток от места их введения.

4. Показано, что определяющим фактором дифференцировки трансплантированных in vitro клеток является их новое микроокружение: ММСК приобретают только нейроноподобную морфологию, в то время как НСПК приобретают иммуноцитохимические маркеры дифференцирующихся нейронов.

5. Разработана методика контролируемого повреждения эксплантатов сетчатки инфракрасным лазерным излучением, показано усиление миграционной активности трансплантированных клеток в направлении нанесенного дефекта, а так же ускорение их дифференцировки по сравнению с сетчаткой без травмы.

6. При трансплантации клеток в эксплантаты сетчатки после нанесения лазерного повреждения показана зависимость интеграции клеток от способа их трансплантации: для НСПК и ММСК оптимальным являлось их введение во внутренний ядерный слой эксплантата сетчатки, а для клеток ПЭ – нанесение на его поверхность.

7. Показано, что для эффективного встраивания клеток в состав сетчатки в месте повреждения, их трансплантация должна быть произведена не позднее, чем через сутки после нанесения повреждения.

8. Показана принципиальная возможность заместительной интеграции трансплантированных НСПК и ММСК в поврежденную область сетчатки глаза, однако в последнем случае лишь 0,1% клеток, претерпевает истинную трансдифференцировку и приобретает способность к функциональной репарации дефектов

Выводы

Работа выполнена при реализации ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на

2009 – 2013 годы

и поддержке индивидуального гранта Carl Zeiss № 2-15