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ASPECTOS BASICOS DEL GENERO Brucella
M.V. MSc. Datty Rosales-Zambrano Octubre 2014
J-40013861-2
• Hipócrates describe en
su tratado Epidemias
algo similar a la
Brucelosis (400 A.C).
• El apóstol San Pablo
se infecto n su naufragio
en la Isla de Malta :
“Aguijón en la carne”
BRUCELOSIS EN EL MUNDO
• Marston, 1859.
• Bruce, 1884. Micrococcus melitensis.
• Dr. Bernard Bang. Bacillus abortus,1895.
• Comisión de Fiebre Mediterránea, 1905.
• B. suis .Traum. 1914.
• B. ovis .1953. Buddles y Boyes.
• B. canis. Carmichael (Nicoletti,2002).
DATTY R-Z.
Brucelosis en Venezuela
• José María Vargas. 1838. Fiebres Malignas.
• Mosquera y Risquez. Fiebre ondulante.1898 y 1903.
• Kubes. 1939. Observaciones sobre la Brucelosis de los animales domésticos en
Venezuela. Brucella abortus. Encontrados Edo. Zulia. Cepa 19 y Reacción de Huddleson. • Gallo y Vogelsang. 1939. Relaciones entre la infección
brucelar de los animales y de la Fiebre Ondulante en el hombre. Campaña contra la Brucelosis.
• Landaeta y Ortiz,1940. Primer caso identificado de Brucelosis
Humana en el País. • 1941. Inicia producción cepa 19
en • Risquez, Vogelsang y Gallo.
1943-1946. Estado actual de la Brucelosis en Venezuela. ALTO
PORCENTAJE DE GANADO BOVINO AGLUTINANTE A
BANG. • Briceño Iragorry. 1949. Breve
nota sobre Brucella suis. • De Lima, Santader,Pons y col.
1956. Consideraciones sobre Brucelosis Bovina y Humana
en el estado Zulia.
M.V.MSc.Datty Rosales-
Zambrano. Vet.Adv.Technologies
C.A.
Brucelosis en Venezuela
• B. abortus es la especie mas importante (Vargas, 2002).
• B. suis bv.1 ha sido descrita en capibara (Hidrochaeris hidorchaeris ) y pecari (Tayassus tajacu).(Lord et
al.,1983 and 1991).
• Recientemente B. suis en vacuno B.taurus x B. indicus (Rosales-Zambrano et al., 2014)
• B. melitensis, no aislada en el país.
Taxonomía y relaciones filogenéticas de
Brucella sp.
• Phylum: Proteobacteria (16S r)
–Clase: Alphaproteobacteria*
• Orden: Rhizobiales
– Familia: Brucellaceae
» Género: Brucella
Ochrobactrum sp
» * Rickettsias, Bartonella (Parásitos IC)
» *Agrobacterium,Rhizobium (Fitopatógenos)
DATTY R-Z.
DATTY R-Z.
DATTY R-Z.
B. papionis nov. sp 2014
B. inopinata nov. sp 2010
Brucelas atípicas
DRZ
DATTY R-Z. Guzman-Berri at al., 2012
Filogenia del Genero Brucella
Corbel,2006
Especies Zoonóticas
• Especies terrestres:
• B. melitensis
• B. abortus
• B. suis
• B. canis
• Especies marinas:
• B. delphini
• B. pinnipedialis
• B. ceti
DATTY R-Z.
Características Microbiológicas del
Genero Brucella
• Cocobacilos, GRAM negativas, inmóviles, no esporulados, aeróbicos y carboxifílicos, en cadenas o pares (Contreras,1992; López y col,1991 y García,1999).
• Intracelular facultativa (Schuring,1999).
• Colonias pequeñas, húmedas y brillantes, pueden se L,R ,o M.
• Requerimientos complejos: CO2, medios ricos, temp. 37 C°, mínimo 5 días incubación.
• Afecta animales y hombre (López y col,1991).
DATTY R-Z.
DATTY R-Z.
Características estructurales y antigénicas de B. abortus.
• Membrana externa rica en: FL, LPS,y proteínas, FDC y
lípidos de ornitina con AG largos (Joklik y col,1994).
• Algo permeable a agentes hidrófobos.
• Similar a las enterobacterias (López y col,1991).
DATTY R-Z.
Tomado de Castro.2005.
Tomado de Castro.2005.
Estructura de la envoltura celular celular de Brucella
DATTY R-Z.
Factores de Virulencia
• Una vez ingerida, o internalizada las bacterias, el sistema de defensa
• insta la fusión del fagosoma con los lisosomas para formar
fagolisosomas, los orgánulos donde se localizan la mayoría de los
agentes tóxicos bactericidas.
• Las Brucellas pueden permanecer en el fagosoma intacto y bloquear
la fusión posterior con el lisosoma. Ello le protege de la acción de los
péptidos catiónicos y enzimas líticas presentes en los gránulos
lisosómicos.
DATTY R-Z.
DATTY R-Z
Factores de Virulencia
• Se cree que la cadena O (un polisacárido) y quizá lípidos de ornitina
interactuarían directamente con la membrana del fagosoma
impidiendo la fusión.
• Se sabe que la superóxido dismutasa y la catalasa, enzimas presentes
en Brucella, se integran en el mecanismo de defensa frente a la
toxicidad oxidativa.
DATTY R-Z.
Ingreso de Brucella al macrófago.
DATTY R-Z
• Las Brucellas no poseen los siguientes factores de virulencia clásicos:
o EXOTOXINAS
o VARIACION ANTIGENICA
o ACTIVIDAD ENDOTOXICA DE LA LPS ES DE MENOR ACTIVIDAD QUE LA DE ENTEROBACTERIAS
o PLASMIDOS O FAGOS QUE PUEDAN TRANSFERIR GENES DE VIRULENCIA
o PILIS O FIMBRIAS PARA ADHERIR SUSTRATOS
DATTY R-Z.
DATTY R-Z.
TECNICAS DIAGNOSTICAS APLICADAS
A BRUCELOSIS ANIMAL.
DATTY R-Z.
TECNICAS DIAGNOSTICAS APLICADAS
A BRUCELOSIS ANIMAL.
• DIAGNOSTICO DIRECTO:
–Aislamiento y cultivo
–Diagnóstico molecular
DATTY R-Z.
Aislamiento en TSA (colonias pequeñas y translúcidas)
Urea: producción de ureasa
TSI: triple azúcar hierro, Neg.
CIT:citrato de Simmons, Neg.
SIM: medio de SIM ( indol y movilidad), Neg. todas
H2S: producción de H2S en tiras de papel filtro con acetato de plomo, Variable
DATTY R-Z.
FASE DE LA CEPA
La fase en la que se encuentran las Colonias se determina por: •Aglutinacion con suero anti-brucela y acriflavina antes de proceder a identificarla
DATTY R-Z.
Pruebas bioquímicas de Brucella
UREA
TSI CIT SIM
H2S
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Producción de H2S
DATTY R-Z.
Prueba de la ureasa
DATTY R-Z.
Tabla diferenciación Brucella (López, 1989)
DATTY R-Z.
Especies
Uso CO2 Prod H2S Catalasa Oxidasa Tionina Fucsina Aglutinación
A M R Ac
B. abortus 1 2 3 4 5 6 7 8 9
+/- +
+/- +/-
- - - +
+/-
+ + + + -
+/- +/-
- +
+ + + + + + + + +
+ + + + + + + + +
- - + - + + + + +
+ - + + + + + + +
+ + + - - + + - -
- - - + + - + + +
- - - - - - - - -
- - - - - - - - -
B. suis 1 2 3 4
- - - -
+
+/- - -
+ + + +
+ + + +
+ + + +
- - - -
+ + + +
- - - +
- - - -
- - - -
B. melitensis
1 2 3
- - -
- - -
+ + +
+ + +
+ + +
+ + +
- + +
+ - +
- - -
- - -
B. ovis + + + + + + - - + +
B.canis - - + + + - - - + +
B. neotomae
- - + + - - - - - -
DATTY R-Z. Audic et al.,2011
TABLA DE FAGOTIPIFICACION EN Brucella
DATTY R-Z. Corbel, 1989
Bacteriofagos de Brucella
Placas líticas
Cultivo de Brucella sembrada con hisopo
DATTY R-Z.
Crecimiento en tionina 1:50,000
DATTY R-Z.
Crecimiento en fucsina 1:50,000
DATTY R-Z.
• http://www.dnalc.org/view/15924-Making-
many-copies-of-DNA.html
TECNICAS MOLECULARES EN DX.BRUCELOSIS
Kary Mullis. Cetus Co. Calfornia. USA.1986.
USOS
• Taxonomía
– Aislados presuntivos
– Variabilidad fisiológica (Cambios)
– Hospederos
• Identificación y Diagnostico
Confirmatorio
– Alimentos
– Muestras clínicas
– Confirmación definitiva
DATTY R-Z.
OMIC`S
DATTY R-Z.
Genómica Transcriptómica Proteómica
Hospedador
Especifico
Filogenia
y
Evolución
Virulencia y
Patogenicidad
• Octubre 2011: 39 genomas de Brucella
• Mayo 2014: 431 genomas de Brucella (Completos o en emsamblaje)
• B. melitensis 16M (2002)
• B.suis 1330 (2002)
• B. abortus (2005)
• B. ovis y microti (2009)
• B. pinnepedialis (2011)
DATTY R-Z.
DATTY R-Z. Audic et al.,2011
TECNICAS MOLECULARES EN DX.BRUCELOSIS
DATTY R-Z.
• Alta sensibilidad, especificidad, rápido y económico.
• Secuencias usadas:
– IS711 (Bricker y Halling,1994)
– 16sRNA (Romero y col,1995)
– OMP31(Baily y col,1992; Streevatsan y col,2000).
– BCSP-31 (Guarino y col,2000)
• Se pueden usar muestras clínicas: sangre completa,suero, leche, semen, tejidos.
Electroforesis en agarosa al 15.% de amplificados para BCSP-31 obtenidos a partir de sangre completa de búfalos
seropositivos a Brucella sp.
PM C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9
TECNICAS MOLECULARES EN DX.BRUCELOSIS
DATTY R-Z.
• Técnicas para caracterización de cepas y biovares:
– AMOS-PCR (Bricker y Halling,1994).
– Multiplex (García-Yoldi y col,2006)
– RFLP-PCR con IS711 (Halling y col,1993)
– Genotipificación: SNP’s (Scott y col,2008), MLVA, MLST.
Ancora et al.,2005
PCR-Multiplex o Brucella ladder.
DATTY R-Z.
1. Brucelas marinas 2. B. melitensis 3. B. melitensis Rev1 4. B. ovis 5. B. abortus
6. B. abortus RB51 7. B. abortus S19 8. B. suis 9. B. canis 10. B. neotomae Garcia-Yoldi et al, 2006
272bp
→
587bp→
1682bp→
1071bp
→ 794bp→
152bp→
1. Marcador de talla
molecula 1 kb plus de
invitrogen
2. Cepa Venezuela
3. B. suis 1330
4. B. abortus 2308 450bp→
1 2 3 4
