Construyendo la excelencia

Programa Ingeniería AgronómicaExtensión Facatativá

Docente: Jennifer Gutiérrez

Estudiantes :Lina Martinez

Biología molecular Quinto semestre

Universidad De Cundinamarca Facatativá 2015

LA CLONACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DEL GEN CAPAO DE PIMIENTA PARA RESPUESTA DE DEFENSA DE LA

HOJA EN SENESCENCIA INDUCIDA POR SAL.

Recibido: 22 de abril 2015Aceptado: 06 de octubre 2015Publicado: 24 de octubre 2015

PUBLICADO POR: Huai-Juan Xiao, Ke-Ke Liu, Da-Wei

Li, Mohamed Hamed Arisha, Wei-Guo Chai and Zhen-Hui Gong

PAGINA: BMC Biotecnología 2015, 15: 100 doi: 10.1186 /

s12896-015-0213-1

LINK: http://www.biomedcentral.com/1472-6750/15/100

ABREVIATURAS

ABA: ácido abscísicopb: par de bases (s)DRE: elementos sensibles Dehydration-EST: Expresado secuencia de etiquetaFCC: clorofila fluorescente catabolitoMDA: malondialdehídoMeJA: metil jasmonatoMW: Peso MolecularNaCl: cloruro de sodioORF: marco abierto de lecturaPAO: feofórbido una oxigenasaPi: punto isoeléctricoQRT-PCR: PCR cuantitativa en tiempo realCARRERA: La rápida amplificación de cDNA extremosSA: El ácido salicílicoTRV: virus del cascabel del tabacoUTR: región sin traducirVIGS: inducida por Virus-silenciamiento génicoWT: Tipo Wild-

RESUMEN

Feofórbido una oxigenasa (PAO) es una enzima importante en el catabolismo de la clorofila y está involucrado en la senescencia foliar. Estudios previos han demostrado la función de PAO durante la muerte celular. Se utilizaron técnicas de clonación y RACE basados en homología para obtener el ADNc de longitud completa del gen Capao. La expresión del gen se determinó mediante PCR cuantitativa en tiempo real. La función del gen CAPAO se estudio mediante silenciamiento génico inducido por virus y las técnicas transgénicas con plantas de tabaco (Nicotiana tabacum). Un gen CAPAO se aisló de pimiento (Capsicum annuum L.). El ADNc de longitud completa CAPAO se compone de 1.838 pb, que contiene un marco de lectura abierto de 1614 pb, y codifica una proteína de 537 amino ácidos CAPAO expresión, según lo determinado por PCR cuantitativa en tiempo real, fue mayor en las hojas de las raíces, tallos y flores.La expresión de gen CAPAO fue inducida en la senescencia natural y diversas tensiones. El gen Capao puede estar relacionado con las respuestas de defensa a diversas tensiones y jugar un papel importante en la hoja en senescencia por sal senescencia.

INTRODUCCIÓN Hoja senescencia es la etapa final del desarrollo de las hojas, en última

instancia conduce a la muerte de la hoja entera. Aunque también puede ser estimulada por diversos factores ambientales, incluyendo hormonas vegetales, la sequía, la salinidad, la temperatura extrema, la oscuridad, las heridas y las infecciones patógenas.

La senescencia de las hojas con el tiempo puede afectar el rendimiento de las plantas en condiciones ambientales adversas. Por lo tanto, el estudio de la senescencia foliar no sólo fortalecerá la comprensión de un proceso biológico básico, también puede proporcionar métodos para retrasar el envejecimiento planta con el fin de mejorar las características agrícolas de cultivos de hortalizas.

Pimiento (Capsicum annuum L.) es un cultivo vegetal importante que es extensa cultivada en todo el mundo. En los últimos años, la senescencia prematura de plantas de pimiento causadas por diversas tensiones ambientales se ha convertido en un fenómeno universal y se considera un importante campo de investigación.

Este estudio se realizó para clonar este gen (CAPAO) de la planta de pimienta y analizar sus características moleculares.

METODOLOGÍA

Los patrones de expresión de genes CAPAO en tejidos

específicos y en respuesta a diversas tensiones se analizaron por PCR cuantitativa en tiempo

real.

El silenciamiento génico inducido por virus (VIGS) y las tecnologías

transgénicas se utilizaron para estudiar la función de genes

Capao.

La pérdida del color verde, inducida por la degradación de la clorofila, es el síntoma más

visible de la senescencia foliar.

El tabaco (Nicotiana tabacum) es una de las plantas modelo más importantes para la investigación transgénica. En estudios anteriores, muchos nuevos genes de otras plantas se han transferido en tabaco para futuras investigaciones en sus funciones .

Feofórbido una oxigenasa (PAO) se ha considerado como una enzima crucial en la degradación de la clorofila. El gen PAO se obtuvo inicialmente a partir de maíz (designado ZmLls1) y luego demostraron que la expresión de PAO es inducida por senescencia natural y las tensiones ambientales en las plantas.

Los resultados sugieren que Capao puede desempeñar un papel

importante durante la senescencia foliar y la degradación de la clorofila.

RESULTADOS

Clonación y Análisis de la secuencia de CapaoEl ADNc de longitud completa designado Capao se obtuvo utilizando las técnicas de clonación in silico y RACE. La transcripción consiste en 1838 nucleótidos, que incluye una región 5 'no traducida (UTR) de 32 pb, un ORF de 1614 pb y un 3'-UTR de 192 pb. CAPAO se predijo para codificar una proteína de 537 amino ácidos con un peso molecular teórico (PM) de 60,8 kDa y un punto isoeléctrico calculado (pI) de 6,89. El análisis estructural reveló que CAPAO pertenece a una superfamilia de hierro-azufre.

Un árbol filogenético, construido usando software MEGA5.05, se utilizó para investigar la relación evolutiva de la secuencia de aminoácidos con las proteínas CAPAO PAO de otras plantas. Se formaron dos grupos utilizando los 14 PAO secuencias de proteínas de C. annuum L., N. tabacum, S. lycopersicum, R. communis, V. vinifera, B. napus, A. thaliana, Medicago truncatula, Aegilops tauschi, Pisum sativum y Brassica rapa var. parachinensis . Capao agrupado en el primer grupo, que incluía SlLLS1, NtPAO, BoPAO, BrPAO y AtPAO. Capao estaba más estrechamente relacionado con SlLLS1, NtPAO que las proteínas PAO de otras plantas.

Expresión específica de tejido de Capao

Con el fin de investigar los niveles de expresión del gen Capao en diferentes tejidos, el ARN total fue extraído de las raíces, tallos, hojas y flores, y en tiempo real PCR cuantitativa (QRT-PCR) se realizó. Se detectaron las transcripciones CAPAO en todos estos tejidos y se encontró que es mayor en las hojas que en otros tejidos. Para diferentes etapas de desarrollo de las hojas, se detectó un bajo nivel de Capao en las hojas jóvenes y totalmente maduros, pero la expresión Capao se incrementó en hojas senescentes.

La inducción de moléculas de señalización, estreses abióticos y bióticos

Con el fin de estudiar su función en las plantas de pimiento, se analizó primero el patrón de expresión de Capao. Cultivar las plantas de semillero B12 en la etapa de seis hojas se trataron con diversas tensiones, incluyendo fitohormonas, sal, osmosis y Phytophthora (infección) y se analizaron mediante RT-PCR.

Las plantas de pimiento fueron expuestas a 400 mM de cloruro de sodio (NaCl) y manitol 400 mM, y

luego la abundancia de las transcripciones CAPAO se analizó

por RT-PCR cuantitativa.

El nivel de expresión CAPAO en las plantas tratadas con NaCl 400 mM

comenzó a aumentar gradualmente en 4 h y alcanzó su punto máximo

(11,9 veces) a las 24 h, en comparación con el control (0 h

Con el tratamiento osmótico, CAPAO se indujo rápidamente en plantas de

pimiento, con un aumento de 3,4 veces en la expresión en 2 h y una elevación

10,7 veces más fuerte en 12 h.

La transcripción nivel más alto se detectó a las 24 h (18,7 veces).

Estos resultados indican que el aumento de la abundancia del transcrito del gen CAPAO puede ser parte de la respuesta al estrés abiótico,

incluyendo alta salinidad y estrés osmótico.

Ensayo de VIGS de Capao de genes en plantas de pimientoSilenciando eficiencia del gen Capao

Los resultados mostraron que CAPAO participa en la vía de degradación de la clorofila y está implicado en la respuesta a varios tipos de estrés en plantas de pimiento. Para examinar más a fondo la función de Capao de pimienta, se utilizo un virus sonajero tabaco (TRV) basado VIGS. Las plantas de pimiento inoculadas con Agrobacterium durante 6-7 semanas se utilizaron para los siguientes tratamientos.

Un vector vacío se aplicó a plantas (TRV2: 00) como control negativo.

TRV2: plantas CaPDS, fue silenciada en el gen de la fitoeno desaturasa

endógena (PDS) para causar photobleaching, se utilizaron como controles positivos para probar la

eficiencia VIGS.

Tres semanas después de la inoculación de Agrobacterium, se encontró que la

mayoría de las plantas mostraron claramente síntomas de la infección viral.

Estos resultados indicaron que VIGS se aplicó con éxito en este experimento. Como se muestra

en la Fig. 5a, no se observó diferencia morfológica entre las

plantas silenciadas-Capao (TRV2: Capao) y las plantas de control

tratadas vector vacío (TRV2: 00) 45 d después de la inoculación

Al mismo tiempo, los niveles de transcripción Capao en plantas vacías de control de vectores (TRV2: 00) y plantas silenciadas-Capao (TRV2: Capao) fueron

examinados por RT-PCR cuantitativa para detectar la eficacia de Capao silenciamiento génico por VIGS.

Los resultados mostraron que el nivel transcripcional CAPAO se redujo

notablemente en las plantas silenciadas-CAPAO comparación con

el control del vector vacío, lo que demostró que el silenciamiento

génico fue exitosa.

El fenotipo de las plantas transgénicas de tabaco después del tratamiento estrés salino

Antes del tratamiento de estrés salino, no hubo diferencias fenotípicas entre CAPAO plantas transgénicas y WT. En la etapa temprana del tratamiento de estrés sal (solución de NaCl 150 mM), ambas hojas de plantas transgénicas y WT marchitas con el grado de marchitamiento más grave en las plantas WT.

Junto con el momento del tratamiento, la parte inferior de las hojas se volvió

amarilla.

Después del tratamiento de sal para 7 d, las hojas de las plantas transgénicas se volvió amarilla y el borde de las hojas

inferiores mostraron síntomas necróticos después del tratamiento estrés salino,

mientras que las hojas jóvenes superiores eran verdes.

Sin embargo, las hojas de las plantas WT parecían encogerse, las hojas más bajas quedaban de color amarillo, y

las hojas superiores de color verde.

CONCLUSIONES

•En general, se concluye que CAPAO juega un papel importante en la senescencia y la degradación de la clorofila, así como las respuestas de defensa a diversas tensiones.

•Capao fue inducida en la senescencia natural y diversas tensiones.

•Silencio de Capao dio lugar a un fenotipo de estancia verde en plantas de pimiento, y la sobreexpresión de Capao aceleró el proceso de la hoja inducida por sal senescencia.

•En el futuro, las plantas transgénicas sobre la sobreexpresión o desmontables de genes Capao en pimiento se utilizarían para el estudio de la función de detalle de Capao.