Forough L. Nowrouzian Nahid KaramiChristina Welinder-OlssonChristina Åhrén

SARA PUERTA CALDERÓN

NICOLÁS RINCÓN

III SEMESTER

VIRULENCE GENE TYPING OF METHICILLIN-RESISTANT STAPHYLOCOCCUS AUREUS AS A COMPLEMENT IN EPIDEMIOLOGICAL TYPINGJournal of Microbiological Methods

INTRODUCTION

GENERALITIES

• Staphylé: “grape”, Coccus: “granule”

• Gram positive bacteria.

• Diameter of about 0.5-1 um

• Includes at least 40 species, 24 subspecies.

Staphylococcus

INTRODUCTION

GENERALITIES

• Facultative anaerobes.

• Grown in conditions with high concentrations of NaCl (10%)

• Temperature 18-40 ° C.

Staphylococcus

INTRODUCTION

GENERALITIES

• Pathogens in humans.

• The non-sporulating bacteria more resistant to heat, desiccation and salinity.

Staphylococcus

INTRODUCTION

GENERALITIES

• Facultative anaerobes bacteria.

• Gram positive bacteria.

• Production of coagulase, catalase.

• Stationary and not sporulated.

Staphylococcus aureus

INTRODUCTION

GENERALITIES

• Widely distributed in the environment.

• Part of the flora of many sites of the body.

• Well grows on agar at 37 ° C.

• One of the most resistant microorganisms known.

Staphylococcus aureus

INTRODUCTION

Scalded skin

syndrome

Food poisoning

Toxic Shock Syndrome

Skin infections

Bacteremia Endocarditis Pneumonia Osteomyeli

tis

Diseases for presence of S. aureus.

INTRODUCTION

The factors that influence virulence are:

• The ability toxigenic pathogen.

• The invasiveness of the pathogen.

VIRULENCEThe ability of a

pathogen to cause infection.

INTRODUCTION

Coagulasa. Hemolysin. Leucocidin. Hyaluronidase.

Staphylokinase.

Lipases. Enterotoxins. Exfoliative toxin. Protein A.

Penicillinase or b-

lactamase.

Catalase. Pyrogenic exotoxin.

Toxic Shock Toxin (TSST-

1).

VIRULENCE S. aureus

INTRODUCTION

METHICILLIN

It prevents the formation of crosslinks between the

polymer chains linear peptidoglycan

It is the major component of the cell wall of gram positive bacteria

It inhibits the synthesis of the

bacterial cell wall.

INTRODUCTION

METHICILLINIt acts by

Union Competitive inhibition

Trasnpeptidasa the enzyme (protein binding to penicillin PUP)

used by the battery

To generate crosslinks (D-alanyl-alanine) used in the synthesis of peptidoglycan

INTRODUCTION

Staphylococcus

Pathogens in humans.

Staphylococcus aureus

Gram positive bacteria

Virulence factors

Diseases Resistance

Methicillin

GENERAL OBJETIVE

OBJETIVE

• Evaluate and describe the utility of virulence gene determination as a complementary tool for epidemiological typing of MRSA in relation to spa typing and pulsed-field gel electrophoresis (PFGE).

MATERIALES Y MÉTODOS

AISLAMIENTOS

• Almacenados los MRSA con genotipo PFGE desde 1983 en Suecia.

• Determinación de patrones visuales (TENOVER – BioNumerics 6.6)

MATERIALES Y MÉTODOS

• Registro de datos para cada aislamiento.

• Descripción de los aislamientos.

• Fueron escogidos 63 aislamientos entre 1994-201, que representaban los MRSA más frecuentes de área.

MATERIALES Y MÉTODOS

PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)

• Técnica desarrollada por Kary Mullis en los 80’s.

• Su objetivo es la amplificación directa de un gen o un fragmento de DNA o indirecta de un RNA.

• Aumenta el número de copias de una secuencia de ADN.

MATERIALES Y MÉTODOS

FUNDAMENTOS

• Emplear ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación.

• Dejar que las hebras de ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas nuevamente.

MATERIALES Y MÉTODOS

METODOLOGÍA

• Desnaturalización del DNA para dar hebras sencillas

• Hibridación especifica de la hebra sencilla con un oligonucleótido

• Replicación de la hebra sencilla por una DNA polimerasa a partir de oligonucleótidos anterior como cebador.

MATERIALES Y MÉTODOS

ALGUNOS REACTIVOS

• Buffer

• DNA polimerasa

• MgCl2

RESULTADOS

Comparación entre las cepas para el propósitos epidemiológicos

Se identificaron 30 genes relacionados con la virulencia

9 genes de adhesinas 21 genes tóxicos

Relación de los factores de virulencia con los genes

RESULTADOS

Carecieron de los genes lukm, seh, etb, sed, selr, eta, sea, selp, seb y etv.

Presentaron los genes Ipb, cIfA, cifB y fnbB

Todos las S. Aureus aislados

RESULTADOS

RESULTADOS

• Todos los 7 aislados revelaron un perfil VF idéntico

ST8 (VF A) recogido en 7

años• Todos los 10 aislados

revelaron un perfil VF idéntico

ST80 ( VF B) recogido en 13

años

RESULTADOS

• 17 de los 22 aislados presentaron un perfil VF idéntico

ST30 (VF C) recogido en 16

años• 14 de los 20 aislados

presentaron un perfil VF idéntico

ST45 (VF D) recogido en 8

años

RESULTADOS

La elección del método de tipificación molecular depende del propósito de la investigación

Los resultados demuestran claramente que ninguno de los métodos de genotipificación pueden identificar por si solos la tipificación epidemiológica

DISCUSSION

Investigator´s Principal statement Agree or disagree

Carpaij et al Between different strains of STs the VF profiles were completely different

Agree

Fossum Moen et al

It is likely that strains belonging to the same ST demonstrate similar VF

Agree

Peacock et al It is unlikely that strains belonging to the same ST demonstrate similar VF

Disagree

Cooper and Feil MLST (Multilocus Sequence Typing) does not have the power to completely study local epidemic spread by S. aureus

Agree

CONCLUSIONS

The deep understanding and determination about the virulence factors profile of the MRSA, can have a great utility for epidemiologic typing

The identification of the specific genes related with the virulence factors of the MRSA can help to develop new ways of genetic treatment for patients infected with this bacteria

CONCLUSIONS

When conducting research must keep of the comparison of strains with epidemiological and clinical purposes, to maintei infection control.

With each research project must respect the established protocols and make a proper selction of molecular quantification methods for good typing