Genetika razvoja

Svake 3,5 min u svijetu se rodi beba sa kongenitalnom malformacijom

Svake godine oko 150.000 beba sa ozbiljnim poremećajima

Učestalost 1 beba na 20 rođenih – u vašoj polulaciji bit će barem 1 beba sa malformacijama

Nekoliko tisuća različitih kongenitalnih malformacija – nekima znamo uzrok, nekima ne

Kongenitalna malformacija je abnormalnost strukture tijela, funkcije ili metabolizma koja je dovoljno ozbiljna da zahtjeva brigu liječnika

Uzroci kongenitalnih malformacija

Možete li reći koja od ovih žena je trudna?

Većina žena sazna za trudnoću tek mjesec dana nakon začeća

Upravo u tom periodu događaju se kritične promjene u razvoju bebe

“Niti rođenje, niti udaja / ženidba, niti smrt nisu najvažniji trenuci u životu. Najvažniji trenutak života je gastrulacija”.

Lewis Wolpert (1996)

Gastrulacija – kritično razdoblje u razvitku – djelovanje teratogenih faktora – poznati teratogeni – alkohol, zračenje, lijekovi, virusi itd

Sve ili ništa Više ili manje

Sve stanice odraslog organizma – potekle od jedne – ista DNA

Za vrijeme razvoja stanice se usmjeravaju pod utjecajem faktora rasta, hormona i ostalih signalnih molekula koje modificiraju kromatin i ekspresiju pojedinih gena.

Sposobnost genoma da odgovori na razvojne signale ključan za diferencijaciju stanica

Pluripotentne stanice – da bi dale diferencirane stanice tkiva – pakiranje genoma u područja koja su dostupna transkripcijskim faktorima ili nisu

Heterokromatin i eukromatin

Različit način pakiranja kromatina

Što je različito u kromatinu koji je aktivan (otvoren), od onog koji nije (zatvoren)?

‘Epi’genetika - ‘na’ ili ‘preko’ genetske informacije kodirane u DNA

U različitim stanicama na istu DNA dolazi drugačija informacija o modeliranju kromatina

1. Metilacija DNA

Epigenetske modifikacije

Najčešće zahvaća citozin Ciljno mjesto metilacije: CpG sekvence

Dodavanje metilne skupine na peti C atom

citozina

Biološka uloga 5mC:

ekspresija gena

prijenos obrasca ekspresije gena na stanice kćeri

Nova baza5- metilcitozin (5mC)

Metilacija DNA i ekspresija gena

Nemetilirane CpG sekvence = aktivni geni

Metilacija sprječava vezivanje transkripcijskih faktora – nema ekspresije

promotor kontrolna regija

aktivni kromatin – acetilirani histoni srži nukleosoma

Acetilacija odstranjuje pozitivan naboj i smanjuje afinitet između histona i DNA

Metilacija DNA i ekspresija gena

Metilirani CpG privlače histonske deacetilaze

Povećana mobilnost nukleosoma duž DNA

Pristup transkripcijskoj mašineriji

Metilirani CpG privlače histonske deacetilaze

Metilacija CpG sekvenci + modifikacija histona = inaktivan kromatin

Utišavanje gena – mehanizam

metilirani CpG privlače MeCP2 koji aktivira histonske deacetilaze (HDAC) – deacetilacija histona.

MeCP2 aktivira i histonske metiltransferaze ( SUVh39) koje metiliraju H3-histone na K9 što privlači heterokromatinski protein HP1 koji stabilizira inaktivno stanje heterokromatina.

DNA metiltransferaza

Nemetilirani citozin

Replikacija DNA

Prijenos metilacijskog obrasca ekspresije gena na stanice kćeri

DNA metiltransferaza (Dnmt)

metilira CpG sekvence

Metilacija Metilacija

Ne prepoznaje ga Dnmt

Hemimetilirana DNA

Obrazac metilacije DNA je nasljedan – svi potomci ove stanice imat će isti metilacijski obrazac

Jedan te isti genom može dati više epigenoma

Svaka stanica prenosi svoj epigenom na stanice kćeri

Jednojajčani blizanci naslijede isti set gena, u odrasloj dobi različiti

epigenetske modifikacije – pod utjecajem vanjskih faktora: prehrana, fizička aktivnost, pušenje, način života

Stariji jednojajčani blizanci – značajne razlike u ukupnoj količini i distribuciji 5mC Različite predispozicije bolestima (pokazano na 30 parova blizanaca)Fraga et al. (2005) PNAS July 26, vol. 102 no. 30, 10604–10609

Jednojajčani blizanci – identičan genotip, epigenetski se ne razlikuju u ranom djetinjstvu

Iste epigenetske promjene nastale zbog utjecaja vanjskih faktora djeluju istovremeno na tri generacije

Tri generacije odjednom izložene istim uvjetima okoliša (prehrana, otrovi, hormoni)

Rani razvoj: nakon oplodnje epigenetsko reprogamiranje genoma svake buduće vrste stanica

Nakon oplodnje do blastociste –globalna demetilacija

Sposobnost epigenetskih faktora da odgovore na razvojne signale je istovremeno i temelj njihove osjetljivosti na vanjske faktore

Npr. epigenom se može promijeniti zbog različite prehrane (folna kis, B12), etanola

Nakon blastociste – gastrualcija –globalna de novo metilacija

Mnoge hranjive tvari– donori metilnih skupina – mogu promijeniti epigenom zametka koji se razvija: prehrana majke sa prevelikom ili premalom količinom donora metila može promijeniti ekspresiju gena

Važno u ranom razvoju kad se uspostavlja epigenom buduće jedinke

Što je folat?

• Vodotopivi vitamin B-kompleksa:• Folat

– dolazi prirodno u hrani (apsorbira se 50%)• Folna kiselina

– u obliku vitaminskog suplementa (apsorbira se 100%)

S-adenosyl-methionine

5-methyl-tetrahydro-folate

S-adenosyl-methionine

Zašto je folat važan?

Sudjeluje u biokemijskom putu SAM –donoru metilnih skupina – metilaciji DNA

Miševi i ljudi imaju gen agouti

ljudi: pretilost, proizvodnja inzulina

miš: agouti gen nemetiliran – miš sa žutim krznom, pretio, sklon razvoju dijabetesa i rakaagouti gen metiliran (kao što je u normalnom mišu) krzno smeđe,mršav, vrlo nizak rizik od razvitka bolesti

Primjer:

Pretio žuti miš i mršavi smeđi miš genetički identični

Što može napraviti nedostatak folata u prehrani?

Dva miša istog genotipa iste starosti – majka smeđeg miša dobivala folat u trudnoći, majka žutog ne

Žutu trudnu mišicu hranimo s dodatkom folata – potomstvo smeđe, zdravo

Neuralni žlijeb

Mezoderm uz neuralnu cijev zadeblja i dijeli se u somite – prekursori mišića i kostura

Neuralna cijev zatvorena Čovjek: Neuralna cijev se zatvori do 28. dana trudnoće

Zatvaranje neuralne cijevi kritično – ako se ne zatvori do kraja – spina bifida

Folat – donor metila može sprječiti do 70% slučajeva spine bifide (uč. 1/1000) – uzimanje folata mjesec dana prije začeća i u prvom trimestru trudnoće

• Daily multivitamin use− 400µg folic acid

alkohol inhibira apsorpciju folata

Metabolizam folata poremećen djelovanjem:

pušenje – smanjuje iskorištavanje folata

Ne zaboravimo da postoji i otac!

Pred 40 god. Gladys Friedler: ženke štakora prije trudnoće izložila djelovanju morfija.

Potomci mali, nisu nikad izlagani morfiju - njihovi potomci isto mali

Izložila djelovanju morfija mužjake prije parenja – također utjecaj na potomke

Rezultati odbačeni – kako otac može prenijeti na potomke nešto što nije mutacija?

Otkrivena epigenetika – objašnjeno

Anne Ferguson-Smith: chromosomes remember whether they came from the mother or Anne Ferguson-Smith: chromosomes remember whether they came from the mother or from the father

2006. Muški miševi izloženi kokainu (inhalacija) kroz dulje vrijeme, pareni sa zdravim ženkama: potomci nisu mogli zapamtiti gdje je hrana u kavezu (naročito ženski potomci)

Nikakva oštećenja DNA nisu pronađena u spermijima mužjaka

Pamćenje – neuroni –eksprimiraju specifične proteine potrebne za normalnu funkciju

stanice koje nisu neuroni eksprimiraju NRSE (neuron-restrictive silencer element) koji zajedno sa histonskim deacetilazama suprimira gene karakteristične za neuron

Vanjski signali – okoliš može promijeniti epigenetske markere i neuron ne funkcionira kao neuron

Droge (npr. kokain) uzrokuje dugotrajnu adaptaciju stanica mozga temeljenu na promjeni u ekspresiji gena

BDNF (Brain-derived neurotrophic factor) – faktor rasta aktivan u hipokampusu, korteksu – dijelovi hipokampusu, korteksu – dijelovi mozga ključni za učenje, pamćenje, naročito dugotrajno pamćenje

CREB (cAMP response element-binding) transkripcijski faktor koji se veže na sekvence DNA nazvane CRE (cAMP response elements) regulirajući ekspresiju nizvodnih gena. Geni regulirani CREBom su BDNF i mnogi neuropeptidi

Ne podcjenjujmo epigenetski obrazac majke koji se prenosi na djecu i određuje njihovo ponašanje!

Majke miševa koje su brižne i paze na svoje potomke predale su svoj metilacijski obrazac CNS-u svojih potomaka. Taj se obrazac zadržava do odrasle dobi i prenosi na slijedeću generaciju.

Kad smo kod CNS-a:

Zadržavanje metilacijskog obrasca u odrasloj dobi potvrđuje hipotezu da se obrazac prenosi na stanice potomke

Objašnjava nasljeđivanje “instinkta” - načina ponašanja

Razdoblje prije gastrulacije – pravilo sve ili ništa

Sve ili ništa Više ili manje

Epigenetske modifikacije gena u dva kritična perioda: razvoju gameta preimplantacijskom rastu

Za vrijeme gametogeneze uspostavljaju se specifični metilacijski obrasci u gametama oba spola

Potpomognuta oplodnja – uključuje manipulaciju gametama i preimplantacijskim embrijima

Intrauterini zaostatak u rastuPrerani porodSmanjena porođajna težinaAngelman i Beckwith-Wiedemann sindrom ( 6x veća incidencija nego prirodnim putem)

Children Born After Assisted Reproduction at Greater Risk of Congenital Malformations, ScienceDaily (July,2010)

ICS 26/301 (8.6%)IVF 75/837 (9.0%) ozbiljnih kongenitalnih malformacijaDjeca začeta prirodnim putem 168/4000 (4.2%)

Stimulacija ovarija?Manipulacija i selekcija gameta?Kultivacija embrija?

Zašto povećan rizik od kongenitalnih malformacija nakon potpomognute oplodnje?

Za vrijeme gametogeneze uspostavljaju se specifični metilacijski obrasci u gametama oba spola

Stimulacija ovulacije, ICSI – intervencija prije završene uspostave metilacijskog obrasca u gametama

Priprema oocite i spermija za ICSI:

Odstranjivanje stanica cumulusa uz pomoć hijaluronidaze. Kontrola pod invertnim mikroskopom –postojanje prve polocite – znači oocita u metafazi II.

Svaka oocita se stavlja u kapljicu medija koja okružuje kapljicu medija sa spermijima. Kapljice se prekriju laganim parafinskim uljem i stavljaju na grijani stolić mikroskopa sa mikromanipulatorom.

Za vrijeme injektiranja spermija oocita se pridržava mikropipetom, a drugom mikropipetom se injektira spermij.

Intrauterini zaostatak u rastuPrerani porodSmanjena porođajna težinaAngelman i Beckwith-Wiedemann sindrom

Zašto baš ovakvi poremećaji?

Svi spadaju u poremećaje imprintinga

Što je genomski imprinting?

Čovjek: 100-200 utisnutih genaČovjek: 100-200 utisnutih gena

Anne Ferguson-Smith: chromosomes remember whether they came from the mother or from the father

Intrauterini zaostatak u rastu, smanjena porođajna težina: poremećaj imprintinga

Kako i zašto je nastao genomski imprinting?

Teorija genetskog konflikta:

Imprinting je nastao kao rezultat različitog interesa majke i oca za rast fetusa in utero

Geni eksprimirani od oca imaju funkciju poticati fetalni rast i omogućiti što bolji prolaz hranjivih tvari od majke do fetusašto bolji prolaz hranjivih tvari od majke do fetusa

Geni eksprimirani od majke imaju funkciju suprimirati fetalni rast (majka se bori protiv parazita koji raste u njezinom tijelu!)

Jedino prava kombinacija gena ekspirmiranih od oca i majke može uravnotežiti prehranu i potrebe za rast fetusa

Primjeri koji idu u prilog teoriji genetskog konflikta:

IGF2: insulin growth factor II, eksprimiran od oca

potiče fetalni rast

potiče rast placente, omogućuje transport hranjivih tvari

IGF2R: insulin growth factor II receptor, eksprimiran od majke

IGF2 i njegov receptor IGF2R– odgovorni za fetalni rast

IGF2R: insulin growth factor II receptor, eksprimiran od majke

smanjuje količinu slobodnog IGF2

Knockout miševi za IGF2R – povećana placenta, prekomjerni fetalni rast

Knockout miševi za IGF2 – manja placenta, manji potomci

Jedino prava kombinacija ekspresije majčinih i očevih gena može rezultirati normalnim razvojem

U svakoj generaciji imprint suprotnog spola se mora izbrisati i u gametama ustanoviti vlastiti koji odgovara spolu osobe

Nasljeđujemo različiti imprint od oca i majke

Ciklus imprintinga

Disbalans aktivnosti utisnutih gena dovodi do poremećaja imprintinga i bolesti

Bekwith-Wiedemann sindrom

- makroglosia, umbilikalna hernia, velika porođajna težina, hepatomegalija, nefromegalija, visoki % Wilmsovih i drugih embrionalnih tumora – rabdomiosarkom, hepatoblastom

pogođena tkiva – visoka ekspresija Igf2

Nasljeđivanje:

- 15% obiteljsko, autosomno dominanto (11.krom. utisnuta regija)

- 85% sporadičnih slučajeva: - 20 % genetski (pUPD, mutacije)- 60 % epigenetski (poremećaj metilacije)- 20 % nepoznati

Potpomognuta oplodnjaPotpomognuta oplodnja ii BWSBWS

ART/cohort

country referenceRR

6/149 UK Maher et al., 2003x 4

USA DeBaun et al., 200343/65*

x 6

#LOM/#tested

2/2

5/6

#ICSI/#IVF

3/3

5/2

study

retro.

retro.prosp.

RR = relative riskLOM = loss of maternal methylation * overlapping patients

Halliday et al., 2004

6/149 UK Maher et al., 2003x 4

France Gicquel et al., 20036/149 x 3

4/37 Australiax 9

19/341* USA

2/2

6/6

3/3

- Chang et al., 2005

3/3

2/4

1/3

5/5 -

retro.

retro.

retro.caseretro.

8/213 retro. UK Sutcliffe et al., 20068/8

K.H. Ørstavik et al. : Another Case of Imprinting Defect in a Girl with Angelman Syndrome Who Was Conceived by Intracytoplasmic Sperm Injection The American Journal of Human Genetics, Volume 72, Issue 1, 218-219, 2003 Kromosom 15

Angelman regija aktivna u majke, u oca inaktivirana imprintingom

Takav balans daje zdravo dijete

Angelman sindrom će nastati ako iz bilo kojeg razloga majčina regija nije aktivna

IVF – ICSI: djevojčice zadržale očev imprint, izgubile majčinManipulacija gametama? In vitro kultura?

ART – assisted reproduction technique

Rješenje problema:

PREIMPLATACIJSKA DIJAGNOSTIKA

Joe Leigh Simpson: Children born after preimplantation genetic diagnosis show no increase in congenital anomalies, Human Reproduction, Vol.25, No.1 pp. 6–8, 2010