Detectia prezentei Salmonella spp prin real time PCR

INTALNIREAINTALNIREA TRIMESTRIALATRIMESTRIALA AA

SOCIETATII MEDICILOR VETERINARI IN PATOLOGIA AVIARA SI SOCIETATII MEDICILOR VETERINARI IN PATOLOGIA AVIARA SI A ANIMALELOR MICI DIN ROMANIAA ANIMALELOR MICI DIN ROMANIA

ACADEMIA DE STIINTE AGRICOLE SI SILVICE ACADEMIA DE STIINTE AGRICOLE SI SILVICE

““GHEORGHE IONESCU – SISESTI”GHEORGHE IONESCU – SISESTI”AULA MAGNAAULA MAGNA

BucuBucurresti esti 2525 septembrieseptembrie 201 20144

DETECTIA PREZENTEI DETECTIA PREZENTEI SALMONELLASALMONELLA spp spp

IN PRODUSE DE ORIGINE IN PRODUSE DE ORIGINE AVIARA PRIN AVIARA PRIN rPCRrPCR

Virgilia PopaVirgilia Popa11, Eduard Marius Caplan, Eduard Marius Caplan11, Jenica Bucur, Jenica Bucur22, , Marian CulcescuMarian Culcescu11, Gheorghe Stratulat, Gheorghe Stratulat1,21,2

11SN Institutul Pasteur SA, SN Institutul Pasteur SA, 22FFARMAVET SA.ARMAVET SA.

SalmonellaSalmonella ““BacillusBacillus//Eberthella typhiEberthella typhi” – 1880; ” – 1880;

““Bacillus suipestiferBacillus suipestifer”” - 1885 - 1885

Teobald SmithTeobald Smith1859-19341859-1934

Daniel Elmer Daniel Elmer SalmonSalmon

18518500-19-191144

Karl Joseph Karl Joseph EberthEberth

18183535-19-192626

SALMONELLA / SALMONELLA / SALMONELOZE SALMONELOZE

1959 – V. Stoenescu1959 – V. Stoenescu

1963 – V. Stoenescu, S. Sandulescu, C. Vior1963 – V. Stoenescu, S. Sandulescu, C. Vior

1965 – S. Bem, G. Ciortea,E. Marcea, R. Gavrila 1965 – S. Bem, G. Ciortea,E. Marcea, R. Gavrila

1972 – E. Niculescu (Avram), S. Sandulescu, G. Paunescu, E. Manolescu1972 – E. Niculescu (Avram), S. Sandulescu, G. Paunescu, E. Manolescu

1976 – E. Gorgan, C. Laslo1976 – E. Gorgan, C. Laslo

1977 – S. Sandulescu, V.Mihalache1977 – S. Sandulescu, V.Mihalache

1979 – V. Rusu, R. Dorobantu1979 – V. Rusu, R. Dorobantu

1980 – V. Teusdea1980 – V. Teusdea

1981 – I.V. Patrascu 1981 – I.V. Patrascu

1983 – M. Siddique, M. Negut, I. Bercea, G. Stratulat 1983 – M. Siddique, M. Negut, I. Bercea, G. Stratulat

19819866 – O. Sicoe – O. Sicoe, M. Rusu, M. Rusu

1994 – G. Stratulat1994 – G. Stratulat

1995 – D. Danes1995 – D. Danes et alet al. .

1998 – 1998 – V. V. Popa, Popa, M. M. Borca, Borca, D. D. Danes, Danes, D. D. Nita, Nita, E. E. Avram, Avram, I. I. Sandu, Sandu, M. M. Gruia, Gruia, M. M. Danes Danes

2003 – A. Stanica 2003 – A. Stanica

2007 – M. Vanghele, H. Coste, M. Ionescu, I. Sandu2007 – M. Vanghele, H. Coste, M. Ionescu, I. Sandu

2008 – A. Ungvari2008 – A. Ungvari

2014 – M. Raduta2014 – M. Raduta

R. Clepa…R. Clepa…

LPA Clinceni: M. Mihalache, F. Eftimie, A. Preda, L. DraghiaLPA Clinceni: M. Mihalache, F. Eftimie, A. Preda, L. Draghia

1967 - Verdes N; 1978 – I.Manoiu, S. Nemteanu; 1981 – V.Stanescu, W.Klemm, C. Laslo; 1967 - Verdes N; 1978 – I.Manoiu, S. Nemteanu; 1981 – V.Stanescu, W.Klemm, C. Laslo; 1981 – C. Berbinschi, C. Faur, G. Ontanu; 1985 - EO Bucur1981 – C. Berbinschi, C. Faur, G. Ontanu; 1985 - EO Bucur

Revista de cresterea animalelorRevista de cresterea animalelor

Rev. de zRev. de zootehnie si medicina ootehnie si medicina veterinaraveterinara

Lucrarile I.C.V.B. PasteurLucrarile I.C.V.B. Pasteur

Studii si cercetari de med. Studii si cercetari de med. vvet.et.

Lucrari stiintitifice FMVLucrari stiintitifice FMV

Rev. Rom. Med. Vet.Rev. Rom. Med. Vet.

Teze de doctoratTeze de doctorat FMV FMV

TEHNICI PCRTEHNICI PCR

- amplificare clasica – control post-amplificare amplificare clasica – control post-amplificare prin gel-electroforeza (end-point)prin gel-electroforeza (end-point) - amplificare in timp real (spectrofotometrica) – - amplificare in timp real (spectrofotometrica) – control in timpul reactieicontrol in timpul reactiei

- - Sybr GreenSybr Green-- Taqman Taqman – mono, multiprimer / – mono, multiprimer /

multisondamultisonda

STANDARDE ISO/ REGLEMENTARI STANDARDE ISO/ REGLEMENTARI SALMONELLASALMONELLA, PCR, PCR

- EN ISO 6579:2002 – Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for EN ISO 6579:2002 – Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for the detection of Salmonella spp.the detection of Salmonella spp.

- - Regulamentul CE 2073/2005 privind criteriile microbiologice pentru produsele alimentareRegulamentul CE 2073/2005 privind criteriile microbiologice pentru produsele alimentare

- - ISO/TS 20836:2005ISO/TS 20836:2005Microbiologie des aliments—Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la recherche Microbiologie des aliments—Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la recherche de micro-organismes pathogènes dans les aliments—Essais de performance des de micro-organismes pathogènes dans les aliments—Essais de performance des thermocycleursthermocycleurs

ISO 20837:2006ISO 20837:2006Microbiologie des aliments—Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la détection Microbiologie des aliments—Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la détection des micro-organismes pathogènes dans les aliments—Exigences relatives à la préparation des micro-organismes pathogènes dans les aliments—Exigences relatives à la préparation des échantillons pour la détection qualitativedes échantillons pour la détection qualitative

ISO 20838:2006ISO 20838:2006Microbiologie des aliments—Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la détection Microbiologie des aliments—Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la détection des micro-organismes pathogènes dans les aliments—Exigences relatives à l’amplification et des micro-organismes pathogènes dans les aliments—Exigences relatives à l’amplification et à la détection pour les méthodes qualitativesà la détection pour les méthodes qualitatives

ISO 22174:2005ISO 22174:2005Microbiologie des aliments—Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la recherche Microbiologie des aliments—Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la recherche de micro-organismes pathogènes dans les aliments—Exigences générales et définitionsde micro-organismes pathogènes dans les aliments—Exigences générales et définitions

ISO 22118:2011ISO 22118:2011Microbiologie des aliments—Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la détection et Microbiologie des aliments—Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la détection et la quantification des micro-organismes pathogènes dans les aliments—Caractéristiques de la quantification des micro-organismes pathogènes dans les aliments—Caractéristiques de performanceperformance

ISO 22119:2011ISO 22119:2011Microbiologie des aliments—Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) en temps réel pour Microbiologie des aliments—Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) en temps réel pour la détection des micro-organismes pathogènes dans les aliments—Exigences générales et la détection des micro-organismes pathogènes dans les aliments—Exigences générales et définitionsdéfinitions

DETECTIA DETECTIA SALMONELLASALMONELLA spp spp PRIN REAL TIME PCR (qPCR /ReTiPCR/rPCR)PRIN REAL TIME PCR (qPCR /ReTiPCR/rPCR)

- POS: IP-CD-BM-316- POS: IP-CD-BM-316

- metoda PCR in timp real in care sunt utilizati concomitent metoda PCR in timp real in care sunt utilizati concomitent doi fluoroforidoi fluorofori, unul , unul prin care este semnalat / detectat ADN-ul specific prin care este semnalat / detectat ADN-ul specific SalmonellaSalmonella spp, iar cel de-al spp, iar cel de-al doilea semnalizeaza prezenta / absenta doilea semnalizeaza prezenta / absenta inhibitorilorinhibitorilor in reactie in reactie

- amplificator spectrofotometric care este echipat pentru detectia amplificator spectrofotometric care este echipat pentru detectia concomitenta a doua emisii de fluorescenta la 522 nm si la 553 nm.concomitenta a doua emisii de fluorescenta la 522 nm si la 553 nm.

- limita de detectie a kitului este de limita de detectie a kitului este de ≤ 5 còpii ADN≤ 5 còpii ADN;; ttotusi limita de detectie otusi limita de detectie depinde de matricea probei, gradul de procesare, extractia ADN si continutul depinde de matricea probei, gradul de procesare, extractia ADN si continutul in ADN. in ADN.

-kitul a fost validat si certificat de AOAC (nr. licenta 041103) si de Microval kitul a fost validat si certificat de AOAC (nr. licenta 041103) si de Microval (RQA2008LR22)(RQA2008LR22)


Metoda rPCR (amplificare PCR in timp real) cu sonda Taqman prin utilizarea kitului comercial „Sure Metoda rPCR (amplificare PCR in timp real) cu sonda Taqman prin utilizarea kitului comercial „Sure Food Pathogen Salmonella Plus V” (validat Microseq si AOAC):Food Pathogen Salmonella Plus V” (validat Microseq si AOAC):

PProbe: robe: probe cultura bacteriana de preimbogatire in BPW (Buffered peptone water), de 20 ore, probe cultura bacteriana de preimbogatire in BPW (Buffered peptone water), de 20 ore, obtinute in Laboratorul de bacteriologie – IPasteur, din probe comune carne pasareobtinute in Laboratorul de bacteriologie – IPasteur, din probe comune carne pasare

Extracţie ADNExtracţie ADN: cu trusa QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen – 51304, cf. protocolului pentru bacterii).: cu trusa QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen – 51304, cf. protocolului pentru bacterii).

PCRPCR: cu kitul Sure Food Pathogen : cu kitul Sure Food Pathogen SalmonellaSalmonella Plus V Plus V ( (rBiopharm - S5111V, cf. protocolului kitului). rBiopharm - S5111V, cf. protocolului kitului).

MartorMartor(i)(i) pozitiv pozitiv(i)(i): martor pozitiv din kit; martor de extractie - extract ADN dintr-o tulpina izolata in : martor pozitiv din kit; martor de extractie - extract ADN dintr-o tulpina izolata in 2013 de 2013 de SalmonellaSalmonella spp (cod 7396), obtinut cu kitul Qiagen; martor de extractie - extract ADN dintr-o spp (cod 7396), obtinut cu kitul Qiagen; martor de extractie - extract ADN dintr-o tulpina izolata in 2013 de tulpina izolata in 2013 de SalmonellaSalmonella spp (cod 7396), obtinut prin liza termica. spp (cod 7396), obtinut prin liza termica.

MartorMartor((ii)) negativ negativ((ii)): amestecul de reactie din kit (reagentii pentru amplificare, fara ADN); extract ADN : amestecul de reactie din kit (reagentii pentru amplificare, fara ADN); extract ADN dintr-o tulpina de dintr-o tulpina de Escherichia coliEscherichia coli standard (C1a GE Healthcare). standard (C1a GE Healthcare).

Amplificator spectrofotometricAmplificator spectrofotometric: Mx3005P (Stratagene). Software MxPro v4.01 - 2007 (Stratagene). : Mx3005P (Stratagene). Software MxPro v4.01 - 2007 (Stratagene).



Judet Nr. ferme Nr.probe Nr.probe + % probe +A 9 40 18 45B 1 4 1 25C 1 4 1 25D 4 17 11 65

15 65 31 48


1. Instrument pentru programele de 1. Instrument pentru programele de autocontrolautocontrol

2. Rapid – maxim 24 de ore de la 2. Rapid – maxim 24 de ore de la primirea probelorprimirea probelor

3. Sensibilitate, specificitate, 3. Sensibilitate, specificitate, robustete inalte robustete inalte

CONTROLCONTROL

DEZINFECTANTI / ANTISEPTICE DEZINFECTANTI / ANTISEPTICE

Health & Medicine

Detectia prezentei Salmonella spp prin real time PCR