Detección de pirogenos (endotoxinas) por Gel-Clot

C o n t r o l m i c r o b i o l ó g i c o d e m e d i c a m e n t o s

Determinación de endotoxinas bacterianas por el método de gelificación

con lisado de amebocitos de Limulus polyphemus (LAL)

Práctica No.7

Castro Loa Fernando Adrian López Rangel Lourdes Villa Pérez Diana Gabriela

9FM1 - QFI

Equipo No.2

F u n d a m e n t o s t e ó r i c o s


1

Es cualquier agente productor de fiebre.

Son sustancias que actúan de forma indirecta sobre los centros termorreguladores del hipotálamo y producen un aumento de temperatura.

Por lo general, son moléculas de alto peso molecular y de naturaleza polimérica.

Los pirógenos más comunes son los de origen microbiológico, como los componentes esenciales de la pared

celular de bacterias (Lipopolisacárido de bacterias Gram negativas).

Amebas

Cél. Vegetal

Bacterias Virus

P i r ó g e n o


2

T i p o s d e P i r ó g e n o s

• Endógenos

Citocinas proinflamatorias e inflamatorias como Interleucinas (I, II, IV), Prostaglandina (PGE2) , Ácido araquidónico, etc. Algunos individuos tienden a ser muy susceptibles a dichas moléculas, ya sea por sobreexpresión de receptores a las mismas o bien por algún daño en el centro termorregulador hipotalámico.

• Exógenos

— Agentes microbiológicos: Provenientes de bacterias, levaduras, hongos, tales como constituyentes celulares (LPS, flagelos, Pili, etc.).

— Agentes químicos: Pueden encontrarse en la naturaleza y

pueden provenir de algunas plantas o insectos, por ejemplo la melitina.


3

E f e c t o s f i s i o l ó g i c o s d e l o s P i r ó g e n o s

Los efectos que se presenten son dosis dependiente. • Bajas dosis de pirógenos inducen reacciones inflamatorias, sin

síntomas clínicamente significativos.

• Dosis moderadas de pirógenos inducen fiebre y cambios significativos en la composición del plasma.

• Altas dosis de pirógenos puede llevar a choques sépticos, caracterizados por una disfunción cardiovascular, incluyendo la depresión y dilatación del miocardio, la vasodilatación, vasoconstricción, disfunción del endotelio y disfunción de órganos (riñón, hígado, pulmones y cerebro) seguido de la falla de múltiples órganos y muerte.


4

L i p o p o l i s a c á r i d o b a c t e r i a n o

Considerado como la endotoxina pirogénica más importante dentro del ámbito clínico.

Bacteria Gram (-) p. ej. Brucella sp.

• Antígeno O: Está formado por un homopolímero lineal de 10 a 100 unidades.

• Núcleo: Está formado por oligosacáridos de Glucosamina, Glucosa, Manosa, Quinovosamina y Ácido 3-desox-D-nanno octulosónico (Kdo).

• Lípido base o A: Es un esqueleto disacárido de diaminoglucosa y ácidos grasos de cadena larga.

(Endotoxin)


5

C a r a c t e r í s t i c a s d e l l p s b a c t e r i a n o

Tienen dos partes principales: 1. Una cadena polisacárida hidrofílica. 2. Un grupo hidrofóbico. Dado que la longitud de la cadena polisacárida es variable, su peso molecular va desde los 5,000 a 25,000 Da. Es muy estable y puede soportar temperaturas de 120°C por periodos de 3 horas. Son insensibles a cambios de pH, por lo que se requiere una alta concentración de ácidos o álcalis durante un periodo de tiempo largo para destruirles.

En agua, los LPS pueden tomar dif. tamaños: • En presencia de surfactantes, se rompen en monómeros con

pesos moleculares bajos. • En disoluciones que contienen cationes mono o divalentes,

forman micelas de alto peso molecular (>300 kDa) • En agua ultrapura, se forman agregados que permiten su

remoción con membranas de ósmosis inversa y ultrafiltración.


6

M e c a n i s m o d e a c c i ó n d e l o s p i r ó g e n o s

Tipo Ligandos

TLR1 Lipoproteínas

TLR2 Peptidoglicano & Lipoproteínas

TLR3 RNA

TLR4 LPS, Ác. Lipoteicoico

TLR5 Flagelina bacteriana

TLR6 Peptidoglicano

Receptores tipo toll (TLR) en mamiferos

Célula animal

TLR1 TLR5

TLR2

Bacteria Gram -

Respuesta inflamatoria e inmunológica

Respuesta “dosis”-dependiente. Se elevan los niveles de citocinas proinflamatorias e inflamatorias circulantes como la IL-I,II y

IV, la PGE2, etc.

IL

PGE2

Circulación sanguínea hacia SNC

Región hipotalámica sensa dichas citocinas y genera aumento en los procesos metabólicos viscerales, aumentando así la temperatura

corporal (Fiebre)


7

I m p o r t a n c i a d e l a p r e s e n c i a d e

e n d o t o x i n a s e n p r e p a r a d o s f a r m a c é u t i c o s

En vista de que los niveles de pirógenos en agua pueden variar dramáticamente y de que su presencia puede afectar los resultados de experimentos bioquímicos y biológicos, se han establecido niveles máximos

aceptables para contaminantes pirogénicos en el agua de laboratorio en estándares ASTM relativos a agua purificada para aplicaciones de laboratorio.

Las endotoxinas interactúan con las membranas celulares y tienen efectos sobre las funciones y crecimiento celular.

Estos efectos pueden son causados por la inserción de LPS sobre receptores celulares o a proteínas solubles. Ha sido demostrado que el uso de agua libre de pirógenos en los

medios para cultivo celular optimiza la viabilidad celular y su crecimiento.

Cultivo de células de mamíferos


8

Electroforesis

Biología molecular

El agua utilizada para la preparación de reactivos y el enjuague del equipo debe estar libre de pirógenos y otras

sustancias orgánicas que podrían afectar la polimerización de geles o bien la precisión del enfoque isoeléctrico, con lo que

pondrían en riesgo la precisión y reproducibilidad de resultados experimentales.

Técnicas experimentales sensibles, como la PCR, clonación o producción de anticuerpos monoclonales, requieren el uso de agua ultrapura y libre de contaminantes inorgánicos y

orgánicos (como pirógenos y ácidos nucleicos).

El uso de agua ultrapura, libre de pirógenos en la preparación de medios y buffers con lleva un mejor desarrollo del embrión y mayores tasas de fertilización.

Fertilización in vitro


9

P r o c e s o d e d e s p i r o g e n i z a c i ó n

Inactivación

• Empleo de calor seco a más de 250 °C

• Empleo de calor húmedo de 110-120°C

• Inactivación química

– Agentes Oxidaciones

– Agentes Alquilantes

– Agentes Hidrolíticos

• Empleo de radiaciones ionizantes

Eliminación

• Por lavado con agua exenta de pirógenos

• Osmosis inversa

• Ultrafiltración: membranas con un límite de peso molecular nominal (NMWL de su nombre en inglés) suficientemente bajo.

• Filtros de profundidad.

• Combinación de los anteriores


10

M é t o d o s d e d e t e c c i ó n d e p i r ó g e n o s

1. Método in vivo: Prueba en conejo

2. Método in vitro: Prueba de gelificación por el método del Lisado de amebocitos de Limulus polyphemus.


11

Método in vivo: Prueba en conejo (MGA-0711 – Prueba de pirógenos)

INTERPRETACIÓN Considerar cualquier disminución de temperatura con respecto a la temperatura control como cero. La muestra cumple los requisitos para ausencia de pirógenos si ningún conejo muestra un incremento individual de 0.5°C o mayor con respecto a su temperatura control. Si un conejo muestra un aumento de temperatura individual de 0.5°C o mayor, continuar la prueba usando cinco conejos más.

Conejo 1 Conejo 2 Conejo 3

Temperatura 38 °C 38.3 °C 38.1 °C

38.1 °C 38.3 °C 38.2 °C

38.2 °C 38.5 °C 38.3 °C

38.1 °C 38.6 °C 38.1 °

38.3 °C 38.3 °C 38.1 °C

38 °C 38.2 °C 38.2 °C

38.2 °C 38.4 °C 38.1 °C

Δmax 0.3 °C 0.3 °C 0.2 °C

Temperatura

Adminis tración


12

1° Etapa

INTERPRETACIÓN Considerar cualquier disminución de temperatura con respecto a la temperatura control como cero. La muestra cumple los requisitos para ausencia de pirógenos si ningún conejo muestra un incremento individual de 0.5°C o mayor con respecto a su temperatura control. Si un conejo muestra un aumento de temperatura individual de 0.5°C o mayor, continuar la prueba usando cinco conejos más.

Conejo 1 Conejo 2 Conejo 3

Temperatura 38 °C 38.3 °C 38.1 °C

38.1 °C 38.3 °C 38.2 °C

38.2 °C 38.5 °C 38.3 °C

38.1 °C 38.8 °C 38.1 °

38.5 °C 38.3 °C 38.1 °C

38 °C 38.2 °C 38.2 °C

38.2 °C 38.4 °C 38.1 °C

Δmax 0.5 °C 0.5 °C 0.2 °C

Temperatura

Adminis tración


13

2° Etapa

INTERPRETACIÓN La muestra cumple los requisitos para ausencia de pirógenos si no más de tres de los ocho conejos presentan un aumento de temperatura individual de 0.5°C o mayor y si la suma del aumento de la temperatura máxima individual de los ocho conejos no excede 3.3°C.

RESULTADO Producto pirogénico o no libre de pirógenos.

Conejo 1 Conejo 2 Conejo 3 Conejo 4 Conejo 5 Conejo 6 Conejo 7 Conejo 8

Δ max 0.5 °C 0.5 °C 0.2 °C 0.7 °C 0.8 °C 0.5 °C 0.9 °C 0.6 °C

Δ max total 4.7 °C

Conejo 4 Conejo 5 Conejo 6 Conejo 7 Conejo 8

Temperatura 38 °C 38.3 °C 38.1 °C 38.5 °C 38.4 °C

Δ max 0.7 °C 0.8 °C 0.5 °C 0.9 °C 0.6 °C

Administración


14

Método in vitro: Prueba de gelificación por el método del Lisado de amebocitos de Limulus polyphemus

• En 1960 el Dr. Frederick Bang encontró que al inyectar bacterias marinas al torrente sanguíneo del cangrejo herradura (Limulus polyphemus) se producía la coagulación de la sangre.

• Estudios posteriores, revelaron que ésta coagulación se debía a endotoxinas de las bacterias marinas.

• El ahora conocido reactivo de LAL, se obtuvo de los amebocitos.

— Limulus: Nombre genérico del cangrejo

— Amibocito: Célula que contiene los componentes activos del reactivo.

— Lisado: Proceso para obtener el componente de las células.

• Existen dos métodos para su determinación:

— Formación de un gel (Gelificación).

— Fotométrico.


15

Método de LAL por gelificación

Es el ensayo clásico. La reacción desarrollada en el tubo de ensaye es la misma que ocurre in vivo en la hemolinfa del cangrejo de herradura cuando éste tiene contacto con alguna endotoxina bacteriana.

INTERPRETACIÓN Considerar una prueba positiva cuando el gel se mantiene integro al invertir el tubo 180° y una prueba negativa cuando no hay formación de un gel firme.


16

Método de LAL por vía fotométrica

• Método Turbimétrico: Las pruebas se llevan a cabo a temperatura (37 ± 1°C) y tiempo de incubación recomendada por el fabricante del lisado.

— Cinético: Mide el tiempo necesario para que la mezcla de reacción alcance una absorbancia predeterminada o el grado de turbiedad desarrollada.

— Turbimétrico de punto final: Se basa en la relación cuantitativa entre la concentración de endotoxina y la turbiedad de la mezcla de reacción al final de un periodo de incubación.

• Método cromogénico: Se mide el cromóforo liberado de un péptido

cromogénico, al reaccionar el lisado con la endotoxina.

— Cinético: Mide el tiempo que tarda la reacción en alcanzar una absorbancia predeterminada o el grado de color desarrollado.

— Cromogénico de punto final: Se basa en la reacción cuantitativa entre la concentración de endotoxina y la cantidad de cromóforo liberado al final del período de incubación

Límite endotoxina (máxima concentración válida)

Es la máxima concentración de endotoxina bacteriana permitida en el producto la cual no debe producir una respuesta clínica pirogénica cuando se administra bajo la dosis indicada.

Máxima dilución válida (MVD)

Es la máxima dilución permitida para el producto en su forma concentrada o diluida en la que el límite de endotoxina puede determinarse.

Sensibilidad del lisado

Es la mínima concentración de endotoxina bacteriana en una muestra, la cual puede ser detectada por el LAL , sin que exista inhibición o realce de la reacción. Se encuentra indicada en el marbete.


17

Conceptos importantes

CEE: Reconstituir con el volumen de agua del reactivo y se agita vigorosamente por 4 min. LAL: Reconstituir con el volumen de agua del reactivo y se MEZCLA SUEAVEMENTE sin hacer espuma. Realizar pruebas preliminares con la finalidad de: 1. Verificar la sensibilidad del lisado y así validar el proceso o la prueba.

2. Detección de interferencias del producto con la prueba.


18

Consideraciones

Realizar no menos de 4 determinaciones de cada lote

LAL empleando un solo lote de endotoxina

Incluir un control negativo en cada determinación utilizando agua grado reactivo para LAL

Diluir hasta tener una concentración de 1 UE/mL

Prepara diluciones empleando factor de dilución 1:2 que

comprenda intervalo de 0.25λ a 4λ, agitar por lo menos 1

min.

Agitar suavemente para evitar destrucción de LAL

Incubar a 37ªC ±1 ªC por 60 min y hacer lectura

Calcular sensibilidad

Sensibilidad del lisado

Un resultado positivo es la formación de un coagulo firme que mantiene su

integridad cuando el tubo se invierte.

Un resultado negativo se caracteriza por la ausencia total de gel o por la formación de un gel viscoso que no se mantiene íntegro

al invertir el tubo.


19

* SENSIBILIDAD DEL LISADO F u n d a m e n t o s t e ó r i c o s

20

Ejemplo para el calculo de la sensibilidad del lisado

* PRUEBA DE INTERFERENCIA F u n d a m e n t o s t e ó r i c o s

21

Prueba de interferencia del producto con el lisado

P a r t e e x p e r i m e n t a l

1 UE/mL

1 mL

0.5 UE/mL 0.25 UE/mL 0.06 UE/mL0.125 UE/mL

1 mL 1 mL1 mL

0.03 UE/mL0.25 UE/mL 0.125 UE/mL 0.06 UE/mL Control (-)0.5 UE/mL

0.1 mL

Agua libre de

pirógenos

1.0 mL

1.0 mL 1.0 mL1.0 mL

0.1 mL

1:2 1:2 1:21:2

0.06 UE/mL

1:2

1 mL

1 UE/mL1 UE/mL

1 mL

0.5 UE/mL0.5 UE/mL 0.25 UE/mL0.25 UE/mL 0.06 UE/mL0.06 UE/mL0.125 UE/mL0.125 UE/mL

1 mL 1 mL1 mL


0.1 mL


0.1 mL

Agua libre de

pirógenos

Agua libre de

pirógenos

1.0 mL

1.0 mL 1.0 mL1.0 mL

0.1 mL

1:2 1:2 1:21:2

0.06 UE/mL0.06 UE/mL

1:2

1 mL

P a r t e E x p e r i m e n t a l

22

Curva de sensibilidad

Control (-)Control (+)Control (+)

De Muestra

Muestra

MuestraEndotoxina

0.25 UE/mL (+)

Agua libre

de pirógenos

0.1 mL0.1 mL 0.1 mL 0.1 mL

Control (-)Control (+)Control (+)

De Muestra

Muestra

MuestraEndotoxina

0.25 UE/mL (+)

Agua libre

de pirógenos

0.1 mL

Control (-)Control (-)Control (+)Control (+)Control (+)

De Muestra

Control (+)

De Muestra

MuestraMuestra

MuestraMuestraEndotoxina

0.25 UE/mL (+)

Endotoxina

0.25 UE/mL (+)

Agua libre

de pirógenos

Agua libre

de pirógenos

0.1 mL0.1 mL 0.1 mL 0.1 mL

P a r t e e x p e r i m e n t a l

23

Análisis de muestras

R e s u l t a d o s

R e s u l t a d o s e x p e r i m e n t a l e s

24

EQUIPOMUESTRA

ANALIZADA

CONTROL

NEGATIVO

CONTROL

POSITIVO

CONTROL POSITIVO

DEL PRODUCTO

VALIDÉZ DEL

ANÁLISIS

ANÁLISIS DEL

PRODUCTODICTAMEN

1Medroxi

progesterona- - - Rechazado - Rechazado

3Di luyente

inyectable- + - Aprobado - Aprobado

4Solución

his tidina- + - Aprobado - Aprobado

5Bromuro de

vercuronio- - - Rechazado - Rechazado

6Bromuro de

rocuronio- - - Rechazado - Rechazado

Curva de sensibilidad

Análisis de muestras

NÚMERO DE TUBO 1 2 3 4 5

4λ 2λ λ 0.5λ 0.25λ

0.5 UE/mL 0.25UE/mL 0.125 UE/mL 0.06 UE/mL 0.03UE/mL

CURVA 1 + + + - -

CURVA 2 + + - - -

CONCENTRACIÓN DE

ENDOTOXINA Sensibilidad del lisado 0.1768 UE/mL

R e s u l t a d o s e x p e r i m e n t a l e s

25

Conclusiones

• Existen principios activos que no pueden ser probados mediante el método de LAL.

• La interferencia de los productos puede dar falsos negativos.

• No se pueden utilizar animales de experimentación si los principios activos a evaluar producen algún efecto cardiotónico o bien que puedan dañar algún órgano o la muerte del mismo animal de experimentación.

• El método de LAL es rápido y efectivo para la detección de pirógenos en un producto farmacéutico.

• La sensibilidad del kit tiene que ser comprobada previo al análisis de un producto farmacéutico.

• Previo al análisis del producto, se tiene que realizar una investigación bibliográfica para conocer el principio activo que se va a someter a éste tipo de pruebas.

A n e x o s

* PRUEBA DE INTERFERENCIA A n e x o i

26

Comparación de métodos de análisis para pirógenos

Ventajas Desventajas

Método cualitativo

Tiempos largos de prueba

Costoso y se necesita de un bioterio y

condiciones estrictas

El efecto depende de la respuesta fisiologica

Método cualitativo

Susceptibilidad de contaminación

Condiciones controladas

Personal calificado

Método cuantitativo

Amplio rango de detección

Tiempo de detección rápido

Alta sensibilidad 0.005 UE/ mL

Tiempo de incubación y lectura controlado

Solo se puede leer una vez la muestra

Límite de detección de 0.001 UE/mL

Fácil uso

Método de gelificación

Respuesta a gran variedad de agentes

pirogénicos Uso de animales

Equipo sencillo y económico

Fácil interpretación de resultados

Punto final Provee resultados rápidos (16 min) Interpretación del color de las muestras

Método

Fotométrico

Turbidimétrico

Cinético Equipo costoso

Punto final Método cuantitativo

Cromogénico

Cinético Interpretación del color de las muestras

Bacterial endotoxin testing (Get-clot) – PDF

B i b l i o g r a f í a y R e f e r e n c i a s

Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos 10ma edición

United States Phamacopeia . 24th ed.

Validación del método de LAL – PDF

Especificaciones de un kit de LAL – PDF

http://www.mclmicro.com/services/bacterial-endotoxin-lal-testing/






http://www.finlay.sld.cu/publicaciones/vaccimonitor/Vm2012/a21.pdf




http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/Pyrochrome_multilang_IFUs/PyrochromeIFU_PN000856_es_r1.pdf




Education

Detección de pirogenos (endotoxinas) por Gel-Clot