Mikroorganizmaları saymak için farklı yöntemler vardır. Bazıları direk ölçüm ile (örneğin mikroskop), bazıları metabolit üretiminin takibi ile (örneğin ATP) indirekt olarak yapılabilir.

Mikroorganizmaların sayısını belirlemek büyüme kinetiğinin temelini oluşturur.

1. 10 ml E.coli kültürü hazırlandı.

2. Geceboyu 37°C’de çoğaltıldı.

3. 2 litre besi ortamı hazırlandı.

(L-broth)

4. 10 ml E.coli kültürü ortama transfer edildi.

5. 37°C’de çalkalamalı su banyosunda üretildi.

6. Her 30 dakikada bir 5 ml örnek alındı.

7. Yaşayan canlı sayımı ve O.D. yöntemiyle sayım yapıldı.

8. saate kadar örnek alındıktan sonra, 8. saat örneğinin alınmasında;

ÖRNEK SAYIM YÖNTEMİ

1. 6 tane 0,9 ml steril serum fizyolojik hazırla

2. Aseptik transfer ile 0,1 ml örnekten al, 1. tüpe ekle. Aynı şekilde 2 den 3’e ve devamında 5’ten 6’ya seyreltme yap.

3. Agarlı besi ortamı hazırla ve petriye dök. Otoklavladıktan sonra katı besi ortamının üzerine 0,1 ml her seyreltmeden steril pipetle agarlı besi ortamına süspansiyonu ekle.

4. Mikroorganizma süspansiyonunu agarlı ortamın üzerine yay.

5. 37°C’de inkübasyona bırak.

OPTİK DANSİTE

Kör olarak büyüme ortamını kullanarak 600 nm de optik dansiteyi ölç.

Zaman (saat): 8O.D600 : 3.8

Canlı Sayımı:

10-1 seyreltme

10-2 seyreltme

10-3 seyreltme

10-4 seyreltme

10-5 seyreltme

10-6 seyreltme

10-5 seyreltme

10-5 seyreltmesi yapılan petride 87 koloni ölçülmüştür. 8 saat sonra ana kültürdeki mikroorganizma sayısı nedir?

CEVAP:

87 x 100000 = 8700000 E.coli / 0,1 ml seyreltilmiş örnek

= 87000000 E.coli / ml seyreltilmiş örnek

Zaman(saat): Canlı Hücre /ml: O.D. 600:0.5 3.1x101 0.641.0 3.2x101 0.651.5 8.4x101 0.852.0 2.58x102 1.102.5 8.57x102 1.363.0 2.11x103 1.553.5 9.80x103 1.894.0 2.04x104 2.054.5 5.92x104 2.285.0 1.90x105 2.535.5 3.15x105 2.646.0 1.71x106 3.016.5 4.33x106 3.217.0 1.42x107 3.477.5 3.11x107 3.648.0 8.70x107 3.778.5 3.39x108 4.169.0 1.04x109 4.409.5 1.04x109 4.4010.0 9.68x108 4.3910.5 1.04x109 4.4011.0 1.03x109 4.4011.5 1.04x109 4.4012.0 4.45x108 4.2218.0 3.49x102 1.1624.0 3 0.13

•Hücre sayısına karşı zaman grafiğe geçirildiğinde deneysel sonuçlar yorumlanabilir.

Canlı H

ücre / ml

Zaman (saat)

!!! ANCAK!!!

Hücre sayısındaki çok büyük değişimler pikler oluşturduğundan büyüme ortamında neler olup bittiği anlaşılamaz.

Çözüm: Canlı hücre sayısı logaritmik skalada Y-eksenine yerleştirildiğinde yorumlanabilir bir grafik elde edilir.

Log

10 canlı hücre / m

l

Zaman (saat)

Hücre sayısının logaritmik skalaya yerleştirilmiş şekliyle elde edilen grafik.

Log

10 c

anlı

hüc

re /

ml

Zaman (saat)

Optik dansiteye dayalı sayım ve canlı sayımı yöntemleri birbirine paralellik gösterir.

SORU: OD ile karşılaştırıldığında canlı sayım yöntemine göre, ölüm fazındaki hızlı düşüşün sebebi nedir?

Log

10 canlı hücre / m

l Zaman (saat)

İlk 12 saat incelenirse fazlar daha iyi görülebilir.

Log

10 canlı hücre / m

l Zaman (saat)

Mikroorganizmaların Yaşam Fazları

BÜYÜME HIZI SABİTİ (µ)

µ ; büyüme hızının bir ölçüsüdür.

Hücrelerin Büyümesinin Hızı = µ x Hücrelerin Sayısı

ln Nt - ln N0 = µ(t - t0)

µ , aşağıdaki eşitlikle hesaplanabilir.

log10 N - log10 N0 = (µ/2.303) (t - t0)

Formül aşağıdaki şekle çevrilebilir.

µ = ( (log10 N - log10 N0) 2.303) / (t - t0)

t0 = 1.5h:

N = 8.4x101,log10 N = 1.92

t = 8.5h:N = 3.39x108,log10 N = 8.53

Log

10 canlı hücre / m

l Zaman (saat)

µ = ( (log10 N - log10 N0) 2.303) / (t - t0)

= ( (8.53 - 1.92) 2.303) / (8.5 - 1.5) = (6.61 x 2.303) / 7

= 15.22 / 7 = 2.18 saat-1

log10 Nt = log10 N0 + g log102

g = (log10 Nt - log10 N0) / log102

g = (log10 Nt - log10 N0) / log102

= (8.53 - 1.92) / 0.301 = 21.96 jenerasyon 7 saat

= 7 / 21.96 = 0.32 saat (x 60 = 19.2 dakika)µ ve g birbiri ile µ = ln2/g = 0.693/g eşitliği sayesinde ilişki içindedir.

KATLANMA ZAMANI veya JENERASYON ZAMANI (g)

t0 = 1.5h:

N = 8.4x101,log10 N = 1.92

t = 8.5h:N = 3.39x108,log10 N = 8.53 L

og 10 canlı hücre / m

l Zaman (saat)

Bu çalışma sonunda µ = 2.18 saat-1 (yani saatte 2.18 jenerasyon geçirmektedir.) ve jenerasyon süresi 0,32 saat (19,2 dakika) olarak bulunmuştur.

Yüksek substrat konsantrasyonu daha fazla spesifik büyüme hızına sebep olur. Ancak substrat konsantrasyonu monod sabitinden daha yüksek olduğunda spesifik büyüme hızı yaklaşık olarak ........................................................ eşit olacaktır.maksimum spesifik büyüme hızına

Kesikli fermentasyon sırasında substrat konsantrasyonu düşecektir. Dolayısıyla ............................................ düşecektir.

spesifik büyüme hızı da

Aşağıdaki sonuçlar bir kesikli fermentasyonun eksponansiyel fazından elde edilmiştir.

Zaman (saat)

3

6

9

12

Kuru Ağırlık (g/L)

0,016

0,256

4,100

65,53

Ln kuru ağırlık

-4,135

-1,363

1,411

4,183

µ = ? h-10,92

Aşağıdaki sonuçlar bir kesikli fermentasyon sonucu elde edilmiştir.

Zaman (saat)

2

4

6

8

10

12

20

Kuru Ağırlık (g/L)

0,027

0,073

0,201

0,546

1,48

4,03

7,2

Ln kuru ağırlık

-3,612

-2,617

-1,604

-0,605

0,392

1,394

1,974

Ln kuru ağırlığa karşı zaman grafiğinin eğimi ................ dir.

0,5008 h-1

Maksimum spesifik büyüme hızı ise ......... dir. 0,5008 h-1

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

0 5 10 15 20 25Seri 1

Fermentasyon işlemi sonucunda aşağıdaki eşitlik elde edilmiştir

175 mg laktoz -----------> 100 mg laktat + 35 mg asetat + 45 mg hücre

Laktozdan hücre verimini hesaplayınız.

Laktozdan hücre verimi 45 mg hücre / 175 mg laktoz = 0,257 mg/mg

Lactobacillus casei ile glukozdan laktik asit üretilmektedir. Laktatın 1 g glukoz için ortalama verimi 0,9 dur. Kültür 1000 litrelik bir biyoreaktörde 20 saat tutulmaktadır.

Aşağıdaki verilere dayanarak mikroorganizmanın ürettiği laktatın son konsantrasyonunu ve kütlesini hesaplayınız.

Zaman (saat) 0 20

Glukoz (g/L) 200 25

Laktat (g/L) 10

Laktat (g)

167,5

10000 167500

Lag faz sırasında aşağıdaki olaylardan hangisi gerçekleşir?

a) Hücreler yeni protein ve membran sentezler

b) Hücreler direk bölünerek büyümeye başlar

c) Lag faz gerçekte yoktur. Bu evrede hücreler yavaşça büyür

d) Hücreler birbirlerini öldürmek için antibiyotik üretirler.

Kesikli kültür uygulamasında hücrelerin maksimum spesifik büyüme hızı (µm) nasıl belirlenebilir?

a) µm = ln (biyokütle) ye karşı zaman grafiğinin eğimi

b) µm = ln (biyokütle) ye karşı zaman grafiğinin log fazdaki

eğimi

c) µm = biyokütleye karşı zaman grafiğinin eğimi

d) µm = biyokütleye karşı zaman grafiğinin log fazdaki

eğimi

Kesikli bir fermentasyonda aşağıdaki bilgiler edinilmiştir.

Zaman (saat)

0

1

2

3

4

5

5,5

6

7

8

Biyokütle (g/L)

0,1

0,15

0,2

0,25

0,68

1,8

3,0

5,0

5,3

5,3

Substrat (g/L)

10,0

9,9

9,8

9,7

8,8

6,5

4,1

0,2

0

0

•Lag faz kaç saat sürmüştür?

•Spesifik büyüme hızını ve katlanma zamanını hesaplayınız.

• Biyokütle verimi (YXS) hesaplayınız.

ln(x/x0)=u*(t-t0) ln(5.0/0.25)=u*(6-3) u=1 hr-1

ln(2)/u = 0.69 hr Katlanma Zamanı =

Verim = (5.3-0.1 g biyokütle)/(10g substrat) = 0.52 g biyokütle/g substrat

Glukoz bazlı bir ortamda aşağıdaki parametreler elde edilmiştir

µm = 0.65 h-1

Ks = 0.05 g.l-1

Glukoz konsantrasyonuna karşı gelen spesifik büyüme hızını hesaplayınız

Glukoz (g/L)

0,01

0,1

0,5

1

20

90

µ h-1

0,108

0,433

0,591

0,619

0,648

0,650 S >>KS