Capitolo 3

La replicazione del DNA

Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A

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Domande 3

• Come avviene la replicazione del DNA?• Quali enzimi sono necessari?• I procarioti hanno poco DNA da replicare, gli eucarioti

tanto. Procedono allo stesso modo, o in modi differenti?

Figura 3.1

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Tre modelli di replicazione del DNA

Figura box 3.1

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Centrifugazione in CsCl per la separazione di molecole di diversa densità

Figura 3.2

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Meselson e Stahl 1958

La replicazione del DNA è semiconservativa

Colture di cellule di porcellino d’India

Aggiunta di 5-BUdR, analogo della timina, con minore tendenza a legarsi al colorante fluorescente

Due cicli di replicazione:

1.TT, TT TU, UT 2. TU, UT TU, UU

Cromosomi arlecchino

Prova citologica della replicazione semiconservativa

Tre fasi nella replicazione del DNA

1. Inizio2. Allungamento della catena3. Fine

Allungamento della catena: Le DNA Polimerasi

• Possono aggiungere un nucleotide all’estremità 3’ libera di una catena di acido nucleico, se dispongono di nucleotidi trifosfati

• Possono rimuovere un nucleotide all’estremità 3’ o 5’ di una catena di acido nucleico

• Non possono iniziare la replicazione se non dispongono di una catena con l’estremità 3’ libera

• Non possono legare fra loro due frammenti di DNA

Le DNA P di Escherichia coli

Nella replicazione di Escherichia coli

DNA stampo (elica singola) + primer + dATP, dCTP, dGTP, dTTP

una DNA polimerasi

DNA a doppia elica Energia di legame

5’---(n-nucl)---3’ + dXTP 5’---(n+1-nucl)---3’ + energia

La DNAP III:Allunga la doppia elica in direzione 5’—3’Controlla l’appaiamento fra basi, e se è imperfetto rimuove l’ultimo nucleotide aggiunto (attività proof-reading)La DNAP I:Degrada l’RNA nella doppia elica in direzione 5’—3’ Allunga la doppia elica, estendendo il frammento in direzione 5’—3’ e rimpiazzando l’RNA stampoLa DNA PII:ripara il DNA danneggiato

Figura 3.3

Allungamento della catena di DNA

Correzione di bozze: Meccanismo d’azione delle DNA P III batteriche (attività

esonucleasica 3’ → 5’)

Subunità Q

Figura 3.4

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•Proteina iniziatrice (DnaA)•SSB (single-strand binding proteins•Elicasi (DnaB e DnaC)•Primasi = RNA P

Inizio della replicazione

La replicazione del DNA inizia con la produzione di RNA

Inizio della replicazione: elica leading e elica lagging

La replicazione procede nelle due direzioni a partire dalla forcella

Frammenti di Okazaki

Durante la replicazione, la stessa elica è, in tratti diversi, leading e lagging

La “bolla replicativa”

Figura 3.5

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In sintesi:

Figura 3.9

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Filamento leading e filamento lagging occupano entrambe le eliche, in posizioni diverse

Figura 3.7

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Fine della replicazione: la ligasi

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Figura 3.6

Fine della replicazione

Figura 3.10

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Replicazione di cromosomi circolari

Nella foto: SV40

I superavvolgimenti sono un problema per la replicazione di cromosomi circolari

100 superavvolgimenti

Azione della topoisomerasi

https://www.youtube.com/watch?v=vA2itKIDPPo

Mechanism of Action of Topoisomerase UCSDhttps://www.youtube.com/watch?v=3QWA-tFdGN8

Schema dei passaggi enzimatici nella replicazione di E. coli

1. La topoisomerasi fa rilassare il filamento

2. La proteina iniziatrice si lega a ori-C

3. Due elicasi (una per ciascuna forca replicativa) denaturano e svolgono un tratto della doppia elica

4. Le single-strand binding proteins stabilizzano il DNA ad elica singola, senza coprire le basi

5. La RNA polimerasi (primasi) si lega all’elicasi e sintetizza un innesco di circa 30 paia di basi

6. La DNA P III lo estende da 5’ a 3’

7. Ad ogni passaggio la DNA P III rimuove gli appaiamenti sbagliati (proof-reading)

8. La DNA P I degrada l’innesco ed estende il frammento adiacente, procedendo da 5’ a 3’

9. La ligasi salda i filamenti adiacenti, senza aggiungere alcun nucleotide

Due eccezioni

ΦX174: DNA a singolo filamento

DNA P

DNA P

Due eccezioni

Mosaico del tabacco: RNADNA P*

* DNA polimerasi RNA dipendente! (trascrittasi inversa)

DNA P

Ciclo cellulare in Eucarioti e procarioti (ore)

Organismo M G1 S G2 Totale

E. coli 1Lievito 20’ 25’ 40’ 35’ 2Piante 1 8 12 8 29Uomo 1 8 10 5 24

Velocità di replicazione:E. coli: 50000 basi al minutoDrosophila: 2600 basi al minutoTopo: 2200 basi al minuto

Il genoma umano è circa 1000 volte più grande di quello di E. coli

Figura 3.13 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A

Negli Eucarioti, molte bolle di replicazione in ogni cromosoma

I cromosomi eucarioti sono lineari, non circolari

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Figura 3.14

Diverse regioni del cromosoma si replicano simultaneamente

Quando tutto il DNA è stato replicato, per legare fra loro i frammenti ci vuole la ligasi

La ligasi catalizza la formazione di un legame fosfodiestereo

Negli eucarioti superiori

DNA P α: sintesi del primerDNA P β: riparazione del DNA nucleareDNA P γ: replicazione, solo nei mitocondri DNA P δ: sintesi dell’elica laggingDNA P ε: sintesi dell’elica leading*

* Finora dimostrato solo nel lievito

SPECIE Dimens. genoma N repliconi velocità replicazione/min

E. coli: 4,2 Mb 1 50000

Drosophila: 140 Mb 3500 2600

Topo: 3200 Mb 25000 2200

In sintesi, negli eucarioti superiori

DNA Pε

DNA Pδ

E alla fine?

Figura 3.15

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TelomerasiLe regioni terminali dei cromosomi (telomeri) contengono sequenze ripetute:Ciliati (Tetrahymena): n(TTGGGG)Flagellati (Trypanosoma), uomo: n(TTAGGG)

L’enzima telomerasi contiene un tratto di RNA complementare alla sequenza ripetuta e lo usa come primer per replicare l’estremità telomerica 5’: è unaDNA P – RNA dipendente

Carol Greider

Figura 3.16Peter J Russell, Genetica © 2010

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Come funziona la telomerasi

Come funziona la telomerasi

Figura 3.17 Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A

Ma ancora non è finita: si raddoppiano anche i nucleosomi

Negli eucarioti, sintesi e

degradazione di cicline, prodotte da

geni-orologio regolano il ciclo

cellulare

Riassunto 3• La replicazione del DNA è semiconservativa: un’elica serve da

stampo e viene mantenuta invariata, l’altra viene sintetizzata ex novo.

• La replicazione richiede l’intervento di enzimi: RNA e DNA polimerasi, ligasi, elicasi e topoisomerasi, e di altre proteine

• Nei procarioti la replicazione procede da un unico punto iniziale, negli eucarioti ciascun cromosoma ha varie origini di replicazione da cui iniziano sintesi simultanee; in questo modo, un insieme di enzimi complessivamente più lento riesce a ridurre i tempi di replicazione del DNA eucariote.

• Nella replicazione dei genomi lineari, ha un ruolo importante la telomerasi