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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

Evaluación bacteriológica de leche cruda, sometida a tres concentraciones de

ozono, mediante su comprobación microbiológica en placas petrifilm.

Trabajo de titulación presentado como requisito previo a la obtención del

Título de Médico Veterinario Zootecnista.

Autor:

Alex Wladimir Soque Díaz

Tutor:

Dr. Jorge Adalberto Mosquera Andrade

Quito, mayo 2019

i

© DERECHOS DE AUTOR

Yo, Alex Wladimir Soque Díaz en calidad de autor y titular de los derechos

morales y patrimoniales del trabajo de titulación “EVALUACIÓN

BACTERIOLÓGICA DE LECHE CRUDA, SOMETIDA A TRES

CONCENTRACIONES DE OZONO, MEDIANTE SU COMPROBACIÓN

MICROBIOLÓGICA EN PLACAS PETRIFILM”, modalidad presencial.

Proyectos de investigación, de conformidad con el Art. 114 del CÓDIGO

ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS CONOCIMIENTOS,

CREATIVIDAD E INNOVACIÓN, concedo a favor de la Universidad Central

del Ecuador una licencia gratuita, intransferible y no exclusiva para el uso no

comercial de la obra, con fines estrictamente académicos. Conservo a mi favor

todos los derechos de autor sobre la obra, establecidos en la normativa citada.

Así mismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la

digitalización y publicación de este trabajo de titulación en el repositorio virtual,

de conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación

Superior.

El autor declara que la obra objeto de la presente autorización es original en

su forma de expresión y no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo

la responsabilidad por cualquier reclamación que pudiera presentarse por esta

causa y liberando a la Universidad de toda responsabilidad.

Firma:

Alex Wladimir Soque Díaz

C.I.: 1723712780 Dirección electrónica: [email protected]

ii

INFORME DE APROBACIÓN DEL TUTOR

En mi carácter de Tutor del Trabajo de Grado, presentado por el señor ALEX

WLADIMIR SOQUE DIAZ, para optar por el Título de Médico Veterinario y

Zootecnista, cuyo título es: “EVALUACIÓN BACTERIOLÓGICA DE LECHE

CRUDA, SOMETIDA A TRES CONCENTRACIONES DE OZONO,

MEDIANTE SU COMPROBACIÓN MICROBIOLÓGICA EN PLACAS

PETRIFILM”. Considero que dicho trabajo, reúne los requisitos y méritos

suficientes para ser sometido a la presentación pública y evaluación por parte del

tribunal examinador que se designe.

En la ciudad de Quito, a los 22 días del mes de abril del 2019.

Dr. Jorge Adalberto Mosquera Andrade

C.I.: 1702609197

E-mail: [email protected]

iii

APROBACIÓN DE LA PRESENTACIÓN ORAL/TRIBUNAL

El tribunal constituido por:

Dr. Byron Puga, Dra. María Inés Baquero y Dra. Martha Naranjo.

Luego de aceptar la presentación oral del trabajo de titulación previo a la

obtención del título (o grado académico) de Médico Veterinario Zootecnista

presentado por el señor Alex Wladimir Soque Díaz.

Con título:

“EVALUACIÓN BACTERIOLÓGICA DE LECHE CRUDA, SOMETIDA A TRES


MICROBIOLÓGICA EN PLACAS PETRIFILM”.

Emiten el siguiente veredicto (aprobado/reprobado)

Fecha

Para constancia de lo actuado firman:

Nombre y Apellido Calificación Firma

Presidente Dr. Byron Puga

Vocal Principal Dra. María Inés Baquero

Vocal Principal Dra. Martha Naranjo

iv

DEDICATORIA

“Te he mandado que seas fuerte y valiente. No tengas, pues, miedo ni te

acobardes, porque el Señor tu Dios estará contigo dondequiera que vayas.” Josué 1:9

Gracias Señor Dios por permitirme cumplir mis sueños y guiar mis pasos bajo tu guía

y protección.

A mis padres Inés y Apolinario por todo el cariño y entrega, además de enseñarme

que la honestidad, la humildad y el amor son las armas más poderosas para enfrentar

las adversidades del mundo.

A mis hermanos Leonardo, Boris, Eduardo; a mi cuñada Flor Catalina y a mi sobrina

Sofía.

A todos ellos, mi familia, mis mejores amigos, el mejor regalo que Dios me dio. Ellos

que siempre han creído en mí. Muchas gracias.

Alex Soque Díaz

v

RECONOCIMIENTO

Quiero iniciar mencionando a la Universidad Central del Ecuador y a la Facultad de

Medicina Veterinaria y Zootecnia por permitirme realizar mis estudios.

Al Laboratorio de Bacteriología y Micología de la Facultad de Medicina Veterinaria y

Zootecnia por haberme prestado las facilidades para realizar la fase experimental de

este estudio.

Un reconocimiento especial al Doctor Jorge Mosquera por concederme la confianza

para realizar este proyecto, por toda su paciencia y la orientación durante el desarrollo

del mismo.

A la Doctora María Inés Baquero un reconocimiento por toda la colaboración, las

enseñanzas y el apoyo brindado durante la realización de mi tesis.

Al Proyecto Semilla “Efecto del ozono en leche en la disminución de carga bacteriana

y el mantenimiento de sus propiedades físico químicas” por permitirme ser parte del

mismo.

Y a todas las personas, amigos, compañeros de estudio, profesores, que de alguna

manera me brindaron su apoyo durante la realización de este proyecto, muchas

gracias a todos.

Alex Soque Díaz

vi

ÍNDICE GENERAL

RESUMEN ................................................................................................................... x

ABSTRACT ................................................................................................................. xi

CAPÍTULO I ................................................................................................................ 1

INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 1

CAPÍTULO II ............................................................................................................... 4

OBJETIVOS ............................................................................................................. 4

GENERAL ............................................................................................................. 4

ESPECÍFICOS ...................................................................................................... 4

CAPÍTULO III .............................................................................................................. 5

MARCO TEÓRICO .................................................................................................. 5

Generalidades ...................................................................................................... 5

Ozono ................................................................................................................... 5

Síntesis y Estructura Molecular del Ozono ........................................................... 6

Características físico-químicas del ozono ............................................................. 8

Principios del Tratamiento con Ozono .................................................................. 9

Equipamiento para el tratamiento de ozono de los alimentos ............................... 9

Ozono en Estado Acuoso ..................................................................................... 9

Ozono en Estado Gaseoso ................................................................................... 9

Ventajas y Desventajas de la Ozonoterapia ....................................................... 10

Mecanismo de Acción Antimicrobiana del Ozono ............................................... 11

Uso de petrifilm en el análisis microbiológico de alimentos ................................ 11

CAPÍTULO IV ............................................................................................................ 14

MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................. 14

vii

Materiales ........................................................................................................... 14

Metodología ........................................................................................................... 17

Lugar de Estudio ................................................................................................. 17

Tipo de Investigación .......................................................................................... 17

Ozono y Tratamientos......................................................................................... 17

Muestreo ............................................................................................................. 19

Análisis Microbiológico........................................................................................ 19

Análisis Estadístico ............................................................................................. 19

CAPÍTULO V ............................................................................................................. 20

RESULTADOS Y DISCUSIÓN .............................................................................. 20

Correlación estadística entre concentración (tiempo-dosis) y reducción del

recuento microbiano ........................................................................................... 25

Discusión ............................................................................................................ 25

ANÁLISIS DE COSTOS PARCIALES .................................................................... 28

CAPÍTULO VI ............................................................................................................ 31

CONCLUSIONES .................................................................................................. 31

CAPÍTULO VII ........................................................................................................... 32

BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................... 32

ANEXOS ................................................................................................................... 42

viii

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Breve reseña de logros y certificaciones alcanzadas por el ozono. .............. 6

Tabla 2.Características físico-químicas del ozono ...................................................... 8

Tabla 3.Materiales biológicos utilizados en la fase de campo. .................................. 14

Tabla 4.Materiales químicos empleados en la fase de campo. ................................. 14

Tabla 5.Materiales físicos utilizados en la fase de campo. ........................................ 14

Tabla 6. Materiales químicos utilizados durante la fase de laboratorio del estudio. .. 15

Tabla 7.Materiales físicos utilizados durante la experimentación en el laboratorio. .. 15

Tabla 8.Implementos y suministros adicionales durante la ejecución del estudio. .... 16

Tabla 9.Lista de equipos empleados durante la realización del estudio. ................... 16

Tabla 10.Tipos de tratamientos según la dosis de ozono y el tiempo de exposición. 18

Tabla 11.Recuentos microbianos (Log10 UFC/ml) observados en leche cruda y leche

tratada con ozono según dosis y tiempo de exposición. ........................................... 22

Tabla 12: Comparación de los resultados de T9 (Log10 UFC/ml) con los parámetros

establecidos en la Norma NTE INEN 10 Leche pasteurizada. Requisitos ................ 23

Tabla 13.Recuentos microbianos (Log10 UFC/ml) observados en leche cruda y leche

tratada con ozono (T9), leche hervida y leche UHT .................................................. 23

Tabla 14.Valores de “p” para cada recuento, tras la comparación de T9 con la leche

hervida, T9 con la leche UHT y T9 con el testigo (leche cruda). ............................... 24

Tabla 15. Análisis de costos parciales del tratamiento testigo. ................................. 28

Tabla 16. Análisis de costos parciales por tratamientos experimentales. ................. 28

Tabla 17. Análisis de costos parciales de la leche pasteurizada UHT. ..................... 29

Tabla 18. Análisis de costos parciales de la leche hervida ....................................... 29

Tabla 19. Comparación de costos entre el testigo, la leche hervida, la leche

pasteurizada UHT y el tratamiento de ozono (T9). .................................................... 29

ix

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. . Reacción química a partir de la molécula de oxígeno para generar ozono. 7

Figura 2. Molécula de ozono. ...................................................................................... 7

Figura 3.Diferencias en la carga bacteriana de la leche tras la aplicación de

ozonización. .............................................................................................................. 20

Figura 4. Diferencias en la carga bacteriana de la leche, donde a la dosis más alta se

llegó a un valor de 0 para coliformes totales. ............................................................ 21

Figura 5. Diferencias en la carga bacteriana de Escherichia coli donde a la dosis más

alta se llegó a un valor de 0....................................................................................... 21

Figura 6. Comparación de resultados de los tres distintos tratamientos en estudio. . 24

x

TEMA: “EVALUACIÓN BACTERIOLÓGICA DE LECHE CRUDA, SOMETIDA A TRES


MICROBIOLÓGICA EN PLACAS PETRIFILM”.

Autor: Alex Wladimir Soque Díaz

Tutor: Jorge Adalberto Mosquera Andrade

Fecha: Mayo 2019

RESUMEN

La presente investigación tuvo como objetivo determinar el efecto del ozono en la

disminución de la carga bacteriana presente en la leche cruda.

Las distintas muestras de leche cruda recolectadas fueron sometidas a cultivo antes y

después de la aplicación de ozono a dosis de 50, 75 y 100 mg/l durante 10, 20 y 30

minutos. Además, se cultivaron muestras de leche sometida a ebullición y

ultrapasteurizada. La eficacia del ozono fue evaluada al cuantificar la carga microbiana

de mesófilos aerobios totales, coliformes totales, Escherichia coli, Listeria

monocytogenes y Salmonella spp.

En la leche control (sin tratamiento), el conteo de mesófilos aerobios totales fue 3,90

Log10UFC/ml; 3,68 Log10UFC/ml para coliformes totales y 3,67 Log10UFC/ml para

Escherichia coli; no se demostró crecimiento de Listeria monocytogenes y Salmonella

spp. El tratamiento con 100 mg de O3 por 30 minutos redujo la población de mesófilos

aerobios totales a 1,37 Log10UFC/ml y a 0 Log10UFC/ml en coliformes totales y

Escherichia coli. La leche hervida mostró recuentos bacterianos más altos que la leche

UHT y la leche ozonizada (T9). La leche UHT presentó niveles de mesófilos aerobios

totales más altos (p≥ 0.05) en relación a las muestras de leche tratadas con ozono.

En conclusión, la ozonización fue efectiva para disminuir la carga bacteriana en leche

cruda.

PALABRAS CLAVE: LECHE, OZONO, TRATAMIENTO CON OZONO, CALIDAD

MICROBIOLÓGICA

xi

TITLE: “BACTERIOLOGICAL ASSESSMENT OF RAW MILK, AGAINST THREE OZONE CONCETRATION, USING MICROBIOLOGICAL CHECKING ON PETRIFILM PLATES”.

Author: Alex Wladimir Soque Diaz Tutor: Jorge Adalberto Mosquera Andrade

Date: May 2019

ABSTRACT

The present research work has as its main objective to determine the effect

of ozone in the decrease of bacterial burden existing in raw milk.

The different samples of raw milk collected were put into culture before and after of application of

ozone in different dosages: 50, 75 and 100 mg/I during 10, 20 and 30 minutes. In addition,

samples of milk to boiling point and ultra pasteurised were cultured. The efficacy of ozone was

assessed when quantifying microbial burden of total mesophilic aerobic, total coliforms,

Escherichia coli, Listeria monocytogenes and Salmonella spp.

In the control milk (no treatment), a count of total mesophilic aerobic was 3.90 Log10 UFC/ml; 3.68

Log10 UFC/ml for total coliforms and 3.67 Log10 UFC/mI for Escherichia coli; no development of

Listeria monocytogenes and Salmonella spp was shown. The treatment with 100 mg of O3 for 30

minutes reduced population of total mesophilic aerobic to 1.37 Log10 UFC/ml and 0 Log10

UFC/ml in total coliforms and Escherichia coli. Boiled milk showed higher bacterial

count than UHT milk and ozonised milk (T9). UHT milk presented higher levels of

mesophilic aerobic (p>0.05) in comparison with the samples of milk with ozone.

In conclusion, ozonation was efective at diminishing bacterial burden in raw milk.

KEY WORDS: MILK, OZONE, TREATMENT WITH OZONE, MICROBIOLOGICAL QUALITY.

El Centro Educacional de Idiomas y Especializaciones Administrativas CENDIA C.A certifica, mediante firma del traductor y sello de la institución, haber realizado la traducción del presente documento.

1

CAPÍTULO I

INTRODUCCIÓN

Según la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura

(FAO), la producción mundial de leche alcanzó los 833,5 millones de toneladas para

el año 2017 (FAO, 2017). En Ecuador, de acuerdo a datos de la Encuesta de Superficie

y Producción Agropecuaria Continua, la producción láctea para el año 2017 fue de

5,135 millones de litros/día (INEC- ESPAC, 2017). La Asociación de Ganaderos de la

Sierra y Oriente establece que, a nivel nacional, se consumen de 90 a 100 l/año/per

capita de leche y productos derivados (AGSO, 2019).

La leche es un alimento con alto grado de nutrientes; posee una consistencia líquida y

un pH ligeramente ácido (Moncada, 2011), características que la convierten en un

medio ideal para el crecimiento de microorganismos (Dahmer et al., 2007). La Norma

Técnica Ecuatoriana del Instituto Nacional de Normalización NTE INEN 9 “Leche

Cruda. Requisitos”, define a la leche cruda como aquella que no fue sometida a una

temperatura superior a 40°C, estableciendo como límite máximo un recuento de

microorganismos aerobios mesófilos de 1,5x106 UFC/ml (INEN, 2012). En el caso de

leche pasteurizada, la norma NTE INEN 10 “Leche Pasteurizada. Requisitos”

establece un índice máximo permisible de buena calidad estimado en 3x104 UFC/ml

de microorganismos aerobios mesófilos (INEN, 2012). Y para la leche larga vida, la

normativa NTE INEN 701 “Leche Larga Vida. Requisistos” establece como límite

máximo la presencia de hasta 10 colonias UFC/ml para ser declarada como leche

comercialmente estéril (INEN, 2009).

Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA), por lo general, son de tipo

infeccioso o tóxico, ocasionadas por bacterias, virus, parásitos o sustancias químicas

contaminantes que pueden contener los productos finales o las materias primas, como

es la leche cruda (OMS, 2016). En este sentido, y para garantizar el consumo de

productos seguros e inocuos, la industria alimenticia ha investigado diversos procesos

2

que contrarresten a estos agentes microbianos, entre ellos el uso de ozono (Perry &

Yousef, 2011).

El procesamiento de la leche es esencial para asegurar su inocuidad y extender su

vida útil, siendo la pasteurización el tratamiento térmico más usado. Los tratamientos

térmicos han influenciado sobre propiedades nutricionales como la proteína del suero

y el contenido de vitaminas de la leche, debido a que son componentes muy

termolábiles. Además de causar cambios en la viscosidad y sabor de la misma (Lopes

et al., 2016; Mejía-López et al., 2017).

Debido a este impacto negativo sobre la calidad nutricional de la leche, han emergido

nuevas técnicas y procedimientos no térmicos que buscan un producto de calidad

(Lopes et al., 2016)

El ozono es un desinfectante de rápida acción, cuyo efecto se basa en la oxidación

que se produce en ácidos grasos polinsaturados que constituyen parte de la pared

celular, provocando una pérdida de la permeabilidad selectiva y posterior disrupción

celular (Cavalcante et al., 2013), ocasionando la inactivación de bacterias, células

vegetativas y esporuladas, levaduras, mohos y virus (Pretell et al., 2016). En el caso

de micotoxinas (aflatoxinas), el ozono reacciona sobre el enlace C8-C9 del anillo de

furano, produciendo aldehídos, cetonas y CO2 (Diao et al., 2013). Esto, sumado a su

alta capacidad de difusión en la materia orgánica (hasta 3000 veces más rápida que

el cloro), lo convierte en una estrategia a considerar en la obtención de alimentos

inocuos (Patil et al, 2009).

Estudios experimentales previos demuestran la efectividad del ozono aplicado por

burbujeo sobre bacterias psicrófilas, enterobacterias y Staphylococcus (Cavalcante et

al., 2013; Mariaselvam & Muthukumar, 2011; Varga & Szigeti, 2016). No se dispone

información sobre la aplicación directa del ozono en el tanque de leche que será

transportada al centro de acopio. La Food and Drug Administration (FDA) no estipula

una dosis máxima de ozono que pueda ser aplicada a los alimentos, sin embargo

afirma su actividad microbiológica efectiva permitiendo su uso, siempre y cuando no

altere la composición del alimento tratado o ponga en riesgo al medio ambiente o al

3

operario (FDA, 2001). Las dosis establecidas en este estudio se direccionaron al

cumplimiento bacteriológico de la leche pasteurizada, acordes a la normativa técnica

ecuatoriana NTE INEN 10 “Leche Pasteurizada. Requisitos” (INEN, 2012).

La presente investigación se realizó con el objetivo de evaluar bacteriológicamente la

leche cruda antes y después de ser sometida directamente a la acción desinfectante

del ozono, con el antecedente de no existir una investigación similar documentada en

el Ecuador.

4

CAPÍTULO II

OBJETIVOS

GENERAL

Evaluar bacteriológicamente la leche cruda tras ser sometida a tres

concentraciones y tres tiempos de ozono mediante su comprobación

microbiológica.

ESPECÍFICOS

Determinar a qué concentración de ozono le corresponde la mayor acción

antibacteriana en leche cruda.

Determinar cuál periodo de exposición al ozono posee la más alta eficacia

contra las bacterias en la leche cruda.

5

CAPÍTULO III

MARCO TEÓRICO

Generalidades

La leche al ser de naturaleza líquida, con alto grado de contenido de agua, y con un

pH cercano a la neutralidad convierten a la leche en el medio propicio para el

desarrollo de diversos microorganismos que ocasionan su temprana descomposición,

además de ocasionar posibles intoxicaciones en los consumidores (Sarkar, 2016).

Ozono

La contaminación alimentaria se ha constituido en uno de los problemas más latentes

dentro de la industria de alimentos, problema que requiere un continuo control en cada

paso dentro de la cadena de producción. El ozono ha sido usado como agente

descontaminante para controlar y eliminar la presencia de microorganismos en los

alimentos (Brodowska et al., 2018).

El ozono fue descubierto por Schönbein en 1839, quien observó que la electrólisis del

agua producía un gas con olor. El primer uso comercial que se le dio al ozono fue como

desinfectante de agua destinada al consumo humano en Francia a inicios del siglo XX

(Bocci, 2011).

6

Tabla 1. Breve reseña de logros y certificaciones alcanzadas por el ozono.

Año Suceso

1839 Ozono descubierto por Schönbein

1886 Se reconoce la acción desinfectante del ozono sobre agua contaminada en Europa

1891 Pruebas positivas contra bacterias en Alemania

1895 Soret determina la fórmula molecular del ozono

1906 Francia inaugura la primera planta de tratamiento de agua a base de ozono

1909 El ozono es utilizado para preservar carne en Alemania

1939 El ozono previene el crecimiento de mohos y levaduras durante el almacenamiento de frutas

1970 El ozono es usado para el control de algas en Francia

1982 US FDA otorga el estatus de GRAS al ozono

1997 se declara al ozono como seguro para su contacto directo con alimentos

2001 FDA aprueba el uso de ozono en la cadena de procesamiento de alimentos, como agente antimicrobiano o aditivo

2004 La FDA proporciona una guía de recomendaciones para el uso de ozono con propósito de reducción de patógenos en jugo de manzana o cidra

Fuente (Donnell & Cullen, 2012)

Síntesis y Estructura Molecular del Ozono

El ozono es una molécula triatómica de oxígeno, cuya estructura molecular le

proporciona un alto poder oxidativo (Bocci, 2011; Sun et al., 2014) Durante la síntesis

de la molécula de ozono, la molécula de oxígeno se divide en dos átomos no

apareados de oxígeno (radicales libres), cada uno de los cuales ocupa una órbita 2p.

Este átomo de oxígeno que contiene un par no emparejado (radical libre) se combina

con una molécula de oxígeno para conformar la estructura del ozono (Donnell & Cullen,

2012).

7

Figura 1. . Reacción química a partir de la molécula de oxígeno para generar ozono. Fuente: (Manoj Kumar & Sabikhi, 2019)

Figura 2. Molécula de ozono. Fuente: (Donnell & Cullen, 2012)

8

Características físico-químicas del ozono

Tabla 2.Características físico-químicas del ozono

Características

Color o Azul (generado del aire) o Incoloro (generado de oxígeno puro) o Azul oscuro (fase líquida)

Olor Acre

Punto de fusión -192.5 ± 0.4°C

Punto de ebullición -119.9 ± 0.3°C

Temperatura crítica -12.1°C

Presión crítica 54.6 atm

Densidad 2.14 g/L a 0°C

Potencial óxido-reducción 2.07 V

Peso molecular g/mol 47.9982

Solubilidad en agua, ppm a 20°C 3

Calor de formación KJ/mol 144.7

Gravedad específica 1.658

Fuente: (Manoj Kumar & Sabikhi, 2019)

Un gran número de investigadores han llegado a comprobar, a través de la

experimentación, las propiedades y aplicaciones el ozono sobre todo tipo de alimentos

(desde frutas, vegetales, especies, carne cruda, mariscos, bebidas, etc.) (Brodowska

et al., 2018).

El uso de ozono es uno entre muchos procedimientos que contribuyen al mejoramiento

de la inocuidad y la calidad de los alimentos (Freitas-Silva & Souza, 2016).

El tratamiento de ozono u ozonoterapia sobre los alimentos es un método químico en

el cual muestras de alimentos contaminados son expuestas ante el ozono en su fase

acuosa o en su fase gaseosa (Brodowska et al., 2018).

Los efectos bactericidas del ozono han sido demostrados sobre una amplia variedad

de bacterias Gram negativas y Gram positivas, así como esporas bacterianas

(Pandiselvam et al., 2019).

La aplicación de ozono mejora la calidad microbiológica de los productos alimenticios

sin cambios sustanciales en sus propiedades nutricionales, químicas y físicas (Freitas-

Silva & Souza, 2016).

9

Principios del Tratamiento con Ozono

Existen diferentes formas por las que el ozono puede ser producido. Este compuesto

puede ser generado por la exposición de oxígeno a una fuente de energía como un

campo eléctrico de alta energía (método de la corona de descarga), radiación

ultravioleta (método fitoquímico) o la conversión de moléculas de oxígeno O2 a ozono

O3 (método químico) (Srinath.D et al., 2017). Otros métodos de generación de ozono

incluyen la electrolisis, la reacción elemental del fósforo con agua y la producción

radioquímica; pero estos últimos procedimientos se encuentran aún en fases de

desarrollo y su relación costo beneficio es negativa (Fukui et al., 2014)

Equipamiento para el tratamiento de ozono de los alimentos

Para la aplicación de ozono se puede utilizar en su fase gaseosa o en su fase acuosa.

En la práctica, los sistemas de ozonoterapia poseen algunos componentes básicos:

gas (oxígeno puro o aire), un generador de ozono, una fuente de energía eléctrica, un

reactor, una unidad de eliminación de gas y un analizador de ozono (Sharma, 2008).

Ozono en Estado Acuoso

Con el principal objetivo de purificar y desinfectar agua, se ha utilizado soluciones de

ozono a distintas concentraciones (Brodowska et al., 2018).

La degradación del ozono disuelto en agua es mucho más veloz que cuando se

encuentra disuelto en oxígeno o en el aire (Srinath D. et al., 2017).

Los principales factores que afectan la solubilidad del ozono con el agua son el pH, la

temperatura y la calidad del agua (pureza) (Brodowska et al., 2018).

Ozono en Estado Gaseoso

El ozono en estado gaseoso es relativamente más estable que en su estado acuoso.

Esta estabilidad puede verse afectada por factores como la concentración de ozono,

la temperatura, la presión, la presencia de contaminantes y catálisis (Brodowska et al.,

2018). Al contrario con su fase acuosa, el ozono gaseoso posee una vida media más

prolongada (Donnell & Cullen, 2012).

10

Está documentada la eficacia del ozono en su forma gaseosa como agente

antimicrobiano en el empaque y almacenamiento de alimentos (James et al, 2002). Su

acción ha sido comprobada contra Salmonella infatis y Pseudomona aeruginosa en

carcasas de pollo (Al-Haddad et al, 2005). Además, es eficaz contra residuos de

fungicidas en la producción de vino (Karaca et al, 2012) y su acción antimicrobiana en

frutas tales como melón (Marı, 2008), arándanos (Varese et al, 2015), higos secos

(Kırog, 2006) y uvas (Saavedra et al, 2016). La eficiencia antibacteriana del ozono en

solución acuosa fue investigada en productos como el pimiento rojo, berros y fresas

(Alexandre et al, 2011).

Ventajas y Desventajas de la Ozonoterapia

Ventajas

Está libre de residuos químicos. Al contrario de métodos como el uso de cloro, el

cual al reaccionar con material orgánico forma residuos potencialmente peligrosos

(trihalometanos) (Trindade et al., 2012)

Puede ser aplicado en todo tipo de alimentos (vegetales, carne, agua, bebidas,

etc.)

Es efectivo sobre alimentos frescos y conservados (congelados).

No altera el aspecto visual, las propiedades físicas (textura) y la calidad nutricional

de los alimentos.

Es una tecnología amigable con el medio ambiente y en constante mejoramiento.

(Brodowska et al., 2018)

Desventajas

Diversos niveles de sensibilidad de microorganismos ante el ozono.

La efectividad de la terapia depende de la dosis adecuada de ozono.

Al ser inestable en solución acuosa, su acción es inhibida por la presencia de

pesticidas o solventes clorados.

Aún no es económicamente viable.

La percepción del consumidor ante productos tratados con ozono.

11

(Brodowska et al., 2018)

Mecanismo de Acción Antimicrobiana del Ozono

El ozono posee un amplio espectro de actividades antimicrobianas, el cual es el

resultado del poder oxidante de los radicales libres, producto de su degradación. Estos

radicales son hidroxil, hidroperoxi y superóxido; sin embargo, se declara al ozono

molecular como el principal inactivador de microorganismos (Brodowska et al., 2018;

Donnell & Cullen, 2012).

La inactivación bacteriana durante el tratamiento con ozono es un proceso complejo

debido a que el ozono ataca a los constituyentes de la membrana celular (proteínas,

enzimas respiratorias y lípidos insaturados), la pared celular (peptidoglicanos), el

citoplasma (enzimas y ácidos nucleicos), esporas y cápsides víricas (Brodowska et al.,

2018; Manoj Kumar & Sabikhi, 2019).

La mayoría de investigadores han llegado a señalar que existen dos posibles

mecanismos de la acción antimicrobiana del ozono:

Oxidación de los grupos sulfhidrilo y aminoácidos (enzimas y proteínas) para

producir péptidos más pequeños, durante la exposición al ozono.

Oxidación de los ácidos grasos poliinsaturados en ácidos peróxidos.

La acción sobre las células bacterias constituye un proceso secuencial donde el daño

superficial va seguido de la formación de poros en la pared celular, la membrana

celular expulsa material al exterior y permite el ingreso de agua, ocasionando un

agrandamiento, por lo que se produce una destrucción de los ácidos nucleicos y la

posterior muerte celular (Brodowska et al., 2018; Donnell & Cullen, 2012; Manoj Kumar

& Sabikhi, 2019).

Uso de petrifilm en el análisis microbiológico de alimentos

El aseguramiento de la calidad e inocuidad de los alimentos se ha constituido en un

desafío a nivel mundial, por tanto, el análisis frecuente de alimentos en laboratorios

analíticos juega un papel significante. Analizar los alimentos dentro de parámetros

microbiológicos es de vital importancia para determinar la calidad e higiene de los

productos (IOM & NCR, 2010).

12

Dentro del análisis microbiológico de los alimentos, las técnicas convencionales son

consideradas laboriosas (Spanu et al., 2014) y envuelven una serie de procedimientos

entre los cuales tenemos la rehidratación del medio de cultivo, la esterilización del

equipo, la preparación de la muestra, la inoculación en los medios de cultivo y la

incubación a una temperatura y tiempo determinados (Perkins, 2016).

Los petrifilms son productos que permiten la cuantificación de cepas bacterianas

viables. Los cuales están compuestos de películas recubiertas de nutrientes (medio de

cultivo), agentes gelidificantes solubles en agua fría y un indicador de tetrazolium para

su fácil interpretación (Fritz et al., 2015). La Association of Official Analytical Chemists

(AOAC International) validó el sistema petrifilm dentro de la implementación de

tecnologías alternativas para la cuantificación de bacterias. Además de recomendar su

utilización por fácil uso y su alta eficiencia (Nelson et al., 2013). El sistema petrifilm

suprime la necesidad de preparación de medios tradicionales, anteriormente usados

en técnicas de enumeración de microorganismos (Shen & Zhang, 2017).

La capacidad del sistema petrifilm fue comparada ante los medios tradicionales en un

estudio donde se buscaba aislar colonias de Escherichia coli, coliformes totales y

contaje de aerobios totales, en muestras de leche en polvo, carne de pollo y leche de

fórmula (Lakmini & Madhujith, 2012).

Dentro de la industria láctea, el método petrifilm ha demostrado su efectividad en

aislamiento de microorganismos coliformes en muestras de yogurt griego (Hervert el

al, 2016). De la misma manera, Souza demostró la efectividad del sistema petrifilm

frente a los métodos tradicionales, buscando aislar cepas de Staphylococcus aureus,

Escherichia coli y coliformes totales, en muestras de leche de oveja (Souza et al, 2015).

Viçosa et al (2010) lograron determinar la presencia de Staphylococcus aureus en la

leche cruda de bovinos, tras analizarla a través del sistema petrifilm.

En el año 2014, Bird demostró la capacidad de este sistema al lograr aislar e identificar

cepas de Salmonella spp. en muestras de carne cruda de res, carne cruda de pollo,

carne cruda de cerdo, huevos pasteurizados, nuggets de pollo, camarones, espinacas

13

y alimento balanceado de perro, las que fueron inoculadas experimentalmente con

esta cepa bacteriana (Bird et al., 2014).

En la Universidad de Minnesota, con el sistema petrifilm se logró determinar la

presencia de Staphylococcus aureus y Streptococcus spp., en muestras de leche

mastítica (McCarron et al., 2009)

Además, se demostró la efectividad de este sistema al detectar infecciones

intramamarias en vacas al final del periodo de lactancia (Cameron et al., 2013).

En el 2016, Hervert comparó distintos métodos para la detección de microrganismos

de importancia sanitaria (Escherichia coli y coliformes), dentro de la industria de

procesamiento de alimentos, dando como resultado una alta eficiencia por parte del

sistema petrifilm (Hervert et al., 2016).

También, se ha comprobado su capacidad de aislar cepas de Escherichia coli, tras el

análisis de carcasas de cerdo y cordero luego del faenamiento (Hauge et al., 2017),

así como se ha logrado su eficacia en el análisis de balanceado destinado a la crianza

de pollos broiler (Pinto, 2018).

14

CAPÍTULO IV

MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales

De Campo

Tabla 3.Materiales biológicos utilizados en la fase de campo.

Materiales Biológicos

Leche cruda de vaca Agua

Tabla 4.Materiales químicos empleados en la fase de campo.

Materiales Químicos

Alcohol gel Oxígeno (gas)

Tabla 5.Materiales físicos utilizados en la fase de campo.

Materiales Físicos

Mandil Gel Refrigerante

Cubrebocas Recipientes contenedores

Cofias Mangueras

Guantes Frascos estériles para

recolectar muestras de

leche

Botas

Cooler

15

De Laboratorio

Tabla 6. Materiales químicos utilizados durante la fase de laboratorio del estudio.

Materiales Químicos

Placas 3M™ Petrifilm™ para control

de Listeria ambiental

3M™ Suplemento para Enriquecimiento

de Salmonella

Placas 3M™ Petrifilm™ para

Recuento de Aerobios

TSI® (Triple Sugar Iron Agar. BIORAD.

Lote: 1M112. (Francia)

Caldo Urea MERCK

Placas 3M™ Petrifilm™ para

recuento de E. coli y Coliformes

Reactivo de Kovacs

Buffered Peptone Water DIFCO

Placas 3M™ Petrifilm™ Salmonella

Express SALX

Lysine iron agar DIFCO

SIM (Sulfuro Indol Motilidad). DIFCO.

3M™ Base para Enriquecimiento de

Salmonella

Tabla 7.Materiales físicos utilizados durante la experimentación en el laboratorio.

Materiales Físicos

Guantes de Látex M Gradilla plástica

Dispersor 3M™ Petrifilm™ para placas Matraz Erlenmeyer 500 ml

Asa metálica Hisopos estériles

Fundas plásticas estériles Vaso de precipitación

16

Suministros de Oficina

Tabla 8.Implementos y suministros adicionales durante la ejecución del estudio.

Lista de Implementos

Computadora portátil

Cuaderno de 100 hojas empastado

Esferográfico

Internet

Marcador permanente punta fina Faber-Castell

Marcador permanente punta gruesa Faber-Castell

Etiquetas adhesivas

Equipos

Tabla 9.Lista de equipos empleados durante la realización del estudio.

Equipos e Instrumental

Generador de 6 gramos de Ozono (Ozonizador)

Destilador de agua, Modelo Elit-3 Marca Barnstead Water Still

Micropipeta Incubadora de convección forzada 42 °C

Autoclave, Modelo SIM-E. Serie 058592, Markel Forge

Incubadora 37 °C

Balanza electrónica, Boeco Germany BLC 500

Rerigeradora Durex RDE

Cámara de flujo laminar con filtros HEPA: Biological Hazard Biobase Midcis Precision Scientific CO PS. Modelo BSC-15011 A2-X Marca Biobase

Vortex marca Heidolph

17

Metodología

Lugar de Estudio

La fase de campo, donde se obtuvieron las muestras fueron de la hacienda “El

Carmen” ubicada en la provincia de Pichincha, Cantón Quito, Parroquia de Amaguaña,

sector Yanahuayco.

El presente ensayo se llevó a cabo en el Laboratorio de Bacteriología y Micología,

perteneciente a la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad

Central del Ecuador, ubicado en la ciudad de Quito en la calle Jerónimo Leyton s/n y

Gatto Sobral, ciudadela universitaria.

Tipo de Investigación

El estudio fue determinado con un diseño experimental, longitudinal de tipo

cuantitativo.

Ozono y Tratamientos

Para lograr determinar la concentración más efectiva de ozono, en miligramos (mg), y

el tiempo de exposición de las muestras de leche en minutos, se adaptaron los

procedimientos descritos en los estudios de Sung y Cavalcante (Sung et al, 2014)

(Cavalcante et al., 2013), tras lo cual se llegaron a determinar tres concentraciones

(50, 75 y 100 mg/l) durante tres periodos de tiempo (10, 20 y 30 minutos). Los

tratamientos realizados se detallan a continuación.

18

Tabla 10.Tipos de tratamientos según la dosis de ozono y el tiempo de exposición.

Tratamientos Concentración (mg/l) Tiempo (minutos)

T1 50 10

T2 50 20

T3 50 30

T4 75 10

T5 75 20

T6 75 30

T7 100 10

T8 100 20

T9 100 30

T0 Testigo o control (leche cruda)

El ozono fue producido a partir de oxígeno médico a través de un generador (Bioline®)

de 6 gramos. Durante la aplicación de ozono, cada una de las muestras de leche

sometidas a un tratamiento fueron colocadas en bolsas plásticas herméticas estériles

(una por tratamiento) y, a continuación, se realizó la aplicación de ozono de manera

directa en la muestra con agitación constante durante la dispersión del mismo en

función a la concentración y tiempo establecido para cada tratamiento. Concluida la

inoculación y dispersión del ozono, se transportaron las muestras en contenedores

herméticos a 4°C al Laboratorio de Bacteriología y Micología de la Facultad de

Medicina Veterinaria y Zootecnia.

19

Muestreo

Las muestras de leche cruda fueron obtenidas directamente del tanque de recolección

de la hacienda lechera seleccionada. Se recolectaron 10 litros de leche, durante tres

semanas; las muestras fueron tomadas de ordeños aleatorios e independientes.

Además, se recolectó muestras de leche hervida y leche UHT de marca comercial para

los análisis respectivos para comparar con los resultados obtenidos en los

especímenes de leche tratada con ozono.

Análisis Microbiológico

En el laboratorio de Bacteriología y Micología se realizó la cuantificación bacteriológica

de aerobios mesófilos totales, coliformes totales, Escherichia coli, Listeria

monocytogenes spp y Salmonella spp en cada una de las muestras tratadas con

ozono. A cada muestra se realizó diluciones 10-1 y 10-2 en agua peptonada tamponada

(Difco BD Sparks®) y se utilizó el sistema Petrifilm® de la casa 3M® para el cultivo,

aplicando protocolos para mesófilos totales (AOAC 990.12), coliformes totales y

Escherichia coli (AOAC 991.14), Listeria monocytogenes (AOAC-RI 030601) y para

Salmonella spp (AOAC 2014.01).

Análisis Estadístico

Los datos microbiológicos fueron analizados mediante la prueba de varianza de una

vía de Kruskal Wallis y la prueba de U de Mann Whitney, con un intervalo de confianza

del 95%. Además, se realizó un análisis de correlación de Spearman para comparar el

recuento microbiológico de las distintas muestras tratadas a dosis de ozono y tiempo

de tratamiento predeterminados. Para el análisis estadístico, se utilizó el software IBM

SPSS Statistics© versión 23.

20

CAPÍTULO V

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El recuento microbiano de las muestras control y especímenes tratados con ozono

consta en la tabla 11. El mayor recuento de unidades formadoras de colonias (UFC)

correspondió a las muestras control (T0, leche cruda). Los especímenes de leche

tratada con ozono presentaron carga microbiana, sin embargo, los recuentos en UFC

fueron gradualmente disminuyendo en función a la dosis de ozono y tiempo de

administración hasta alcanzar valores bajos a la dosis máxima de O3 (100 mg/l/30

minutos), la cual evidencia mejores resultados (Fig.3, Fig. 4, Fig.5).

Figura 3.Diferencias en la carga bacteriana de la leche tras la aplicación de ozonización.

1,37

1,69

2,52

2,70

2,95

3,04

3,07

3,15

3,16

3,90

0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50

T9

T8

T7

T6

T5

T4

T3

T2

T1

Testigo

Carga Bacteriana en la leche (log10 UFC/ml)

Tra

tam

ien

tos

MESÓFILOS AEROBIOS TOTALES

21

Figura 4. Diferencias en la carga bacteriana de la leche, donde a la dosis más alta se llegó a un valor de 0 para coliformes totales.

Figura 5. Diferencias en la carga bacteriana de Escherichia coli donde a la dosis más alta se llegó a un valor de 0.

0,00

1,00

1,92

2,23

2,26

2,31

2,35

2,38

3,03

3,68

0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00

T9

T8

T7

T6

T5

T4

T3

T2

T1

Testigo


Tra

tam

ien

tos

COLIFORMES TOTALES

0,00

0,70

1,18

1,76

2,09

2,23

2,44

2,51

2,59

3,67

0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00

T9

T8

T7

T6

T5

T4

T3

T2

T1

Testigo


Tra

tam

ien

tos

Escherichia coli

22

En promedio, si se compara con las muestras control, la reducción decimal de

microorganismos posteriores al uso de ozono fue de 1,27, 1,73 y 1,89 Log10UFC/ml

para mesófilos aerobios totales, coliformes y Escherichia coli, respectivamente. El

análisis estadístico del recuento microbiano, para cada muestra tratada con ozono

relacionada a dosis y tiempo, evidenció diferencia estadística significativa (p≤ 0,05)

respecto a las muestras control. Resultados que se encuentran dentro de lo estipulado

en la normativa nacional NTE INEN 10 (INEN, 2012), para el tratamiento 9 (Tabla 12).

Se encontró similar recuento de microorganismos (mesófilos aerobios totales,

coliformes totales y Escherichia coli) en los tratamientos T2 (50 mgO3/20 minutos) y

T3 (50 mg O3/30 minutos); similar comportamiento fue observado en los tratamientos

T8 (100 mg O3/20 minutos) y T9 (100 mg O3/30 minutos), sin demostrar diferencias

estadísticamente significativas (p≥ 0,05).

No se reportaron recuentos de Listeria monocytogenes y Salmonella spp. en los

distintos tratamientos.

Tabla 11.Recuentos microbianos (Log10 UFC/ml) observados en leche cruda y leche tratada con ozono según dosis y tiempo de exposición.

Recuentos Microbianos

Tratamientos

T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9

Mesófilos aerobios totales 3,90 3,16 3,15 3,07 3,04 2,95 2,70 2,52 1,69 1,37

Coliformes totales 3,68 3,03 2,38 2,35 2,31 2,26 2,23 1,92 1,00 0,00

Escherichia coli 3,67 2,59 2,51 2,44 2,23 2,09 1,76 1,18 0,70 0,00

Listeria monocytogenes A A A A A A A A A A

Salmonella spp. A A A A A A A A A A

A= ausencia. T0 = control T1 a T9 = tratamientos con ozono

Los tratamientos con similar color indican ausencia de diferencia significativa (p≥ 0,05) en los tres parámetros estudiados.

23

Tabla 12. Comparación de los resultados de T9 (Log10 UFC/ml) con los parámetros establecidos en la Norma NTE INEN 10 Leche pasteurizada. Requisitos

Recuentos Microbianos T9 Requisitos NTE INEN 10

Mesófilos aerobios totales 1,37 4,48

Coliformes totales 0 0

Escherichia coli 0 0

Listeria monocytogenes A 0

Salmonella spp. A 0

A= ausencia. T9= Tratamiento 9 (100 mg O3/30 minutos)

El recuento microbiano en leche sometida a los diferentes esquemas de tratamiento

con ozono comparado con leche hervida y UHT, mostró una reducción considerable;

se observó disminución del recuento de mesófilos aerobios totales, coliformes y

Escherichia coli, mientras que la leche hervida exhibió recuentos más altos a

comparación con T9 (leche ozonizada) y leche UHT (tabla 13).

Tabla 13.Recuentos microbianos (Log10 UFC/ml) observados en leche cruda y leche tratada con ozono (T9), leche hervida y leche UHT

Tipo de leche

Recuento Microbianos Leche cruda

Leche hervida

Leche UHT

T9

Mesófilos aerobios totales 3,90 3,71 2,50 1,37

Coliformes totales 3,68 2,77 0,00 0,00

Escherichia coli 3,67 1,44 0,00 0,00

Listeria monocytogenes A A A A

Salmonella spp. A A A A

A= ausencia.

24

Figura 6. Comparación de resultados de los tres distintos tratamientos en estudio.

Estadísticamente se realizó una comparación entre el tratamiento 9 (T9) con los

resultados de la leche hervida y con los resultados de la leche UHT, respectivamente,

a través de la prueba de U de Mann-Whitney, donde se aprecia que no existe una

diferencia significativa entre T9 y leche UHT para los valores de coliformes totales y

Escherichia coli (tabla 14).

Tabla 14.Valores de “p” para cada recuento, tras la comparación de T9 con la leche hervida, T9 con la leche UHT y T9 con el testigo (leche cruda).

Comparación entre tipos de leche

Recuentos Microbianos

Leche hervida - T9 Leche UHT - T9 Leche cruda - T9

Mesófilos aerobios totales

0,00* 0,035* 0,05*

Coliformes totales 0,00* 1 0,03*

Escherichia coli 0,00* 1 0,04*

Listeria monocytogenes

A A A

Salmonella spp. A A A

A= ausencia. * Valores que difieren estadísticamente (p≤ 0,05)

3,9 3,71

2,5

1,37

3,68

2,77

0 0

3,67

1,44

0 00

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

LecheCruda

LecheHervida

LecheUHT

T9

Ca

rga

Ba

cte

ria

na

lo

g1

0 U

FC

/ml

Mesófilos aerobios totales Coliformes totales Escherichia coli

25

Correlación estadística entre concentración (tiempo-dosis) y reducción del

recuento microbiano

Existió alta correlación entre concentración de O3 y reducción del recuento de

mesófilos aerobios totales, coliformes y Escherichia coli. El tiempo de exposición al O3

en relación al recuento bacteriano presentó moderada correlación. En este sentido, se

observó que a medida que se aumentó la concentración de ozono disminuyó la carga

bacteriana en la leche tratada. No se consideraron valores de referencia para Listeria

monocytogenes y Salmonella spp., por no encontrarse en la muestra testigo (cruda) y

en los distintos tratamientos con ozono, leche hervida o UHT.

Discusión

El principal hallazgo del estudio fue el efecto del ozono en la reducción de la carga

bacteriana de las muestras tratadas de leche respecto a las muestras control donde

los recuentos microbiológicos son mayores. Se advierte que fueron detectadas

bacterias en las muestras tratadas con ozono, reduciéndose gradualmente su recuento

en función a la dosis y tiempo de ozono empleado en cada uno de los tratamientos, al

punto que en la muestra T9 el conteo de mesófilos aerobios totales fue 1,37 Log10

UFC/ml), coliformes totales (0 Log10 UFC/ml) y Escherichia coli (0 Log10 UFC/ml),

parámetros aceptados en la normativa ecuatoriana NTE INEN 10 “Leche Pasteurizada.

Requisitos” (INEN, 2012) y europea (European Commission, 2005). Los resultados

concuerdan con otros estudios realizados en alimentos tratados con ozono para

disminuir la carga microbiana y aumentar la vida útil de los productos, por lo que se

colige que se detectarán mayores recuentos microbianos en productos no tratados con

ozono (Al-Haddad et al., 2005; Alexandre et al., 2011).

El recuento de mesófilos aerobios totales presentó valores más altos en leche cruda

(3,9 Log 10 UFC/ml), observándose en las muestras tratadas disminución de la carga

microbiana a medida que se incrementó la concentración y tiempo de aplicación de

ozono (tabla 9). Los resultados concuerdan con el estudio de Cavalcante y

colaboradores (2013) que reportan un efecto similar del ozono para reducir la carga de

mesófilos aerobios totales (1,5 mg O3 por litro durante 15 minutos). El conteo final de

26

coliformes totales en leche cruda fue 3,68 Log10 UFC/ml, siendo este el valor de

recuento más alto; a medida que se trató con ozono las distintas muestras, la carga

bacteriana se redujo hasta 0 Log10 UFC/ml en la muestra T9. La información disponible

no reporta el efecto del tratamiento de la leche cruda con ozono sobre

microorganismos coliformes; un estudio sobre el efecto del ozono en alimentos frescos

(papaya) se traduce en recuentos bajos a una dosis de ozono de 9,2±2 µl/L (Yeoh et

al, 2014).

El contaje total de Escherichia coli en leche cruda fue 3,67 Log10 UFC/ml; en las

muestras tratadas se demostró una disminución gradual en el recuento bacteriano a

medida que se incrementó la dosis de ozono, registrándose un recuento de 0 Log10

UFC/ml en T9, resultado que coincide con el reporte de Sung y colaboradores (2014),

quienes destacan el efecto del ozono en forma gaseosa a dosis de 2-3 gramos

O3/m3/minuto y calor, aplicados a jugo de manzana pasteurizada a la que previamente

se inoculó experimentalmente Escherichia coli.

En leche hervida, se logró las cargas bacterianas iniciales de mesófilos aerobios

totales (3,71 Log10 UFC/ml), coliformes totales (2,77 Log10 UFC/ml) y Escherichia coli

(1,44 Log10 UFC/ml), resultados que concuerdan con el reporte de Agarwal et al.

(2012), donde se señala la reducción del recuento de mesófilos aerobios totales (de

valor inicial a valor final) y coliformes (valor inicial y final).

Difieren los valores iniciales y finales del recuento de Escherichia coli, donde reportan

0 Log10 UFC/ml, atribuyéndose a que el estudio de Agarwal controló las variables

tiempo y temperatura de ebullición de la leche. Con esta aclaración, se destaca la

diferencia estadística significativa (p≤ 0,05) en la reducción del recuento bacteriano al

comparar leche hervida y leche tratada con ozono.

En la leche UHT se demostró la presencia de mesófilos aerobios totales (2,50 Log10

UFC/ml), resultado similar al hallado en Turquía, donde fueron evaluadas muestras de

leche UHT obtenidas de supermercados locales (Tekinsen et al, 2007).

Debido a limitaciones de equipamiento, no se probaron dosis más bajas de ozono.

Además, el estudio no midió la concentración de ozono residual luego de tratar las

27

distintas muestras de leche, por lo que, a mediano plazo, deberá complementarse

nuevos estudios para determinar valores residuales y dosis menores a 50 mg/litro en

10 minutos de exposición. Además, resta estimar el impacto del ozono sobre el medio

ambiente y sobre el personal que labora para el sistema de manejo de la producción

lechera del país.

La presente investigación permitió demostrar la disminución de la carga bacteriana de

la leche cruda a través de la ozonización, proceso que se equipararía a otros

tradicionalmente utilizados. Serían necesarios estudios posteriores para conocer la

factibilidad económica al reemplazar una planta pasteurizadora tradicional por una que

utilice ozono en el proceso.

28

ANÁLISIS DE COSTOS PARCIALES

El análisis económico se detalla a continuación:

Tabla 15. Análisis de costos parciales del tratamiento testigo.

Tratamiento Testigo

Costo del Producto por

litro

Litro

Costo Unitario

Leche Cruda

0,50 $

1

0,50 $

Tabla 16.Análisis de costos parciales por tratamientos experimentales.

Tratamientos Concentración

de Ozono Tiempo de Exposición

Costo del Tratamiento/ 1 L

Costo Unitario

O3 +Leche

Diferencia

T1 50 mg/l 10 minutos

0,10 $ 0,60 $ +0,10 $


0,15 $ 0,65 $ +0,15 $


0,20 $ 0,70 $ +0,20 $


0,25 $ 0,75 $ +0,25 $

T5 75mg/l 20 minutos

0,30 $ 0,80 $ +0,30 $


0,35 $ 0,85 $ +0,35 $


0,40 $ 0,90 $ +0,40 $


0,45 $ 0,95 $ +0,45 $


0,50 $ 1,00 $ +0,50 $

29

Tabla 17.Análisis de costos parciales de la leche pasteurizada UHT.

Tabla 18.Análisis de costos parciales de la leche hervida

Tabla 19. Comparación de costos entre el testigo, la leche hervida, la leche pasteurizada UHT y el tratamiento de ozono (T9).

Tratamientos

Costo

Unitario

Costo Tratamiento

Testigo

Diferencia

T9 1,00 $ 0,50 $ +0,50 $

Leche UHT 0,85 $ 0,50 $ +0,35 $

Leche Hervida 0,60 $ 0,50 $ +0,10 $

De acuerdo con lo expuesto, el análisis de todos los tratamientos con ozono resulta en

un costo más elevado con respecto al tratamiento testigo, con una diferencia

económica que oscila desde 0,60 $ hasta 1,00 $.

Cabe señalar que el tratamiento testigo solo correspondía a la leche cruda sin ninguna

intervención o acción adicional, lo que explica el margen de diferencia económica entre

tratamientos.

Tal como se detalla en la tabla 19, se eligió al tratamiento 9 (T9) para su comparación

con los costos de los tratamientos testigo, leche UHT y leche hervida, esto debido a la

efectividad reportada tras el análisis microbiológico.

Leche UHT


litro

Litros utilizados

Costo Unitario

Marca Comercial

0,85 $

1

0,85 $

Leche Hervida


litro

Costo del Tratamiento Proceso

Costo Unitario

Leche cruda +

Ebullición

0,50 $

0,10 $

0,60 $

30

El alto costo de ozonización se debe a que se utilizó apenas 1 litro de leche cruda para

el proceso, debiendo disminuir conforme se incrementa la cantidad a ser procesada.

31

CAPÍTULO VI

CONCLUSIONES

Se lograron obtener resultados de la cuantificación de bacterias de las muestras de

leche cruda (testigo), así como de las muestras de leche correspondientes a los

distintos tratamientos de ozono.

Con una concentración de 100 mg O3/l se logró que la leche tratada con ozono

alcance los parámetros establecidos por la normativa ecuatoriana NTE INEN 10

“Leche Pasteurizada. Requisitos” (INEN, 2012) y europea (European Commission,

2005).

Del mismo modo, con un periodo de acción de 30 minutos del ozono sobre la carga

bacteriana de la leche se cumplieron estos estándares de calidad, que califican al

producto apto para el consumo humano (NTE INEN 10 “Leche Pasteurizada.

Requisitos”, 2012; European Commission, 2005 )

El Tratamiento 9 (100 mg O3/l durante 30 minutos), fue el más efectivo al permitir

una reducción del 64,87% (2,53 Log10 UFC/ml) del conteo inicial de mesófilos

aerobios totales, una reducción del 100% (3,68 Log 10 UFC/ml) para coliformes

totales y una reducción del 100% (3,67 Log10 UFC/ml) para Escherichia coli.

32

CAPÍTULO VII

BIBLIOGRAFÍA

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42

ANEXOS

1. Resultados de la cuantificación de Mesófilos Aerobios Totales.

Tratamientos con Ozono Leche Hervida

Leche UHT Testigo T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9

UFC/ml 7966,67 1439,33 1400 1172,67 1100,0 898 501 328 48,67 23,33 5099,7 313,3

Notación Científica

8 x103 1,4 x10

3 1,4 x10

3 1,2 x10

3 1,1 x10

3 9 x10

2 5 x10

2 3,3 x10

2 5 x10 2 x10 5,10X10

3 3,1310

2

Log10

UFC/ml 3,90 3,16 3,15 3,07 3,04 2,95 2,70 2,52 1,69 1,37 3,71 2,50

2. Resultados de la cuantificación de Coliformes Totales. Tratamientos con Ozono Leche Hervi

da Leche U

HT Testigo

T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9

UFC/ml 4787,33

1074,67 238,33

223,67 204 183,33

171,67 82,33 10 0 583,7 0


4,8x103 1,1 x10

3 2,4 x

102

2,2x

102

2x102 1,8x

102

1,7x

102

8 x 10

1 x 10 0 5,8X102 0

Log10

UFC/ml 3,68 3,03 2,38 2,35 2,31 2,26 2,23 1,92 1,00 0 2,77 0

3. Resultados de la cuantificación de Escherichia coli. Tratamientos con Ozono Leche

Hervida

Leche UHT Testig

o T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9

UFC/ml 4666,33

388 324,33 273,33 170 123 57,33 15 5 0 27,3 0


4,7x103 3,9x10

2 3,2x10

2 2,7x10

2 1,7x10

2 1,2x10

2 6 x 10 1,5 x 1

0 5 0 2,7X10 0

log10UFC/ml 3,67 2,59 2,51 2,44 2,23 2,09 1,76 1,18 0,70 0 1,44 0

43

4. ANOVA de una vía de Kruskal Wallis por Tratamientos.

5. ANOVA de una vía de Kruskal Wallis en base a la concentración de ozono.

Prueba Aerobios Totales E. coli Coliformes totales

Chi-cuadrado 26,741 27 23,765

gl 3 3 3

Sig. asintótica 0 0 0

6. ANOVA de una vía de Kruskal Wallis en base al tiempo de exposición al ozono.


Chi-cuadrado 9,166 9 8,441

gl 3 3 3

Sig. asintótica 0,027 0,03 0,038

7. Prueba de U de Mann-Whitney analizando los tratamientos por parejas.

Tratamientos

Aerobios Totales

Escherichia coli

Coliformes totales

Sig. Asintótica

Existencia de Dif. Sig.

Sig. Asintótica


Sig. Asintótica


1 – 2 0,046 Si 0,046 Si 0,05 Si

1 – 3 0,507 No 0,376 No 0,05 Si

1 – 4 0,037 Si 0,046 Si 0,05 Si

1 – 5 0,05 Si 0,05 Si 0,05 Si

1 – 6 0,05 Si 0,05 Si 0,05 Si

1 – 7 0,05 Si 0,05 Si 0,05 Si

1 – 8 0,05 Si 0,05 Si 0,05 Si

1 – 9 0,05 Si 0,046 Si 0,037 Si

1 – 10 0,05 Si 0,046 Si 0,05 Si

2 – 3 0,197 No 0,178 No 0,261 No

2 – 4 0,034 Si 0,043 Si 0,05 Si

2 – 5 0,046 Si 0,046 Si 0,184 No

2 – 6 0,046 Si 0,046 Si 0,376 No


Chi-cuadrado 28,474 28.152 27,75

gl 9 9 9

Sig. asintótica 0,001 0,001 0,001

44

2 – 7 0,046 Si 0,046 Si 0,05 Si

2 – 8 0,046 Si 0,046 Si 0,05 Si

2 – 9 0,046 Si 0,043 Si 0,037 Si

2 – 10 0,046 Si 0,043 Si 0,05 Si

3 – 4 0,034 Si 0,046 Si 0,05 Si

3 – 5 0,046 Si 0,05 Si 0,658 No

3 – 6 0,046 Si 0,05 Si 0,077 No

3 – 7 0,046 Si 0,05 Si 0,05 Si

3 – 8 0,046 Si 0,05 Si 0,05 Si

3 – 9 0,046 Si 0,046 Si 0,037 Si

3 – 10 0,046 Si 0,046 Si 0,05 Si

4 – 5 0,037 Si 0,105 No 0,05 Si

4 – 6 0,037 Si 0,046 Si 0,513 No

4 – 7 0,037 Si 0,046 Si 0,05 Si

4 – 8 0,037 Si 0,046 Si 0,05 Si

4 – 9 0,037 Si 0,043 Si 0,037 Si

4 – 10 0,037 Si 0,043 Si 0,05 Si

5 – 6 0,05 Si 0,127 No 0,05 Si

5 – 7 0,05 Si 0,05 Si 0,05 Si

5 – 8 0,05 Si 0,05 Si 0,05 Si

5 – 9 0,05 Si 0,046 Si 0,037 Si

5 – 10 0,05 Si 0,046 Si 0,05 Si

6 – 7 0,05 Si 0,05 Si 0,05 Si

6 – 8 0,05 Si 0,05 Si 0,05 Si

6 – 9 0,05 Si 0,046 Si 0,037 Si

6 – 10 0,05 Si 0,046 Si 0,05 Si

7 – 8 0,05 Si 0,077 No 0,05 Si

7 – 9 0,05 Si 0,072 No 0,037 Si

7 – 10 0,05 Si 0,046 Si 0,05 Si

8 – 9 0,077 No 0,121 No 0,121 No

8 – 10 0,05 Si 0,046 Si 0,05 Si

9 – 10 0,05 Si 0,043 Si 0,037 Si

45

8. Prueba de Correlación relacionando a la concentración de ozono, tiempo de expos

ición y UFC (crecimiento bacteriano).

Rho de Spearman

Aerobios Totales Escherichia coli Coliformes Totales

Ozono Tiempo Ozono Tiempo Ozono Tiempo

Coeficiente 0,96 0,452 0,961 0,44 0,894 0,399

Sig. 0 0,012 0 0,0115 0 0,03

Correlación Si Si Si Si Si Si

Grado de

Correlación

Muy buena Correlación

Moderada

Correlación


Moderada

Correlación


Baja

Correlación

9. ANOVA comparando al tratamiento 9, la leche hervida y la leche UHT.

Tratamientos

Aerobios Totales Escherichia coli Coliformes totales

Sig. Asintóti

ca

Diferencia Significativa

Sig. Asintótica


Sig. Asintótica


T9 – Hervida

0 Si 0 Si 0 Si

T9 – UHT

0,035 Si 1 No 1 No

Hervida – UHT

0 Si 0 Si 0 Si

46

10. Registro de Toma de Muestras.

11. Registro de Resultados.



REGISTRO DE TOMA DE MUESTRAS

Muestra N° :

Fecha:

Lugar:

Tipo de Muestra:

Cantidad:

Observaciones:



REGISTRO DE RESULTADOS

Muestra N° : Fecha:

Código:

Repetición:

Microorganismo Resultado

Total 10

-1 10

-2

Aerobios Totales

Escherichia coli

Coliformes Totales

Salmonella spp.

Listeria spp.

47

12. Procesamiento de Muestras.

48

13. Resultados en las placas petrifilm.