Identifica Microorganismos en Base a Técnicas Bacteriológicas

CBTis 134

Equipo 5

Introducción El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con

el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares.

Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas, proceso llamado fijación. Para las bacterias la fijación por el calos es lo más corriente, aunque también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehído, ácidos y alcoholes. Después dela fijación se realiza habitualmente en células que han sido secadas sobre un portaobjetos, tratando después éste con el agente fijador y siguiendo inmediatamente el proceso de tinción. La fijación produce generalmente el encogimiento de las células, la tinción, por el contrario, hace que las células aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera que las medidas de las células que han sido fijadas o teñidas no pueden realizarse con mucha precisión.

La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos.

Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo.

Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles. Los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la localización de las gotículas o depósitos de grasa.

Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con otra sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. Esta sustancia se denomina mordiente. Un mordiente habitual es el ácido tánico. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de modo que ahora sí podrá atacar el colorante.

Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la microscopia son suficientes los procedimientos simples de tinción. El azul de metileno es un buen colorante simple que actúa sobre todas las células bacterianas rápidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente útil para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tiñe.

FACTORES QUE AFECTAN A TODA TECNICA DE TINCION

Las técnicas de coloración constituyen una practica diaria en el laboratorio de microbiología por los cuales se deberá considerar una serie de factores que pueden alterar los resultados estos procesos. Así pues los principales factores son:

Pureza del colorante.- a mayor grado de impurezas a mayor error y menor calidad de tinción.

Concentración del colorante.- a mayor concentración mayor error en la tinción; igual que a menor concentración.

El pH del colorante.- este es un factor fundamental ya que depende de las estructuras que se desee observar para elegir el pH adecuado.

Conservación del colorante .- se debe conservarse en lugares frescos, secos, y obscuros ; envasados y etiquetados.

Técnica Empleada.- se deberá seguir rigurosamente paso a paso cada técnica de tinción.

Temperatura.- en la mayoría de los casos se utiliza la temperatura ambiental pero si existe algunas técnicas que requieran de temperatura adecuada.

Cantidad de la muestra.- deberá ser representativa y homogénea pero no muy grande.

Realizar correctamente el frotis.- se debe fijarse bien para que cuando se les añada los colorantes mordientes y decolorantes no arrastren a los microorganismos que se desee observar.

Soluciones mordientes.- en ciertos casos son necesarios ya que actúan como fijadores y ayudan a la fijación del colorante a las correspondientes estructuras .

Tiempos de Tinción.- es necesario que todas las sustancias se mantengan en la preparación un tiempo preciso y variable según la tinción.

Tipos de Colorante

Se han desarrollado varios tipos de colorantes usados para observar componentes celulares y tisulares. Se los puede agrupar de la siguiente manera. Colorantes que distinguen entre los componentes ácidos y básicos

de la célula. Colorantes especiales que reconocen elementos particulares

intracelulares y extracelulares. Colorantes con sales metálicas que precipitan los tejidos y forman

depósitos metálicos en ellos.

TECNICA DE TINCION

Toda técnica de tinción requiere de los siguientes pasos: Realización de un frotis y fijación posterior Coloración Decoloración Lavado. Coloración de contraste. Observación al microscopio.

Preparación de un frotis Sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota del

material que se va a teñir (si es líquido) o se hace rodar el hisopo con que se tomó la muestra. Una vez que el hisopo ha tocado la superficie del portaobjetos, que no está estéril, ya no puede ser empleado para inocular los medios de cultivo.

Puede usarse una aguja estéril para transferir una pequeña cantidad de un cultivo bacteriano a la superficie del portaobjetos. Este material es suspendido en una gota de agua o solución salina previamente colocada sobre el portaobjetos. Cuando se trata de colonias muy pequeñas que pueden perderse en una gota de líquido se emplea una varilla delgada de madera estéril con la cual se toca la colonia obteniéndose así una fracción apreciable del desarrollo.

El material se frota directamente sobre el portaobjetos, donde puede visualizarse con facilidad. El material colocado en el portaobjetos se deja secar al aire o bien se pasa varias veces por la zona azul de la llama de un mechero de Bunsen hasta que el vidrio esté tan caliente que moleste al tacto pero no queme.

Tipos de Tinciones Bacterianas

Tinción simple

Se caracteriza por: Necesita fijación previa. Se utiliza un solo colorante y este debe ser básico (azul de metileno o fucsina) Permite la visualización la concentración, morfología y el modo de agrupación

bacteriana.

Tinción Negativa Es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin

teñir pero se colorea un cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las células. La sustancia utilizada para la tinción negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las células. La tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las células en microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas.

Se caracteriza por : No necesita fijación previa. Se utiliza un solo colorante. Nos permiten visualizar sobre un fondo oscuro la forma de la bacteria y

alguna otra estructura como es la presencia de capsula.

Tinciones Diferenciales Se utilizan varios colorantes combinados. Las

estructuras celulares se diferencian en función de los diferentes colorantes que fijan de acuerdo con su propia constitución química.

Los ejemplos clásicos serían la tinción de GRAM o la de Ziehl-Neelsen.

Tinción de Gram Denominada así por el bacteriólogo danés Hans Christian Gram, quien la

desarrollo. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, Gram positivas y Gram negativas.

Descrita en forma breve, la secuencia de la tinción es la siguiente: el Frotis fijado con calor se tiñe 1 min con Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre con solución Yodada durante 1 min y se lava de nuevo con agua, decolorar con mezcla alcohol etílico/acetona. Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 20 a 30 segundos. Lavar y secar.

Las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La presencia de peptoduglicano es lo que define el color con el se teñirá la célula.

La pared de la célula Gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano así como algo de ácido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la célula Gram-positiva es peptidoglicano.

La pared de la célula Gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho más delgada, únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de la célula Gram-negativa es peptidoglicano.

Tinción de Ziehl-Neelsen La tinción de Ziehl-Neelsen es una coloración diferencial útil en la

identificación de micobacterias, aunque no permite la diferenciación de distintas especies. La características de ácidoresistencia de estos microorganismos hace de esta coloración un método rápido en el diagnóstico presuntivo de infección micobacteriana.

La tinción se basa en colocar carbol-fucsina y calentar la preparación ligeramente para solubilizar las ceras, lípidos y otros ácidos grasos de la pared celular para que permita el paso libre del colorante, el cual tiene una enorme afinidad por los ácidos micólicos presentes en la pared. Al enfriar con agua, los componentes de la pared vuelven a solidificar, resistiendo la acción abrasiva del alcohol-ácido, y el azul de metileno se utiliza como contratinción

Tinciones estructurales

Las tinciones estructurales presenta las siguientes características: Requieren fijación previa generalmente por calor Utilizan al menos dos colorantes. Nos permiten observar su morfología Nos permiten visualizar otras características de carácter estructural como son

la presencia de esporas, flagelos, cilios, capsulas, etc. Dentro de las tinciones estructurales tenemos a la tinción de esporas

La tinción específica de esporas requiere dos colorantes: 1.- Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en caliente. 2.- Safranina: colorante de contraste que tiñe las formas vegetativas. Las endosporas, tras la primera tinción, no perderán el colorante en el

lavado con agua, y sí lo harán las formas vegetativas, que quedarán teñidas con el segundo colorante.

Al interpretar resultados, se debe tener en cuenta que la posición y la morfología de la endospora en el interior de la bacteria constituyen un carácter taxonómico útil para diferenciar especies dentro de un mismo género.

Tinción de Esporas

Tinción Flagelar Tinción de Flagelos: los flagelos se tiñen con mucha dificultad debido a

que se suelen retraerse con facilidad si la tinción no es adecuada , de ahí que se requiere de técnicas especiales y especificas basadas en la afinidad que los flagelos presentan frente a ciertas anilinas.

TECNICA: Realizar el frotis de cultivo joven y fijar. Cubrir la preparación con mordiente Rhodes durante unos 4 minutos. Lavar con agua destilada. Cubrir con nitrato de plata amoniacal al 5% calentándolo casi hasta

ebullición sin dejar que se seque la solución en la muestra durante unos 4 minutos.

Lavar con agua destilada, aplicar un cubre objetos y examinara a inmersión. Resultado. los flagelos se observan por la precipitación del nitrato de plata

amoniacal sobre ellos lo que les da un aspecto pardo mas o menos oscuro que contrasta sobre el resto de la bacteria.

Conclusión

Las tinciones utilizadas en el laboratorio de microbiología permiten el diagnóstico oportuno y sugerente de los agentes infecciosos, por lo que juegan un papel importante en la decisión del tratamiento inicial de las enfermedades infecciosas. Se debe practicar la tinción adecuada de acuerdo con el agente infeccioso en sospecha y el tipo de muestra clínica. Las tinciones son herramientas elementales, vigentes y de uso universal que coadyuvan al diagnóstico microbiológico

Bibliografía

http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm https://

estructurayfuncioncelularbacteriana.wikispaces.com/Tinciones+de+microorganismos

http://analisisaproductoscarnicos.blogspot.mx/2012/06/tinciones-utilizadas-en-microbiologia.html