FAKULTET KEMIJSKOG INŽENJERSTVA I TEHNOLOGIJE
Andrijana Meščić
SINTEZA NOVIH ACIKLIČKIH PIRIMIDINSKIH NUKLEOZIDNIH ANALOGA S POTENCIJALNOM
PRIMJENOM U POZITRONSKOJ EMISIJSKOJ TOMOGRAFIJI
DOKTORSKI RAD
Zagreb, 2014.
FACULTY OF CHEMICAL ENGINEERING AND TECHNOLOGY
Andrijana Meščić
SYNTHESIS OF NOVEL PYRIMIDINE NUCLEOSIDE ANALOGUES WITH POTENTIAL
APPLICATION IN POSITRON EMISSION TOMOGRAPHY
DOCTORAL THESIS
Zagreb, 2014.
FAKULTET KEMIJSKOG INŽENJERSTVA I TEHNOLOGIJE
Andrijana Meščić
SINTEZA NOVIH ACIKLIČKIH PIRIMIDINSKIH NUKLEOZIDNIH ANALOGA S POTENCIJALNOM
PRIMJENOM U POZITRONSKOJ EMISIJSKOJ TOMOGRAFIJI
DOKTORSKI RAD
Mentor: Prof. dr. sc. Silvana Raić-Malić
Zagreb, 2014.
FACULTY OF CHEMICAL ENGINEERING AND TECHNOLOGY
Andrijana Meščić
SYNTHESIS OF NOVEL PYRIMIDINE NUCLEOSIDE ANALOGUES WITH POTENTIAL APPLICATION IN
POSITRON EMISSION TOMOGRAPHY
DOCTORAL THESIS
Supervisor: Prof. dr. sc. Silvana Raić-Malić
Zagreb, 2014.
Bibliografski podaci:
UDK: 547.854:615.84-7(043.3) Znanstveno područje: prirodne znanosti Znanstveno polje: kemija Institucija: Sveučilište u Zagrebu, Fakultet kemijskog inženjerstva i tehnologije,
Zavod za organsku kemiju Voditelj rada: Prof. dr. sc. Silvana Raić-Malić Broj stranica: 176 Broj slika: 45 Broj tablica: 6 Broj shema: 26 Broj literaturnih referencija: 122 Datum obrane: 14. ožujka 2014. Sastav povjerenstva za obranu: Doc. dr. sc. Tatjana Gazivoda Kraljević (FKIT),
Izv. prof. dr. sc. Irena Škorić (FKIT) Prof. dr. sc. Miroslav Bajić (Veterinarski fakultet)
Rad je pohranjen u: Nacionalnoj i sveučilišnoj knjižnici u Zagrebu, Hrvatske bratske zajednice bb; Knjižnici Fakulteta kemijskog inženjerstva i tehnologije u Zagrebu, Marulićev trg 20; Knjižnici Sveučilišta u Rijeci, Dolac 1; Knjižnici Sveučilišta u Splitu, Livanjska 5 i Knjižnici Sveučilišta u Osijeku, Europska avenija 24.
Tema rada prihvaćena je na sjednici Fakultetskog vijeća Fakulteta kemijskog inženjerstva i
tehnologije Sveučilišta u Zagrebu održanoj 11. srpnja 2011. te odobrena na sjednici Senata
Sveučilišta u Zagrebu održanoj 22. studenoga 2011.
ii
Zahvaljujem mentorici prof. dr. sc. Silvani Raić-Malić na predloženoj temi, znanstvenim
raspravama, savjetima i stručnoj pomoći koju mi je pružila tijekom izrade doktorskog rada.
Hvala prof. dr. sc. Simonu Ametameyu što mi je omogućio znanstveni boravak na ETH
Zürich, na njegovoj pomoći, i uključivanju u eksperimentalni rad te hvala Thomasu Betzelu
na upoznavanju s radiokemijom i B-labosom (...for his german supervision and swiss
equipment...)
Zahvaljujem prof. dr. sc. Leonardu Scapozzi što mi je omogućio znanstveni boravak na
Fakultetu znanosti Sveučilišta u Ženevi, na njegovim savjetima i pomoći te Lucile Pernot na
pomoći prilikom izvođenja testa fosforiliranja.
Zahvaljujem prof. dr. sc. Janezu Plavecu na dvodimenzijskim i PP19F spektrima NMR te na
konformacijskoj analizi molekula.
Hvala prof. dr. sc. Mariu Cetini s Tekstilno tehnološkog fakulteta na određivanju kristalnih
struktura.
Zahvaljujem doc. dr. sc. Sandri Kraljević Pavelić i njezinoj istraživačkoj grupi na Odjelu
za biotehnologiju Sveučilišta u Rijeci na ispitivanju antitumorske aktivnosti
priređenih spojeva.
Hvala prof. dr. sc. Davorki Završnik, te Amaru Osmanoviću i Mirsadi Salihović na ugodnoj
suradnji.
Hvala kolegicama dr.sc. Svjetlani Krištafor, doc. dr. sc. Tatjani Gazivoda Kraljević i Silviji
Maračić na pomoći te brojnim savjetima i idejama.
Veliko hvala mojim kolegicama na nesebičnoj pomoći, savjetima i vremenu koje su odvojile
za mene tijekom izrade ovog rada.
Hvala svim članovima Zavoda za organsku kemiju Fakulteta kemijskog inženjerstva i
tehnologije na ugodnoj radnoj atmosferi i dobrom društvu.
Istraživanje u doktorskom radu je provedeno u okviru švicarskog projekta SCOPES 2009-
2012 (SNF) 'Development of novel C-5 fluoroalkyl N-acyclic pyrimidine nucleoside analogs
as PET tracer for in situ monitoring of gene and cell-based therapies using HSV1-TK as a
reporter gene'.
iii
SAŽETAK
Sintetizirani su novi pirimidinski aciklički nukleozidni mimetici kao potencijalni 'lažni'
supstrati enzima timidin-kinaze virusa herpes simpleks tipa 1 (HSV1-TK). Novi spojevi su
pripravljeni s ciljem pronalaska molekule radiotragača za praćenje enzimske aktivnosti
HSV1-TK u tumorskim stanicama primjenom pozitronske emisijske tomografije (PET).
Sintetizirani su C-5 supstituirani 2-hidroksietilni derivati pirimidina koji sadrže lanac poput
poznatih prolijekova aciklovira, ganciklovira, penciklovira i 2,3-dihidroksipropilni lanac u
položaju N-1 pirimidina, te je promatran utjecaj acikličkog glikona na reakciju fosforiliranja
pomoću enzima HSV1-TK. Provedeni su različiti sintetski putevi u višestupnjevitim
sintezama produkata kako bi se dobilo veće sveukupno iskorištenje ciljanih produkata. Tako
su provedene reakcije N-alkiliranja N-anionskog 5-supstituiranog pirimidinskog derivata kao
prekursora i reakcije sililiranja. Alkiliranje 4-metoksipirimidin-2-ona odvijalo se u N-1 i O-2
položaju pirimidinskog prstena, pa su u toj reakciji izolirani N-aciklički i O-aciklički
pirimidinski regioizomeri. Nadalje, pripravljeni su konformacijski ograničeni pirimidinski
derivati u kojima se nezasićeni izobutenilni lanac koji zamjenjuje šećernu komponentu nalazi
na položaju C-6 pirimidina. Fluoralkenilni nukleozidni mimetik može se koristiti kao modelni
spoj za razvoj molekule tragača u metodi PET. Pripravljeni su i 5-alkinilni derivati pirimidina
Sonogashira-inom reakcijom N-acikličkog 5-joduracilnog derivata s odgovarajućim
terminalnim alkinima pomoću paladijevog katalizatora. Nasuprot tome, derivati pirimidina s
heteroarilnim supstituentom u položaju C-5 pirimidina pripravljeni su Stille-ovom reakcijom
povezivanja organokositrovih intermedijara s nezasićenim organskim elektrofilom pomoću
paladija kao katalizatora.
Testovi fosforiliranja su pokazali da se 5-supstituirani N-aciklički pirimidin s
penciklovirnim lancem u položaju N-1 (5-HEU-PCV) djelotvorno i specifično fosforilirao
pomoću enzima HSV1-TK. Pored toga, spoj nije bio toksičan na normalne fibroblaste
čovjeka. Spoj 5-HEU-PCV je, dakle, zadovoljio osnovne preduvjete za njegovu primjenu u
praćenju enzimske aktivnosti i izabran je kao predvodni spoj za razvoj molekule PET-tragača.
Kako bi se provelo radiooznačavanje tog spoja izotopom 18F, pripravljen je njegov prekursor s
odgovarajućim zaštitnim skupinama. Potom je provedeno označavanje tosilnog prekursora
radionuklidom 18F te je markirana molekula praćena in situ kod miševa sa zloćudnim
tumorom. Radiosinteza s visokim radiokemijskim iskorištenjem (45 % ± 4, n = 4) je
provedena u dva stupnja, nukleofilnom supstitucijom prekursora s kompleksom [18F]KF i
kriptofiksaRR2.2.2 te uklanjanjem 4-metoksi i izopropilidenske zaštitne skupine.
iv
Zatim je provedeno praćenje in vivo i biodistribucija označene molekule kandidata, HHB-
5-[18F]FEP, u tumorskim stanicama kod miševa. Rezultati ispitivanja in vivo nove molekule
su uspoređeni s poznatim PET-tragačem, [18F]FHBG. U usporedbi s [18F]FHBG novi je spoj
pokazao manju selektivnost. Nasuprot tome, prednost novog spoja u odnosu na poznati PET-
tragač je njegova niža radioaktivnost u području abdomena. Spoj je također pokazao
stabilnost, odnosno nisku vrijednost defluoriranja in vivo.
Ključne riječi: aciklički nukleozidni analozi; C-5 supstituirani pirimidini; timidin-kinaza
virusa herpes simpleks tipa 1 (HSV1-TK); pozitronska emisijska tomografija (PET); reakcije
unakrsnog povezivanja katalizirane paladijem.
v
SUMMARY
Synthesis of novel acyclic pyrimidine nucleoside analogues with potential application in
positron emission tomography
A series of novel acyclic pyrimidine nucleoside analogues was synthesized as potential
fraudulent substrates of herpes simplex virus type 1 timidine kinase (HSV1-TK). New
compounds were prepared with the aim of finding a radiotracer for monitoring HSV1-TK
enzyme activity in tumor cells using positron emission tomography (PET). C-5 substituted 2-
hydroxyethyl pyrimidine derivatives bearing 2,3-dyhydroxypropyl and acyclovir-,
ganciclovir- and penciclovir-like side chains were prepared and the influence of the acyclic
glycone on their phosphorylation ability with HSV1-TK was observed. In order to obtain
better overall yield of the target compounds, different synthetic routes were used during multi
step syntheses. Therefore, N-alkylation of N-anionic 5-substituted pyrimidine derivatives as
precursors and silylation reaction method were used. Alkylation of 4-methoxypyrimidin-2-
one derivative occurred both at TTN-1 and O-2 position of pyrimidine ring resulting in N-
acyclic and O-acyclic pyrimidine regioisomers. Furthermore, a new series of
conformationally restricted pyrimidine derivatives bearing isobutenyl side chain that mimics
the sugar moiety at C-6 position of pyrimidine has also been prepared. The novel
fluoroalkenyl pyrimidine nucleoside mimetic can be used as a model compound for
development of a PET tracer molecule. Alkynyl pyrimidine derivatives were obtained via
Sonogashira cross-coupling of N-acyclic 5-iodouracil derivative with corresponding terminal
alkynes using palladium as a catalyst. On the contrary to this, heteroaryl pyrimidine
derivatives were prepared by Stille cross-coupling of organostannane intermediates with
unsaturated organic electrophile using palladium catalyst.
The phosphorylation assays showed that the C-5 substituted N-acyclic pyrimidine with a
penciclovir-like side chain at N-1 (5-HEU-PCV) was efficiently and selectively
phosphorylated by HSV1-TK. Besides, this compound was not cytotoxic to normal human
fibroblasts. Therefore, this acyclonucleoside was selected as a leading compound for the
development of a PET radiotracer. In order to perform radiolabelling, a precursor with
corresponding protecting groups was prepared. Radiolabelling of the tosyl precursor with
radionuclide 18F was performed and the resulting compound was used for in situ imaging in
tumor bearing mice.
A high yield radiosynthesis (45 % ± 4, n = 4) was accomplished in two steps by
nucleophilic substitution on a tosylate leaving group of the precursor using [18F]fluoride-
cryptate complex and subsequent removal of the 4-methoxy and isopropylidene protecting
vi
groups. In vivo assay and biodistribution assay of the radiolabelled candidate molecule,
TTHHB-5-[18F]FEP, in tumor bearing mice was also performed.
In vivo results of the new molecule were compared to [18F]FHBG which is considered to
be the gold standard for HSV1-tk gene visualization. In comparison with [18F]FHBG, HHB-5-
[18F]FEP showed to be less selective. On the contrary, a clear advantage of the novel
radiotracer is the lower abdominal radioactivity. The novel compound also showed stability
and low defluorination rate in vivo.
Keywords: acyclic nucleoside analogues; C-5 substituted pyrimidines; herpes simplex
virus type 1 thymidine kinase (HSV1-TK); positron emission tomography (PET); palladium-
catalysed cross-coupling reactions.
vii
SADRŽAJ
1. UVOD .............................................................................................................................. 1
2. OPĆI DIO......................................................................................................................... 5
2.1. Aciklički nukleozidni analozi..................................................................................... 6
2.1.1. Uvod .................................................................................................................. 6
2.1.2. Aciklovir............................................................................................................ 8
2.1.3. Ganciklovir...................................................................................................... 10
2.1.4. Penciklovir ...................................................................................................... 11
2.1.5. (S)-9-(2,3-dihidroksipropil)adenin .................................................................. 11
2.1.6. Sinteza acikličkih nukleozidnih analoga ......................................................... 12
2.2. Pozitronska emisijska tomografija ........................................................................... 14
2.2.1. Uvod ................................................................................................................ 14
2.2.2. Osnovni princip dobivanja PET-slike ............................................................. 16
2.2.3. Izbor radionuklida ........................................................................................... 17
2.2.4. PET-tragači za praćenje stanične proliferacije tumora ................................... 18
2.2.4.1 [18F]FLT ....................................................................................................... 19
2.2.4.2 [18F]FDG ...................................................................................................... 20
2.2.5. Praćenje ekspresije HSV1-tk pomoću metode PET ........................................ 22
2.2.5.1 Radiooznačeni nukleozidni analozi za praćenje ekspresije HSV1-tk .......... 24
2.2.5.2 C-6 supstituirani derivati pirimidina kao potencijalni netoksični
PET-radiotragači za praćenje ekspresije HSV1-tk ....................................... 27
2.3. Suicidalna genska terapija ........................................................................................ 32
2.3.1. Novi pristup selektivnom uništavanju tumorskih stanica ............................... 32
2.3.2. Citozin-deaminaza i 5-fluorcitozin.................................................................. 33
2.3.3. HSV1-TK/prolijek u suicidalnoj genskoj terapiji: put od antivirusnog do
antitumorskog lijeka........................................................................................ 34
2.4. Reakcije unakrsnog povezivanja katalizirane paladijem ......................................... 38
2.4.1. Sonogashira-ina reakcija ................................................................................. 38
2.4.2. Stille-ova reakcija............................................................................................ 39
3. REZULTATI I RASPRAVA ......................................................................................... 43
3.1. Uvod ......................................................................................................................... 44
viii
3.2. C-5 supstituirani hidroksietilni derivati pirimidina s 2,3-dihidroksipropilnim
lancem i lancem poput aciklovirnog, ganciklovirnog i penciklovirnog u
položaju N-1 pirimidina ........................................................................................... 46
3.2.1. Sinteza C-5 supstituiranih N-acikličkih pirimidinskih nukleozidnih
analoga (2338)............................................................................................... 46
3.2.2. Fosforiliranje hidroksietilnih N-acikličkih derivata pirimidina pomoću
enzima HSV1-TK............................................................................................ 55
3.3. Nukleozidni analog s lancem poput ganciklovirnog u položaju N-1 pirimidina
i 2-hidroksietilnim supstituentom u položaju N-3.................................................... 60
3.3.1. Sinteza N-1-[(1,3-dihidroksi-2-propoksi)metil]-N-3-(2-
hidroksietil)pirimidin-2,4-diona (46) .............................................................. 60
3.3.2. Fosforiliranje spoja 46 pomoću enzima HSV1-TK......................................... 61
3.4. Sinteza fluoriranog referentnog spoja HHB-5-FEP (52) i prekursora za
radiooznačavanje 53 ................................................................................................. 62
3.5. Radiokemija ............................................................................................................. 64
3.5.1. Radiosinteza spojeva HHB-5-[18F]FEP ([18F]52) i [18F]FHBG (56) .............. 64
3.5.2. Ispitivanje in vitro ulaska spoja HHB-5-[18F]FEP ([18F]52) u
transducirane stanice ....................................................................................... 66
3.5.3. Ispitivanje antitumorskog djelovanja in vitro spojeva 5, 7, 8, 10, 11, 18,
23−38, 49, 50, 52 i 53...................................................................................... 66
3.5.4. Praćenje aktivnosti HSV1-TK pomoću spoja HHB-5-[18F]FEP ([18F]52)
i [18F]FHBG (56) metodom PET..................................................................... 67
3.5.5. Biodistribucija ................................................................................................. 67
3.6. Strukturna analiza N-1 alkiliranih i O-2 alkiliranih regioizomera C-5
hidroksietilnog derivata pirimidina .......................................................................... 70
3.6.1. Analiza spektara 1H i 13C NMR ...................................................................... 70
3.6.2. Kristalna i molekulska struktura 5-(2-acetoksietil)-4-metoksipirimidin-2-
ona (10) ........................................................................................................... 71
3.7. Z- i E-izomeri fluoriranih C-6 izobutenilnih N-metilnih derivata timina i
prekursora za reakciju radiooznačavanja ................................................................. 73
3.7.1. Sinteza C-6 izobutenilnih N-metilnih derivata timina..................................... 73
3.7.2. Spektroskopska analiza1H, 13C i 19F NMR Z-/E-izomera spoja 69 i spoja
70 ..................................................................................................................... 76
ix
3.7.3. Ispitivanje antitumorskog djelovanja in vitro C-6 izobutenilnih derivata
timina............................................................................................................... 78
3.8. N-aciklički 5-supstituirani heteroarilni i alkinilni pirimidinski derivati .................. 79
3.8.1. Sinteza spojeva 7685 reakcijama unakrsnog povezivanja kataliziranih
paladijem ......................................................................................................... 79
3.8.2. Fosforiliranje N-acikličkog 5-(furan-2-il)pirimidinskog derivata 77
pomoću enzima HSV1-TK.............................................................................. 82
3.8.3. Kristalna i molekulska struktura spojeva 77, 80 i 85g .................................... 83
3.8.4. Ispitivanje antitumorskog djelovanja in vitro za spojeve 77, 81, 84ad,
85a i 85b.......................................................................................................... 85
4. EKSPERIMENTALNI DIO........................................................................................... 87
4.1. Opće napomene ........................................................................................................ 88
4.2. Reakcija fosforiliranja .............................................................................................. 89
4.2.1. Analiza HPLC produkata reakcije fosforiliranja............................................. 89
4.3. Pročišćavanje radiooznačenih spojeva HHB-5-[18F]FEP ([18F]52) i [18F]FHBG
(56) ........................................................................................................................... 90
4.4. Rentgenska strukturna analiza.................................................................................. 90
4.5. Ispitivanje in vitro ulaska radiooznačenog spoja u transducirane stanice................ 91
4.6. Praćenje aktivnosti HSV1-TK in vivo metodom PET.............................................. 92
4.7. Biodistribucija HHB-5-[18F]FEP ([18F]52) i [18F]FHBG (56) ex vivo ..................... 92
4.8. Antitumorska ispitivanja in vitro.............................................................................. 93
4.9. Pregled sintetiziranih spojeva................................................................................... 94
4.9.1. Pregled sintetiziranih 5-hidroksietilnih N- i O-acikličkih derivata
pirimidina i prekursora za njihovu sintezu...................................................... 94
4.9.2. Pregled sintetiziranih N-3-hidroksietilnih derivata pirimidina s lancem
poput ganciklovirnog u položaju N-1 i prekursora za njihovu sintezu ........... 95
4.9.3. Pregled sintetiziranih C-6 acikličkih derivata timina i prekursora za
njihovu sintezu ................................................................................................ 96
4.9.4. Pregled sintetiziranih N-acikličkih C-5 supstituiranih heteroarilnih i
alkinilnih derivata pirimidina .......................................................................... 97
4.9.5. Pregled zaštitnih skupina s označenom numeracijom atoma .......................... 98
4.10. Postupci za pripravu spojeva.................................................................................... 99
5. ZAKLJUČAK .............................................................................................................. 135
6. LITERATURA............................................................................................................. 139
x
xi
7. PRILOZI.............................................................................................................................
ŽIVOTOPIS ..............................................................................................................................
1. UVOD
UVOD
Pozitronska emisijska tomografija je neinvazivna dijagnostička i znanstvena metoda kojom
je moguće kvantitativno mjeriti različite fiziološke, biokemijske i molekulske procese u živim
tkivima koristeći molekule označene pozitron-emitirajućim radionuklidima. Te molekule su
dio biološkog procesa koji se prati te ih nazivamo molekulama tragačima1,2. Metoda PET se
primjenjuje u onkologiji, kardiologiji i neurologiji te ima važnu ulogu u razvoju lijekova.
Primjena metode PET u današnjoj onkologiji je ključna za dijagnozu i terapiju tumora.
Najčešće korišteni PET-radiotragač je analog glukoze, TT2'-deoksi-2'-[18F]fluor-D-glukoza
([18F]FDG), koji se klinički primjenjuje za detekciju tumora u ranoj fazi jer se akumulira i
radioaktivno raspada u stanicama koje su veliki potrošači glukoze kao što su stanice raka. No,
u kliničkoj primjeni [18F]FDG uočeni su i nedostatci, prije svega njezino nespecifično
nakupljanje u nemalignim stanicama, poput inflamatornih stanica, pa to može navesti na
pogrešno tumačenje rasta tumora. U odnosu na [18F]FDG, primjena nukleozida obilježenih
radioizotopima povoljnija je i specifičnija metoda za praćenje proliferacije tumorskih stanica.
Rak je jedan od najvećih zdravstvenih problema današnjice. Značajan napredak u razvoju
novih lijekova i terapija postignut je posljednjih 60 godina, a zahvaljujući otkriću lijekova kao
što su cisplatin, taksani i derivati dušikova iperita, uspješno se liječe neki oblici bolesti, iako
pacijenti moraju trpjeti neželjene nuspojave. Naime, tek su posljednjih godina postignuti
uspjesi u razvoju „ciljanih“ lijekova i terapija koje pokazuju manja popratna djelovanja.
Primjerice otkriće imatiniba (glivek) koji se primjenjuje u liječenju kronične mijeloične
leukemije (CML) navijestilo je početak novog razdoblja razvoja necitotoksičnih agensa koji
djeluju specifično (ciljano) na određene biološke mete.3 Usprkos tim postignućima, liječenje
mnogih vrsta tumora ostaje problematično, a stopa smrtnosti razočaravajuće visoka.4
Problemi kod liječenja tumora uspoređuju se s problemima pri odstranjivanju korova. Stanice
raka se mogu odstraniti kirurški, toksičnim kemikalijama ili radijacijom, ali teško je odstraniti
baš svaku stanicu. Kirurški se ne mogu ukloniti sve stanice raka, a lijekovi koji ubijaju stanice
raka štetni su i za normalne stanice. Ako i samo nekoliko stanica raka zaostane, one mogu
proliferirati, uzrokovati povratak bolesti, a za razliku od normalnih stanica, često postaju
otporne na citotoksične lijekove kojima se tretiraju.
Bitno je naglasiti da je liječenje tumora, bilo kirurški ili radiološkim tretmanom, obično
jedino moguće ako tumor nije metastazirao. Kako obično 55 % malignih tumora metastazira
prije nego se dijagnosticiraju, važna je rana dijagnoza tumora.
Jedan od novijih intenzivno istraživanih pristupa u liječenju raka je genska terapija tumorskih
stanica sa suicidalnim genom. Značajna je uloga metode PET za praćenje ekspresije gena za
timidin-kinazu virusa herpes simpleks tipa 1 (HSV1-tk) koji je najviše proučavani suicidalni
2
UVOD
gen u genskoj terapiji raka. Pristup se zasniva na unošenju gena HSV1-tk u tumorske stanice
pomoću odgovarajućeg nosača. Stanica u kojoj je izražen gen HSV1-tk proizvest će enzim
HSV1-TK. Tumorsko tkivo koje ima aktivnost enzima HSV1-TK tretira se s izabranim
prolijekom, netoksičnim antivirusnim spojem, kojeg virusna HSV1-TK prevodi u toksični
metabolit koji uzrokuje smrt stanice. Najčešće se rabi kombinacija enzima HSV1-TK i
prolijeka ganciklovira.5
Praćenje ekspresije HSV1-tk metodom PET je moguća preko interakcije produkta
spomenutog gena, enzima HSV1-TK, s odgovarajućom radiooznačenom molekulom tragačem
koja je supstrat spomenutog enzima.6,7
Kada se supstrati HSV1-TK označe pozitron-emitirajućim radioizotopom, najčešće 18F,
njihovi negativno nabijeni fosforilirani metaboliti ostaju zarobljeni u tumorskoj stanici jer ne
mogu prijeći kroz negativno nabijenu staničnu membranu, pri čemu emitiraju gama-zrake
koje se mogu detektirati PET-detektorom. Tako je moguće kvantitativno pratiti prostornu
raspodjelu molekule PET-tragača.
Sintetizirani su brojni radiooznačeni supstrati enzima HSV1-TK, kao molekule tragači s
potencijalnom primjenom u praćenju aktivnosti tog enzima primjenom metode PET, koji se
mogu svrstati u dvije osnovne skupine: analozi timidina koji je prirodni supstrat timidin-
kinaze, označeni radionuklidom 124I ili 18F i aciklički purinski nukleozidni analozi poput
ganciklovira ili penciklovira označeni izotopom 18F u pobočnom lancu ili na položaju C-8
purinske jezgre.8,9
Obećavajući kandidati za razvoj netoksičnih molekula tragača za praćenje ekspresije
HSV1-tk su derivati pirimidina u kojima se lanac koji zamjenjuje šećernu komponentu nalazi
na položaju C-6 pirimidina.10 Za vizualizaciju ekspresije HSV1-tk koriste se pirimidinski i
purinski analozi nukleozida, a za vizualizaciju stanične proliferacije najviše se koriste
pirimidinski derivati timidina. Pirimidinski nukleozidni analozi općenito su pokazali znatno
manju citotoksičnost u odnosu na purinske nukleozidne analoge.
Purinski analog [18F]FHBG se smatra zlatnim standardom u kliničkim ispitivanjima za
vizualizaciju HSV1-tk metodom PET. Negativna strana njegove uporabe je nakupljanje u
području abdomena jer se izlučuje putem jetre i žuči, a u usporedbi s pirimidinskim
derivatima manje je osjetljiv na HSV1-TK. Potreba za novim molekulama tragačima koji
nemaju nedostatke postojećih PET-tragača, kao što su nepovoljna farmakokinetika i
citotoksična nuzdjelovanja, rezultirala je pripravom novih supstrata enzima HSV1-TK.
Istraživanja su pokazala kako prisutnost atoma fluora u organskoj molekuli povećava
elektrostatske interakcije i može pridonijeti boljem vezanju fluoriranih molekula na aktivno
3
UVOD
4
mjesto enzima.11 Tako od ukupnog broja lijekova odobrenih za kliničku primjenu, 20–25 %
lijekova sadrži barem jedan atom fluora u svojoj strukturi. S obzirom da je atom fluora malen,
uvođenje fluora u molekulu ima zanemarive steričke utjecaje. Međutim, fluor utječe na
fizikalno-kemijska i konformacijska svojstva molekula. S obzirom da je fluor
najelektronegativniji element, njegovo uključivanje u strukturu molekule utječe na kiselost,
odnosno bazičnost susjednih funkcionalnih skupina, što ima za posljedicu odgovarajuću
bioraspoloživost molekule. Fluor, pored toga, utječe i na lipofilnost molekule.
Monofluoriranje ili trifluormetiliranje zasićenih alkilnih skupina smanjuje lipofilnost zbog
snažnog elektron-odvlačećeg utjecaja fluora, dok fluoriranje aromata, polifluoriranje, te
fluoriranje atoma u čijem susjedstvu se nalaze atomi s π vezom povećava lipofilnost
molekule. Dobro preklapanje 2s ili 2p orbitala fluora s odgovarajućim orbitalama ugljika čini
vezu C-F slabo polariziranom, a to pridonosi povećanoj lipofilnosti molekule. Uvođenje
fluora u molekulu također povećava otpornost molekule prema metaboličkoj razgradnji.
2. OPĆI DIO
OPĆI DIO
2.1. Aciklički nukleozidni analozi
2.1.1. Uvod
Aciklički nukleozidni analozi su sintetski analozi prirodnih nukleozida u kojima je šećerni
prsten zamijenjen acikličkim dijelom, lancem koji oponaša dio ili cijeli prsten. Imaju važnu
ulogu u modernoj medicini prvenstveno kao snažni antivirusni lijekovi.12 Neki od
najpoznatijih acikličkih nukleozidnih analoga za liječenje infekcija uzrokovanih herpes
virusima su (S)-9-(2,3-dihidroksipropil)adenin ((S)-DHPA), te N-9-aciklički derivati gvanina:
aciklovir (9-(2-hidroksietoksimetil)gvanin, ACV), ganciklovir (9-(1,3-dihidroksi-2-
propoksimetil)gvanin, GCV) i penciklovir (9-[4-hidroksi-3-(hidroksimetil)butil]gvanin, PCV)
(TTslika 1). Navedeni su nukleozidni analozi prolijekovi jer se njihovo antivirusno djelovanje
zasniva na konverziji in vivo u aktivni trifosfatni oblik, lijek. Trifosfatni aciklički nukleotidi
se ne mogu primijeniti jer u takvom obliku ne mogu proći kroz staničnu membranu.
Mehanizam djelovanja acikličkih nukleozidnih analoga sastoji se u inhibiciji virusne DNA-
polimeraze, što uzrokuje prekid replikacije DNA-lanca tj. daljnje umnažanje virusa i njegovo
inficiranje zdravih stanica.13 Virusna DNA-polimeraza je enzim koji ima važnu ulogu u
replikaciji virusa i izgradnji lanca DNA od odgovarajućih nukleotida. Da bi inhibirali
spomenuti enzim, većina acikličkih nukleozidnih analoga zahtijeva konverziju in vivo u
trifosfat. Konverziju acikličkih nukleozidnih analoga u monofosfat kataliziraju virusne
kinaze. Kinaze su enzimi koji kataliziraju prijenos γ-fosfatne skupine s adenozin-trifosfata
(ATP) na 5'-OH skupinu nukleozida, - ili β-fosfatnu skupinu nukleotida. Postoje dvije
poznate timidin-kinaze u sisavaca, mitohondrijska i citoplazmatska.
Stanica zaražena s herpes virusom proizvodi virusnu timidin-kinazu koja nije toliko
strukturno selektivna kao timidin-kinaza iz čovjeka (hTK). To znači da virusna timidin-kinaza
može, osim prirodnog supstrata timidina, fosforilirati i mnoge pirimidinske i purinske
nukleozidne analoge. Fleksibilnost lanca acikličkih nukleozidnih analoga omogućava im da
zauzmu konformaciju pogodnu za interakciju s enzimom, kao supstrati ili inhibitori.14 Kao
'lažni' supstrati, aciklički nukleozidni analozi kompetitivno inhibiraju fosforiliranje timidina i
smanjuju količinu timidinskog nukleotida u zaraženoj stanici.15 Daljnje fosforiliranje u di- i
trifosfat kataliziraju stanične kinaze čovjeka. U trifosfatnom obliku aciklički nukleozidni
analozi inhibiraju DNA-polimerazu, natječu se s prirodnim supstratima za ugradnju u rastući
lanac DNA i ugrađuju se u lanac DNA, pri čemu dolazi do terminacije lanca ili usporavanja
produljenja lanca virusne DNA. Kako acikličke nukleozidne analoge može fosforilirati u
6
OPĆI DIO
monofosfatni derivat samo virusna timidin-kinaza, oni će antivirusno djelovanje pokazati
samo u stanicama zaraženim virusom, i to je razlog njihovog selektivnog djelovanja.
HN
N
N
O
H2N NO
OH
OH
2'-deoksigvanozin(dG)
N
HNN
N
O
H2N O OH
OH
1'2' 3'
4' 5'
N
HNN
N
O
H2N O OH
OH
N
HN N
N
O
H2N OH
OH
aciklovir; ACV ganciklovir; GCV penciklovir; PCV
N
N N
N
NH2
O
OH
OH
OH
N
NN
N
NH2
O OH
OHHO
adenozin (S)-DHPA
Slika 1. Strukture izabranih acikličkih nukleozidnih analoga. Radi usporedbe s prirodnim
nukleozidima 2'-deoksigvanozinom i adenozinom isprekidanim linijama je označen dio šećera
koji nije dio strukture acikličkih nukleozidnih analoga.16
7
OPĆI DIO
2.1.2. Aciklovir
Interes za sintezu acikličkih nukleozidnih analoga započeo je 70-tih godina prošlog
stoljeća kada je prvi put objavljeno antiherpesno djelovanje aciklovira, koji je poslužio
znanstvenicima kao modelni spoj za razvoj strukturno sličnih spojeva. U usporedbi s
prirodnim purinskim nukleozidom, 2'-deoksigvanozinom, kod aciklovira je ciklička 2'-
deoksiriboza zamijenjena 2-hidroksietoksimetilnim lancem (slika 1 i 2).
GOHO
HO
GOHO
HO
G = gvanin
aciklovir; ACV 2'-deoksigvanozin
Slika 2. Usporedba strukture ACV i 2'-deoksigvanozina.16
Djelovanje aciklovira na herpes viruse je selektivno, a istovremeno je slabo toksičan za
nezaražene stanice, stoga se otkriće aciklovira smatra početkom novog doba selektivnog
pristupa antivirusnoj terapiji.17,18 Smatra se zlatnim standardom za liječenje infekcija
uzrokovanih herpes simpleks virusima tipa 1 i 2 (HSV1, HSV2), varicella zoster virusom
(VZV) i citomegalovirusom (CMV).
Antiherpesno djelovanje aciklovira proizlazi iz toga da virusni enzim timidin-kinaza (TK)
fosforilira aciklovir do monofosfatnog derivata ACV-MP. Stanični enzim TK dalje fosforilira
ACV-MP u di- (ACV-DP) i na kraju u trifosfatni derivat (ACV-TP). Trifosfatni derivat se,
kao zamjenski supstrat, ugrađuje u rastući lanac virusne DNA, inhibira DNA-polimerazu
herpes virusa i uzrokuje terminaciju DNA-lanca (slika 3).19 Naime, iako je aciklovir
strukturno sličan prirodnom nukleozidu, nema 3'-OH skupinu pa se nakon njegove ugradnje u
rastući lanac DNA daljnji nukleotidi ne mogu dodavati u lanac DNA čime je njegova
replikacija završena. Kako ACV-TP pokazuje znatno veću inhibiciju virusne DNA-
polimeraze u odnosu na staničnu α-DNA-polimerazu, aciklovir ima selektivno djelovanje.
8
OPĆI DIO
HN
N N
N
O
H2NO
HO
HSV1-TK
HN
N N
N
O
H2NO
HO
O
kompetitivnainhibicija virusne DNA polimeraze
ugradnja u DNA
HN
N N
N
O
H2N
OP
OH
-OO
OP
OH
OOP
OH
-OO
O
HN
N N
N
O
H2N
OP
OH
O
OP
OH
OOP
OH
-OO
O
HN
N N
N
O
H2N
OP
OH
O
ACV
ACV-MP
ACV-TP
ATP
ADP
stanica u kojoj nema
virusne TK
Slika 3. Prikaz mehanizma djelovanja aciklovira kao inhibitora DNA-polimeraze.13
Nedostatak aciklovira je njegova slaba oralna bioraspoloživost, kratko zadržavanje u
citoplazmi i slaba topljivost u vodi. S ciljem dobivanja spojeva s boljim svojstvima,
sintetizirano je nekoliko esterskih derivata aciklovira: L-valilni ester aciklovira (valaciklovir),
glicil–aciklovir i alanil–aciklovir (slika 4). Valaciklovir se u oralnoj terapiji primjenjuje kao
prolijek aciklovira. Hidrolizom in vivo prevodi se u aciklovir.20
HN
N N
N
O
H2NO
ONH2
O
alanil-ACV NH3
HN
N N
N
O
H2NO
ONH2
O
valaciklovir
HN
N N
N
O
H2NO
ONH2
O
glicil-ACV
Slika 4. Strukture esterskih derivata aciklovira i aminokiselina.
9
OPĆI DIO
2.1.3. Ganciklovir
Ganciklovir (GCV) se strukturno razlikuje od aciklovira jer u lancu koji imitira šećer ima
OH skupinu ekvivalentnu 3'-OH skupini u prirodnom 2'-deoksigvanozinu (slika 1).21
TTPrvenstveno se koristi u liječenju bolesti uzrokovanih citomegalovirusom (CMV) u osoba
s oslabljenim imunološkim sustavom. Kako je oralna bioraspoloživost GCV slaba,
primjenjuje se valilni ester GCV, valganciklovir (slika 5).20
HN
N N
N
O
H2N
ONH2
O
valganciklovir
OH
Slika 5. Struktura valilnog estera ganciklovira.
Mehanizam selektivnog djelovanja ganciklovira u stanicama zaraženim virusom CMV i
HSV sličan je mehanizmu djelovanja aciklovira i temelji se na procesu fosforiliranja koji se
provodi u tri stupnja djelovanjem odgovarajućih enzima. Prvi stupanj fosforiliranja katalizira
virusna timidin-kinaza. Prevođenje u di- i trifosfatne derivate (GCV-DP i GCV-TP) katalizira
stanična gvanilat-kinaza, a potom nekoliko staničnih kinaza, među kojima je i fosfoglicerat-
kinaza. S obzirom da je GCV-TP analog prirodnog purinskog nukleotida 2'-deoksigvanozin-
trifosfata (dG-TP), GCV-TP postaje supstrat DNA-polimeraze koju kompetitivno inhibira u
odnosu na prirodni supstrat. GCV-TP se umeće u rastući lanac DNA. Iako GCV ima
hidroksilne skupine analogne 3'- i 5'-hidroksilnim skupinama koje se nalaze u prirodnom
nukleozidu i koje omogućuju produljenje lanca DNA, nedostatak potpunog šećernog prstena
čini GCV-TP lošim supstratom za produljenje lanca DNA.21,22
10
OPĆI DIO
2.1.4. Penciklovir
Penciklovir (PCV) je strukturno srodan gancikloviru, međutim u lancu koji imitira šećer
umjesto atoma kisika nalazi se metilenska skupina (slika 1).23 Pokazao je aktivnost na viruse
HSV1, HSV2, VZV i Epstein Barr virus (EBV).
Konverzijom odgovarajućim kinazama nastaje penciklovir-trifosfat (PCV-TP) koji
kompetitivno inhibira DNA-polimerazu u odnosu na prirodni supstrat dG-TP. Ugrađuje se u
lanac DNA, ali zbog nedostatka cikličkog šećera smanjuje brzinu sinteze DNA. Iako je
konverzija PCV učinkovitija od konverzije ACV u odgovarajući monofosfatni derivat
pomoću virusne TK, ACV-TP je, kao inhibitor HSV DNA-polimeraze, aktivniji od PCV-TP.
S obzirom da PCV pokazuje slabiju oralnu bioraspoloživost od ACV, sintetiziran je oralni
prolijek penciklovira 9-[4-acetoksi-3-(acetoksimetil)butil]-6-deoksigvanin, famciklovir, koji
konverzijom in vivo pomoću enzima koji kataliziraju deacetiliranje i oksidaciju purinskog
nukleozida daje PCV (slika 6).
N
NN
NH2N
OAc
famciklovir
OAc
Slika 6. Struktura prolijeka penciklovira, famciklovira.
2.1.5. (S)-9-(2,3-dihidroksipropil)adenin
(S)-9-(2,3-dihidroksipropil)adenin ((S)-DHPA) je antivirusni lijek širokog spektra
djelovanja koji pokazuje podjednako djelovanje protiv DNA- i RNA-virusa. Spoj su prvi
sintetizirali E. de Clercq i A. Holy sredinom sedamdesetih godina prošlog stoljeća.24 Struktura
DHPA je temeljena na adeninu na koji je u N-9 položaju vezan aciklički dihidroksipropilni
lanac (slika 1). Pokazao se djelotvornim protiv infekcija uzrokovanih virusima HSV. Svrstava
se u skupinu inhibitora S-adenozilhomocistein-hidrolaze (SAH).25 Mehanizam djelovanja
DHPA sličan je djelovanju ostalih acikličkih i karbocikličkih analoga adenina, a zasniva se na
inhibiciji enzima SAH-hidrolaze, pri čemu je onemogućeno cijepanje molekule SAH u dvije
komponente, homocistein i adenozin. Posljedica toga je nakupljanje molekule SAH u stanici.
11
OPĆI DIO
S obzirom da je SAH i produkt reakcije metiliranja virusne mRNA primjenom S-
adenozilmetionina (SAM), kao donor metilne skupine, dolazi do inhibicije te reakcije i na taj
način do prekidanja replikacije virusa jer je reakcija metiliranja bitna za stabilnost i
funkcioniranje mRNA virusa (slika 7).
Slika 7. Prikaz mehanizma djelovanja inhibitora SAH-hidrolaze.25
Timidin-kinaza virusa herpes simpleks (HSV1-TK) posljednjih se godina pokazala
značajnom kao suicidalan gen u genskoj terapiji malignih tumora, a kako fosforilirani
metaboliti antivirusnih spojeva ostaju zarobljeni u stanici jer su negativno nabijeni kao i
stanična membrana, radiooznačavanje takvih antivirusnih spojeva s pozitron-emitirajućim
izotopom može se iskoristiti za praćenje aktivnosti virusne timidin-kinaze primjenom metode
PET.
2.1.6. Sinteza acikličkih nukleozidnih analoga
Sinteza acikličkih nukleozidnih analoga uglavnom se sastoji od sinteze odgovarajućeg
lanca te potom povezivanja tog lanca s odgovarajuće supstituiranom purinskom ili
pirimidinskom bazom. Zbog prisutnosti više dušikovih atoma u nukleozidnoj bazi obično
nastaje smjesa regioizomera što stvara probleme prilikom pročišćavanja. Aciklonukleozidi se
mogu sintetizirati reakcijom nukleozidne baze s -klormetilnim eterima u prisutnosti jake
baze26 ili reakcijom sililiranih nukleozidnih baza s aktiviranim aglikonom i uz Lewisovu
kiselinu kao katalizator (Vorbrüggen-ova sinteza).27,28 Ostali pristupi uključuju
transglikoziliranje katalizirano kiselinom,29,30 te oksidaciju pentoze nukleozida.31
Pirimidinske baze se mogu pripraviti Shaw-ovom sintezom, dok se purinske baze obično
12
OPĆI DIO
sintetiziraju Traube-ovom sintezom koja uključuje povezivanje amino supstituiranih
pirimidina, a potom ciklizaciju s mravljom kiselinom.32
Jedan od načina sinteze spoja GCV je alkiliranje trimetilsililirane gvaninske baze (2), te
acikličkog klormetilnog etera (4) koji je pripremljen klormetiliranjem 1,3-dibenziloksipropan-
2-ola (3) (shema 1) uz tetrabutilamonijev fluorid kao katalizator.33 Nastaje smjesa N-7 (5) i N-
9 (6) izomera u omjeru 2 : 1, koji se mogu uspješno odvojiti prekristalizacijom u etanolu.
Nakon uklanjanja zaštitnih skupina u N-9 alkiliranom izomeru izolira se GCV (7).
HN
N NH
N
O
H2N
A) B)
NH(SiMe3)2
HN
N N
N
O
H2NO
PhH2CO
PhH2CO
N
N N
N
OSiMe3
Me3SiN
SiMe3
PhH2CO
PhH2CO
OH
PhH2CO
PhH2CO
OCH2Cl
HN
N N
N
O
H2N
O
OCH2PhOCH2Ph
HN
N N
N
O
H2NO
HO
HO
(CH2O)n
HCl (g)
Bu4NF
Pd
C)
7, GCV
1
2
3
4
5 6
EtOH
Shema 1. Sinteza GCV. A) modifikacija purinske baze; B) sinteza odgovarajućeg lanca; C)
reakcija alkiliranja i uklanjanje zaštitne skupine.
13
OPĆI DIO
2.2. Pozitronska emisijska tomografija
2.2.1. Uvod
PET je neinvazivna metoda molekulske vizualizacije kojom je moguće kvantitativno
promatrati biološke procese u živim organizmima koristeći molekule označene pozitron-
emitirajućim radionuklidima, molekule tragače, koje su dio biološkog procesa koji se prati.1,2
Jedna je od najnaprednijih metoda za praćenje molekulskih interakcija in vivo, distribucije,
farmakokinetike i farmakodinamike molekula. Metoda PET koristi radiofarmaceutike u vrlo
malim količinama (mikrogrami i pikogrami) pri čemu oni imaju zanemarive farmakološke
utjecaje i toksičnost.
U posljednja tri desetljeća raste interes za primjenu metode PET u medicinske svrhe, kao i
u znanstvenim i kliničkim ispitivanjima različitih oboljenja. Tako se danas ova metoda
uspješno primjenjuje u onkologiji, kardiologiji34,35 i neurologiji36 te ima važnu ulogu u
razvoju lijekova i procjeni njihovog djelotvornog djelovanja. Bitne informacije o
farmakokinetici i metabolizmu lijeka mogu se dobiti radiooznačavanjem kandidata lijeka.37
Pirimidinski analog 5-fluoruracil (5-FU) najčešće je korišteni lijek za liječenje raka dojke,
raka gastrointestinalnog trakta i raka jetre.38 5-FU inhibira enzim timidilat-sintazu koji
sudjeluje u sintezi DNA. Primjenom dinamičkog PET-a objašnjena je farmakokinetika i
metabolizam tog lijeka u zdravom i malignom tkivu.39 Metoda PET ne razmatra samo jednu
izdvojenu funkciju ili metabolizam već dobivena slika ovisi o radiotragaču i njegovom
metabolizmu. Mnoge biološki važne molekule mogu se izabrati za radiooznačavanje.
Najčešće korišteni PET-radiotragač je [18F]FDG koji se koristi u onkologiji za promatranje
metabolizma glukoze jer je on uglavnom povećan u neoplastičnom tkivu u odnosu na
normalno tkivo. Osim metabolizma glukoze, u tumorskom su tkivu promijenjeni i mnogi
drugi metabolički putevi što se može pratiti uz odgovarajuće PET-tragače (tablica 1).
14
OPĆI DIO
Tablica 1. Metabolizam i funkcije koje su promijenjene u neoplastičnom tkivu i PET-tragači
koji se koriste za njihovo praćenje.
funkcija/metabolizam PET-tragač
metabolizam glukoze [18F]fluordeoksiglukoza (FDG)
replikacija DNA/stanična proliferacija [11C]timidin
[18F]fluortimidin (FLT)
sinteza proteina, transport aminokiselina [11C]metionin (MET)
[18F]fluoretiltirozin (FET)
[18F]fluormetiltirozin (FMT)
[18F]fluordihidroksifenilalanin (F-DOPA)
sinteza membranskih lipida [18F]fluoracetat
[11C]kolin
[18F]fluorkolin (FCH)
hipoksija [18F]fluormisonidazol (FMISO)
apoptoza [18F]fluoraneksin V
angiogeneza [18F]fluorgalakto-RDG
reporterski geni pirimidinski i purinski derivati označeni
izotopima 18F ili 124I (FIAU, FEAU, FHBG)
kontrola terapije tumora [18F]fluoruracil (FU)
vezanje za estrogenski receptor [18F]fluorestradiol (FES)
vezanje za somatostatinski receptor [68Ga]galij-DOTATOC/DOTANOC
Za razliku od metoda MRI (Magnetic Resonance Imaging), CT (Computed Tomography)
ili rentgenskog snimanja koji daju slike anatomije (veličine i položaja) pojedinih organa, PET
prati biokemijske promjene u tkivima koje se pojavljuju prije vidljivih znakova bolesti
uočljivih drugim metodama i smatra se najpreciznijom metodom za kvantitativnu analizu
dinamičkih biokemijskih procesa in vivo, poput stanične proliferacije, enzimskih reakcija,
interakcija liganda i receptora i staničnog metabolizma. Dok se primjenom metode CT, MRI i
rentgenskog ili ultrazvučnog snimanja mogu vidjeti promjene u veličini tumora do kojih može
doći tjednima ili mjesecima nakon antitumorskog tretmana, PET omogućuje promatranje
metaboličkih promjena u tumoru koje uslijede odmah nakon antitumorskog tretmana.40
15
OPĆI DIO
Poseban izazov navedenog molekulskog praćenja je, osim razvoja odgovarajućih
instrumenata koji omogućuju vizualizaciju bioloških procesa detekcijom signala molekule
tragača, izbor molekula tragača koje su uključene u biološki proces koji se prati.
Razvoj novih molekula tragača složeni je interdisciplinaran pristup koji se sastoji od
organske sinteze, radiooznačavanja molekule tragača te bioloških ispitivanja in vitro i in vivo
radiooznačenog spoja.
2.2.2. Osnovni princip dobivanja PET-slike
Metoda PET se zasniva na detekciji γ-zračenja koje se emitira iz tijela pacijenta u koje je
unešen pozitron-emitirajući radiofarmaceutik. -zračenje je rezultat raspada nestabilnih
jezgara pozitron-emitirajućih izotopa. Na osnovu informacija o detektiranim γ-zrakama,
računalo daje prostornu raspodjelu radiotragača unutar pacijenta (slika 8).2 Pozitron je
protučestica elektrona koja ima istu masu i spin kao elektron, ali suprotan električni naboj.
Pozitron putuje 1 do 2 mm u tkivu i nailaskom na elektron susjednog atoma dolazi do
anihilacije (međusobnog poništavanja) i emisije dviju γ-zraka (fotona energije 511 KeV) koje
su međusobno pod kutom od 180° (slika 8).
Slika 8. Dobivanje PET-slike. A) Nakon sudara pozitrona i elektrona nastaju dva fotona
jakosti 511 KeV; B) PET-skener detektira γ-zrake nastale raspadom radionuklida.2
Kada γ-zrake istovremeno dođu do scintilacijskog detektora, nastaje signal. Fotonska
energija koju apsorbira detektor ponovno se emitira kao vidljiva svjetlost koju detektira
fotomultiplikator koji svjetlosni signal konvertira u strujni signal koji je proporcionalan
energiji fotona. Detektirani signali oblikuju se kao prikaz prostorne raspodjele radioaktivnosti
u organizmu i mogu biti prikazani kao presjeci (tomografija) ili se oblikuju u trodimenzijsku
16
OPĆI DIO
sliku. PET je kvantitativna metoda koja mjeri prostornu koncentraciju radiotragača u tkivu s
visokom točnošću (u pikomolarnoj razini). Detekcija γ-zraka omogućuje rekonstrukciju slike i
otkrivanje položaja i veličine tumora svega nekoliko milimetara.
Osim slikovnog prikaza raspodjele radiofarmaceutika, potrošnja radiofarmaceutika u
određenom području može se kvantificirati te usporediti s ostalim dijelovima organizma.
Uzimajući u obzir težinu, visinu i površinu tijela pacijenta te dozu radiofarmceutika,
izračunava se metabolička aktivnost pojedine regije, a izražava se u tzv. SUV-indeksima
(Standardized Uptake Values).
koncentracija radioaktivnosti u tkivu (MBq/g) SUV =
unesena radioaktivnost (MBq/masa tijela (g))
2.2.3. Izbor radionuklida
Kako pozitron-emitirajući radionuklidi kao što su 11C, 13N i 15O mogu zamijeniti stabilne
analoge u lijekovima i biomolekulama, moguće je sintetizirati PET-tragač s istim kemijskim i
biološkim svojstvima koje ima odgovarajući neoznačeni analog. Izbor radionuklida ovisi o
njihovim fizikalnim i kemijskim svojstvima, dostupnosti i vremenu poluživota radionuklida
koje bi trebalo omogućiti radiosintezu molekule tragača (ponekad su radiosinteze dugotrajne),
te o trajanju promatranog biološkog procesa. Emisija pozitrona je karakteristika jezgre koja je
osiromašena neutronima. Radionuklidi kao što su 68Ga i 124I emitiraju pozitrone velike
energije što rezultira smanjenom rezolucijom konačne slike jer je doseg pozitrona u tkivu
prije anihilacije s elektronom velik. Radionuklidi koji se najčešće koriste u pozitronskoj
emisijskoj tomografiji su 11C (t1/2 = 20,4 min), 13N (t1/2 = 9,9 min), 15O (t1/2 = 2 min), 68Ga (t1/2
= 68 min), 18F (t1/2 = 109,8 min), 64Cu (t1/2 = 12,7 h) i 124I (t1/2 = 4,12 d).34
Radiooznačavanjem spoja izotopom 11C nastaje radiotragač sa svojstvima koja se ne
razlikuju od odgovarajuće neoznačene molekule, osim u malim kinetički izotopnim efektima.2
Radiosinteza spojeva označenih izotopom 11C mora biti jednostavna i kratka s obzirom na
njegovo kratko vrijeme poluživota, a spojevi označeni s ovim izotopom mogu se primijeniti
za praćenje ranih faza u metabolizmu.
Izotop 18F je zbog svojih dobrih kemijskih i nuklearnih svojstava najčešće korišteni
radionuklid u dijagnostici i farmakološkim istraživanjima primjenom metode PET. Prvi je put
proizveden 1936. godine i četiri godine kasnije primijenjen u istraživanju adsorpcije fluorida
17
OPĆI DIO
u kostima i caklini. Danas se ovaj radionuklid uspješno koristi u kliničkoj onkologiji s
radiofarmaceutikom [18F]FDG.
Osim najčešće primjenjivanog [18F]FDG-a, ostali radiofarmaceutici obilježeni izotopom 18F u čestoj komercijalnoj primjeni jesu [18F]kolin (FCH), [18F]tirozin (FET) i [18F]DOPA.
Dobro svojstvo izotopa 18F je da se može proizvesti u dobrom iskorištenju čak i u
ciklotronu niže energije. Relativno dugo vrijeme poluživota ovog izotopa (109,7 min)
omogućava zahtjevniju radiosintezu, dopremanje tragača s udaljenih mjesta proizvodnje, a
istraživanja bioloških procesa mogu trajati duže. Radionuklid 18F ima nisku energiju β+
pozitrona od 635 keV što omogućuje visoku rezoluciju slike PET, jer je linearni doseg
pozitrona u tkivu mali (1–2 mm), kao i male doze radijacije prema pacijentima prilikom
primjene [18F]radiofarmaceutika. Izotop 18F prostorno može, također, zamijeniti atom vodika
jer su Van der Waals-ovi polumjeri ovih atoma slični, ali se razlikuju u elektronskoj gustoći.
Najčešći i najučinkovitiji način proizvodnje izotopa 18F visoke molarne aktivnosti je iz
vode obogaćene izotopom 18O koja se koristi kao meta u ciklotronu uz protonsku zraku
relativno male energije (oko 18 MeV). Kemijske reakcije za uvođenje izotopa 18F u molekulu
primjenjive su za 'hladnu' kemiju i radiokemiju. Provođenje radiokemije zahtijeva, iz
sigurnosnih razloga, primjenu zaštićenih prostora u kojima se te reakcije odvijaju (hot cells).
Same reakcije uvođenja nuklida 18F mogu se podijeliti na reakcije elektroflne i nukleofilne
supstitucije, među kojima su reakcije nukleofilne supstitucije zastupljenije.
2.2.4. PET-tragači za praćenje stanične proliferacije tumora
Radiooznačeni nukleozidni analozi istražuju se i primjenjuju kao molekule tragači u
metodi PET za vizualizaciju proliferirajućih tumorskih stanica kako bi doprinijeli
učinkovitosti primijenjene radioterapije i kemoterapije. Ti se spojevi mogu, također, koristiti
za praćenje ekspresije gena i genske terapije kako bi se dobile informacije o položaju stranog
gena u organizmu, odnosno o njegovoj ekspresiji.41
Brzina proliferacije upućuje na to da li je tumor benigni ili maligni (invazivni) i bitna je za
karakterizaciju malignih tumora. Sadašnje metode koje procjenjuju proliferaciju tumora su
uglavnom invazivne i temelje se na uzimanju uzorka tumorskog tkiva biopsijom.41
Neinvazivne metode procjene proliferacije tumorskog tkiva omogućile bi praćenje utjecaja
terapije antitumorskim lijekovima i lijekovima koji su u razvoju na tumore.42 Jedna od takvih
neinvazivnih metoda je metoda PET. Mnoge se istraživačke skupine bave sintezom PET-
tragača s potencijalnom primjenom u praćenju proliferacije tumora. Jedan takav potencijalni
18
OPĆI DIO
PET-tragač je analog timidina, 3'-deoksi-3'-[18F]fluortimidin ([18F]FLT) (slika 9) koji je
ispitan klinički na pacijentima s rakom pluća, malignim gliomom, rektalnim rakom te
limfomom.35,43
2.2.4.1 [18F]FLT
[18F]FLT ima veliki afinitet za TK1, izoenzim timidin-kinaze koji se nalazi u citoplazmi.44
Fosforiliranje FLT-a se odvija na skupini 5'-OH (slika 9). Kako se na položaju 3' timidina
umjesto OH skupine nalazi elektron-odvlačeći atom fluora koji stabilizira glikozidnu vezu C-
N, [18F]FLT je otporan na metaboličku razgradnju pomoću enzima timidin-fosforilaze i
pucanje glikozidne veze što je prednost za praćenje in vivo.45
OO
HN
N
18F
OHO
HN
NO
[18F ]FLT
18F
O
OO
P-O O
OH
[18F]FLT-MP
TK1
Slika 9. 3'-Deoksi-3'-[18F]fluortimidin ([18F]FLT) i njegovo fosforiliranje pomoću enzima
TK1.
Za razliku od drugih nukleozidnih molekula tragača, [18F]FLT se gotovo ne umeće u lanac
DNA jer fluor na položaju 3' šećera inhibira njegovu ugradnju u rastući lanac DNA, a njegovo
zadržavanje u stanici ovisi uglavnom o aktivnosti enzima TK1.40 Količina enzima TK1 ovisi o
staničnom ciklusu i visoka je tijekom faza S (replikacija DNA), G2 (priprema za mitozu) i M
(mitoza stanice), a niska tijekom faza G0 (mirovanje stanice) i G1 (rast stanice) staničnog
ciklusa. Može se zaključiti da je enzimska aktivnost TK1 odraz sinteze DNA. Istraživanja su
tako pokazala da se sinteza TK1 poveća 10 puta kada stanica uđe u fazu sinteze DNA u
odnosu na fazu G1.46 Lokalizirano nakupljanje radioaktivnosti ([18F]FLT-fosfata) odraz je,
dakle, sinteze DNA odnosno umnažanja stanica tumora i na taj se način može pratiti dinamika
proliferacije malignih stanica. [18F]FLT prati i normalnu proliferativnu aktivnost stanica
19
OPĆI DIO
koštane srži koje se često dijele pa je vizualizacija tumora u tom predjelu kao i u području
jetre otežana.
Radiotragač 1-(2'-deoksi-2'-[18F]fluor-β-D-arabinofuranozil)timin ([18F]FMAU) prati
aktivnost enzima TK2 koja je pojačana prilikom sinteze DNA u mitohondrijima (slika 14).
Nakupljanje [18F]FMAU u tkivu nije mjera stanične proliferacije, ali je pokazatelj ukupne
mase mitohondrija u tkivu.47
2.2.4.2 [18F]FDG
Najznačajniji i najčešće primjenjivan radiofarmaceutik u kliničkoj primjeni je analog
glukoze, [18F]FDG, obilježen pozitron-emitirajućim izotopom 18F koji zamjenjuje OH
skupinu na položaju 2' u glukozi (slika 10). [18F]FDG se koristi u onkologiji za dijagnostiku i
praćenje rasta tumora.42,48
OOH
[18F]FDGD-glukoza
HO
HOOH
OH
OOH
HO
HO 18F
OH
Slika 10. Strukture [18F]FDG i D-glukoze prikazane kao β-D-glukopiranoza.
Jedan od načina sinteze [18F]FDG-a je reakcijom nukleofilne supstitucije s 18F– ionom.
Kriptofiks2.2.2. (K2.2.2.) je krunasti eter koji se koristi kao katalizator za povećanje
nukleofilnosti fluoridnih iona jer stvara kompleks s kalijevim ionima i čini fluoridni ion
reaktivnijim (slika 11).
Slika 11. Princip djelovanja kriptofiksa. Krunasti eter kompleksira s ionima K+.
20
OPĆI DIO
Kao odlazeća skupina u reakciji s fluoridnim ionom koristi se triflatna skupina, a
hidroksilne su skupine prevedene u acetilne. Nakon fluoriranja uz [18F]KF i kriptofiks2.2.2. te
kisele ili bazne hidrolize, izolira se [18F]FDG (shema 2). Za kliničku primjenu [18F]FDG-a,
sinteza ovog spoja potpuno je automatizirana.49
[18F]KF, K2.2.2. H3O+ (HCl)O
OAc
[18F]FDGD-Glukoza
AcO
AcO OTfOAc
OOAc
OAc
OOH
AcO HO
AcO 18F HO 18FOAc
Shema 2. Dobivanje [18F]FDG-a reakcijom nukleofilne supstitucije.
Nakon intravenozne primjene [18F]FDG se nakuplja u stanicama kao i neoznačena glukoza.
Ekspresija proteinskog transportera za glukozu (Glu1) omogućuje da [18F]FDG uđe u stanicu.
Enzim heksokinaza koji prevodi glukozu u glukozu-6-fosfat fosforilira i [18F]FDG u
[18F]FDG-6-fosfat unutar stanice.42 Slike PET [18F]FDG-a odražavaju tako aktivnost enzima
heksokinaze. Kako je za daljnju glikolizu potrebna hidroksilna skupina na položaju 2',
negativno nabijena radiooznačena molekula nakuplja se u stanici, radioaktivno se raspada i
tako šalje signale iz stanica s povećanom potrošnjom glukoze, uglavnom tumorskih stanica
(slika 12). Pomoću kamere PET registrira se raspodjela [18F]FDG-a u organizmu, a pomoću
računalnog sustava dobiva se prikaz metaboličke aktivnosti tkiva cijelog organizma s
mogućnošću tomografskog (slojevitog) prikaza. Iako je unos tog radiofarmceutika povećan u
malignim stanicama, nakupljanje [18F]FDG-a nije uvijek selektivno samo za stanice tumora
jer se potrošnja glukoze može povećati i kod upala, infekcija i drugih benignih procesa što
može dati lažan rezultat.50
21
OPĆI DIO
Slika 12. Usporedba metabolizma [18F]FDG i glukoze.
S obzirom na manju selektivnost radiofarmaceutika [18F]FDG i njegovu manju osjetljivost jer
se ne mogu detektirati metastaze manje od 10 mm, potrebno je razviti nove osjetljivije metode
za detekciju tumora. Stoga je nužno primijeniti druge radiofarmaceutike koji bi mogli
učinkovitije dijagnosticirati pojavu tumora i karakterizirati njegova biološka svojstva.
2.2.5. Praćenje ekspresije HSV1-tk pomoću metode PET
PET je vrlo važna metoda za praćenje ekspresije gena HSV1-tk u suicidalnoj genskoj
terapiji. Ekspresija gena HSV1-tk indirektno se promatra preko interakcije genskog produkta
enzima HSV1-TK i radiooznačene molekule koja je supstrat tog enzima. HSV1-tk je u
kombinaciji s prolijekom, primjerice ganciklovirom, terapijski gen, a u kombinaciji s
odgovarajućom radiooznačenom molekulom reporterski gen.6,7
Praćenje ekspresije HSV1-tk metodom PET sastoji se od nekoliko stupnjeva (slika 13):
1. prijenos gena HSV1-tk pomoću odgovarajućeg vektora u ciljano tkivo (transfekcija,
odnosno transdukcija),
2. transkripcija gena HSV1-tk i translacija mRNA na ribosomu u protein, genski produkt
enzim timidin-kinazu HSV1-TK ,
3. radiooznačena molekula uštrcava se u bolesnika, ulazi u genetički promijenjene stanice
gdje je enzim HSV1-TK fosforilira. Radiooznačena molekula je tako zatočena u genetički
modificiranoj stanici tumora jer ne može prijeći kroz negativno nabijenu staničnu membranu,
koncentrira se unutar stanice i emitira signal s mjesta na kojem je izražen HSV1-tk.
22
OPĆI DIO
Koncentracija radiooznačene molekule, koja se vidi prema razini radioaktivnosti, odraz je
aktivnosti HSV1-TK, odnosno ekspresije HSV1-tk.51 Položaj i koncentracija molekule tragača
(intenzitet signala) stoga su direktno povezani s međudjelovanjem molekule tragača i enzima
HSV1-TK.
Slika 13. Shematski prikaz vizualizacije ekspresije HSV1-tk s molekulom tragačem
[124I]FIAU. Reporterski gen se transkripcijom i translacijom prevodi u genski produkt, enzim
HSV1-TK. Enzim selektivno prevodi molekulu tragača u metabolit koji je zarobljen u
transduciranoj, genetički promijenjenoj stanici.42
Sintetizirani su mnogi radiooznačeni supstrati enzima HSV1-TK kao molekule tragači s
potencijalnom primjenom u praćenju ekspresije tog enzima primjenom metode PET. Također
su istraživani prednosti i nedostatci njihove primjene.52,53
Molekule tragači trebaju zadovoljiti sljedeća svojstva:54
1. trebaju biti djelotvorni i selektivni supstrati HSV1-TK ,
2. ne smiju biti citotoksični za normalne stanice i stanice u kojima je izražena aktivnost
HSV1-TK,
3. trebaju imati strukturu prikladnu za radiooznačavanje,
4. trebaju imati povoljna farmakokinetička svojstva koja uključuju i brz izlazak iz krvi
kako bi se smanjila pozadinska aktivnost u krvi,
5. ne smiju ulaziti u stanice u kojima nije izražena aktivnost HSV1-tk,
6. trebaju biti stabilni in vivo i ne smiju stvarati metabolite koji otežavaju kvantitativnu
procjenu koncentracije radiotragača.
23
OPĆI DIO
Molekule tragači koji se koriste u metodi PET mogu se svrstati u dvije osnovne skupine:
analozi timidina (npr. FLT, FMAU, FIAU, FEAU) označeni radionuklidom 124I ili 18F i
aciklički nukleozidni analozi poput ganciklovira i penciklovira označeni izotopom 18F u
pobočnom lancu, primjerice [18F]FHBG ili na položaju C-8 purinske jezgre (slika 14).8,9
O O
HN
N
HHOH H
H F18OHO
R
O
R = I
R = CH3
R = CH3CH2
[18F]FIAU
[18F]FMAU
[18F]FEAU
HN
N N
N
H2NX OH
F18[18F]FHBG
[18F]FHPGX = CH2
X = O
Slika 14. Strukture izabranih PET-tragača.
2.2.5.1 Radiooznačeni nukleozidni analozi za praćenje ekspresije HSV1-tk
9-[4-[18F]fluor-3-(hidroksimetil)butil]gvanin ([18F]FHBG) (slika 14) ima dobra
farmakokinetička svojstva i smatra se, uz 1-(2'-deoksi-2'-fluor-1-β-D-arabinofuranozil)-5-
[124I]joduracil ([124I]FIAU), zlatnim standardom za praćenje ekspresije HSV1-tk u kliničkim
ispitivanjima.7,55 S obzirom na slab prolazak krvno-moždane barijere spoj se ne može koristiti
za vizualizaciju ekspresije gena HSV1-tk u mozgu, niti za praćenje ekspresije HSV1-tk u
području abdomena zbog njegovog izraženog nakupljanja u tom području vjerojatno zbog
izlučivanja putem jetre i žuči.56 Jednostavan način sinteze [18F]FHBG-a je iz penciklovira
(PCV) (8), kao početnog spoja. Uz metoksitritilnu zaštitnu skupinu i tosilatnu skupinu koja je
dobro odlazeća skupina, fluoriranjem s [18F]KF uz kriptofiks2.2.2. nastaje radiooznačeni spoj
11 koji nakon uklanjanja zaštitne skupine uz kiselinu daje ciljani spoj 12 (shema 3).
24
OPĆI DIO
HN
N N
N
O
H2N
OH
OH
HN
N N
N
O
H2N
OMTr
OH
HN
N N
N
O
TrMHNOMTr
OTS
HN
N N
N
O
TrMHNOMTr
18F
HN
N N
N
O
H2N
OH
18F
MTrCl TsCl
kriptofiks 2.2.2.
HCl
12, [18F]FHBG
8 9 10
11
[18F]KF
Shema 3. Radiosinteza spoja [18F]FHBG.
[124I]FIAU se u usporedbi s [18F]FHBG više akumulira u HSV1-TK preobraženim
stanicama. Stoga je spoj osjetljiviji na HSV1-TK, ali je istovremeno manje specifičan zbog
djelomičnog fosforiliranja pomoću timidin-kinaze iz čovjeka što otežava detekciju slabije
ekspresije gena (slika 15).57 Dugo vrijeme poluživota radioizotopa 124I (t1/2 = 4,2 dana)
omogućava vizualizaciju kroz duži vremenski period iako je [124I]FIAU podložan dejodiranju
in vivo. Iskorištenja reakcije radiooznačavanja izotopom 124I su relativno visoka (70–80 %),
ali je iskorištenje dobivanja pozitron-emitirajućeg izotopa 124I nisko (oko 20 %) u usporedbi s
reakcijom dobivanja izotopa18F.
O
HN
N
I124
OHO
O
OH
F
[124I]FIAU
Slika 15. Radiotragač [124I]FIAU.
Pokazalo se da uvođenje elektronegativnog fluora u položaj 2' ili 3' šećera, stabilizira
glikozidnu vezu nukleozida. 1-(2'-deoksi-2'-[18F]fluor-D-arabinofuranozil)-5-joduracil
25
OPĆI DIO
([18F]FIAU) i 1-(2'-deoksi-2'-[18F]fluor-D-ribofuranozil)-5-joduracil ([18F]FIRU) imaju dobra
svojstva kao PET-tragači.51
U posljednje se vrijeme 5-etil-2'-[18F]fluor-1-β-D-arabinofuranoziluracil ([18F]FEAU)
pokazao kao potencijalni molekulski tragač sa superiornim svojstvima, tj. povećanom
selektivnošću i osjetljivošću za stanice u kojima je izražena aktivnost HSV1-tk.51 Pirimidinski
radiotragači imaju neka bolja svojstva u odnosu na acikličke gvanozinske derivate, veći
afinitet za HSV1-tk i smanjeno nakupljanje radioaktivnosti u području abdomena pa je
pozadinska aktivnost u tom području manja. Naime, put izlučivanja pirimidinskih nukleozida
je renalni, a purinskih kao što je [18F]FHBG hepatobiliarni.6,56 Usporedba [18F]FEAU s
drugim PET-tragačima, radiooznačenim FHBG, FHPG, FIAU, FMAU i FLT pokazala je da
[18F]FEAU ima veću selektivnost i najveći omjer nakupljanja u stanicama s aktivnošću
HSV1-TK u odnosu na nakupljanje u netransduciranim stanicama.7 S obzirom na veći afinitet
za HSV1-TK, FEAU ima i manju citotoksičnost na normalne stanice. [18F]FEAU je, pored
toga, metabolički stabilan in vivo. Sintetski se može dobiti povezivanjem zaštićenog šećernog
prstena s ugrađenim izotopom 18F (15) i trimetilsililiranog pirimidina (16). Selektivno N-1
alkiliranje je postignuto reakcijom sililiranja 5-etiluracila s heksametildisilazanom (HMDS).
Nakon uklanjanja zaštitnih skupina u bazičnim uvjetima, dobiva se [18F]FEAU (18) (shema
4).
OTMSO
RO OR'
ORRO
R = benzoat
R' = triflat
MeCN
18F-
O
RO
ORRO 18F
CH2Cl-CH2Cl
HBr/AcOH
O
RO
RO 18FBr
N
NTMSO
CH2Cl-CH2Cl
HN
N
O O
OO
RO
18FRO
CH3OH
NaOCH3
HN
NOO
HO
18FHO
18, [18F]FEAU
13 14 1516
17
Shema 4. Sintetski put dobivanja spoja [18F]FEAU. Referentni neoznačeni spoj FEAU može
se pripraviti primjenom analognog sintetskog puta.51
26
OPĆI DIO
Radiosinteza radionuklida označenih izotopom 18F u položaju 2' šećera ([18F]FEAU,
[18F]FIAU) je znatno složenija, višestupnjevita i time dugotrajna (> 180 min) pa se takva
radiooznačena molekula tragač dobiva u niskom iskorištenju.
2.2.5.2 C-6 supstituirani derivati pirimidina kao potencijalni netoksični PET-radiotragači za
praćenje ekspresije HSV1-tk
Pirimidinski derivati u kojima se lanac koji zamjenjuje šećernu komponentu nalazi na
položaju C-6 pirimidina, a ne na položaju N-1 predstavljaju obećavajuće kandidate za razvoj
netoksičnih molekula tragača.10 Pored toga, pokazalo se da uvođenje dvostruke veze u lanac
daje molekulama blagu rigidnost što se pozitivno odražava na njihovu interakciju s
fosforilirajućim enzimima.58,59
Pirimidinski derivat s 2-fluor-3-hidroksipropilnim lancem na položaju C-6 timina (23)
(shema TT5) je pokazao veći afinitet vezanja za HSV1-TK od prolijekova ganciklovira i
aciklovira.10 6-(3-benziloksi-2-hidroksipropil)-2,4-dimetoksitimin (21) je pripremljen
reakcijom litiranja 5,6-dimetil-2,4-dimetoksipirimidina (19) i potom reakcijom
organolitijevog intermedijara s benziloksiacetaldehidom (20). Fluoriranjem uz
dietilaminosumporov trifluorid (DAST), kao reagens za fluoriranje, i uklanjanjem benzilne
skupine uz borov triklorid (BCl3) i acetil-klorid (AcCl), dobiven je spoj 23 (shema 5).
Pripravljen je i odgovarajući radiooznačeni analog, fluoriranjem zaštićenog prekursora s
[18F]tetrabutilamonijevim fluoridom, ali je iskorištenje reakcije bilo vrlo nisko (1 %).
N
N
CH3
OCH3
H3CO
N
N
CH3
OCH3
H3CO CH2Li
BnO
O
H
HN
NH
CH3
O
O CH3
OH
N
N
CH3
OCH3
H3CO
F
HN
NH
CH3
O
O
F
OBnOBn
OH
1. POCl32. NaOCH3
3. n-BuLioctena kiselina DAST
1. AcCl, H2O
2. BCl3
1819
20
2122
23
Shema 5. Sintetski put dobivanja spoja 23.
27
OPĆI DIO
6-(2,3-dihidroksipropil)-5-[18F]fluormetilpirimidin-2,4-dion ([18F]fluormetil-HHT) (slika
16) je kao lažni supstrat HSV1-TK uspješno locirao melanom stanične linije B16F1 kod
miševa i selektivnije se nakupljao u tumorskim stanicama od poznatog PET-tragača
[18F]FHBG.60
HN
NH
O
CH218F
O
OH
OH[18F]fluormetil-HHT
Slika 16. Struktura spoja [18F]fluormetil-HHT.
U usporedbi s [18F]FHBG, spoj [18F]fluormetil-HHT se također manje nakupljao u
abdomenu. Nedostatak tog spoja bilo je njegovo defluoriranje in vivo i nakupljanje fluoridnih
iona u kostima miševa pa se pristupilo optimiranju strukture kako bi se prevladali navedeni
nedostatci.
S ciljem povećanja stabilnosti in vivo spoja [18F]fluormetil-HHT, izotop 18F je ugrađen u
pobočni lanac na položaju C-6 timidina. Sintetiziran je C-6 dihidroksiizobutilni derivat timina
(DHBT) koji se pokazao kao dobar supstrat enzima HSV1-TK.61 Kako se DHBT u reakciji
fluoriranja ciklizirao, pripravljen je njegov N-metilirani derivat, 6-(1,3-dihidroksiizobutil)-N-
metiltimin (N-Me-DHBT) (slika 17, shema 6).62
Slika 17. Strukture spojeva DHBT i N-Me-DHBT.
HN
NH
CH3
O
O
OHOH
DHBT
HN
N
CH3
O
O
OHOH
CH3
N-Me-DHBT
28
OPĆI DIO
Ciljani spoj N-Me-DHBT (29) dobiven je sintezom prikazanom na shemi 6. Spoj 25
pripravljen je adicijom organolitijevog intermedijara s ketonom, 1,3-bis(benziloksi)propan-2-
on (24).
N
N
CH3
OCH3
H3COOH
OBnOBn
N
N
CH3
OCH3
H3CO CH3
BnO
O
OBn
N
N
CH3
OCH3
H3COO
OBnOBn
C C
O
OCH3
O
N
N
CH3
OCH3
H3CO
OBnOBn
N
N
CH3
OCH3
O
OBnOBn
CH3
HN
N
CH3
O
O
OHOH
CH3
29, N-Me-DHBT
LDATHF metil-oksalil-klorid
DMAP
Bu3SnHAIBN
1. BCl3 CH3I
2. AcCl
19
24
2526
2728
Shema 6. Sintetski put dobivanja spoja N-Me-DHBT.
Dobiveni je spoj u reakciji s metil-oksalil-kloridom u prisutnosti 4-dimetilaminopiridina
(DMAP) dao oksalat 26. Iz oksalata je, potom, u radikalskoj deoksigenaciji s
tributilkositrovim hidridom (Bu3SnH) uz 2,2'-azobis(izobutilnitril) (AIBN) sintetiziran spoj
27. Metiliranje položaja N-1 je provedeno uz metil-jodid. Benzilna zaštitna skupina je
uklonjena s BCl3, a demetiliranje položaja 4 pirimidina s AcCl pri čemu je dobiven ciljani
spoj 29.
Oba su spoja, DHBT i N-Me-DHBT, imala bolji afinitet vezanja za enzim HSV1-TK od
aciklovira i ganciklovira.61 Kristalna struktura kompleksa N-Me-DHBT i HSV1-TK prikazana
je na slici 18.
29
OPĆI DIO
Slika 18. Interakcije N-Me-DHBT s aminokiselinama u aktivnom mjestu enzima HSV1-TK.
Molekule vode su prikazane kao crvene kuglice, a vodikove veze kao crvene isprekidane
linije.
Kristalna struktura pokazuje kako N-metilna skupina stabilizira aciklički dio molekule.
Pirimidinski prsten je učvršćen između Met128 i Tyr172 i tvori kompleks nalik sendviču.
Timinski je dio dodatno stabiliziran vodikovim vezama s karboksamidom Gln125 te s
pobočnim lancem Arg176 i dvije molekule vode. Dihidroksiizobutilni lanac s vodikovim
vezama nalazi se unutar aktivnog dijela enzima. Hidroksilna skupina je vodikovom vezom
povezana s Arg163, posebno značajnom aminokiselinom u katalitičkoj domeni za stvaranje
interakcija, i sa sulfatnim ionom.
Pripravljen je i prekursor za radiooznačavanje u kojem su dvije primarne hidroksilne
skupine zaštićene tosilnom i metoksitritilnom skupinom. Fluorirani derivat spoja N-Me-
DHBT, N-Me-FHBT, i njegov radiooznačeni analog, N-Me-[18F]FHBT, sintetizirani su prema
shemi 7.62
30
OPĆI DIO
HN
N
CH3
O
O
OHOH
CH3
29, N-MeDHBT
HN
N
CH3
O
O
OMTrOH
CH3
HN
N
CH3
O
O
OMTrOTs
CH3
HN
N
CH3
O
O
OHF
CH3
HN
N
CH3
O
O
OH
CH3
18F
33, N-Me-[18F]FHBT
32, N-Me-FHBT
MTrCl TsCl DAST
1. [18F]KF2. HCl
DMAP
30 31
Shema 7. Sintetski put dobivanja spoja N-Me-FHBT i njegovog radiooznačenog analoga N-
Me-[18F]FHBT.
Reakcija [18F]radiooznačavanja je provedena pomoću fluorirajućeg reagensa [18F]KF uz
kriptofiks 2.2.2.. Nakon kisele hidrolize radiooznačenog spoja, dobiven je ciljani spoj 33.
Rezultati in vitro pokazali su izraženiju akumulaciju N-Me-[18F]FHBT u stanicama u
kojima je izražena aktivnost TK (HEK293TK+) u odnosu na netransducirane stanice. N-Me-
[18F]FHBT je u usporedbi s [18F]FHBG pokazao smanjeno nakupljanje u području abdomena,
ali manju selektivnost jer se više u odnosu na [18F]FHBG nakupljao u netransduciranim
stanicama (slika 19).
Slika 19. PET-slike miševa s ksenograftovima u koje su injektirani N-Me-[18F]FHBT i
[18F]FHBG. U desnom ramenu miševa nalazi se HEK293TK+ ksenograft, a u lijevom
HEK293 kontrolni ksenograft.
31
OPĆI DIO
2.3. Suicidalna genska terapija
2.3.1. Novi pristup selektivnom uništavanju tumorskih stanica
Standardne metode za liječenje raka uključuju kirurško odstranjivanje tumora,
kemoterapiju, te liječenje ionizirajućim zračenjem. Standardni kemoterapijski agensi i
ionizirajuće zračenje temelje se na tome da se tumorske stanice dijele brže nego normalne
stanice pa je toksičnost tretmana za tumorske stanice veća nego za normalne stanice, iako su
toksični utjecaji izraženi i u normalnim stanicama.63
Napredak u molekulskoj biologiji i poznavanju ljudskog genoma rezultirao je novim
pristupom terapiji tumora te se za liječenje zloćudnih tvorevina koristi unos stranih gena u
tumorsku stanicu. Genska terapija tumora omogućuje direktni tretman tumorskih stanica
mijenjanjem njihovog fenotipa ili unosom suicidalnih gena u tumorsku stanicu. Dosadašnja se
istraživanja na području genske terapije tumora mogu podijeliti u četiri osnovna područja64,65:
1. unos gena kako bi se pojačao odgovor imunološkog sustava na tumorske stanice,
2. unos tumor-represorskih gena,
3. transfer gena odgovornih za otpornost na lijekove i
4. unos suicidalnih gena.
Jedan od obećavajućih pristupa u terapiji tumora je suicidalna genska terapija gdje se
selektivno u tumorske stanice ugrađuje virusni ili bakterijski gen čiji produkt, enzim, može
netoksični prolijek prevesti u toksični metabolit, odnosno aktivni kemoterapijski agens. Cilj
suicidalne genske terapije je selektivno uništenje stanice tumora bez toksičnog utjecaja na
normalne stanice, dakle kemoterapija je usmjerena direktno na tumorske stanice.66 Geni koji
se najčešće koriste u suicidalnoj genskoj terapiji su: gen za timidin-kinazu virusa herpes
simpleks tipa 1 (HSV1-tk), gen za citozin-deaminazu (CD), gen za timidin-kinazu virusa
varicella zoster (VZV-tk), gen za nitroreduktazu, gen za ksantin-gvanin-
fosforiboziltransferazu (Escherichia coli gpt), Escherichia coli Deo gen (tablica 2).67
32
OPĆI DIO
Tablica 2. Najčešće korišteni suicidalni sustavi za gensku terapiju raka.
enzim prolijek aktivni lijek
HSV-TK ganciklovir ganciklovir-trifosfat
VZV-TK 6-metoksipurin-arabinozid adenin-arabinozid-
trifosfat
citozin-deaminaza (CD) 5-fluorcitozin 5-fluoruracil
nitroreduktaza 5-(aziridin-1-il)-2,4-
dinitrobenzamid (CB1954)
5-(aziridin-1-il)-4-
hidroksilamin-2-
nitrobenzamid
ksantin-gvanin-
fosforiboziltransferaza
(XGPRT)
6-tioksantin 6-tioksantin-monofosfat
purinska nukleozidna
fosforilaza (PNP)
6-metilpurin-deoksiribozid 6-metilpurin
2.3.2. Citozin-deaminaza i 5-fluorcitozin
Kombinacija enzima citozin-deaminaze (CD) i 5-fluorcitozina, kao prolijeka, je intenzivno
istraživana.66 Naime, enzim CD katalizira hidrolitičko deaminiranje citozina u uracil. Ovom
reakcijom se netoksični 5-fluorcitozin (5-FC) prevodi u toksični kemoterapijski agens, 5-
fluoruracil (5-FU).
CD je enzim koji je karakterističan za stanice bakterija i gljivica, ali ne i stanice čovjeka pa
su normalne stanice otporne na toksična djelovanja 5-FC. Citotoksični učinci 5-FU se
ispoljavaju nakon konverzije 5-FU u 5-fluor-2'-deoksiuridin-5'-monofosfat (5-FdU-MP). 5-
FdU-MP je ireverzibilni inhibitor timidilat-sintaze i tako inhibira sintezu deokistimidin-
trifosfata što uzrokuje inhibiciju sinteze DNA (slika 20).
33
OPĆI DIO
N
NH2
O NH
F
enzim citozindeaminaza
HN
O
O NH
F
5-FC 5-FU
HN
O
O NO
OH
H H
H H
O P O-
O-
O
5-FdU-MP
Slika 20. Transformacija netoksičnog 5-FC-a u 5-FU i 5-FdU-MP koji je ireverzibilni
inhibitor timidilat-sintaze.
Provedena su ispitivanja in vitro i in vivo enzima CD i prolijeka 5-FC na različitim
tumorima (karcinom crijeva,68 rak gušterače,69 rak dojke,70,71 rak potrbušnice72) koja su
pokazala visoke koncentracije 5-FU koji je nastao konverzijom iz 5-FC. 5-FU se koristi kao
lijek u klasičnoj kemoterapiji raka za liječenje raka dojke, raka gastrointestinalnog trakta i
jetre. Međutim, potrebne su velike koncentracije tog toksičnog lijeka kako bi se postigla
regresija tumora. Kao i kod drugih metoda suicidalne genske terapije dostava gena u tumorske
stanice omogućuje lokaliziranu konverziju prolijeka u toksični metabolit što isključuje
toksično nuzdjelovanje na zdrave stanice. CD se izolira iz bakterije E. coli ili iz gljivica.
Klinička ispitivanja ukazala su na neke nedostatke primjene ovog enzima i prolijeka kao što
su konverzija 5-FC u 5-FU u normalnim stanicama koje imaju aktivnost CD ako se u tim
stanicama nalazi enterobakterija. Još jedan nedostatak ove metode je nedovoljna pretvorba 5-
FC u 5-FU u transduciranim, genetički promijenjenim stanicama.
2.3.3. HSV1-TK/prolijek u suicidalnoj genskoj terapiji: put od antivirusnog do
antitumorskog lijeka
Obećavajući i najviše istraživan sustav suicidalne genske terapije koji je ušao u fazu III
kliničkog ispitivanja je suicidalna genska terapija s kombinacijom gena HSV1-tk i prolijeka
ganciklovira.5 Mogućnost primjene ove metode prvi je put opisana 1986. godine.73 Kao što je
prije rečeno, gen HSV1-tk kodira enzim HSV1-TK koji netoksični prolijek metabolizira u
toksični produkt. Ova metoda koristi manju selektivnost virusne timidin-kinaze naspram
timidin-kinaze čovjeka. Tumorske se stanice biokemijski transformiraju transfekcijom s HSV-
DNA fragmentima.74
34
OPĆI DIO
Kako bi se strani gen unio u stanicu, koriste se različiti virusni i nevirusni nosači ili
vektori. Kako su virusi razvili prirodni mehanizam za unos svog genoma u stanicu, oni su
izvrsni nosači za unos strane DNA. Ovi vektori nastali su zamjenom gena odgovornih za
replikaciju i patogenost virusa sa stranim terapeutskim genom. Izbor virusnog vektora ovisi o:
vrsti tumorske stanice u koju treba unijeti terapeutski gen i terapeutskoj strategiji koja će se
primijeniti. Najčešće korišteni virusni vektori su adenovirusi, retrovirusi, vakcinia virus,
poksivirus, virusi povezani s adenovirusima, herpes simpleks virus i lentivirusi.75 Vektori
transduciraju samo stanice koje su mitotički aktivne pa na taj način selektivno djeluju na
tumore koji su u fazi replikacije, a ne na stanice u blizini tumora koje se ne dijele.76
Danas oko 70 % protokola odobrenih za klinička ispitivanja genske terapije koristi viruse
kao nosače jer su virusni, u usporedbi s nevirusnim vektorima, bolji u unosu gena u stanicu.67
U nevirusne vektore ubrajaju se gola DNA, kationski liposomi i kationski polimeri.
Tretmanom genetički promijenjenih stanica s prolijekom, nekim antivirusnim agensom
nastaje citotoksični produkt jer ga virusna TK fosforilira do monofosfata (slika 21), a daljnjim
fosforiliranjem pomoću TK čovjeka, nastaju trifosfatni derivati koji se ugrađuju u DNA i
inhibiraju DNA-polimerazu što rezultira prekidanjem daljnje izgradnje lanca DNA pri čemu
tumorska stanica umire. Stanice u kojima nije izražena aktivnost virusne timidin-kinaze ostaju
netaknute. Na taj način, npr. antivirusni lijek ganciklovir u tumorskim stanicama s HSV1-TK
prelazi u citotoksični ganciklovir-trifosfat i uništava tumorske stanice.
Slika 21. HSV1-TK fosforilira ganciklovir u ganciklovir-monofosfat (GCV-MP). A) dimerna
struktura HSV1-TK; B) ganciklovir smješten u aktivno mjesto HSV1-TK; vodikove veze
označene su isprekidanim linijama.77
35
OPĆI DIO
Enzim HSV1-TK 1000 puta djelotvornije monofosforilira ganciklovir u usporedbi s TK
čovjeka.78 U koncentracijama koje se koriste u ispitivanju, GCV nije toksičan na stanice koje
nisu genetički promijenjene s genom HSV1-tk.
Prolijek mora ispunjavati nekoliko uvjeta da bi se koristio u genskoj terapiji raka
enzim/prolijek:79
1. mora prolaziti kroz staničnu membranu stanice tumora,
2. razlika u citotoksičnosti prolijeka i odgovarajućeg metaboliziranog aktiviranog
toksičnog lijeka mora biti što veća,
3. prolijek mora biti dobar supstrat enzima izraženog u stanici,
4. aktivni lijek treba biti jako citotoksičan,
5. poželjno je da aktivni lijek prelazi u druge stanice difuzijom ili na neki drugi način kako
bi se postigao 'bystander' učinak.
F.L. Moolten i J.M. Wells su 1990. godine primijetili da genetički promijenjene stanice u
koje je unešen gen HSV1-tk i, potom, tretirane s GCV izazivaju osjetljivost susjednih
netransduciranih stanica.80 Citotoksično se djelovanje, dakle, prenosi i na susjedne stanice,
koje ne sadrže HSV1-TK ('bystander' učinak) (slika 22).
Slika 22. Shematski prikaz genske terapije primjenom HSV1-tk.74
Zahvaljujući navedenom učinku GCV pokazano je da je za neke stanične kulture potrebno
transducirati samo 10 % stanica i tretirati ih s GCV kako bi se postigla 100 % smrt stanica. U
modelu in vivo je potvrđeno da samo 10–50 % stanica transduciranih s HSV-tk pri tretmanu s
36
OPĆI DIO
GCV uzrokuju potpunu regresiju tumora.81 Jedan od predloženih mehanizama ovakvog
djelovanja je da GCV-TP prelazi iz transducirane stanice u susjednu genetički nepromijenjenu
stanicu pomoću propusne veze odnosno kanala prisutnih u staničnoj membrani u zrcalnoj
simetriji koji povezuju citoplazme dviju stanica i omogućuju da se male u vodi topljive tvari s
molarnom masom manjom od 1000 (ioni, metaboliti) razmijene između dviju stanica.
Sastavljeni su od kompleksa proteina. Svaka pora je sastavljena od 6 strukturnih podjedinica
koneksina organiziranih u prsten, konekson. U prilog ovom pretpostavljenom mehanizmu idu
eksperimenti u kojima se lijekovima negativno djelovalo na stvaranje propusne veze, što je
izazvalo inhibiranje ovakvog učinka.82 Ispitivanja su pokazala da su u suicidalnoj genskoj
terapiji primjenom gena HSV1-tk
purinski nukleozidni analozi pokazali veći 'bystander' učinak u odnosu na pirimidinske
nukleozidne analoge.83
Primjena metode HSV1-tk/GCV u ispitivanjima in vitro na staničnim kulturama i in vivo
na različitim malignim tumorima (leukemija, tumor na mozgu, rak mokraćnog mjehura, rak
jetre, rak usta) pokazala je obećavajuće rezultate jer je opažena znatna regresija tumora.
Pozitivni rezultati potaknuli su klinička ispitivanja sa sustavom HSV1-tk/GCV koja su prošla
faze I, II i III ispitivanja.84–88 Uspješni rezultati dobiveni su u fazi I kliničkog ispitivanja u 8
pacijenata s rakom prostate.89 Međutim, klinička ispitivanja ukazala su na neke nedostatke
prilikom postizanja selektivnog i učinkovitog unosa gena u ciljane stanice. Razlog izostanku
antitumorskog djelovanja tijekom kliničkih ispitivanja je taj da dostupni vektori nisu dovoljno
uspješni u dopremanju transgena u ciljane tumorske stanice pa nije transducirana dovoljna
količina tumorskih stanica.76,90 Nadalje, ekspresija stranih gena unutar tumora je slaba, a zbog
reakcije imunološkog sustava i uništavanja genetički promijenjenih stanica 'bystander' učinak
nije vidljiv. Uspjeh primjene suicidalne genske terapije ovisit će, stoga, o pronalasku
učinkovitijeg načina unosa gena u tumorsku stanicu, ali i o razvoju same metode za praćenje
ekspresije gena u stanici in vivo.
37
OPĆI DIO
2.4. Reakcije unakrsnog povezivanja katalizirane paladijem
2.4.1. Sonogashira-ina reakcija
Sonogashira-ina reakcija omogućuje sintezu supstituiranih alkina povezivanjem arilnih ili
alkenilnih halogenida (ili triflata) i terminalnih alkina u prisutnosti paladija kao katalizatora,
baze te bakrovog halogenida kao kokatalizatora (shema 8).91,92 Smatra se jednom od
najznačajnijih reakcija moderne organske sinteze. Omogućuje nastanak sp2-sp veze ugljik-
ugljik i dobivanje enin- i arilalkin-konjugiranih veza koje se često susreću u prirodnim
spojevima, farmaceuticima i biološki važnim molekulama, a predstavljaju i važne sintetske
intermedijare.93
+HR1Pd (0) katalizator
R1 = aril, heteroaril, alkilR2 = aril, heteroaril, vinilX = I, Br, Cl, OTfY = I, Br
R2R2R1
CuY
bazaX
Shema 8. Općeniti prikaz Sonogashira-ine reakcije.
Bakrov (I) jodid (CuI) s terminalnim alkinom čini reaktivan bakrov acetilid pa kao
sporedni produkt reakcije mogu nastati alkinski homodimeri. Značajna količina takvog
nuzprodukta nastaje kad je oksidativna adicija arilhalogenida spora ili uz prisutnost kisika.
Baza, najčešće organski amin, se dodaje za deprotoniranje terminalnog protona alkina.
Iako mehanizam Sonogashira-ine reakcije nije u potpunosti razjašnjen, pretpostavlja se da
se temelji na tri osnovna stupnja: oksidativna adicija, transmetaliranje i reduktivna
eliminacija.
U prvom se stupnju na Pd(0)L2 kompleks (L = ligand) adira nezasićeni arilni ili vinilni
halogenid, pri čemu nastaje planarni Pd(II) kompleks. Adicija je olakšana ako je smanjena
elektronska gustoća na vezi C-X spoja R2-X zbog prisutnih elektron-odvlačećih supstituenata.
U drugom stupnju dolazi do transmetaliranja nastalog paladijevog intermedijarnog
kompleksa. Dodatkom CuI dolazi do aktiviranja alkina, pri čemu nastaje Cu-acetilid koji
reagira s intermedijarom Pd pri čemu nastaje kompleks paladija i alkina. Nakon reduktivne
eliminacije regenerira se Pd(0)L2 kompleks i izolira se supstituirani alkin (slika 23).92
38
OPĆI DIO
R1 R2
R1Pd
L
R2
L PdR2L
LX
R2 X
CuX R1 Cu
R1 H + baza
Pd0L2
oksidativna adicija reduktivna eliminacija
transmetaliranje
Slika 23. Mehanizam Sonogashira-ine reakcije.
Najčešće se reakcije izvode na sobnoj temperaturi, iako blago povećanje temperature
reakcijske smjese ponekad pogoduje nastanku nove veze C–C i većem iskorištenju reakcije.
Najčešće upotrebljavani paladijevi kompleksi su tris(dibenzilidenaceton)dipaladij (Pd2(dba)3)
i tetrakis(trifenilfosfin)paladij(0) ((PPh3)4Pd). (PPh3)4Pd je fotoosjetljiv i nestabilan u
atmosferskim uvjetima. Njegovi nedostatci su otežano uklanjanje iz smjese produkata kao i
povremena slaba reaktivnost koja je posljedica velikih liganada. Halogene soli bakra koje se
najčešće rabe su bakrov (I) jodid (CuI) i bakrov (I) bromid (CuBr). Kao baza se najčešće
koriste trietilamin (Et3N), dietilamin (Et2NH), dipropilamin (Pr2NH) ili morfolin, dok se kao
otapala najviše upotrebljavaju N,N-dimetilformamid (DMF), dimetilsulfoksid (DMSO), THF
ili N-metilpirolidon (NMP).
2.4.2. Stille-ova reakcija
Stille-ova reakcija je reakcija nezasićenih organohalogenida i organokositrovih spojeva uz
paladijev katalizator. Jedna je od najčešće korištenih reakcija za dobivanje veze C-C
definirane stereokemije.92 Moguće je sintetizirati različite organokositrove spojeve i tako u
molekulu elektrofilnog halogenida uvesti alkilni, vinilni, alillni ili arilni supstituent (shema 9).
39
OPĆI DIO
+Pd (0) katalizator
R = alkil, arilR1 = alkil, vinil, alil, arilR2 = aril, alil, acil, vinilX = I, Br, Cl, OTf
R2 R2R1XR3Sn R1
Shema 9. Općeniti prikaz Stille-ove reakcije.
Odlazeća skupina je obično halogen ili triflat. Kao katalizator se koriste paladijevi
kompleksi pri čemu je važno da ligandi na paladiju budu elektron-donirajući (snažni donori)
kako bi se pospješila oksidativna adicija. Katalizatori koji se najčešće upotrebljavaju u Stille-
ovoj reakciji su (PPh3)4Pd i benzilbis(trifenilfosfin)klorpaladij (BnPdCl(PPh3)2) kao Pd(II)
katalizator. Od ostalih katalizatora koristi se PdCl2(PPh3)2, PdCl2(PhCN)2, PdCl2(MeCN)2,
Pd(dba)2 ili Pd2dba3. Za provođenje reakcije koriste se polarna otapala NMP, DMF i DMSO i
najčešće visoke temperature.
Mehanizam Stille-ove reakcije se sastoji od oksidativne adicije, transmetaliranja i
reduktivne eliminacije koja vodi do produkta i regeneracije katalizatora (slika 24).94
Pd0L2
PdL R2
XL
R2 X
PdL R2
R1L
R1 R2
R1 SnBu3XSnBu3
reduktivna eliminacija oksidativna adicija
transmetaliranje
Slika 24. Mehanizam Stille-ove reakcije.
Upotreba kokatalizatora kao i izbor odgovarajućeg otapala utječu na optimiziranje Stille-
ovih reakcija.95 C.M. Crawforth i suradnici slučajno su 2005 god. otkrili kako zaostaci N-
bromsukcinimida (NBS) pospješuju Stille-ovu reakciju.95
U reakciji nastali tributilstanil-halogenidi (Bu3SnX) se teško uklanjaju iz reakcijske smjese
jer polako hidroliziraju na silika-gel-u prilikom pročišćavanja. Postoji nekoliko metoda za
njihovo uklanjanje kao što su: ekstrakcija s heksanom, tretman s DBU-I2, obrada reakcije s
40
OPĆI DIO
KF u metanolu ili redukcija s NaBH3CN (konverzija Bu3SnX u Bu3SnH).96,97 Jedan od načina
uklanjanja Bu3SnX je obrada reakcije s vodenom otopinom NaOH pri čemu nastaju Bu3SnOH
i (Bu3Sn2)O koji su znatno polarniji i zaostaju na koloni.
Organokositrovi halogenidi (jodidi, bromidi ili kloridi) se obradom reakcijske smjese s KF
pretvaraju u organokositrove fluoride.98 Trialkil- ili triarilkositrovi fluoridi su nehlapljivi,
netopljivi (u organskim otapalima i vodi) polimeri.
Organokositrovi spojevi nisu osjetljivi na zrak i vlagu te toleriraju različite funkcionalne
skupine na molekuli supstratu koje se onda ne moraju zaštiti prije reakcije stvaranja nove veze
C-C. Nedostatak ovih spojeva je njihova toksičnost i problemi uklanjanja iz reakcijske
smjese.
Samo jedna od skupina na organokositrovom spoju sudjeluje u reakciji s organskim
halogenidom. Različite skupine se različitim brzinama prenose s organokositrovog spoja na
organski halogenid, a među njima najsporije jednostavne alkilne skupine. Zbog toga je
pogodan organokositrov spoj s tri jednostavne alkilne skupine i četvrtom alkilnom,
alkenilnom, arilnom ili alilnom skupinom koja se prenosi na organski halogenid.99 Uobičajne
alkilne skupine na organokositrovim reagensima su metilna i butilna. Trimetil-kositrovi
nuzprodukti se lakše uklanjaju iz reakcijske smjese, ali su istovremeno toksičniji u usporedbi
s tributil-kositrovim spojevima.
41
OPĆI DIO
42
3. REZULTATI I RASPRAVA
REZULTATI I RASPRAVA
3.1. Uvod
U doktorskom radu su sintetizirani novi N-aciklički C-5 supstituirani hidroksietilni derivati
pirimidina s lancem poput aciklovirnog, ganciklovirnog, penciklovirnog i 2,3-
dihidroksipropilnim lancem u položaju N-1 pirimidina,100,101 te spoj s lancem poput
ganciklovirnog u položaju N-1 pirimidina i hidroksietilnim supstituentom u položaju N-3, kao
i C-6 izobutenilni derivati timina.102 Osim toga, reakcijama kataliziranih paladijem
sintetizirani su N-aciklički C-5 supstituirani heteroarilni i alkinilni derivati pirimidina.
Osnovni cilj doktorskog rada bio je pronaći selektivni radiotragač, tj. molekulu obilježenu
izotopom 18F, koja bi se mogla primijeniti za praćenje ekspresije HSV1-tk metodom PET i
koja bi prevladala nedostatke postojećih PET-radiotragača.
U okviru doktorskog rada ostvareni su specifični ciljevi(TTslika 25):
1. provedena je sinteza i strukturno određivanje novih acikličkih pirimidinskih derivata,
2. ispitano je antiproliferativno djelovanje novopripravljenih spojeva na odabrane tumorske
stanične linije i normalne fibroblaste porijeklom iz čovjeka,
3. proveden je test fosforiliranja ciljanih spojeva pomoću enzima HSV1-TK,
4. za spoj 5-(2-hidroksietil)-N-1-[4-hidroksi-3-(hidroksimetil)butil]pirimidin-2,4-dion (37),
koji se pokazao kao djelotvoran supstrat HSV1-TK sintetiziran je odgovarajući fluorirani
analog, kao referentni spoj, i prekursor s odgovarajućim zaštitnim skupinama za
radiooznačavanje izotopom 18F,
5. provedeno je radiooznačavanje prekursora radionuklidom 18F i praćenje radiooznačene
molekule in situ kod miševa sa zloćudnim tumorom.103
44
REZULTATI I RASPRAVA
Slika 25. Dijagram tijeka sinteze molekule PET-tragača.
sinteza i strukturno određivanje acikličkih pirimidinskih derivata
test fosforiliranja pomoću enzima HSV1-TK
supstratfluorirani
analog
prekursor za radiooznačavanje
radiooznačavnje izotopom 18F
ispitivanjain vitro
ispitivanjain vivo
antitumorska ispitivanja
supstrat
test fosforiliranja pomoću enzima HSV1-TK
45
REZULTATI I RASPRAVA
3.2. C-5 supstituirani hidroksietilni derivati pirimidina s 2,3-
dihidroksipropilnim lancem i lancem poput aciklovirnog,
ganciklovirnog i penciklovirnog u položaju N-1 pirimidina
3.2.1. Sinteza C-5 supstituiranih N-acikličkih pirimidinskih nukleozidnih analoga (2338)
Sintetizirani su C-5 supstituirani 2-hidroksietilni derivati pirimidina s 2,3-
dihidroksipropilnim lancem (25) i lancem poput onog u acikloviru (27), gancikloviru (29) i
pencikloviru (37) u položaju N-1 pirimidina (slika 26). Molekulsko modeliranje spojeva 25,
27, 29 i 37, kao potencijalnih supstrata HSV1-TK, provedeno je u suradnji s prof. dr. sc. L.
Scapozza (Odjel za farmaceutske znanosti, Sveučilište u Ženevi), i ukazalo je da predloženi
spojevi imaju strukturu pogodnu za stvaranje vodikovih veza s ograncima aminokiselina u
aktivnom mjestu enzima.
HN
N
R1
O
O
R1 =
OH
OH
OOH
OOH
OH
OH
OH
,
,
OH
25 27
29 37
Slika 26. C-5 hidroksietilni derivati pirimidina s 2,3-dihidroksipropilnim lancem (25) i
lancem poput aciklovirnog (27), ganciklovirnog (29) i penciklovirnog (37) u položaju N-1
pirimidina.
Ciljani spojevi TT25, 27, 29 i 37 priređeni su reakcijom alkiliranja derivata uracila 4, 8, 10
i 11 s odgovarajućim prethodno pripravljenim alkil-halogenidima (18, 21 i 22) (shema 14).
Sinteza prekursora za N-alkiliranje (8, 10 i 11) provedena je u odličnom iskorištenju
(8090 %) modifikacijama pirimidinskog prstena 5-(2-hidroksietil)pirimidin-2,4-diona (4)
46
REZULTATI I RASPRAVA
(shema 10). Spoj 4 je sintetiziran reakcijom u tri stupnja iz -butirolaktona (1). U prvom
stupnju, reakcijom -butirolaktona (1) i metil-formijata u eteru u prisutnosti natrijevog
metoksida, pripravljen je spoj 2. -ureidometiliden--butirolakton (3) dobiven je
kondenzacijom spoja i uree u drugom stupnju. Potom je intramolekulskom ciklizacijom
spoja 3 pomoću natrijevog etoksida dobiven spoj 4.
Provedene su transformacije pirimidinskog derivata 4 koje uključuju zaštitu primarne
hidroksilne skupine acetiliranjem uz acetanhidrid, a potom kloriranje hidroksilnih skupina s
POCl3 i N,N–dietilanilinom pri čemu je izoliran spoj 6. Nadalje, metoksiliranje položaja C-2 i
C-4 dikloriranog derivata pirimidina provedeno je uz natrijev metoksid. Prilikom reakcije
metoksiliranja, došlo je do deacetiliranja zbog bazičnih uvjeta reakcije pa je spoj 7 ponovno
acetiliran uz acetanhidrid i dobiven je 5-(2-acetoksietil)-2,4-dimetoksipirimidin (8).
Selektivno 2-dealkiliranje spoja 8 provedeno je uz acetil-klorid pri čemu je nastao N-
acetilirani-4-metoksipirimidin-2-on (9). Prilikom pročišćavanja spoja na koloni punjenoj
silika-gelom uklonjena je acetilna skupina s N-1 položaja pri čemu je nastao spoj 10.
Deacetiliranjem C-5 pobočnog lanca u bazičnim uvjetima izoliran je spoj 11.
47
REZULTATI I RASPRAVA
O
ONa
OHN
O O
NH2
O
O O
HN
NH
O
O
HN
NH
O
O
N
N
Cl
Cl
N
N
OCH3
H3CO
N
N
OCH3
H3CO
N
N
OCH3
O
Ac
N
NH
OCH3
O
N
NH
OCH3
O
OH
OH OAc OAc
OHOAc
OAc OAc
123
4 56
78
9 10 11
NaOCH3
metil-formijat
urea
HCl
NaOEt /EtOH
Ac2O
piridin
POCl3
N,N-dietilanilin
NaOCH3/CH3OH
Ac2O
piridin
acetil-klorid
silika-gel
NaOCH3/CH3OH
Shema 10. Sinteza supstrata za N-alkiliranje.
Lanac poput penciklovirnog sa zaštićenim hidroksilnim skupinama i jodom kao odlazećom
skupinom priređen je sintezom u šest stupnjeva (shema 11). Spoj 13 dobiven je reakcijom 2-
kloretanola i etil-vinil-etera (12) u prisutnosti trifluoroctene kiseline kao katalizatora uz
iskorištenje reakcije od 46 %. Reakcijom alkiliranja acetala 13 s natrijevim dietil-malonatom
pripravljen je diester 14 uz iskorištenje od 86 %. Redukcijom esterskih skupina spoja 14 koja
je provedena uz natrijev tetrahidroborat dobiven je diol u kojem su in situ hidroksilne skupine
zaštićene acetiliranjem uz acetanhidrid pri čemu je izoliran diacetoksi-acetal 15 uz
iskorištenje od 30 %. Uklanjanje 1-etoksietilne zaštitne skupine spoja 15 provedeno je u
kiselim uvjetima pri čemu je nastao 4-acetoksi-3-(acetoksimetil)butanol (16). Mesiliranjem
primarne hidroksilne skupine u spoju 16 uz metansulfonil-klorid dobiven je spoj 17 uz
iskorištenje reakcije od 43 %. Jodiranjem spoja 17 pomoću natrij-jodida sintetiziran je lanac
poput penciklovirnog s jodom kao odlazećom skupinom i acetilnim zaštitnim skupinama (18)
48
REZULTATI I RASPRAVA
uz iskorištenje od 31 % (shema 11). Bromiranjem hidroksilne skupine lanca 16 uz
tetrabrommetan (CBr4) i trifenilfosfin (PPh3) izoliran je bromidni derivat 19.
O O OCl
O O
COOEt
COOEt
HO
OAc
OAcO O
OAc
OAc
MsO
OAc
OAc
1213
14
1516
17
18
trifluoroctena kiselina
dietil-malonat
1. NaBH4
2. Ac2O
ledena octena kiselinaMsCl
Et3N
NaIaceton
Br
OAc
OAc
19
CBr4
PPh3
NaOCH3
I
OAc
OAc
ClOH
Shema 11. Sinteza derivata penciklovirnog lanca (17, 18 i 19).
Lanac poput ganciklovirnog (21) dobiven je reakcijom klormetiliranja alkohola 20 uz
plinoviti HCl i paraformaldehid (TTshema 12).
HO
OBn
OBn
HCl(g)
20 21paraformaldehid
Cl O
OBn
OBn
Shema 12. Sinteza ganciklovirnog lanca (21).
Reakcijom acetil-bromida i 1,3-dioksolana, dobiven je lanac poput aciklovirnog (shema
13).
OO+CH3
O
BrBr O
OAc
22
Shema 13. Sinteza aciklovirnog lanca (22).
49
REZULTATI I RASPRAVA
Za dobivanje ciljanih spojeva 25, 27 i 29 korištena su dva sintetska puta (shema 14). U
sintetskom pristupu A primijenjena je Hilbert-Johnson-ova reakcija104 koja omogućava
selektivnu supstituciju na položaju N-1 pirimidinskog prstena. Ovaj pristup uključuje reakciju
5-(2-acetoksietil)-2,4-dimetoksipirimidina (8) s odgovarajućim alkil-halogenidima.
Za uvođenje 2,3-dihidroksipropilnog lanca u 25, aciklovirnog lanca u 27 i ganciklovirnog
lanca u 29, korišteni su alil-bromid, (2-acetoksietoksi)metil-bromid (22) i 1,3-dibenziloksi-2-
(klormetoksi)propan (21). Alkiliranjem spoja 8 s alil-bromidom pripravljen je N-1
supstituirani 4-metoksipirimidinski derivat 23 u 73 % iskorištenju. Alkiliranjem spoja 8 uz (2-
acetoksietoksi)metil-bromid i 1,3-dibenziloksi-2-(klormetoksi)propan sintetizirani su N-1-
supstituirani pirimidin-2,4-dioni 26 i 28 u iskorištenju 43 % i 36 %. N-1-(2,3-
dihidroksipropil)pirimidinski derivat (24) sintetiziran je reakcijom cis-dihidroksiliranja N-1
alilnog pirimidinskog derivata 23 pomoću osmijevog tetraoksida (OsO4), a nakon uklanjanja
metilne i acetilne skupine uz 1 M NaOH nastao je ciljani C-5 hidroksietilni derivat pirimidina
s 2,3-dihidroksipropilnim lancem na položaju N-1 (25). Ukupno iskorištenje opisanog
sintetskog puta je 12 %.
Deacetiliranjem pobočnih lanaca na C-5 i položaju N-1 u spoju 26 u bazičnim uvjetima
dobiven je ciljani C-5 hidroksietilni pirimidinski derivat s lancem poput aciklovirnog u
položaju N-1 (27) u ukupnom iskorištenju od 26 %. Uklanjanjem acetilne skupine u
pobočnom lancu u položaju C-5 i benzilnih skupina u pobočnom lancu u položaju N-1 spoja
28 s BCl3 nastao je ciljani spoj, C-5 hidroksietilni pirimidin s lancem poput ganciklovirnog u
položaju N-1 (29).
Sintetski put B proveden je s ciljem postizanja većeg sveukupnog iskorištenja ciljanih
spojevima (shema 14). Kako bi se dobio ciljani spoj 25, deprotoniranje N-1 provedeno je uz
natrijev hidrid, pa je reakcijom in situ dobivene soli spoja 10 s 1-klor-2,3-dihidroksipropanom
nastao trihidroksilni derivat 4-metoksipirimidin-2-ona (30). Deprotekcijom spoja 30 dobiven
je ciljani spoj, trihidroksipirimidin-2,4-dion (25). U usporedbi sa sintetskim putem A,
sintetski put B za dobivanje spoja 25 bio je učinkovitiji, a istovremeno se izbjegla uporaba
toksičnog OsO4 kao reagensa za cis-dihidroksiliranje.
Spojevi 27 i 29 pripravljeni su reakcijom sililiranja (shema 14, sintetski put B). Kako je
sililiranje derivata pirimidin-2,4-diona 4 uz N,O-bis(trimetilsilil)acetamid (BSA) bilo
neuspješno, 4-metoksipirimidin-2-on (11) je korišten za reakciju sililiranja i selektivnog N-
alkiliranja. Spoj 31 dobiven je trimetilsililiranjem spoja 11 uz BSA, kao reagens za sililiranje,
te dodatkom trimetilklorsilana (TMSCl), kalijevog jodida i 1,3-dioksolana koji in situ čine
alkilirajući agens. Ciljani spoj 27 izoliran je nakon uklanjanja metilne skupine s položaja C-4
50
REZULTATI I RASPRAVA
spoja 31 s natrijevim hidroksidom. Nadalje, spoj 32 s ganciklovirnim lancem također je
pripravljen reakcijom sililiranja. Sililiranjem spoja 4 uz heksametildisilazan (HMDS) i
reakcijom O-sililiranog spoja 4 s 1,3-dibenziloksi-2-(klormetoksi)propanom (21) nastao je N-
1 alkilirani pirimidinski derivat 32 uz iskorištenje od 8 %. U istoj reakciji izoliran je N-
alkilirani 5-(2-kloretilni) derivat (33). Uklanjanjem benzilnih skupina izolirani su ciljani spoj
29 i njegov klorirani derivat 34 u dobrom iskorištenju.
Primjenom sintetskog puta A za pripravu ciljanih spojeva 27 i 29 koji je uključivao
alkiliranje N-anionskih C-5 supstituiranih pirimidinskih intermedijara dobivena su veća
sveukupna iskorištenja u odnosu na iskorištenja dobivena u sintetskom putu B koji je
uključivao reakciju sililiranja (tablica 3).
51
REZULTATI I RASPRAVA
N
N
OCH3
H3CO
OAc
HN
NO
OBn
OBn
O
O
OAcN
N
OCH3
O
OAc
HN
NO
OH
OH
O
O
RN
N
OCH3
O
OAc
OH
OH
HN
N
O
O
OH
OH
OH
HN
NH
O
O
OH
HN
NO
OBn
OBn
O
O
R
NaOCH3/CH3OH
1 M NaOH
spoj 21 K2CO3
NaH, DMF, 1-klor-2,3-dihidroksipropan
R OH Cl
R OH Cl
N
NH
OCH3
O
N
N
OCH3
O
OH
OH
OH
sintetski put A
sintetski put B
OR
HN
NO
OAc
O
O
OAc
HN
NO
OH
O
O
OH
alil-bromid
N
NO
OH
OCH3
O
OH
1 M NaOH BSA, CH3CN, 1,3-dioksolan, KI, TMSCl
1. HMDS, TMSCl;2. spoj 21, TBAI
R Ac H
NaClO3
OsO4
spoj 22,Na2CO3
BCl3
1 M NaOH BCl3
8
10 11
23
24
25
26
27
28
29
31
32 33
34
430
Shema 14. Sinteza C-5 supstituiranih 2-hidroksietilnih derivata pirimidina s 2,3-
dihidroskipropilnim lancem (25), aciklovirnim (27) i ganciklovirnim (29) lancem.
52
REZULTATI I RASPRAVA
Tablica 3. Pregled iskorištenja reakcija za dobivanje ciljanih spojeva 25, 27 i 29 u sintetskom
putu A i B.
25 27 29 sintetski put A iskorištenja
1. acetiliranje 98 % 98 % 98 % 2. kloriranje 99 % 99 % 99 % 3. metoksiliranje 95 % 95 % 95 % 4. acetiliranje 90 % 90 % 90 % 5. alkiliranje/
hidroksiliranje 73 %/ 50 %
43 % 36 %
6. uklanjanje zaštitnih skupina
39 % 74 % 67 %
UUukupno iskorištenje:
12 % 26 % 20 %
25 27 29 sintetski put B iskorištenja
1. acetiliranje 98 % 98 % - 2. kloriranje 99 % 99 % - 3. metoksiliranje 95 % 95 % - 4. acetiliranje 90 % 90 % - 5. demetoksiliranje 80 % 80 % - 6. deacetiliranje - 93 % - 7. sililiranje/alikiliranje 75 % 25 % 8 % 8. uklanjanje zaštitnih
skupina 37 % 26 % 65 %
ukupno iskorištenje 18 % 4 % 5 %
Kako Hilbert-Johnson-ova reakcija 2,4-dimetoksipirimidinskog derivata 8 s alkil-
halogenidima 18 i 19, te mesilatom 17 nije bila uspješna (shema 15), za uvođenje lanca poput
penciklovirnog u položaj N-1 pirimidina korišten je spoj 10 kao supstrat za N-alkiliranje
(shema 16).
N
N
OCH3
H3CO
ROAc
OAc
N
N
OAc
OAc
OCH3
O
OAc OAc
+
18, R = I
19, R = Br
17, R = OMs
K2CO3
8 35
Shema 15. Reakcija spoja 8 i alkil-halogenida 18, 19 i mesilata 17 nije rezultirala nastankom
produkta 35.
53
REZULTATI I RASPRAVA
OAcO
AcON
N
OCH3
OHO
HON
N
OCH3
OAc
OH
N
NH
OCH3
O
N
N
OAc
OAc
OCH3
O
HN
N
OH
OH
O
O
OAc OAc
OH
+
+
1 M NaOH
10
35 36
37, 5-HEU-PCV
38
IOAc
OAc+
18
K2CO3 ili
Cs2CO3 ili
Et3N
klasično zagrijavanje
ili MW
Shema 16. Sinteza C-5 supstituiranih hidroksietilnih N-1 alkiliranih i O-2 alkiliranih derivata
pirimidina s lancem poput penciklovirnog.
Reakcijom spoja 10 uz odgovarajuću bazu s alkil-jodidom 18 nastala je smjesa produkata
35 i 36 u omjeru 49 : 45. Kako su produkti imali istu molarnu masu, snimljeni su njihovi
spektri 2D NMR (Heteronuclear Multiple Bond Correlation (HMBC) i Nuclear Overhauser
Effect Spectroscopy (NOESY) kojima je potvrđena struktura N-1 i O-2 alkiliranih pirimidina.
Nakon uklanjanja metilne skupine i acetilnih skupina N-1 alkiliranog derivata 35 s 1 M
NaOH, nastao je ciljani spoj 37. Uklanjanjem acetilnih skupina u O-2 alkiliranom derivatu 36
izoliran je spoj 38. Za deprotoniranje položaja N-1 pirimidina u reakciji N-alikiliranja
korištene su različite baze (Cs2CO3, K2CO3, Et3N), ali bez većeg utjecaja na iskorištenje
reakcije i omjer nastalih produkata. Uz provedeno klasično zagrijavanje, provedena je i
reakcija potpomognuta mikrovalovima. Iako je vrijeme reakcije skraćeno s 20 min na 2 min,
samo iskorištenje reakcije potpomognuto mikrovalovima slično je iskorištenju reakcije
provedeno klasičnim zagrijavanjem.
54
REZULTATI I RASPRAVA
3.2.2. Fosforiliranje hidroksietilnih N-acikličkih derivata pirimidina pomoću enzima HSV1-
TK
Kako bi se odredilo da li su ciljani spojevi 25, 27, 29 i 37 supstrati enzima HSV1-TK i
hTK (timidin-kinaza iz čovjeka), proveden je test fosforiliranja inkubacijom ciljanih spojeva s
adenozin-trifosfatom (ATP) i enzimom HSV1-TK, odnosno hTK. Reakcije, koje su
provedene tri puta, prekinute su nakon 30, 60 i 90 min. Tijek reakcije praćen je primjenom
visoko-učinkovite tekućinske kromatografije (HPLC). U reakcijama je praćen omjer nastalog
adenozin-difosfata (ADP) i ATP-a tijekom vremena kao i nastajanje novog monofosfatnog
derivata supstrata. Kada je ispitani spoj supstrat HSV1-TK ili hTK na kromatogramu se
pojavljuje novi signal koji se može pripisati monofosfatnom derivatu. Također bi bilo
opaženo povećanje ADP-a tijekom vremena u odnosu na slijepu probu, smanjenje signala koji
odgovara testiranom spoju i smanjenje signala koji odgovara ATP-u jer se jedna fosfatna
skupina s molekule ATP pomoću enzima TK prenosi na testirani spoj pri čemu se ATP
pretvara u ADP, a testirani spoj u monofosfatni derivat. Kako bi se uzela u obzir autohidroliza
ATP-a u uvjetima reakcije, provedene su dvije slijepe probe. Prva slijepa proba sadržavala je
molekulu ATP-a i spoj koji se testira (bez enzima), a druga slijepa proba sadržavala je enzim
HSV1-TK ili hTK te ATP (bez testiranog spoja).
Test fosforiliranja s prirodnim supstratom, 2'-deoksitimidinom (dT), proveden je kako bi se
provjerila aktivnost enzima HSV1-TK i hTK (slika p-1).
N-aciklički lanac pokazao je znatan utjecaj na fosforiliranje ispitanih spojeva pomoću
enzima HSV1-TK. Rezultati fosforiliranja spojeva 25, 27 i 29 s 2,3-dihidroksipropilnim
lancem i lancem poput onog u acikloviru i gancikloviru u položaju N-1 pirimidina su pokazali
kako spomenuti spojevi nisu supstrati HSV1-TK i hTK. U kromatogramu nije opažen novi
signal koji bi odgovarao monofosfatnim derivatima spojeva 25, 27 i 29, niti se omjer ADP i
ATP povećavao u promatranom vremenom (slike p-2, p-3 i p-4).
Nasuprot tome, test fosforiliranja spoja 37 s lancem poput penciklovirnog u položaju N-1
pirimidina pokazao je da je ispitani spoj djelotvoran supstrat HSV1-TK. U kromatogramu je
primijećen novi signal koji odgovara monofosfatnom derivatu 37 (37-MP), povećanje signala
za ADP u odnosu na slijepu probu i smanjenje signala za ATP (slika 27, slika p-5).
55
REZULTATI I RASPRAVA
Slika 27. Kromatogram HPLC i DAD/HPLC za inkubaciju spoja 37 s HSV1-TK i ATP u 30
min.
Vidljivo je da mala promjena u strukturi spoja 29 u odnosu na spoj 37, kao što je zamjena
kisika u (1,3-dihidroksi-2-propoksi)metilnom pobočnom lancu na N-1 u spoju 29
metilenskom skupinom u spoju 37, ima utjecaj na fosforiliranje ovih spojeva. Može se
pretpostaviti da elektron donirajući atom kisika ima utjecaj na interakciju spoja 29 s enzimom
HSV1-TK što onemogućuje enzim da fosforilira spoj 29.
Nadalje, u grupi prof. D. Završnik (Zavod za farmaceutsku kemiju, Farmaceutski fakultet,
Sarajevo) u okviru projekta SCOPES sintetiziran je analog spoja 37, spoj 39 s 3-
hidroksipropilnim lancem u položaju C-5 i lancem poput penciklovirnog u položaju N-1 (slika
28).
ATP
Ap
so
rba
nc
ija (
AU
)
spoj 37 ADP
37-MP
HN
NO
O
OH
OH
OH37
HN
NO
O
OH
OH
OH
39
Slika 28. Strukture 5-(2-hidroksietilnog) (37) i 5-(3-hidroksipropilnog) (39) derivata
pirimidina kao supstrata enzima HSV1-TK.
Test fosforiliranja 3-hidroksipropilnog derivata pirimidina 39 s ATP-om pomoću enzima
HSV1-TK je pokazao kako se spoj 39 također fosforilirao pomoću HSV1-TK, ali je u
56
REZULTATI I RASPRAVA
usporedbi sa spojem 37 znatno lošiji supstrat enzima. U skladu s time je i signal za nastali
monofosfatni derivat 39-MP, kao i omjer ADP/ATP u odnosu na spoj 37 manji (slika 29).
ATP
spoj 39
Ap
so
rban
cij
a (
AU
)
ADP 39-MP
Slika 29. Kromatogram HPLC i DAD/HPLC za inkubaciju spoja TT39 s enzimom HSV1-TK
i ATP u 30 min.
Usporedba rezultata fosforiliranja spojeva 37 i 39 ukazuje na to da veličina supstituenta na
položaju C-5 pirimidina utječe na afinitet vezanja na enzim pa je spoj 37 s manjim
supstituentom (2-hidroksietilni lanac) bolji supstrat HSV1-TK od spoja 39 s većim
supstituentom (3-hidroksipropilni lanac) na položaju C-5.
Nastanak monofosfatnih derivata je dodatno potvrđen analizom maksimalne apsorpcijske
valne duljine novonastalih pikova u odnosu na maksimalnu apsorpcijsku valnu duljinu
polaznih spojeva 37 i 39.
Pored toga, test fosforiliranja spojeva 37 i 39 pomoću hTK i ATP je pokazao da ispitani
spojevi nisu supstrati hTK (slika 32). Nije zapažena promjena u omjeru ADP/ATP kroz
praćeno vrijeme fosforiliranja pomoću hTK.
S obzirom da je spoj 37 djelotvoran i selektivan supstrat HSV1-TK koji, pored toga, nije
pokazao citotoksično djelovanje na normalne stanice, zadovoljio je preduvjete za primjenu u
pozitronskoj emisijskoj tomografiji. Stoga je spoj 37 izabran kao predvodni spoj za pripravu
novog PET-tragača. Pripravljen je fluorirani strukturni analog spoja 37, spoj 52, kao
referentni spoj, u kojem je hidroksilna skupina u C-5 supstituentu zamijenjena fluorom (slika
30).
57
REZULTATI I RASPRAVA
HN
N
OH
OH
O
O
F
52
Slika 30. Struktura referentnog spoja 52, fluoriranog analoga spoja 37.
Proveden je također test fosforiliranja fluoriranog analoga spoja 37 pomoću enzima HSV1-
TK i ATP. Primijećeno je povećanje signala tijekom vremena koji je pripisan monofosfatnom
derivatu spoja 52 (52-MP), povećanje signala za ADP u odnosu na slijepu probu i smanjenje
signala za ATP (slika p-6).
U inkubaciji s HSV1-TK i ATP koja je trajala 90 minuta spoj 52 je gotovo u potpunosti
preveden u monofosfatni derivat (52-MP) (slike 31 i 33).
ADP ATP
52-MP spoj 52
Slika 31. Kromatogram HPLC za inkubaciju spoja 52 s enzimom HSV1-TK i ATP-om u 90
min.
58
REZULTATI I RASPRAVA
Slika 32. Usporedba omjera ADP/ATP u reakcijama fosforiliranja spojeva 37, 39, 29 i dT s
HSV1-TK i hTK. SP se odnosi na slijepu probu, tj. reakciju fosforiliranja koja je provedena u
prisutnosti enzima, ali bez testiranog spoja. S obzirom da su sve reakcije provedene u tri puta
prikazana je i standardna devijacija.
Usporedbom površine ispod signala koji odgovara monofosfatnom derivatu u različitim
vremenima inkubacije, može se procijeniti da oko 40 % 37-MP nastaje u 30 min, dok većina
37-MP (oko 80 %) nastaje u 60 min inkubacije. Nasuprot tome, većina fluoriranog
monofosfatnog derivata 52-MP (oko 70 %) nastaje u 30 min, dok je u 60 min spoj 52 gotovo
potpuno monofosforiliran (slika 33).
HN
N
P
OH
O
O
OH
HN
N
P
OH
O
O
F
Slika 33. Monofosfatni derivati 37-MP i 52-MP tijekom vremena reakcije od 30, 60 i 90 min.
Reakcije su provedene tri puta pa je prikazana i standardna devijacija za svaku reakciju.
59
REZULTATI I RASPRAVA
3.3. Nukleozidni analog s lancem poput ganciklovirnog u položaju N-1
pirimidina i 2-hidroksietilnim supstituentom u položaju N-3
3.3.1. Sinteza N-1-[(1,3-dihidroksi-2-propoksi)metil]-N-3-(2-hidroksietil)pirimidin-2,4-
diona (46)
Višestupnjevitom sintezom iz uracila, kao početnog spoja, sintetiziran je strukturni analog
spoja 29, spoj 46, kao potencijalni supstrat enzima HSV1-TK (shema 18). U spoju 46 se lanac
poput ganciklovirnog nalazi na položaju N-1 pirimidina kao i u spoju 29, ali je hidroksietilni
supstituent, umjesto na C-5, vezan na položaju N-3 pirimidinske jezgre.
Kloriranjem C-2 i C-4 položaja uracila pripravljen je 2,4-diklorpirimidin (40) koji je potom
reakcijom s natrijevim metoksidom preveden u 2,4-dimetoksipirimidin (41). Spoj 41 je
poslužio kao supstrat za selektivno alkiliranje položaja N-1 pirimidina reakcijom s 1,3-
dibenziloksi-2-(klormetoksi)propanom (21) pri čemu je sintetiziran spoj 42 s (1,3-
dibenziloksi-2-propoksi)metilnim lancem u položaju N-1 pirimidina u iskorištenjem od 47 %.
Uklanjanjem metilne skupine s položaja C-4 spoja 42 dobiven je odgovarajući pirimidin-
2,4-dionski derivat 43. Reakcija je provedena na tri načina uz acetil-klorid, 1 M NaOH te
TMSCl i NaI. Uz acetil-klorid spoj 43 je pripravljen u iskorištenju 23 % dok je u bazičnim
uvjetima uz 1 M NaOH spoj 43 sintetiziran u 41 % iskorištenju. Najboljom se pokazala
uporaba TMSCl i NaI pri čemu je spoj 43 izoliran u iskorištenju 47 %. U sljedećem je stupnju
provedena reakcija spoja 43 s 2-benzoiloksietil-bromidom (48) uz K2CO3 u kojoj je izoliran
aciklički derivat uracila s 2-benzoiloksietilnim supstituentom u N-3 položaju pirimidina (44)
uz iskorištenje od 15 %. Lanac 48 sintetiziran je reakcijom 2-brometanola i anhidrida
benzojeve kiseline (Bz2O) (shema 17). Benzilne zaštitne skupine na pobočnom lancu spoja 44
su uklonjene primjenom BCl3, a benzoilna zaštitna skupina na N-3 supstituentu pomoću 1 M
NaOH. Dobiven je spoj 46 u visokom iskorištenju (shema 18).
OBzBr
OHBr
Et3N
(Bz)2O47 48
Shema 17. Sinteza 2-benzoiloksietil-bromida (48).
60
REZULTATI I RASPRAVA
N
NCl
Cl
HN
NH
O
O
POCl3 NaOCH3 N
NH3CO
OCH3
N
NO
OCH3
OBn
OBnO
1. AcCl
HN
NO
O
K2CO3
O OBn
OBn
BzOBr
N
NO
O
BzON
NO
O
BzO BCl3
NaOH
N
NO
O
HO
40 41 21 42
434445
46
48
2. NaOH
3. TMSCl, NaI
Cl
O OBn
OBn
O OBn
OBn
O OH
OH
O OH
OH
K2CO3
Shema 18. Sinteza N-3 hidroksietilnog pirimidinskog derivata s ganciklovirnim lancem (46).
3.3.2. Fosforiliranje spoja 46 pomoću enzima HSV1-TK
Test fosforiliranja spoja 46 s ATP pomoću enzima HSV1-TK je pokazao kako ispitani spoj
nije supstrat spomenutog enzima. Nije zapažen novi signal koji bi odgovarao monofosfatnom
derivatu spoja 46, niti se omjer ADP/ATP povećao tijekom vremena reakcije 30 i 60 min
(slika p-7).
61
REZULTATI I RASPRAVA
3.4. Sinteza fluoriranog referentnog spoja HHB-5-FEP (52) i prekursora
za radiooznačavanje 53
Ciljani spoj, fluoretilni derivat pirimidina s lancem poput penciklovirnog u N-1 položaju
pirimidina, 5-(2-fluoretil)-N-1-[4-hidroksi-3-(hidroksimetil)butil]pirimidin-2,4-dion (52,
HHB-5-FEP), sintetiziran je prema shemi 19.
NaOCH3
CH3OH
p-TsOH x H2O
2,2-dimetoksipropan
N
NH
O
OCH3
OAc
I
OAc
OAc
N
NO
OCH3
OAcN
NO
OCH3
OH
N
NO
OCH3
OH
O
O
N
NO
OCH3
F
O
O
baza
1018
35 49
50
53
51
HN
NO
O
F
OH
OH
N
NO
OCH3
OTs
O
O
OAc
OAc
OH
OH
DAST1. NaI, TMSCl
2. HCl, refluks
TsCl,piridin
52, HHB-5-FEP
52 (HHB-5-FEP) i tosilnog pirimidinskog derivata (53)
kao prekursora za radiooznačavanje.
blago bazičnim uvjetima (0,1 M NaOCH3) pri čemu je nastao spoj 49 s tri primarne
Shema 19. Sinteza referentnog spoja
Penciklovirni lanac je uveden u položaj N-1 pirimidinske jezgre reakcijom spoja 10 s alkil-
jodidom 18 (shema 11) uz bazu K2CO3 pri čemu je nastao C-5 supstituirani N-1 aciklički
pirimidinski derivat 35. Acetilne skupine u N-1 i C-5 pobočnom lancu spoja 35 uklonjene su u
62
REZULTATI I RASPRAVA
hidroksilne skupine. 1,3-diol u N-1 pobočnom lancu zaštićen je reakcijom spoja 49 te p-
toluensulfonske kiseline (p-TsOH x H2O) i 2,2-dimetoksipropana pri čemu je nastao acetonid
50 uz iskorištenje od 59 %. Izopropilidenska zaštitna skupina je stabilna u bazičnim uvjetima,
a izrazito nestabilna u kiselim uvjetima. Fluoriranje nezaštićene hidroksilne skupine u C-5
pobočnom lancu spoja 50 provedeno je u jednom stupnju uz dietilaminosumporov trifluorid
(DAST) kao reagens za fluoriranje uz iskorištenje 34 %. Metilna skupina u položaju C-4 i
izopropilidenska zaštita u spoju 51 uklonjene su na dva načina. Uz NaI i TMSCl nastalo je
nekoliko sporednih produkata i jod koji je otežao pročišćavanje ciljanog spoja 52 koji je
izoliran u iskorištenju od 24 %. C-4 metilna skupina uklonjena je i uz HCl pri čemu je izoliran
ciljani spoj u nešto boljem iskorištenju od 29 %. Prekursor za radiosintezu 53 s tosilnom i
izopropilidenskom zaštitnom skupinom pripravljen je reakcijom 5-(2-
hidroksietil)pirimidinskog derivata 50 s p-toluensulfonil-kloridom u piridinu.
63
REZULTATI I RASPRAVA
3.5. Radiokemija
3.5.1. Radiosinteza spojeva HHB-5-[18F]FEP ([18F]52) i [18F]FHBG (56)
Radiosinteza spojeva HHB-5-[18F]FEP ([18F]52) i [18F]FHBG (56) provedena je u dva
stupnja, reakcijom radiofluoriranja odgovarajućeg prekursora i uklanjanjem zaštitnih skupina
u kiselim uvjetima (shema 20).
N
NO
OCH3
OTs
O
O
N
NO
OCH3 O18F
HN
N
18F
O
[18F]52, HHB-5-[18F]FEP
HN
N N
N
O
H2N
HN
N N
N
O
MTrHN
HN
N N
N
O
MTrHN
[18F]51
56, [18F]FHBG55
[18F]KF HCl
53
HCl[18F]KF
54
kriptofiks 2.2.2
kriptofiks 2.2.2
O
O
OH
OH
OTs
OMTr
18F
OMTr
18F
OH
Shema 20. Radiosinteza spojeva HHB-5-[18F]FEP ([18F]52) i [18F]FHBG (56).
Nukleofilna supstitucija tosilatne odlazeće skupine s [18F]fluoridom provedena je u
acetonitrilu pri 100 °C. [18F]fluor je uveden u molekulu uz odlično iskorištenje radiosinteze
od 60 %. Nakon uklanjanja izopropilidenske zaštitne skupine i metilne skupine s položaja C-4
uz koncentriranu HCl izoliran je ciljani spoj HHB-5-[18F]FEP ([18F]52) u ukupnom
radiokemijskom iskorištenju od 45 ± 4 % (n = 4; n = broj eksperimenata). Tijek reakcije
radiooznačavanja spoja 53 praćen je na UPLC-u (ultra performance liguid chromatography)
(slika p-8). Radiooznačeni ciljani spoj [18F]52 pročišćen je semi-preparativnim HPLC-om u
trajanju od 25 min (tR = 17,9 min uz eluens etanol/20 mM fosfatni pufer) (slike p-9 i p-10), te
je formuliran za ispitivanja in vitro i in vivo.
64
REZULTATI I RASPRAVA
Ukupni iznos radioaktivnosti na kraju sinteze (end of synthesis, EOS) iznosio je 7,36 GBq,
a radiokemijska čistoća > 99 %. Specifična aktivnost iznosila je između 50 i 135 GBq/μmol
nakon ukupnog trajanja radiosinteze od 90 min. Struktura radiooznačenog spoja [18F]52
potvrđena je usporedbom njegovog kromatograma s kromatogramom neoznačenog
fluoriranog referentnog spoja 52 (slika 34).
Slika 34. Kromatogram HPLC spoja [18F]52 i radiokromatogram njegovog analoga, spoja 52.
Stabilnost radiooznačenog spoja praćena je HPLC-analizom formuliranog produkta [18F]52
tijekom 4 sata pri čemu nisu zamijećene promjene u njegovoj radiokemijskoj čistoći (slika p-
11).
[18F]FHBG (56) je pripravljen primjenom analognog sintetskog puta za dobivanje spoja
[18F]52. Za radiofluoriranje odgovarajućeg prekursora 54 s metoksitritilnim zaštitnim
skupinama i tosilatom, kao dobro odlazećom skupinom, korišten je [18F]KF, a zaštitne
skupine su uklonjene uz HCl (shema 20). Ciljani spoj 56 pročišćen je semi-preparativnom
kolonskom kromatografijom.
65
REZULTATI I RASPRAVA
3.5.2. Ispitivanje in vitro ulaska spoja HHB-5-[18F]FEP ([18F]52) u transducirane stanice
Ispitivanje in vitro ulaska radiooznačenog HHB-5-[18F]FEP ([18F]52) u stanice provedeno
je na genetički promijenjenim embrionalnim bubrežnim stanicama iz čovjeka u koje je unešen
gen HSV1-tk (HEK293TK+) i kontrolnim stanicama HEK293. Praćeno je nakupljanje
radiooznačene molekule u navedenih stanicama tijekom 60, 120 i 240 min. U svim ispitanim
vremenskim razmacima, radioaktivnost je bila veća u TK+ stanicama. Eksperimenti su,
nadalje, pokazali kako je omjer radioaktivnosti 35−41 puta veći u TK+ stanicama u odnosu na
kontrolne stanice koje ne pokazuju aktivnost HSV1-TK (slika 35). Ova povoljna svojstva in
vitro potaknula su daljnja testiranja in vivo spoja HHB-5-[18F]FEP ([18F]52).
Slika 35. Omjer ulaska spoja HHB-5-[18F]FEP ([18F]52) u stanice HEK293TK+ i kontrolne
stanice HEK293 tijekom vremena od 60, 120 i 240 min. Na grafu je prikazana standardna
devijacija.
omje
r ra
dio
akti
vnos
ti
HE
K29
3TK
+/H
EK
293
kon
trol
nih
stan
ica
3.5.3. Ispitivanje antitumorskog djelovanja in vitro spojeva 5, 7, 8, 10, 11, 18, 23−38, 49,
50, 52 i 53.
Spojevi 5, 7, 8, 10, 11, 18, 23−38, 49, 50, 52 i 53 su testirani na stanične linije zloćudnih
tumora porijeklom iz čovjeka: karcinom vrata maternice (HeLa), karcinom debelog crijeva
(SW 620), karcinom dojke (MCF-7), karcinom stanica jetre (HepG2), te na normalne
diploidne fibroblaste porijeklom iz čovjeka (BJ). Rezultati ispitivanja su pokazali kako
spomenuti spojevi ne pokazuju antiproliferativno djelovanje na odabrane stanične linije
zloćudnih tumora kao ni na normalne diploidne fibroblaste porijeklom iz čovjeka u
koncentraciji do 100 μM.
66
REZULTATI I RASPRAVA
3.5.4. Praćenje aktivnosti HSV1-TK pomoću spoja HHB-5-[18F]FEP ([18F]52) i [18F]FHBG
(56) metodom PET
Usporedba PET-slika miša s tumorom TK+ u desnom ramenu nakon uštrcavanja
[18F]FHBG (56) (slika A) i HHB-5-[18F]FEP ([18F]52) (slika B) prikazana je na slici 36slika
36.
Slika 36. PET-slike cijelog tijela miša s HEK293 kontrolnim ksenograftom u lijevom ramenu
i s HEK293TK+ ksenograftom u desnom ramenu u trajanju od 30 min (60−90 min nakon
uštrcavanja radiofarmaceutika). A) miš (24,3 g) s injektiranim spojem [18F]FHBG (56; 17,8
MBq); B) miš (28,4 g) s injektiranim spojem HHB-5-[18F]FEP ([18F]52; 8,47 MBq).
3.5.5. Biodistribucija
Sukladno s rezultatima in vitro ulaska spojeva u stanice, primijećeno je veće nakupljanje
spoja HHB-5-[18F]FEP ([18F]52) u ksenograftu TK+ u usporedbi s kontrolnim ksenograftom
HEK293. SUV-indeks (Standardized Uptake Values) za ksenograft TK+ za HHB-5-[18F]FEP
([18F]52) bio je veći (SUVPET = 0,32) od SUV-indeksa za [18F]FHBG (56) (SUVPET = 0,22).
Radioaktivnost u kontrolnom ksenograftu bila je, također, nešto veća (SUVPET = 0,17) u
usporedbi s pozadinskom aktivnošću (SUVPET = 0,08). U usporedbi s [18F]FHBG (56), HHB-
5-[18F]FEP ([18F]52) je pokazao veću pozadinsku aktivnost, ali manju aktivnost u
abdominalnom području. Iako je SUV-indeks za HHB-5-[18F]FEP ([18F]52) veći od SUV-
indeksa za [18F]FHBG (56), nakupljanje HHB-5-[18F]FEP ([18F]52) u ksenograftu TK+ je
manje specifično jer se više spoja HHB-5-[18F]FEP akumuliralo u kontrolnom ksenograftu od
67
REZULTATI I RASPRAVA
poznatog PET-tragača [18F]FHBG (manji omjer TK+/kontrolni tumor za HHB-5-[18F]FEP)
(tablica 4).
Tablica 4. Podaci za biodistribuciju (SUVbiodis) i PET-podaci (SUVPET) za spojeve HHB-5-
[18F]FEP ([18F]52) i [18F]FHBG (56) u miševima s ksenograftovima u vremenu od 95 min
nakon uštrcavanja radiotragača.
[18F]FHBG (56) HHB-5-[18F]FEP ([18F]52) Tkivo
SUVbiodis SUVPET omjer
SUVbiodis SUVbiodis SUVPET
omjer SUVbiodis
ksenograft
TK+ 0,24 ± 0,07 0,22 ± 0,02
TK+/kontr.
ksenograft
5,7 ± 1,9 0,37 ± 0,15 0,32 ± 0,06
TK+/kontr.
ksenograft
3,4 ± 1,1 kontrolni
ksenograft 0,04 ± 0,00 0,09 ± 0,004
0,11 ± 0,01 0,17 ± 0,02
krv 0,03 ± 0,02 0,07 ± 0,04
slezena 0,08 ± 0,08 0,05 ± 0,00
jetra 0,16 ± 0,19 0,06 ± 0,00
bubreg 0,12 ± 0,06 0,25 ± 0,09
pluća 0,03 ± 0,01 0,05 ± 0,00
kost 0,04 ± 0,03 0,05 ± 0,01
srce 0,04 ± 0,05 0,04 ± 0,01
mozak 0,002 ± 0,00 0,01 ± 0,00
želudac 0,02 ± 0,01 0,05 ± 0,01
crijeva 1,78 ± 0,04 0,78 ± 0,05
gušterača 0,03 ± 0,01 0,06 ± 0,02
mišići 0,02 ± 0,00 0,04 ± 0,01 0,08 ± 0,02 0,08 ± 0,002
tiroidna
žlijezda 0,02 ± 0,01 0,12 ± 0,11
žučni mjehur 0,01 do 3,6 1,5 do 3,5
urin 15 do 29 13 do 182
Područje s najvećom akumulacijom radioaktivnosti je područje abdomena, žučnog mjehura
i pozitivni ksenograft TK+. U tablici 4 su prikazani podaci biodistribucije spoja [18F]FHBG
(56) i HHB-5-[18F]FEP ([18F]52) kod miševa s ksenograftom. Podaci su prikazani kao srednja
vrijednost ± standardna devijacija za tri životinje (n = 3). Nakupljanje radioaktivnosti u
pozitivnom ksenograftu TK+ značajno je veće nego u kontrolnom ksenograftu oba
radiotragača. Omjer radioaktivnosti u TK+ i kontrolnom ksenograftu za [18F]FHBG (56) je bio
5,7 ± 1,9 (n = 3), a za HHB-5-[18F]FEP ([18F]52) je iznosio 3,4 ± 1,1 (n = 3). Biodistribucija
oba radiotragača bila je slična. Ipak, u usporedbi s [18F]FHBG (56), novi PET-tragač HHB-5-
[18F]FEP ([18F]52) pokazao je manje nakupljanje radioaktivnosti u abdomenu, jetri i slezeni, a
68
REZULTATI I RASPRAVA
veću radioaktivnost u mišićima, krvi, bubrezima, tiroidnoj žlijezdi i u području mozga.
Visoka razina radioaktivnosti u bubrezima, mokraćnom mjehuru i urinu upućuje na renalni
put izlučivanja radiotragača HHB-5-[18F]FEP ([18F]52) što rezultira manjim nakupljanjem
radioaktivnosti u abdomenu u usporedbi s [18F]FHBG (56) koji se izlučuje putem jetre i urina.
Oba radiotragača pokazala su slabo nakupljanje u kostima što znači da su spojevi stabilni i
nisu podložni defluoriranju.
69
REZULTATI I RASPRAVA
3.6. Strukturna analiza N-1 alkiliranih i O-2 alkiliranih regioizomera C-5
hidroksietilnog derivata pirimidina
3.6.1. Analiza spektara 1H i 13C NMR
Alkiliranjem spoja 10 uz alkil-jodid 18 izolirani su regioizomeri 35 i 36 (slika 37).
Uklanjanjem zaštitnih skupina u bazičnim uvjetima sintetizirani su spojevi 49 i 38.
N
N
R
R
OCH3
O O
RR
N
N
OCH3
RR
35, R = OAc
49, R = OH
36, R = OAc
38, R = OH
Slika 37. N-1 alkilirani i O-2 alkilirani regioizomeri C-5 supstituiranih derivata pirimidina.
Analiza spektara 1H i 13C NMR za spojeve 35, 36, 38 i 49 upućivala je da su alkilirana dva
položaja pirimidinske jezgre. Usporedbom spektara 1H i 13C NMR dvaju regioizomera,
primijećene su najveće razlike u kemijskom pomaku metilenskih protona H-1'' (3,82; 4,34
ppm) i atoma C-1'', C-2, C-6 i C-5 (slika 38). Potvrđeno je da se odsjenjeni protoni H-1'' u
spektru 1H NMR i atomi C-1'', C-2, C-5 i C-6 koji su pomaknuti prema nižim poljima u
spektru 13C NMR mogu pripisati odgovarajućim atomima za O-2 aciklički regioizomer.
Pretpostavljene strukture potvrđene su spektrima 2D NMR. U spektru HMBC (Heteronuclear
multiple-bond correlation spectroscopy) spojeva 35 i 49 primijećeno je sprezanje signala
metilenskih protona H-1'' (3,82; 3,80 ppm) s C-2 atomom (155,1 ppm) i C-6 atomom (147,2
ppm) kroz tri veze što upućuje na to da je alkiliran položaj N-1 pirimidinskog prstena.
Nadalje, spektar HMBC O-2-izomera 36 i 38 pokazuje sprezanje signala H-1'' metilenskih
protona (4,34; 4,32 ppm) s atomom C-2, ali ne i atomom C-6 pirimidina što potvrđuje
strukturu O-alkiliranog regioizomera (slika 38). Nadalje, sprezanje signala protona H-1' i
atoma C-4 i C-6 za spojeve 35, 36, 38 i 49, potvrđuje da se hidroksietilni i acetoksietilni lanac
nalazi na C-5 položaju pirimidina.
70
REZULTATI I RASPRAVA
N
N
OCH3
RH= 3,83
C = 155,6 C = 103,3
C = 147,7O
N
N
OCH3
CH2'
O
RH = 4,34
C= 163,4C= 110,9
C = 158,11''
R = CH2CH(CH2OAc)2
CH2'
R5R5
R5 = CH2OAc
35 36C = 47,2 C= 64,5
Slika 38. Struktura N-1- (35) i O-2-regioizomera (36). Strelice označavaju korelacije 1H-13C
koje su zapažene u spektrima HMBC. Prikazani su karakteristični kemijski pomaci za atome
H-1'', i atome C-2, C-5 i C-6 pirimidinskog prstena.
3.6.2. Kristalna i molekulska struktura 5-(2-acetoksietil)-4-metoksipirimidin-2-ona (10)
Spoju 10 određena je kristalna struktura rentgenskom strukturnom analizom, a njegova
molekulska struktura prikazana je na slici 39. Kristalna struktura spoja 10 pokazala je kako je
2-acetoksietilni lanac vezan za C-5 atom 4-metoksipirimidin-2-onskog prstena. Spoj 10
kristalizirao je s 2 neovisne molekule (označene s A i B) u asimetričnoj jedinici. Duljina veza
molekula 10-A i 10-B je unutar vrijednosti 3 σ uz izuzetak duljine veze N1C2 za A i B
molekulu. Vezni kut N3C4C5 u obje neovisne molekule spoja 10 je proširen. Međutim,
zbroj endocikličkih veznih kuteva u prstenu je 720º što je i očekivano za šesteročlani prsten.
Pretraga Cambridge Structural Database je pokazala da je spoj 10 prvi primjer 4-
metoksipirimidin-2-ona. Iako, poznate su neke strukture u kojima je vodikov atom na N-1
položaju prstena supstituiran i geometrija u tim strukturama odgovara onoj u spoju 10.
Metoksi skupina spoja 10 zauzima sinperiplanarnu konformaciju u odnosu na atom N-3
pirimidinskog prstena pri čemu su torzijski kutevi N3C4O2C7 gotovo identični.
Zanimljivo je da nema razlike u konformaciji acetoksietilne skupine u dvije nezavisne
molekule spoja 10. Atom C-5 pirimidinskog prstena je u molekuli A sinklinalan u odnosu na
O-3 atom, a u molekuli B je antiperiplanaran. Atomi O3/O4/C9/C10/C11 spoja 10 tvore
ravninu koja je gotovo okomita u odnosu na pirimidinski prsten. Diedarski kutevi između
glavnih ravnina molekula A i B iznose 65,04 (12) i 75,61 (12)º.
71
REZULTATI I RASPRAVA
a)
b)
Slika 39. a) Molekulska struktura spoja 10 s prikazanim brojevima atoma; b) dio kristalne
strukture spoja 10. Vodikove veze su prikazane isprekidanim linijama.
Svaka neovisna molekula spoja 10 tvori R22 (8) dimere kroz N1….O1 vodikove veze.
Nadalje, dimeri su povezani sa sedam CH…..O i dvije CH….N vodikove veze pri čemu
navedene intermolekulske interakcije stvaraju trodimenzijsku mrežu (slika 39b).
72
REZULTATI I RASPRAVA
3.7. Z- i E-izomeri fluoriranih C-6 izobutenilnih N-metilnih derivata
timina i prekursora za reakciju radiooznačavanja
3.7.1. Sinteza C-6 izobutenilnih N-metilnih derivata timina
Sinteza 6-izobutenilnog derivata timina 67 prikazana je na shemi 21.107 2,4-dimetoksi
derivat timina (58) dobiven je transformacijama karbonilnih skupina 6-metiltimina koje
uključuju kloriranje s fosforilovim trikloridom, a potom metoksiliranje dobivenog
dikloriranog spoja 57 uz natrijev metoksid. Spoj s pobočnim lancem u položaju C-6 timina
(61), pripravljen je reakcijom litiranja, metodom koja se uspješno primjenjuje za uvođenje
različitih funkcionalnih skupina u pirimidinsku jezgru, a potom nukleofilnom adicijom
organolitijevog intermedijara na karbonilnu skupinu. Provedeno je litiranje metilne skupine u
položaju C-6 spoja 58 uz litijev diizopropilamid (LDA), a zatim nukleofilna adicija
organolitijevog intermedijara na 1,3-dibenziloksipropan-2-on (60) koji je pripravljen Corey-
Kim-ovom oksidacijom alkohola 59.105 Kako bi se spriječila intramolekulska ciklizacija
prilikom reakcije fluoriranja i nastanak pirolo[1,2-c]pirimidina,106 položaj N-1 je zaštićen
metiliranjem spoja 61 koje je provedeno pomoću metil-jodida pri čemu je izoliran spoj 62.
Benzilne skupine su uklonjene primjenom borovog triklorida. U istoj je reakciji provedeno i
demetiliranje položaja C-4 pirimidina pri čemu je izoliran spoj 63 s tri hidroksilne skupine u
pobočnom lancu. Primarne hidroksilne skupine u spoju 63 su zaštićene i prevedene u esterske
skupine uz acetanhidrid pri čemu je pripravljen diacetilirani spoj 64. Fluoriranjem tercijarne
hidroksilne skupine u pobočnom lancu uz DAST, kao reagens za fluoriranje, izoliran je
fluorirani analog 65. U reakciji fluoriranja izoliran je i pirimidinski derivat s dvostrukom
vezom u pobočnom lancu (66), kao produkt reakcije dehidrohalogeniranja. Reakcijom
dehidrohalogeniranja i deacetiliranja uz NaOCH3 u metanolu produkata 65 i 66 dobiven je
ciljani spoj 67 s dihidroksiizobutenilnim lancem u položaju C-6 timina (shema 21).
73
REZULTATI I RASPRAVA
N
N
CH3
OCH3
H3CO CH3
HN
NH
CH3
O
O CH3
POCl3
N
N
CH3
OCH3
H3COOH
OBnOBnBnO
O
OBn
HN
N
CH3
O
O
OHOH
LDA
OH
HN
N
CH3
O
O
OAcOAc
OH
HN
N
CH3
O
O
OAcOAc
F
HN
N
CH3
O
O
OAcOAc
+
HN
N
CH3
O
O
OHOH
N
N
CH3
OCH3
OOH
OBnOBn
CH3
CH3CH3CH3CH3
CH3
57 58
59
CH3I, 55 °C
60 61 62
63646566
BnO
OH
OBnNCS
(CH3)2S
-25 °CBCl3
Ac2ODAST
-75 do -40 °C
NaOCH3/CH3OH
67
N
N
CH3
Cl
Cl CH3
NaOCH3
Shema 21. Višestupnjevita sinteza spoja 67.
Kako je test fosforiliranja N-metilnog C-6 dihidroksiizobutenilnog derivata timina (67) s
ATP i enzimom HSV1-TK pokazao kako je spoj 67 supstrat spomenutog enzima, sintetizirani
su odgovarajući prekursori, sa zaštićenim hidroksilnim skupinama (71 i 75) za sintezu
radiooznačenog derivata timina s 3-[18F]fluor-2-(hidroksimetil)propenilnim pobočnim lancem
na položaju C-6 pirimidina.107 Nadalje, sintetiziran je i monofluorirani spoj 69 koji može
poslužiti kao referentni spoj za identifikaciju radiooznačenog analoga (shema 22). Kao
početni spoj za dobivanje prekursora i odgovarajućeg fluoriranog analoga korišten je spoj 67.
Jedna primarna hidroksilna skupina je selektivno prevedena u metoksitritilnu uz 4-
metoksitrifenilmetil-klorid (MTrCl) u prisutnosti 4-dimetilaminopiridina (DMAP) pri čemu je
dobiven C-6 izobutenilni derivat pirimidina 68 s iskorištenjem 52 % kao smjesa Z- i E-
izomera u omjeru 5 : 2.
74
REZULTATI I RASPRAVA
HN
N
CH3
O
O
OHOMTr
CH3
HN
N
CH3
O
O
FOH
CH3
HN
N
CH3
O
O
FF
CH3
HN
N
CH3
O
O
OHOH
CH3
HN
N
CH3
O
O
OMsOMTr
CH3
HN
N
CH3
O
O
ClOH
CH3
HN
N
CH3
O
O
OHOAc
CH3
HN
N
CH3
O
O
OAcOAc
CH3
HN
N
CH3
O
O
OMsOAc
CH3
+
67 68
69 70
+
7172
7374
+
75
MTrCl
DMAP
sob. tem.
Ac2O
DMAPsob. tem.
-5 °CMsCl MsCl
-8 °C do 0 °C
1) DAST
2) 5 % HCl u MeOH, refluks
Shema 22. Sinteza C-6 izobutenilnih derivata timina (6875).
Monofluorirani spoj iz reda C-6 alkiliranih timina (69) dobiven je reakcijom fluoriranja
primarne hidroksilne skupine spoja 68 pomoću fluorirajućeg reagensa DAST, a potom
hidrolizom u kiselom nastalog fluoriranog spoja kako bi se uklonila metoksitritilna zaštitna
skupina uz iskorištenje reakcije od 24 %. U reakciji fluoriranja izoliran je i difluorirani derivat
70 s iskorištenjem od 36 %. Spoj 69 dobiven je kao smjesa Z- i E-izomera u odnosu 5 : 4.
Nastanak difluoriranog derivata može se objasniti hidrolizom metoksitritilne zaštitne skupine,
a potom reakcijom fluoriranja obje primarne hidroksilne skupine.
Prekursor za radiooznačavanje s mesilatnom odlazećom skupinom 71 je dobiven reakcijom
mesiliranja spoja 68 s metansulfonil-kloridom (MsCl) pri čemu je izoliran i klorirani derivat
72. Nastala je smjesa Z- i E-izomera spoja 71 u omjeru 3 : 2. Monoacetilirani i diacetilirani
75
REZULTATI I RASPRAVA
spojevi 73 i 74 su izolirani nakon reakcije acetiliranja C-6 dihidroksiizobutenilnog derivata
timina (67) uz acetanhidrid, DMAP i trietilamin. Monoacetilirani spoj 73 nastao je kao smjesa
Z- i E-izomera u omjeru 2 : 1. Mesiliranjem nezaštićene hidroksilne skupine u spoju 73 uz
MsCl nastao je spoj 75 s 2-acetoksimetil-3-mesiloksipropenilnim lancem. Omjer Z- i E-
izomera u spoju 75 iznosio je 5 : 4.
3.7.2. Spektroskopska analiza1H, 13C i 19F NMR Z-/E-izomera spoja 69 i spoja 70
HN
N
CH3
O
OHF
CH3
O
HN
N
CH3
O
FOH
CH3
O
1'
2'
3'a
Z-69 E-69
HN
N
CH3
O
FF
CH3
O
70
3'b 3'b 3'a
Slika 40. Mono- i difluorirani C-6 izobutenilni N-metilni derivati timina 69 i 70.
Spektri 1H, 13C i 19F NMR za spojeve 68, 69, 7173 i 75 pokazali su dva para signala koji
odgovaraju njihovim Z- i E-izomerima. Spektri 1H, 13C, 19F NMR i spojeva 69 i 70 pokazali
su konstante sprege koje odgovaraju HF i CF međudjelovanjima i koje su u skladu s već
poznatim podacima za sprege s atomom fluora.108 Provedeno je asigniranje vodikovih i
ugljikovih atoma na koje je vezan fluor i susjednih ugljikovih i vodikovih atoma (tablica p-1,
Eksperimentalni dio). U spektru 1H NMR spoja E-69, signal za proton H-3'a je dublet dubleta
s konstantama sprege 12,2 Hz i 46,8 Hz (sprega s atomom fluora kroz dvije veze). U spektru
13C NMR spoja E-69, signal za atom C-3'a je dublet zbog sprege s atomom fluora kroz jednu
vezu, a konstanta sprege iznosi 166,3 Hz. Signali za atome C-2', C-1' i C-6 su također dubleti
s odgovarajućim konstantama sprege od 13,0 Hz, 12,2 Hz i 1,5 Hz zbog sprezanja s atomom
fluora kroz 2, 3 i 4 veze (tablica p-1). Konfiguracijski izomer Z-69 pokazao je slična
sprezanja i konstante sprege HF i CF (tablica p-1). Nadalje, Z- i E-konfiguracija spoja 69
potvrđena je prostornim međudjelovanjima NOE koja su također ukazala na prevladavajuću
konformaciju spojeva 69 i 70 (slika 41).
76
REZULTATI I RASPRAVA
Slika 41. Prikaz prevladavajuće konformacije fluoriranih derivata pirimidina: a) spoj Z-69; b)
spoj E-69; c) spoj 70. Strelice označavaju interakcije NOE (u %).
Zasićenje hidroksimetilenske skupine H-3'b u pirimidinskom derivatu Z-69 rezultiralo je
umjerenim interakcijama NOE s protonom H-1' (4,8 %, slika 41a, tablica 5). U izomeru E-69
opažene su interakcije fluormetilenske skupine H-3'a i protona H-1' (5,5 %, slika 41b, tablica
5). Nadalje, E-konfiguraciju potvrđuju interakcije NOE C-5 metilnih protona s
hidroksimetilenskim protonima H-3'b u E-69 izomeru. Navedene interakcije nisu prisutne u
izomeru Z-69.
Interakcije NOE u difluoriranom pirimidinskom derivatu 70 pokazuju međudjelovanje
protona H-1' i metilnih protona N-1 (6,2 %), te protona fluormetilenske skupine H-3'b i
protona H-1' (5,4 %, tablica 5). Primijećene su, također, slabe interakcije NOE između
protona H-1' i metilnih protona C-5 (2,0 %, slika 41c, tablica 5). Nadalje, zasićenje H-3'b
metilenskih protona rezultiralo je jakim interakcijama s protonom H-1' (7,5 %), a zasićenje
protona H-3'a uzrokovalo je umjerenu interakciju s metilnim protonima C-5 (3,2 %, tablica 5).
Snimanja interakcija NOE ukazala su da je dominantna konformacija spojeva 67, 69 i 70 u
kojoj je vinilni proton H-1' prostorno bliži metilnoj skupini N-1, a da su metilenski protoni H-
3'a, odnosno H-3'b prostorno bliži metilnim protonima C-5.
77
REZULTATI I RASPRAVA
Tablica 5. Ključne interakcije NOE (u %) za spoj 67, monofluorirani derivat (E-69 i Z-69) i
difluorirani pirimidinski derivat (70).
zasićenje CH3-5 H-1' CH3-N H-3'a H-3'b
međudje-
lovanje
H-1' H-3'a H-3'b CH3-5 H-3'a H-3'b CH3-N H-1' CH3-5 H-1' CH3-5 H-1'
67 1,3 1,3 0,1 2,7 0,6 3,0 7,2 3,3 2,9 0,5 0,5 4,3
E-69 0,5 0,0 0,5 0,9 3,7 0,0 4,5 2,0 0,0 5,5 3,2 0,0
Z-69 0,6 0,5 0,0 2,0 0,0 2,3 7,0 2,9 2,9 0,0 0,0 4,8
70 1,5 2,2 0,0 2,0 0,0 5,4 6,2 3,3 3,2 0,0 0,0 7,5c
3.7.3. Ispitivanje antitumorskog djelovanja in vitro C-6 izobutenilnih derivata timina
Ispitano je antiproliferativno djelovanje spojeva 6874 na stanične linije zloćudnih tumora
porijeklom iz čovjeka: karcinom vrata maternice (HeLa), karcinom debelog crijeva (SW 620),
karcinom dojke (MCF-7), karcinom stanica jetre (HepG2), karcinom gušterače (MiaPaCa-2) i
normalne fibroblaste porijeklom iz čovjeka (WI 38). Spoj 68 s metoksitritilnom skupinom u
pobočnom lancu pokazao je umjerenu aktivnost (IC50 20,4144,) na sve ispitane
stanične linije uključujući i normalne ljudske fibroblaste. Ostali ispitani spojevi nisu pokazali
antiproliferativno djelovanje na tumorske stanične linije i normalne ljudske fibroblaste (WI
38).
78
REZULTATI I RASPRAVA
3.8. N-aciklički 5-supstituirani heteroarilni i alkinilni pirimidinski
derivati
3.8.1. Sinteza spojeva 7685 reakcijama unakrsnog povezivanja kataliziranih paladijem
Reakcijama unakrsnog povezivanja kataliziranih paladijem sintetizirani su C-5
supstituirani heteroarilni (77, 83) i alkinilni (85ai) N-aciklički derivati pirimidina, kao
potencijalni supstrati HSV1-TK.
C-5 furilni derivat pirimidina s lancem poput penciklovirnog na N-1 položaju (77)
sintetiziran je u dva stupnja. Stille-ovom reakcijom 5-joduracila i 2-(tributilstanil)furana uz
katalizator bis(trifenilfosfin)paladijev(II) diklorid ((Ph3P)2PdCl2) sintetiziran je 5-(furan-2-
il)uracil (76) u iskorištenju od 62 %. Reakcijom spoja 76 i alkil-jodida 18 uz bazu uveden je
lanac poput penciklovirnog u pirimidinsku jezgru spoja 76. U istoj reakciji, zbog bazičnih
uvjeta, došlo je do deacetiliranja dviju acetoksi-skupina pobočnog lanca. Izoliran je ciljani
spoj 77 s iskorištenjem od 14 % i manja količina 1,3-disupstituiranog produkta (78) (7 %)
(shema 23).
HN
NH
O
O
I
O
HN
NH
O
O
O
(Bu)3Sn
N
NO
O O
OH
OH
HO
HO
+HN
NO
O
OH
OH76
77
(PPh3)2Cl2Pd spoj 18
K2CO3
78
O
Shema 23. Sinteza 5-(furan-2-il)pirimidina s dihidroksiizobutilnim lancem na položaju N-1
pirimidina (77).
Kako se sintetskim pristupom koji prvo uključuje reakciju kataliziranu paladijem za
dobivanje C-5 supstituiranog produkta, a potom njegovo nespecifično N-alkiliranje izolirao
spoj 77 u niskom ukupnom iskorištenju od 9 %, primijenjen je drugi sintetski pristup. Budući
da reakcijom 5-joduracila i alkil-jodida 18 može nastati N,N-1,3-disupstituirani derivat 5-
joduracila, uvedena je zaštitna skupina u položaj N-3 uracila. Nakon reakcije benzoiliranja
uracila s benzoil-kloridom (BzCl) izoliran je spoj 79 u iskorištenju od 85 %. Položaj C-5
spoja 79 je potom jodiran uz jod i amonijev cerijev(IV) nitrat (CAN) pri čemu je izoliran spoj
79
REZULTATI I RASPRAVA
80 u iskorištenju od 55 %. Spoj 81 je sintetiziran alkiliranjem spoja 80 uz alkil-jodid 18 i
kalijev karbonat (shema 24).
HN
NH
O
O
N
NH
O
O
Bz I N
N
O
O
Bz
OAc
OAc
IBzCl spoj 18
K2CO3
79 80 81
N
NH
O
O
Bz I2
CAN
Shema 24. Sinteza N-3 benzoilnog N-1 acikličkog pirimidina 81, kao prekursora za reakcije
katalizirane paladijem.
Nakon sinteze spoja 81, tienilni supstituent je uveden u položaj C-5 N-1 acikličkog
pirimidina Stille-ovom reakcijom uz 2-(tributilstanil)tiofen i paladijev katalizator (PPh3)4Pd
pri čemu je izoliran spoj 82 u iskorištenju 30 %. Zaštitne skupine su uklonjene u bazičnim
uvjetima uz NaOCH3 i dobiven je spoj 83 u iskorištenju od 25 % (shema 25).
N
N
O
O
Bz IS SnBu3
Pd(PPh3)4
N
N
O
O
Bz
S
81 82 83
NaOCH3 /
CH3OH
OAc
OAc
OAc
OAc
HN
N
O
O
S
OH
OH
Shema 25. Sinteza C-5 tienilnog N-acikličkog derivata pirimidina 83.
Spojevi iz serije C-5 supstituiranih alkinilnih derivata uracila s lancem poput
penciklovirnog u položaju N-1 pirimidina, pripravljeni su Sonogashira-inom reakcijom spoja
81 i odgovarajućih terminalnih alkina (shema TT26).
80
REZULTATI I RASPRAVA
N
N
O
O
Bz IN
N
O
O
BzR
HN
N
O
O
R
Pd(PPh3)4
CuI
Et3N
F
F
84a-i
Br
C5H11
Cl
81
HC R
NaOCH3 /
CH3OH
85a-i
a, R =
b, R =
c, R =
d, R =
e, R =
f, R =
g, R =
h, R =
i, R =
OAc
OAc
OAc
OAc
OH
OH
Shema 26. Sinteza C-5 alkinilnih N-acikličkih derivata pirimidina Sonogashira-inom
reakcijom.
Sonogashira-ina reakcija je provedena uz Et3N, katalizator Pd(PPh3)4, i kokatalizator CuI.
Reakcijska smjesa je nakon završetka reakcije obrađena dodatkom Amberlita IRA 400 koji na
sebe veže u reakciji nastali Et3NHI i time olakšava pročišćavanje produkta. Dobiveni su
spojevi 84ai u dobrom iskorištenju (42−83 %). Najveća iskorištenja dobivena su u reakciji
sinteze N-acikličkog 3,3-dimetilbutinilnog 84i (83 %) i (p-pentilfenil)etinilnog derivata 84d
(81 %). Nasuprot tome, najniže iskorištenje je dobiveno u reakciji sinteze N-acikličkog (p-
bromfenil)etinilnog derivata pirimidina 84b (42 %).
Acetilne skupine u N-1 pobočnom lancu i benzoilna zaštitna skupina uklonjene su u
bazičnim uvjetima uz NaOCH3 pri sobnoj temperaturi i izolirani su spojevi 85ai.
Uklanjanjem zaštitnih skupina uz 1 M NaOH dobiven je ciljani spoj uz znatno niže
iskorištenje reakcije. Uklanjanje zaštitnih skupina pri povišenoj temperaturi ili produljenje
vremena reakcije rezultiralo je nastankom većeg broja sporednih produkata i nižim
iskorištenjem reakcije.
81
REZULTATI I RASPRAVA
3.8.2. Fosforiliranje N-acikličkog 5-(furan-2-il)pirimidinskog derivata 77 pomoću enzima
HSV1-TK
Proveden je test fosforiliranja spoja 77 s adenozin-trifosfatom (ATP) pomoću enzima
HSV1-TK. Kako bi se odredila autohidroliza ATP-a provedene su i dvije slijepe probe.
Reakcija je prekinuta nakon 30, 60 i 90 minuta, a produkti reakcije analizirani su pomoću
HPLC-a. Rezultati su pokazali da se omjer ADP/ATP povećavao s vremenom inkubacije i
nakon 30 min iznosio je 0,27, nakon 60 min iznosio je 0,41, dok je nakon 90 min iznosio 0,46
(slika 42). Taj je omjer oko tri puta veći nego omjer ADP/ATP nastao autohidrolizom ATP-a,
što ukazuje da je spoj 77 supstrat enzima HSV1-TK. Pretpostavlja se da novi signal u
kromatogramu HPLC koji odgovara monofosfatnom derivatu spoja 77 nije zamijećen jer je
prekriven signalom ADP-a.
Slika 42. Prikaz omjera ADP/ATP nakon 30, 60 i 90 min inkubacije spoja 77 s ATP-om i
enzimom HSV1-TK. SP označava slijepu probu (SP1 - inkubacija uz ATP i spoj 77 bez
enzima; SP2 - inkubacija uz ATP i enzim bez spoja 77), a R je reakcija fosforiliranja spoja 77.
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
Odnos ADP/A
TP
30 60 90
t /min
SP1
SP2
R
82
REZULTATI I RASPRAVA
3.8.3. Kristalna i molekulska struktura spojeva 77, 80 i 85g
Kristalne strukture spojeva 77, 80 i 85g određene su rentgenskom strukturnom analizom, a
njihova molekulska struktura prikazana je na slikama 43, 44 i 45.
a) b)
Slika 43. a) Molekulska struktura spoja 77; b) dio kristalne strukture spoja 77. Vodikove veze
su prikazane isprekidanom linijom.
a) b)
Slika 44. a) Molekulska struktura spoja 80. Samo je jedna od dvije neovisne molekule
prikazana na slici; b) dio kristalne strukture spoja 80. Vodikove veze su prikazane
isprekidanom linijom.
83
REZULTATI I RASPRAVA
a) b)
Slika 45. a) Molekulska struktura spoja 85g; b) kristalno pakiranje spoja 85g, prikazano duž
kristalografske osi c. Vodikove veze su prikazane isprekidanom linijom.
U spoju 77 i 85g, 4-hidroksi-3-(hidroksimetil)butilni lanac vezan je na atom N-1
pirimidinskog prstena. Ove se dvije strukture razlikuju u supstituentu na atomu C-5
pirimidinskog prstena. U spoju 77 to je furanski prsten, dok je u spoju 85g dekinilni lanac.
Spoj 80, kod kojeg su benzoilna skupina i jod vezani na atome N-3 i C-5 pirimidinskog
prstena, kristalizirao je s dvije neovisne molekule (označene s A i B) u asimetričnoj jedinici.
Vezni kut C2N3C4 u pirimidinskom prstenu u sve tri strukture je proširen 77, 127,79(14)o;
85g, 127,3(2)o; 80, 126,5(4) i 125,2(5)o. Ipak, zbroj svih endocikličkih veznih kuteva u
prstenu iznosi 720o, kao što se i očekuje za aromatski šesteročlani prsten 77, 719,8o; 85g,
720,0o; 80, 719,6 i 719,9o.
U spoju 77, furanski i pirimidinski prsten su gotovo koplanarni jer diedarski kut između
ravnina prstenova iznosi približno 6o 5,87(10)o. S druge strane, atomi C11/C12/C13/C14
čine ravninu koja je gotovo okomita u odnosu na pirimidinski prsten, s kutem približne
vrijednosti 85o 84,53(15)o. Isto je i s atomima C7/C8/C9/C11 u strukturi spoja 85g, gdje taj
kut iznosi 89,7(2)o. Dvije hidroksimetilne skupine u strukturama spojeva 77 i 85g poprimaju
dvije različite konformacije, antiperiplanarnu C12C13C14O4 = 178,15(14)o u spoju 77,
C8C9C11O4 = 176,0(2)o u spoju 85g i sinklinalnu C12C13C15O5 = 55,10(19)o u
spoju 77, C8C9C10O3 = 53,2(4)o u spoju 85g. Fenilni i pirimidinski prstenovi u dvije
neovisne molekule strukture spoja 80 su gotovo okomiti jer vrijednosti diedarskih kuteva
između ravnina iznose 73,0(3)o i 81,7(3)o.
84
REZULTATI I RASPRAVA
Molekule spoja 77 međusobno su povezane jakim NH···O i OH···O vodikovim vezama u
vrpce, koje su povezane slabim CH···O vodikovim vezama u trodimenzijsku mrežu (slika
43). Zanimljivo je da se osnovna supramolekulska struktura spoja 85g vrlo malo razlikuje
(slika 45). Jedna NH···O i dvije OH···O vodikove veze povezuju molekule u lance
prstenova, koji su potom povezani u trodimenzijsku mrežu vodikovim vezama CH···O tipa.
U strukturi spoja 80, dvije NH···O vodikove veze povezuju dvije neovisne molekule u
dimere (slika 44). Dimeri su povezani slabijim CH···O vodikovim vezama u trodimenzijsku
mrežu. Tako, osnovna supramolekulska struktura je u svim strukturama drugačija, u spoju 77
jake vodikove veze čine vrpce, u strukturi spoja 85g lance prstenova, a strukturi spoja 80
dimere, dok je konačna supramolekulska struktura u svim strukturama trodimenzijska mreža.
3.8.4. Ispitivanje antitumorskog djelovanja in vitro za spojeve 77, 81, 84ad, 85a i 85b.
Spojevi 77, 81, 84ad, 85a i 85b su ispitani na stanične linije zloćudnih tumora porijeklom
iz čovjeka: karcinom vrata maternice (HeLa), karcinom debelog crijeva (SW 620), karcinom
dojke (MCF-7) i na normalne diploidne fibroblaste porijeklom iz čovjeka (BJ) (tablica 6). Svi
ispitani spojevi su pokazali antiproliferativno djelovanje na odabrane stanične linije pri
najvećoj testiranoj koncentraciji (100 μM). Među testiranim spojevima najslabije je
djelovanje pokazao spoj 85a. Općenito, ispitani spojevi su pokazali slabo inhibitorno
djelovanje na karcinom vrata maternice (HeLa). Spojevi 84a, 84b i 85b imali su umjereno
inhibitorno djelovanje (37,176,2 μM) na karcinom dojke (MCF-7) i karcinom debelog
crijeva (SW 620). Nasuprot tome, pirimidinski derivati koji sadrže 5-ciklopropiletinilni 84c i
5-(p-pentilfenil)etinilni supstituent 84d pokazali su najizraženije antiproliferativno djelovanje
(0,2 μM) na karcinom dojke (MCF-7). Također, 5-jodpirimidinski derivat 81 i 5-furilni
derivat 77 su imali izraženo inhibitorno djelovanje (1,2 i 7,3 μM) na tumorske stanice MCF-7.
Spojevi 84c i 84d sa selektivnim antiproliferativnim djelovanjem na stanične linije MCF-7 i
normalne fibroblaste porijeklom iz čovjeka (BJ) u pikomolarnoj koncentraciji su odabrani kao
predvodni spojevi za daljnje optimiranje strukture.
85
REZULTATI I RASPRAVA
86
Tablica 6. Vrijednosti za IC50 (μM) ispitivanih spojeva na odabrane stanične linije.
IC50a (μM)
spojevi stanične linije
MCF-7 SW 620 BJ HeLa
77 7,3 >100 >0,1 >100
81 1,2 >100 0,6 >100
84a 37,1 64,5 40,04 90
84b 39,1 47,2 35,4 >100
84c 0,2 >100 0,02 >100
84d 0,2 78,5 0,2 94,5
85a 96 31,2 >100 >100
85b 76,2 67,7 63,3 >100
aIC50; koncentracija spoja koja inhibira rast stanica za 50 %
4. EKSPERIMENTALNI DIO
EKSPERIMENTALNI DIO
4.1. Opće napomene
Sva otapala su sušena prema preporučenom postupku sušenja sredstvima za sušenje,
odnosno destilirana iznad odgovarajućih molekulskih sita. Za praćenje tijeka reakcije je
korištena tankoslojna kromatografija koja je provedena na pločama 60F-254 presvučenim
slojem silika-gela (Merck) u odgovarajućem sustavu otapala. Za detekciju izoliranih
komponenata je korištena UV-svjetlost valne duljine 254 nm.
Kromatografija na koloni je provedena na silika-gelu (Fluka, 0,063–0,2 nm), dok su
staklene kolone punjene pod utjecajem gravitacije uz odgovarajući eluens.
Temperature tališta sintetiziranih spojeva su određene na instrumentu Kofler (Reichert,
Beč) i nisu korigirane.
Spektri 1H i 13C NMR su snimljeni na spektrometru Bruker Avance 300 i 600 MHz. Svi su
uzorci otopljeni u DMSO-d6 ili CDCl3 i mjereni pri 298 K u NMR-cjevčici od 5 mm. Spektri 1H NMR snimani su pri 300 i 600 MHz, dok su spektri 13C NMR snimani pri 75 i 150 MHz.
Kemijski pomaci (δ) u spektrima 1H i 13C NMR su izraženi u ppm u odnosu prema
tetrametilsilanu (TMS; δ 0,0 ppm), a konstante sprege (J) u hercima (Hz). Pojedinačne
rezonancije su asignirane na temelju njihovih kemijskih pomaka, intenziteta signala,
multipleta signala i konstanti sprega.
Maseni spektri su snimljeni na instrumentu Agilent 6410 opremljenim s elektrosprejem i
trostrukim kvadropolom (LC/MS/MS). Visokoučinkovita tekućinska kromatografija (HPLC)
je provedena na instrumentu Agilent 1100 s UV-detektorom koristeći Zorbax C18 kolonu (2,1
x 30 mm; 3,5 μm). Svi spojevi za biološka ispitivanja in vitro i in vivo imali su čistoću >95 %
u navedenom sustavu HPLC.
Reakcije potpomognute mikrovalnim zračenjem provedene su u Milestone Start S
mikrovalnoj pećnici opremljenoj pyrex (1 bar) posudama.
Flash kromatografija je provedena na instrumentu Teledine ISCO CombiFlash Rf.
88
EKSPERIMENTALNI DIO
4.2. Reakcija fosforiliranja
Reakcija fosforiliranja je provedena u volumenu od 70 µl. Svaka reakcijska smjesa
sadržavala je 4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansulfonsku kiselinu (HEPES; pH 7; 550 mM),
adenozin-trifosfat (ATP; 5 mM ), magnezijev klorid (MgCl2; 5 mM), otopinu ispitivanog
spoja (TT25, 27, 29, 37, 46, 52 i 77; 1 mM) i pročišćeni fuzijski protein timidin-kinaze virusa
herpes simpleks tipa 1 i glutation-S-transferaze (HSV1-TK-GST; 11 µg) ili timidin-kinazu iz
čovjeka (hTK; 0,8 µg). Kako su spojevi 25, 27, 29, 37, 46, 52 i 77 otopljeni u 100 % DMSO,
u reakcijskoj smjesi nije smjelo biti više od 5 % DMSO (konačna koncentracija DMSO 1 %).
Reakcija je započeta dodatkom HSV1-TK-GST i održavana na temperaturi 37 °C te prekinuta
nakon 30, 60 i 90 min s 10 % etilendiamintetraoctenom kiselinom (EDTA; 50 mM; konačna
koncentracija 5 mM) koja tvori kompleks s Mg2+ ionima. Svaka reakcija je provedena tri puta.
Za analizu produkata reakcije primjenom HPLC-a injektiran je volumen od 40 µl reakcijske
smjese u različitim vremenima. Nastanak monofosfatnog nukleotida je praćen kvalitativno.
Kontrolni eksperimenti (slijepe probe) su provedeni usporedno s reakcijama kako bi se
odredila autohidroliza molekule ATP u prisutnosti ispitivanog spoja bez enzima (slijepa proba
1) i u prisutnosti enzima bez ispitivanog spoja (slijepa proba 2).
Rezultirajući omjeri ADP/ATP su izračunati u vremenima od 30, 60 i 90 min inkubacije i
korišteni su kao mjera aktivnosti enzima. Testovi fosforiliranja provedeni su u suradnji s prof.
S.M. Ametameyem (Institut farmaceutskih znanosti, ETH Zürich, Švicarska) te s prof. L.
Scapozzom (Odjel za farmaceutske znanosti, Faculté des Sciences, Sveučilište u Ženevi,
Švicarska).
4.2.1. Analiza HPLC produkata reakcije fosforiliranja
Analiza HPLC produkata reakcije fosforiliranja je provedena na instrumentu Merck
HITACHI LaChrom (Ginkotek HPLC, Münich, Njemačka), opremljenom s pumpom (L-
7100), automatiziranim uzimanjem uzorka (L-7200) i UV-detektorom (L-7400). Analize su
provedene na koloni LiChroCART® 250-4 punjenoj stacionarnom fazom od čestica silika-
gela sfernog oblika (LiCrospher® 100 RP-18 (5 µm)) u kombinaciji s pretkolonom
LiChroCART® 4-4 istog tipa (Merck, KgaA, Darmstadt, Njemačka). Mobilna faza se
sastojala od natrijevog dihidrogenfosfata (NaH2PO4; 200 mM), tetrabutilamonijevog
hidrogensulfata (TBAHS; 25 mM) i 2 % metanola. Sve vodene otopine priređene su iz
89
EKSPERIMENTALNI DIO
deionizirane vode Millipore čistoće. Kolona je konstantno držana na temperaturi 20 °C.
Razdvajanje je provedeno izokratno uz protok 1,1 ml/min, a UV-detekcija na 254 nm.
4.3. Pročišćavanje radiooznačenih spojeva HHB-5-[18F]FEP ([18F]52) i
[18F]FHBG (56)
Pročišćavanje radiooznačenih spojeva je provedeno na semi-preparativnom HPLC-u
opremljenom s pumpom Smartline 1000, Smartline Manager 5000, detektorom UV Smartline
2500, petljom od 3 ml i radiodetektorom GabiStar (Raytest, Straubenhardt, Njemačka).
Korištena je semi-preparativna kolona HPLC s pretkolonom (Phenomenex, Gemini, C18, 110
Å, 5 µm, 250 x 10 mm), a UV-apsorpcija je promatrana na valnoj duljini 254 nm. Kao eluens
za pročišćavanja spoja HHB-5-[18F]FEP ([18F]52) je korišten 5 % EtOH u 20 mM otopini
natrijevog fosfata (pufer na pH 7,4; 11,29 mmol/l NaH2PO4 x H2O i 38,71 mmol/l Na2HPO4 x
2H2O). Za pročišćavanje [18F]FHBG (56), korištena je mobilna faza od 5 % EtOH u H2O. Za
kontrolu kvalitete radiooznačenog formuliranog spoja, njegov je alikvot uštrcan u HPLC
sustav Agilent 1100, opremljen s petljom od 100 µl i radiodetektorom GabiStar (Raytest).
Korištena je analitička kolona HPLC (Phenomenex, Gemini, C18, 110 Å, 5 µm, 250 × 4,6
mm) uz protok 1 ml/min. Za analizu HHB-5-[18F]FEP ([18F]52) je korištena gradijentna
metoda počevši od 100 % A do 50 % B tijekom 30 min (A = H2O, B = acetonitril), a za
[18F]FHBG (56), gradijentna metoda počevši od 100 % A do 15 % B tijekom 15 min (A =
H2O, B = acetonitril). UV-apsorpcija je promatrana na valnoj duljini 254 nm. Za kontrolu
kvalitete [18F]FHBG (56), korištena je izokratna metoda s 97 % A i 3 % B (A = 0,1 %
trifluoroctena kiselina (TFA) u H2O, B = acetonitril). Specifična aktivnost je izračunata na
temelju kalibracijske krivulje dobivene integriranjem UV-pikova pri različitim
koncentracijama referentnog spoja HHB-5-FEP ([18F]52), odnosno FHBG (56).
4.4. Rentgenska strukturna analiza
Jedinični kristali spojeva 10, 77, 80 i 85g dobiveni su pri sobnoj temperaturi iz otopine
metanola i diklormetana. Podaci su prikupljeni pri 295 K pomoću Oxford Diffraction
Xcalibur 2 difraktometra na Zavodu za opću i anorgansku kemiju Prirodoslovno-
matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu (prof. dr. sc. Mario Cetina) uz monokromatsko
MoKα zračenje ( = 0,71073 Å) i grafitni monokromator. Prikupljanje podataka i njihova
redukcija provedena je CrysAlis109 programom. Struktura spojeva riješena je direktnim
90
EKSPERIMENTALNI DIO
metodama primjenom programa SIR-2004110 za spojeve 10 i 77 i SHELXS-2013111 za spojeve
80 i 85g. Sve strukture su utočnjene metodom najmanjih kvadrata na temelju vrijednosti F2
programom SHELXL-2013.111 Grafički prikaz molekulskih struktura načinjeni su programima
PLATON112 i MERCURY.113
4.5. Ispitivanje in vitro ulaska radiooznačenog spoja u transducirane
stanice
Genetički promijenjene embrionalne bubrežne stanice iz čovjeka u koje je unešen gen
HSV1-tk (HEK293TK+) i kontrolne stanice HEK293 uzgajane su u mediju DMEM
(Dulbecco's modified Eagle medium) bogatom glukozom uz dodatak 10 % seruma fetusa
teleta (FBS) i 1 % smjese penicilin/streptomicin. Stanice su inkubirane u vlažnoj atmosferi s 5
% CO2 na 37 °C. Ekspresija timidin-kinaze u stanicama HEK293TK+ je održavana s 0,3
mg/ml G418 u mediju.
HEK293TK+ i kontrolne stanice HEK293 su nasađene na mikrotitar ploče s 12 jažica (8 ×
105 stanica po jažici) u mediju DMEM obogaćenom s 10 % FBS. Nakon 24 h, kada su kulture
stanica dosegnule konfluentnost 80 %, stanice su inkubirane s medijem (1 ml po jažici) koji je
sadržavao 130 kBq HHB-5-[18F]FEP ([18F]52) u vremenu 30, 60 i 240 min. Na kraju
inkubacije, stanice su dva puta isprane s TTpuferskom otopinom natrijevog fosfata PBS
(Phosphate buffered saline) i odvojene od podloge s 0,25 % otopinom tripsina (0,3 ml).
Stanice su suspendirane u mediju (0,7 ml), sedimentirane i lizirane s puferom za liziranje (0,5
ml; 0,0625 M tris(hidroksietil)aminometan (Tris); 2 % natrijev dodecil-sulfat; 7 % glicerol;
pH 6,8). Radioaktivnost staničnog lizata i medija za inkubaciju je mjerena gama-brojačem
(Wizard; PerkinElmer). Radioaktivnost staničnog lizata je izražena prema ukupnom proteinu
u staničnom lizatu (50 μl) s TTDC™ Protein Assay Kit I (BioRad, Hercules, CA). Podaci su
izraženi kao postotak akumulirane aktivnosti/μg proteina ((dpm stanice × 100 %/(dpm
stanice+dmp medija))/μg proteina) i omjer unosa radiotragača u TK+ i kontrolne stanice (dpm
HEK293TK+/dpm HEK293 kontrolne stanice). Ispitivanje in vitro ulaska radiooznačenog
spoja u transducirane stanice provedeno je u suradnji s prof. S.M. Ametameyem (Institut
farmaceutskih znanosti, ETH Zürich, Švicarska).
91
EKSPERIMENTALNI DIO
4.6. Praćenje aktivnosti HSV1-TK in vivo metodom PET
Ispitivanja na miševima su odobrena prema nadležnom veterinarskom odjelu i usklađena
su sa švicarskim zakonima o pravima životinja. NMRI (The Naval Medical Research
Institute) ženke golog miša stare šest tjedana su kupljene od Charles River Laboratories
(Sulzfeld, Njemačka). Životinje su anestezirane s 2–3 % izofluranom i potkožno im je
uštrcano 5 × 106 stanica u Matrigel-u (100 µl). HEK293TK+ stanice su injektirane u desno
rame, a kontrolne stanice HEK293 u lijevo rame. Rast ksenograftova i tjelesna masa miševa
su redovito praćeni. Eksperimenti su provedeni kad su ksenograftovi dosegnuli volumen 1–2
cm3 što je otprilike četiri tjedna nakon inokulacije.
Za promatranje metodom PET korišten je explore VISTA PET/CT-tomograf (Sedecal/GE
Healthcare). Formulirani HHB-5-[18F]FEP ([18F]52) ili [18F]FHBG (56) (100 μl po injekciji)
su uštrcani miševima s HEK293TK+ ksenograftovima u desnom ramenu i HEK293
kontrolnim ksenograftovima u lijevom ramenu preko lateralne vene u repu (t = 0). Nakon
unosa radiotragača, miševi su anestezirani inhalacijom smjese izofluran/zrak/kisik približno 5
minuta prije prikupljanja podataka PET i skeniranja. Jedna životinja je skenirana od 0–90 min
dinamičkim PET-om. Za drugu životinju, podaci su prikupljeni od 60–150 min nakon unosa
radiotragača. Statičnim PET-skeniranjem, miševi su skenirani od 60–90 min. Prikupljeni
podaci dobiveni metodom PET i CT su analizirani softverom PMOD (verzija 3.4).
Praćenje aktivnosti HSV1-TK in vivo metodom PET provedeno je u suradnji s prof. S.M.
Ametameyem (Institut farmaceutskih znanosti, ETH Zürich, Švicarska).
4.7. Biodistribucija HHB-5-[18F]FEP ([18F]52) i [18F]FHBG (56) ex vivo
Miševi s HEK293TK+ ksenograftovima i HEK293 kontrolnim ksenograftovima su
eutanizirani odmah nakon PET-ispitivanja, oko 95 min nakon unosa radiotragača. Organi i
uzorci tkiva su izvagani, a radioaktivnost je određena u gama-brojaču. Radioaktivnost je
izražena SUV-indeksom kao omjer izmjerene radioaktivnosti u gramu tkiva i uštrcane
radioaktivnosti po gramu ukupne tjelesne mase (SUVbiodis).
Biodistribucija nove molekule tragača HHB-5-[18F]FEP ([18F]52) i [18F]FHBG (56) u
miševima s tumorima provedena je u suradnji s prof. S.M. Ametameyem (Institut
farmaceutskih znanosti, ETH Zürich, Švicarska).
92
EKSPERIMENTALNI DIO
4.8. Antitumorska ispitivanja in vitro
Antitumorska aktivnost ispitana je na staničnim linijama zloćudnih tumora porijeklom iz
čovjeka (MCF-7, SW 620, HepG2, HeLa, MiaPaCa-2) i na normalnim diploidnim
fibroblastima (BJ, WI 38).
Stanice su uzgojene u jednom sloju u tekućoj hranjivoj podlozi DMEM obogaćenoj s 10 %
FBS, 2 mM L-glutamina, 100 g/ml penicilina i 100 g/ml streptomicina u vlažnoj komori s 5
% CO2 na 37 °C. Stanične linije nasađene su na standardne mikrotitarske ploče s 96 jažica
koncentracije od 3000 do 6000 stanica po jažici. Nakon toga dodani su testirani spojevi u pet
koncentracija od 10-8 do 10-4 M i stanice su inkubirane 72 h. Kontrolne stanice su rasle u
mediju za rast stanica bez i uz dodatak otapala u kojem su otopljeni uzorci za analizu
(DMSO). Nakon 72 h inkubacije rast stanica je određen pomoću metode MTT.114 Postotak
rasta stanica (PG – cell percentage of growth) izračunat je iz eksperimentalno određenih
vrijednosti apsorbancije prema formulama koje predlaže NIH (National Institutes of Health).
Pomoću PG vrijednosti dobivene su „dose-response“ krivulje, iz kojih su izračunate
vrijednosti IC50 i LC50 za svaki spoj korištenjem metode linearne regresijske analize. Svaka
testna točka dobivena je iz tri neovisna pokusa, s četiri paralelna uzorka u svakom pokusu te
su rezultati statistički analizirani (ANOVA Tukey post-hoc test pri p < 0,05). Konačno,
rezultati su izraženi kao IC50 (inhibitory concentration) i LC50 (lethal concentration)
vrijednosti koje predstavljaju koncentraciju koja uzrokuje inhibiciju rasta stanica za 50 %
odnosno 50 % smrtnost stanica.
Antitumorska aktivnost novopriređenih spojeva ispitana je na Odjelu za biotehnologiju
Sveučilišta u Rijeci u suradnji s doc. dr. sc. S. Kraljević Pavelić.
93
EKSPERIMENTALNI DIO
4.9. Pregled sintetiziranih spojeva
4.9.1. Pregled sintetiziranih 5-hidroksietilnih N- i O-acikličkih derivata pirimidina i
prekursora za njihovu sintezu
ONa
HN NH2
O
O ON
N
R4
R2
R5
R
2, R =
3, R =
4 R2 = R4 = OH, R5 = OH5 R2 = R4 = OH, R5 = OAc6 R2 = R4 = Cl, R5 = OAc7 R2 = R4 = OCH3, R5 = OH8 R2 = R4 = OCH3, R5 = OAc10 R2 = OH, R4 = OCH3, R5 = OAC11 R2 = OH, R4 = OCH3, R5 = OH
O OR
R1 X
OR
OR
13 R = Cl14 R = -CH(COOEt)215 R = -CH(CH2OAc)2
16 R1 = OH, X = CH2, R = Ac17 R1 = OMs, X = CH2, R = Ac18 R1 = I, X = CH2, R = Ac19 R1 = Br, X = CH2, R = Ac21 R1 = Cl, X = O, R = Bn
1''
2''
3''4''
94
EKSPERIMENTALNI DIO
N
N
R4
O
R5
23 R1 = -CHCH2, R4 = OCH3, R5 = OAc24 R1 = -CHOHCH2OH, R4 = OCH3, R5 = OAc25 R1 = -CHOHCH2OH, R4 = OH, R5 = OH26 R1 = -O(CH2)2OAc, R4 = OH, R5 = OAc27 R1 = -O(CH2)2OH, R4 = OH, R5 = OH28 R1 = -OCH(CH2OBn)2, R4 = OH, R5 = OAc29 R1 = -OCH(CH2OH)2, R4 = OH, R5 = OH30 R1 = -CHOHCH2OH, R4 = OCH3, R5 = OH31 R1 = -O(CH2)2OH, R4 = OCH3, R5 = OH32 R1 = -OCH(CH2OBn)2, R4 = OH, R5 = OH33 R1 = -OCH(CH2OBn)2, R4 = OH, R5 = Cl34 R1 = -OCH(CH2OH)2, R4 = OH, R5 = Cl
1'
2'
35 R1 = -CH2CH(CH2OAc)2, R4 = OCH3, R5 = OAc37 R1 = -CH2CH(CH2OH)2, R4 = OH, R5 = OH49 R1 = -CH2CH(CH2OH)2, R4 = OCH3, R5 = OH
51 R1 =
53 R1 =
52 R1 = -CH2CH(CH2OH)2, R4 =OH, R5 = F
O
N
N
R4
R5
36 R2 = -CH2CH(CH2OAc)2, R4 =OCH3, R5 = OAc38 R2 = -CH2CH(CH2OH)2, R4 =OCH3, R5 = OH
R11''
R21''
1'
2'
, R4 = OCH3, R5 = FO
O
, R4 = OCH3, R5 = OTsO
O
50 R1 = O
O
, R4 = OCH3, R5 = OH
5''
4.9.2. Pregled sintetiziranih N-3-hidroksietilnih derivata pirimidina s lancem poput
ganciklovirnog u položaju N-1 i prekursora za njihovu sintezu
OBzBr
48
N
NR2
R4
40 R2 = R4 = Cl
41 R2 = R4 = OCH3
N
NO
43 R1 = -OCH(CH2OBn)2, R3 = H
44 R1 = -OCH(CH2OBn)2, R3 = -CH2CH2OBz45 R1 = -OCH(CH2OH)2, R3 = -(CH2)2OBz46 R1 = -OCH(CH2OH)2
, R3 = -(CH2)2OH,
N
NO
OCH3
O OBn
OBn42
R1
R3
1''
1'
2'
1''
3''4''
1' 2'
O
95
EKSPERIMENTALNI DIO
4.9.3. Pregled sintetiziranih C-6 acikličkih derivata timina i prekursora za njihovu sintezu
N
N
OCH3
H3CO
CH3N
NR2
R4
57 R2 = R4 = Cl
CH3
CH3
58 R2 = R4 = OCH3
OBnBnO
O
60
OBn OBn
OH61
N
N
R4
CH3
Ra Rb
R2'
O
CH3
62 R2' = OH, Ra= Rb = OBn, R4 = OCH3
63 R2' = OH, Ra= Rb= OH, R4 = OH
64 R2' = OH, Ra= Rb= OAc, R4 = OH
65 R2' = F, Ra= Rb = OAc, R4 = OH
HN
N
O
CH3
Ra Rb
O
CH3
66 Ra = Rb = OAc67 Ra = Rb = OH68 Ra = OMTr, Rb = OH69 Ra = OH, Rb = F70 Ra = Rb = F71 Ra = OMTr, Rb = OMs72 Ra = OH, Rb = Cl73 Ra = OAc, Rb = OH74 Ra = Rb = OAc75 Ra = OAc, Rb = OMs
1'
2'
3'
1'
2'
3'
1'
2'
3'
96
EKSPERIMENTALNI DIO
4.9.4. Pregled sintetiziranih N-acikličkih C-5 supstituiranih heteroarilnih i alkinilnih
derivata pirimidina
76 R3 = H, R5 =
N
NH
O
O
R5
N
N
O
O
R3
R
R
R5
R3
O
79 R3 = Bz, R5 = H80 R3 = Bz, R5 = I
77 R = OH, R3 = H, R5 =O
78 R = OH, R3 = -(CH2)2CH(CH2OH)2, R5 =O
81 R = OAc, R3 = Bz, R5 = I
82 R = OAc, R3 = Bz, R5 =S
83 R = OH, R3 = H, R5 =S
N
N
O
O
BzR
HN
N
O
O
R
F
F
Br
C4H9
85a-i
a, R =
b, R =
c, R =
d, R =
e, R =
f, R =
g, R =
h, R =
i, R =
OAc
OAc
OH
OH
84 a-i
CH2(CH2)3CH3
(CH2)3Cl
(CH2)7CH3
CH(CH3)2
1'2'
3' 4'
Ph-1'
Ph-2' Ph-3'
Ph-4'
Ph-5'Ph-6'
1'2'
1''
2''
3''
4''
4''
1'
2'
3' 4'
1''
2''
3''
4''
3'4'
5'3'
3'
5'
5'
3'
97
EKSPERIMENTALNI DIO
4.9.5. Pregled zaštitnih skupina s označenom numeracijom atoma
MTr = OCH3
S
O
O
CH3Ms =
Ac =CH3
O
Bn =
Ts = S
O
O
CH3
Bz =
O
Ph-1'''
Ph-2'''
Ph-3'''
Ph-4'''Ph-5'''
Ph-6'''
Ph-1'Ph-2' Ph-3'
Ph-4'
Ph-5'Ph-6'
Ph-4'
Ph-3'Ph-2'
Ph-1'C-4'
*signali za atome Ph-2''' i Ph-6'''; Ph-3''' i Ph-5'''; Ph-2' i Ph-6'; Ph-3' i Ph-5' imaju iste
kemijski pomake
98
EKSPERIMENTALNI DIO
4.10. Postupci za pripravu spojeva
Natrijev α-oksimetiliden-γ-butirolakton (2)115
U hladnu suspenziju natrijevog metoksida (35,6 g; 0,66 mol) u bezvodnom dietil-eteru
(450 ml) kroz 2 h dokapavana je smjesa metil-formijata (52,6 ml; 0,85 mol) i γ-butirolaktona
(50,0 ml; 0,65 mol). Miješanje je nastavljeno preko noći na sobnoj temperaturi. Reakcijska
smjesa je ostavljena u hladnjaku 1 h pri čemu je istaložio sirasti produkt. Nakon filtriranja i
ispiranja taloga eterom izoliran je spoj 2 (80,9 g; 87 %; t.t. = 124–126 °C).
α-(ureidometiliden)-γ-butirolakton (3)116
Spoj 2 (21,2 g; 0,16 mol) dodavan je u malim obrocima u hladnu otopinu uree (18,7 g;
0,31 mol) i 3 M kloridne kiseline (125 ml). Reakcijska smjesa je ostavljena preko noći u
hladnjaku, talog je odfiltriran i ispran hladnom vodom. Nakon prekristalizacije iz vode i
etanola izoliran je spoj 3 (11,2 g; 53 %; t.t = 207–213 °C).
5-(2-hidroksietil)pirimidin-2,4-dion (4)115
U ohlađenom bezvodnom etanolu (500 ml) otopljen je natrij (4,9 g; 0,21 mmol), a potom i
spoj 3 (30,0 g; 0,18 mol). Reakcijska smjesa je refluksirana 24 h nakon čega je otapalo
upareno pri sniženom tlaku. U ostatak od uparavanja je dodana minimalna količina vode
potrebna da se bijeli kristali otope, a nakon toga je otopina zakiseljena sa H2SO4 do pH 3 i
ostavljena preko noći u hladnjaku. Nastali bijeli kristali spoja 4 su odfiltrirani i isprani dietil-
eterom (16,5 g; 56 %; t.t. = 230–232 °C). MS (ESI): m/z = 157,1 ([M+H]+).
5-(2-acetoksietil)pirimidin-2,4-dion (5) 117
Spoj 4 (1,5 g; 9,70 mmol) je otopljen u bezvodnom piridinu (18 ml). U reakcijsku smjesu
dodan je acetanhidrid (7,6 ml; 80,0 mmol). Reakcijska smjesa je miješana na sobnoj
temperaturi 1 h te prekinuta dodatkom vode. Otapalo je upareno, a ostatak od uparavanja je
pročišćen kolonskom kromatografijom (diklormetan : metanol = 20 : 1). Izoliran je spoj 5 kao
bijeli prah (1,9 g; 98 %; t.t. = 175–180 °C). MS (ESI): m/z = 199,1 ([M+H]+).
99
EKSPERIMENTALNI DIO
5-(2-acetoksietil)-2,4-diklorpirimidin (6)117
Spoj 5 (11,7 g; 58,80 mmol), fosforilov triklorid (POCl3; 116 ml) i N,N-dietilanilin (5,1
ml) refluksirani su 1 sat. Potom je uparen POCl3, a ostatak od uparavanja ekstrahiran s
diklormetanom (45 ml) i vodom (40 ml). Organski sloj je sušen iznad bezvodnog MgSO4.
Nakon filtriranja, otapalo je upareno, a spoj 6 izoliran je kao žuto ulje (13,7 g; 99 %).
5-(2-hidroksietil)-2,4-dimetoksipirimidin (7)118
U otopini natrijevog metoksida pripravljenoj otapanjem Na (420,0 mg; 182,00 mmol) u
metanolu (18,2 ml) otopljen je spoj 6 (846,2 mg; 3,60 mmol). Reakcijska smjesa je miješana
na sobnoj temperaturi 20 sati, a zatim neutralizirana s HCl/dietil-eter te uparena do suha. U
ostatak od uparavanja je dodan diklormetan (15 ml) i miješanje je nastavljeno kroz 1 sat. Sol
je odfiltrirana, a filtrat sušen iznad bezvodnog MgSO4. Otapalo je upareno, a ostatak od
uparavanja je pročišćen kolonskom kromatografijom (diklormetan : metanol = 20 : 1). Spoj 7
izoliran je kao plavo-žuto ulje (629,5 mg; 95 %). MS (ESI): m/z = 185,1 ([M+H]+).
5-(2-acetoksietil)-2,4-dimetoksipirimidin (8)118
Spoj 7 (4,9 g; 26,60 mmol) otopljen je u bezvodnom piridinu (48 ml) i dodan je
acetanhidrid (20,3 ml; 26,60 mmol). Reakcijska smjesa je miješana 1 h na sobnoj temperaturi
te je reakcija prekinuta dodatkom vode. Otapalo je upareno, a ostatak od uparavanja pročišćen
kolonskom kromatografijom (diklormetan : metanol = 30 : 1). Izoliran je spoj 8 kao bezbojno
ulje (5,4 g; 90 %). MS (ESI): m/z = 227,1 ([M+H]+).
5-(2-acetoksietil)-4-metoksipirimidin-2-on (10)118
Spoj 8 (5,1 g; 22,60 mmol) je otopljen u acetil-kloridu (AcCl) (43 ml; 605,00 mmol) u
atmosferi argona. Nakon 20 sati miješanja na sobnoj temperaturi, otapalo je upareno, a ostatak
od uparavanja ispran toluenom (3 x 2 ml). Toluen je uparen, a produkt pročišćen kolonskom
kromatografijom (diklormetan : metanol = 15 : 1). Izoliran je bijeli kristalinični spoj 10 (3,9
g; 80 %; t.t. = 100–102 °C). MS (ESI): m/z = 213,1 ([M+H]+).
5-(2-hidroksietil)-4-metoksipirimidin-2-on (11)118
U otopinu spoja 10 (438,0 mg; 2,10 mmol) u metanolu (25 ml) dodana je otopina
natrijevog metoksida pripravljena otapanjem natrija (94,7 mg; 4,12 mmol) u metanolu (7,3
ml). Reakcijska smjesa je miješana na sobnoj temperaturi 1 h, nakon čega je neutralizirana uz
HCl/dietil-eter, a otapalo upareno. Kolonskom kromatografijom ostatka nakon uparavanja
100
EKSPERIMENTALNI DIO
(diklormetan : metanol = 5 : 1) izoliran je spoj 11 (265,2 mg; 93 %; t.t. = 80–82 °C). MS
(ESI): m/z = 171,1 ([M+H]+).
2-(1-etoksietoksi)-1-kloretan (13)119
U 2-kloretanol (129 ml; 1,92 mmol) je dokapan etil-vinil-eter (12; 185 ml; 1,93 mol) na 0
°C. U reakcijsku smjesu je dodana TFA (0,7 ml; 9,53 mmol). Nakon 1 sat miješanja dodan je
trietilamin (Et3N; 2,8 ml; 19,91 mmol). Produkti su oddestilirani iznad bezvodnog kalijevog
karbonata. Dobiven je žuti uljasti spoj 13 (133,4 ml; 46 %; t.v. = 9092 °C).
Dietil[2-(1-etoksietoksi)etil]malonat (14)119
Dietil-malonat (131,5 ml; 0,87 mol) je dokapan pri temperaturi 60 °C u otopinu natrijevog
etoksida priređenu otapanjem natrija (20,2 g; 0,88 mol) u bezvodnom etanolu (387 ml).
Reakcijska smjesa je miješana na temperaturi 60 °C 2 sata, a nakon toga je dodan spoj 13
(133,4 ml; 0,87 mol) nakon čega je reakcijska smjesa dalje zagrijavana 20 h na temperaturi
refluksa. Otapalo je upareno, a ostatak od uparavanja ekstrahiran s etil-acetatom (400 ml) i
vodom (150 ml). Organski sloj je sušen iznad bezvodnog MgSO4 i filtriran. Nakon uparavanja
dobiven je uljasti spoj 14 (190,0 g; 86 %). MS (ESI): m/z = 276,2 ([M+H]+).
1-acetoksi-2-acetoksimetil-4-(1-etoksietoksi)butan (15)119
U otopinu tert-butanola (440 ml) i spoja 14 (190,0 g; 0,68 mol) postupno je dodan natrijev
tetrahidroborat (43,6 g; 1,14 mol). Reakcijska smjesa je zagrijana na temperaturu refluksa te
je kroz 30 minuta dodan metanol (56 ml) u obrocima tri puta i miješanje je nastavljeno 3 h na
temperaturi refluksa. Nakon hlađenja na sobnu temperaturu, reakcijska smjesa je zakiseljena s
50 ml koncentrirane HCl do pH 7, a otapalo upareno. Dobiven je uljasti produkt kojem je
dodan bezvodni piridin (150 ml) i acetanhidrid (120 ml; 1,26 mol). Nakon hlađenja na 0 °C u
reakcijsku smjesu je dokapan Et3N (405 ml; 2,87 mol) te metanol (74 ml). Reakcija je
miješana 1 h na sobnoj temperaturi i nakon toga uparena do 1/4 volumena. Zaostali produkt je
ekstrahiran s kloroformom (200 ml) i zasićenom otopinom natrijevog karbonata (3 x 120 ml).
Organski sloj je sušen iznad bezvodnog MgSO4 i filtriran. Filtrat je uparen i dobiven je žuti
uljasti spoj 15 (55,0 g; 30 %). MS (ESI): m/z = 276,2 ([M+H]+).
101
EKSPERIMENTALNI DIO
4-(acetoksi)-3-(acetoksimetil)butanol (16)119
U smjesu ledene octene kiseline (48 ml) i vode (12 ml) dodan je spoj 15 (40,0 g; 0,15 mol).
Reakcijska smjesa je miješana preko noći na temperaturi 30 °C. Otapalo je upareno pri
temperaturi 50 °C i dobiven je žuti uljasti spoj 16 (19,6 g; 48 %). MS (ESI): m/z = 205,1
([M+H]+).
4-acetoksi-3-(acetoksimetil)butil-metansulfonat (17)120,
Spoj 16 (16,9 g; 0,08 mol) je otopljen u bezvodnom diklormetanu (80 ml; 1,25 mol). U
ohlađenu otopinu (−5 °C) dokapan je trietilamin (25,6 ml; 0,18 mol) te smjesa metansulfonil-
klorida (13 ml; 0,17 mol) i bezvodnog diklormetana (40 ml). Reakcija je miješana 2 h na −5
°C, a potom ekstrahirana s 1 M HCl (96 ml), zasićenom otopinom natrijevog
hidrogenkarbonata (100 ml) i zasićenom otopinom natrijevog klorida (100 ml). Organski sloj
je sušen iznad bezvodnog MgSO4 i filtriran. Otapalo je upareno i dobiven je spoj 17 (10,0 g;
43 %). MS (ESI): m/z = 283,1 ([M+H]+).
4-(acetoksi)-3-(acetoksimetil)butil-jodid (18)120
Natrijev jodid (10,6 g; 0,07 mol) dodan je otopini spoja 17 (10,0 g; 0,04 mol) u bezvodnom
acetonu (100 ml). Reakcijska smjesa je miješana na temperaturi refluksa 2 sata. Otapalo je
upareno, a u ostatak od uparavanja je dodana voda (200 ml) i dietil-eter (100 ml). Slojevi su
odvojeni, a vodeni sloj ekstrahiran je s dietil-eterom (3 x 100 ml). Organski slojevi su spojeni
i isprani sa zasićenom otopinom natrijevog hidrogensulfita (100 ml), a potom i sa zasićenom
otopinom natrijevog klorida (100 ml). Organski sloj je sušen iznad bezvodnog MgSO4 i
filtriran. Otapalo je upareno, a ostatak od uparavanja je pročišćen kromatografijom na koloni
(n-heksan : etil-acetat = 4 : 3) te je dobiven žuti uljasti spoj 18 (6,8 g; 31 %). MS (ESI): m/z =
315,1 ([M+H]+). 1H NMR: (δ) 4,01 (4H, d, H-4'', J = 5,7 Hz), 3,39–3,33 (2H, m, H-1''), 2,12–2,04 (1H, m,
H-3''), 2,02 (6H, s, COCH3), 1,92–1,79 (2H, m, H-2'') ppm
4-(acetoksi)-3-(acetoksimetil)butil-bromid (19)
Spoj 16 (1,1 g; 4,90 mmol) je otopljen u diklormetanu (13 ml). Otopini je dodan
trifenilfosfin (PPh3; 3,0 g; 7,35 mmol) te tetrabrommetan (CBr4; 3,8 g; 7,35 mmol) u
atmosferi argona. Reakcijska smjesa je miješana 3 h pri sobnoj temperaturi. Otapalo je
upareno, a ostatak od uparavanja pročišćen kolonskom kromatografijom (cikloheksan : etil-
102
EKSPERIMENTALNI DIO
acetat = 3 : 2). Izoliran je spoj 19 kao žuto ulje (500,0 mg; 38 %). MS (ESI): m/z = 68,1
([M+H]+). 1H NMR: (δ) 4,01 (4H, d, H-4'', J = 5,7 Hz), 3,60 (2H, t, H-1'', J = 7,1 Hz), 2,21–2,08 (1H,
m, H-3''), 2,02 (6H, s, COCH3), 1,88 (2H, q, H-2'', J = 7,0 Hz) ppm.
1,3-dibenziloksi-2-(klormetoksi)propan (21)
Reakcijska smjesa 1,3-dibenziloksipropan-2-ola (20; 5,0 g; 18,37 mmol), paraformaldehida
(1,3 g) i apsolutno suhog dikloretana (42 ml) je 8 h propuhivana plinovitim HCl-om. Potom je
dodan bezvodni kalcijev klorid (CaCl2) koji je nakon 1 h odfiltriran, a otapalo upareno pod
sniženim tlakom. Dobiven je spoj 21 u smjesi s početnim spojem 20 (omjer iz spektra 1H
NMR = 1: 1) 1H NMR: (δ) 7,307,25 (10H, m, Ph), 6,29 (2H, s, H-1''), 4,48 (4H, s, CH2Ph), 3,793,77
(1H, m, H-3''), 3,503,40 (4H, m, H-4'') ppm. 13C NMR: (δ) 134,5 (Cq-Ph), 129,1 (CH-Ph),
128,2 (CH-Ph), 77,6 (C-3''), 72,3 (CH2Ph), 69,3 (C-4''), 45,1 (C-1'') ppm.
5-(2-acetoksietil)-N-1-alil-4-metoksipirimidin-2-on (23)
Otopina spoja 8 (375,0 mg; 1,66 mmol) i alil-bromida (0,2 ml; 1,73 mmol) zagrijavana je
na temperaturi refluksa 8 sati. Otapalo je upareno, a ostatak od uparavanja pročišćen
kolonskom kromatografijom (etil-acetat : metanol = 15 : 1) pri čemu je izoliran je spoj 23 kao
bezbojno ulje (305,3 mg; 73 %). MS (ESI): m/z = 253,1 ([M+H]+). 1H NMR: () 7,78 (1H, s, H-6), 5,925,88 (1H, m, H-2''), 5,16 (1H, dd, H-3'', J =10,3 Hz,
J = 1,3 Hz), 5,06 (1H, dd, H-3'', J = 1,4 Hz, J =17,2 Hz), 4,08 (2H, t, H-2', J = 6,6 Hz), 4,36
(2H, d, H-1'', J = 5,4 Hz), 3,83 (3H, s, OCH3), 2,57 (2H, t, H-1', J = 6,5 Hz), 1,95 (3H, s,
COCH3) ppm. 13C NMR: () 170,7 (COCH3), 170,1 (C-4), 155,6 (C-2), 147,5 (C-6), 103,6
(C-5), 133,7 (C-2''), 117,8 (C-3''), 62,6 (C-2'), 54,5 (OCH3), 51,1 (C-1''), 26,0 (C-1'), 21,1
(COCH3) ppm.
5-(2-acetoksietil)-N-1-(2,3-dihidroksipropil)-4-metoksipirimidin-2-on (24)
Osmijev tetraoksid (OsO4; 1,0 mg; 0,004 mmol) i natrijev klorat (NaClO3; 103,0 mg; 0,97
mmol) su dodani otopini spoja 23 (203,5 mg; 0,81 mmol) u vodi (7 ml). Reakcijska smjesa je
miješana na sobnoj temperaturi 3 dana, a potom filtrirana kroz celit. Otapalo je upareno, a
ostatak od uparavanja pročišćen kolonskom kromatografijom (diklormetan : metanol = 10 :
1). Izoliran je spoj 24 kao žuto ulje (115,5 mg; 50 %). MS (ESI): m/z = 287,1 ([M+H]+).
103
EKSPERIMENTALNI DIO
1H NMR: () 7,71 (1H, s, H-6), 4,95 (1H, d, OH, J = 5,5 Hz), 4,70 (1H, t, OH, J = 5,4 Hz),
4,114,02 (3H, m, H-2', H-1''), 3,84 (3H, s, OCH3), 3,783,70 (1H, m, H-2''), 3,483,42 (1H,
m, H-1''), unutar signala za vodu (H-3''), 2,58 (2H, t, H-1', J = 6,5 Hz), 1,98 (3H, s, COCH3)
ppm. 13C NMR: () 170,8 (COCH3), 170,0 (C-4), 156,0 (C-2), 149,2 (C-6), 102,4 (C-5), 69,2
(C-2''), 64,1 (C-3''), 62,6 (C-2'), 54,4 (OCH3), 53,0 (C-1''), 25,9 (C-1'), 21,1 (COCH3) ppm.
5-(2-hidroksietil)-N-1-(2,3-dihidroksipropil)pirimidin-2,4-dion (25)
Metoda A: Spoj 24 (92,4 mg; 0,32 mmol) je otopljen u 1 M NaOH (8 ml) i reakcija je
miješana na sobnoj temperaturi 20 sati te potom neutralizirana dodatkom octene kiseline.
Otapalo je upareno, a ostatak od uparavanja pročišćen kolonskom kromatografijom
(diklormetan : metanol = 5 : 1). Izoliran je bijeli kristalinični spoj 25 (29,0 mg; 39 %; t.t. =
9598 °C). MS (ESI): m/z = 231,1 ([M+H]+).
Metoda B: Spoj 30 (164,0 mg; 0,67 mmol) je otopljen u 1 M NaOH (20 ml) i reakcijska
smjesa je miješana 20 sati na sobnoj temperaturi te potom neutralizirana dodatkom HCl.
Ostatak od uparavanja je pročišćen kolonskom kromatografijom (diklormetan : metanol = 5 :
1) pri čemu je izoliran bijeli kristalinični spoj 25 (57,7 mg; 37 %). 1H NMR: () 11,18 (1H, bs, NH), 7,36 (1H, s, H-6), 4,95 (1H, d, OH, J = 5,5 Hz), 4,69
(1H, t, OH, J = 5,6 Hz), 4,53 (1H, t, OH, J = 5,6 Hz), 3,89 (1H, dd, H-1'', J =13,3 Hz, J = 3,8
Hz), 3,723,64 (1H, m, H-2''), 3,45 (2H, q, H-2', J = 6,7 Hz), 3,413,36 (3H, m, H-1'', H-3''),
2,342,29 (2H, m, H-1') ppm. 13C NMR: () 164,6 (C-4), 151,5 (C-2), 144,3 (C-6), 109,3 (C-
5), 69,6 (C-2''), 64,1 (C-3''), 60,0 (C-2'), 51,4 (C-1''), 30,4 (C-1') ppm.
5-(2-acetoksietil)-N-1-[(2-acetoksietoksi)metil]pirimidin-2,4-dion (26)
Otopini spoja 8 (47,2 mg; 0,21 mmol) i natrijevog karbonata (Na2CO3; 21,9 mg; 0,20
mmol) u diklormetanu (1 ml), dodan je (2-acetoksietoksi)metil-bromid (22) pripravljen in situ
miješanjem acetil-bromida (0,02 ml; 0,2 mmol) i 1,3-dioksolana (0,01 ml; 0,2 mmol).
Reakcijska smjesa je miješana preko noći na sobnoj temperaturi. Otapalo je upareno, a ostatak
od uparavanja pročišćen kolonskom kromatografijom (diklormetan : metanol = 20 : 1).
Izoliran je praškasti spoj 26 (28,2 mg; 43 %; t.t. = 5355 °C). MS (ESI): m/z = 315,1
([M+H]+). 1H NMR: () 11,41 (1H, bs, NH), 7,64 (1H, s, H-6), 5,09 (2H, s, H-1''), 4,174,06 (4H, m,
H-3'', H-4''), 3,69 (2H, t, H-2', J = 4,6 Hz), 2,70 (2H, t, H-1', J = 6,4 Hz), 1,99 (3H, s,
COCH3), 1,98 (3H, s, COCH3) ppm. 13C NMR: () 170,2 (COCH3), 163,7 (C-4), 150,9 (C-2),
104
EKSPERIMENTALNI DIO
142,0 (C-6), 109,4 (C-5), 76,3 (C-1''), 66,7 (C-3''), 62,9 (C-4''), 61,9 (C-2'), 25,8 (C-1'), 20,6
(COCH3), 20,6 (COCH3) ppm.
5-(2-hidroksietil)-N-1-[(2-hidroksietoksi)metil]pirimidin-2,4-dion (27)
Metoda A: Otopini Na (2,1 mg; 0,09 mmol) u bezvodnom metanolu (0,5 ml) dodan je spoj
26 (27,0 mg; 0,09 mmol) otopljen u metanolu (1 ml). Reakcijska smjesa je miješana 1 sat na
sobnoj temperaturi i neutralizirana s 1 M HCl/eter. Nakon uparavanja otapala do suhog i
kolonske kromatografije (diklormetan : metanol = 5 : 1) izoliran je spoj 27 kao bezbojno ulje
(14,6 mg; 74 %). MS (ESI): m/z = 231,1 ([M+H]+).
Metoda B: Spoj 31 (37,0 mg; 0,15 mmol) otopljen je u 1 M NaOH (10 ml) i reakcijska
smjesa je miješana na sobnoj temperaturi 20 sati nakon čega je neutralizirana dodatkom
octene kiseline. Otapalo je upareno, a ostatak od uparavanja pročišćen je kolonskom
kromatografijom (etil-acetat : metanol = 5 : 1). Dobiven je uljasti spoj 27 (9,1 mg; 26 %). 1H NMR: () 11,25 (1H, bs, NH), 7,52 (1H, s, H-6), 5,08 (2H, s, H-1''), 4,60 (2H, bs, OH),
3,503,45 (6H, m, H-2', H-3'', H-4''), 2,35 (2H, t, H-1', J = 6,6 Hz) ppm. 13C NMR: () 164,5
(C-4), 151,5 (C-2), 142,0 (C-6), 111,0 (C-5), 77,0 (C-1''), 71,0 (C-3''), 60,5 (C-4''), 60,0 (C-
2'), 30,3 (C-1') ppm.
5-(2-acetoksietil)-N-1-[(1,3-dibenziloksi-2-propoksi)metil]pirimidin-2,4-dion (28)
U otopinu spoja 8 (114,0 mg; 0,50 mmol) i kalijevog karbonata (K2CO3; 186,4 mg; 1,35
mmol) u diklormetanu (3,7 ml) dodan je 1,3-dibenziloksi-2-(klormetoksi)propan (21; 257,6
mg; 0,8 mmol) u atmosferi argona. Reakcijska smjesa je miješana preko noći na sobnoj
temperaturi, zatim odfiltrirana, a otapalo upareno. Ostatak od uparavanja je pročišćen
kolonskom kromatografijom (diklormetan : metanol = 35 : 1) pri čemu je dobiven spoj 28 kao
bezbojno ulje (87,0 mg; 36 %). MS (ESI): m/z = 483,2 ([M+H]+). 1H NMR: () 11,38 (1H, s, NH), 7,63 (1H, s, H-6), 7,407,22 (10H, m, Ph), 5,20 (2H, s, H-
1''), 4,46 (4H, s, CH2Ph), 4,03 (2H, t, H-2', J = 6,8 Hz), 3,993,94 (1H, m, H-3''), 3,573,40
(4H, m, H-4''), 2,44 (2H, t, H-1', J = 6,8 Hz), 1,98 (3H, s, COCH3) ppm. 13C NMR: () 170,7
(COCH3), 164,2 (C-4), 151,5 (C-2), 143,9 (C-6), 138,7 (Cq-Ph), 128,7 (CH-Ph), 127,9 (CH-
Ph), 127,8 (CH-Ph), 109,7 (C-5), 77,2 (C-3''), 76,5 (C-1''), 72,7 (CH2Ph), 70,3 (C-4''), 62,4
(C-2'), 26,2 (C-1'), 21,1 (COCH3) ppm.
105
EKSPERIMENTALNI DIO
N-1-[(1,3-dihidroksi-2-propoksi)metil]-5-(2-hidroksietil)pirimidin-2,4-dion (29)
Metoda A: U otopinu spoja 28 (63,0 mg; 0,13 mmol) u bezvodnom diklormetanu (5 ml)
ohlađenu na 68 °C dodana je 1 M otopina borovog triklorida u diklormetanu (BCl3; 0,5 ml;
0,45 mmol) u atmosferi argona. Reakcijska smjesa je miješana 3 sata na temperaturi 68 °C.
Reakcija je prekinuta dodatkom smjese otapala diklormetan/metanol (15 ml; 1 : 1). Nakon
zagrijavanja na sobnu temperaturu, otapalo je upareno, a ostatak od uparavanja pročišćen
kolonskom kromatografijom (diklormetan : metanol = 25 : 1). Izoliran je bijeli praškasti spoj
29 (22,7 mg; 67 %; t.t. = 118120 °C). MS (ESI): m/z = 261,1 ([M+H]+).
Metoda B: Deprotekcija spoja 32 provedena je prema postupku opisanom za pripremu
spoja 29 metodom A. Reagensi: spoj 32 (106,0 mg; 0,24 mmol), diklormetan (5 ml), BCl3 u
diklormetanu (0,7 ml; 0,70 mmol). Nakon kromatografije na koloni (diklormetan : metanol =
10 : 1) izoliran je spoj 29 (41,0 mg, 65 %). 1H NMR: () 11,27 (1H, s, NH), 7,53 (1H, s, H-6), 5,16 (2H, s, H-1''), 4,644,59 (3H, m,
OH), 3,523,40 (7H, m, H-2', H-3'', H-4''), 2,35 (2H, t, H-1', J = 6,6 Hz) ppm. 13C NMR: ()
164,5 (C-4), 151,4 (C-2), 142,1 (C-6), 110,7 (C-5), 80,9 (C-3''), 76,3 (C-1''), 61,4 (C-4''), 59,9
(C-2'), 30,3 (C-1') ppm.
5-(2-hidroksietil)-N-1-(2,3-dihidroksipropil)-4-metoksipirimidin-2-on (30)
Otopina spoja 10 (194,4 mg; 0,91 mmol) i natrijevog hidrida (NaH; 90,9 mg; 2,27 mmol,
60 % dispergiran u ulju) u DMF-u (6 ml) miješana je 1 sat pri 60 °C. Nastaloj suspenziji
dokapan je 3-klorpropan-1,2-diol (0,6 ml; 6,82 mmol) i reakcijska smjesa je miješana na
temperaturi 70 °C preko noći. Otapalo je upareno, a nakon pročišćavanja produkta
kromatografijom na koloni (diklormetan : metanol = 5 : 1) dobiven je uljasti spoj 30 (166,9
mg; 75 %). MS (ESI): m/z = 245,1 ([M+H]+). 1H NMR: () 7,63 (1H, s, H-6), 4,92 (1H, d, OH, J = 5,8 Hz), 4,71 (1H, t, OH, J = 5,8 Hz),
4,53 (1H, t, OH, J = 5,5 Hz), 4,05 (1H, dd, H-1'', J = 13,0 Hz, J = 3,3 Hz), 3,83 (3H, s,
OCH3), 3,713,69 (1H, m, H-2''), 3,503,40 (2H, m, H-2'), unutar signala za vodu (H-3'', H-
1''), 2,40 (2H, t, H-1', J = 6,4 Hz) ppm. 13C NMR: () 170,2 (C-4), 156,9 (C-2), 148,8 (C-6),
103,6 (C-5), 69,3 (C-2''), 64,1 (C-3''), 60,1 (C-2'), 54,3 (OCH3), 53,0 (C-1''), 30,0 (C-1') ppm.
106
EKSPERIMENTALNI DIO
5-(2-hidroksietil)-N-1-[(2-hidroksietoksi)metil]-4-metoksipirimidin-2-on (31)
Suspenziji spoja 11 (110,0 mg; 0,65 mmol) u bezvodnom acetonitrilu (6 ml) dodan je N,O-
bis(trimetisilil)acetamid (BSA; 0,8 ml; 3,20 mmol) u atmosferi argona. Nakon 10 min u bistru
otopinu dodani su dioksolan (0,1 ml; 1,66 mmol), kalijev jodid (139,0 mg; 0,83 mmol) i
trimetilsilil-klorid (TMSCl; 0,1 ml). Miješanje je nastavljeno tijekom 48 h na sobnoj
temperaturi. Reakcijska smjesa je uparena, a ostatak od uparavanja pročišćen kolonskom
kromatografijom (diklormetan : metanol = 5 : 1). Dobiven je uljasti spoj 31 (39,1 mg; 25 %).
MS (ESI): m/z = 245,1 ([M+H]+). 1H NMR: () 7,78 (1H, s, H-6), 5,17 (2H, s, H-1''), 4,62 (1H, t, OH, J = 5,4 Hz), 4,59 (1H,
t, OH, J = 5,4 Hz), 3,563,45 (4H, m, H-3'', H-4''), 3,84 (3H, s, OCH3), 3,62 (2H, t, H-2', J =
6,4 Hz), 2,45 (2H, t, H-1', J = 6,6 Hz) ppm. 13C NMR: () 171,7 (C-4), 155,8 (C-2), 146,8 (C-
6), 105,1 (C-5), 78,3 (C-1''), 71,3 (C-3''), 60,5 (C-4''), 59,8 (C-2'), 54,7 (OCH3), 29,9 (C-1')
ppm.
N-1-[(1,3-dibenziloksi-2-propoksi)metil]-5-(2-hidroksietil)pirimidin-2,4-dion (32) i N-1-
[(1,3-dibenziloksi-2-propoksi)metil]-5-(2-kloretil)pirimidin-2,4-dion (33)
Reakcijska smjesa spoja 4 (1,3 g; 8,33 mmol), heksametildisilazana (HMDS; 30 ml),
TMSCl (0,6 ml, 4,57 mmol) i amonijevog sulfata ((NH4)2SO4; 416,0 mg; 3,15 mmol) u
atmosferi argona refluksirana je 24 h. Bistra otopina uparena je na vakuumskoj uljnoj pumpi.
Zaostalo ulje otopljeno je u acetonitrilu (50 ml) u atmosferi argona. Dodan je
tetrabutilamonijev jodid (TBAI; 73,7 mg; 0,20 mmol) i spoj 21 (4,0 g; 12,45 mmol) te je
reakcijska smjesa ostavljena na temperaturi refluksa preko noći. Otapalo je upareno, a ostatak
od uparavanja pročišćen kolonskom kromatografijom (diklormetan : metanol = 35 : 1).
Izolirani su uljasti spojevi 32 (289,6 mg; 8 %) i 33 (87,3 mg; 2 %).
32: MS (ESI): m/z = 441,3 ([M+H]+); 1H NMR: () 11,30 (1H, s, NH), 7,53 (1H, s, H-6),
7,347,28 (10H, m, Ph), 5,21 (2H, s, H-1''), 4,56 (1H, t, OH, J = 5,4 Hz), 4,46 (4H, s,
CH2Ph), 4,003,90 (1H, m, H-3'') 3,503,40 (6H, m, H-2', H-4''), 2,30 (2H, t, H-1', J = 6,7
Hz) ppm. 13C NMR: () 164,4 (C-4), 151,6 (C-2), 142,1 (C-6), 138,7 (Cq-Ph), 128,7 (CH-Ph),
127,8 (CH-Ph), 127,8 (CH-Ph), 111,0 (C-5), 77,1 (C-3''), 76,5 (C-1''), 72,7 (CH2Ph), 70,3 (C-
4''), 60,0 (C-2'), 30,3 (C-1') ppm.
33: MS (ESI): m/z = 459, 2 ([M+H]+); 1H NMR: () 11,43 (1H, s, NH), 7,69 (1H, s, H-6),
7,387,20 (10H, m, Ph), 5,20 (2H, s, H-1''), 4,46 (4H, s, CH2Ph), 4,043,95 (1H, m, H-3''),
107
EKSPERIMENTALNI DIO
3,62 (2H, t, H-2', J = 6,9 Hz), 3,553,40 (4H, m, H-4''), 2,58 (2H, t, H-1', J = 7,0 Hz) ppm. 13C NMR: () 164,1 (C-4), 151,5 (C-2), 143,0 (C-6), 138,7 (Cq-Ph), 128,7 (CH-Ph), 127,8
(CH-Ph), 127,7 (CH-Ph), 109,8 (C-5), 77,2 (C-3''), 76,6 (C-1''), 72,7 (CH2Ph), 70,3 (C-4''),
43,5 (C-2'), 30,2 (C-1') ppm.
N-1-[(1,3-dihidroksi-2-propoksi)metil]-5-(2-kloretil)pirimidin-2,4-dion (34)
Spoj 34 sintetiziran je prema postupku opisanom za sintezu spoja 29. Reagensi: spoj 33
(43,7 mg; 0,10 mmol), diklormetan (8 ml) i BCl3 (0,7 ml; 0,70 mmol). Nakon kolonske
kromatografije (diklormetan : metanol = 5 : 1) izoliran je uljasti spoj 34 (15,0 mg; 57 %). MS
(ESI): m/z = 279,2 ([M+H]+). 1H NMR: () 11,36 (1H, s, NH), 7,65 (1H, s, H-6), 5,13 (2H, s, H-1''), 4,58 (2H, t, OH, J =
5,5 Hz), 3,66 (2H, t, H-2', J = 6,9 Hz), 3,513,32 (5H, m, H-3'', H-4''), 2,62 (2H, t, H-1', J =
6,9 Hz) ppm. 13C NMR: () 164,2 (C-4), 151,3 (C-2), 143,2 (C-6), 110,7 (C-5), 81,0 (C-3''),
76,4 (C-1''), 61,4 (C-4''), 43,6 (C-2'), 30,3 (C-1') ppm.
N-1-[4-acetoksi-3-(acetoksimetil)butil]-5-(2-acetoksietil)-4-metoksipirimidin-2-on (35) i
2-[4-acetoksi-3-(acetoksimetil)butoksi]-5-(2-acetoksietil)-4-metoksipirimidin (36)
Otopini spoja 10 (2,0 g; 9,38 mmol) i K2CO3 (2,0 g; 14,08 mmol) u bezvodnom DMF-u
(60 ml) dokapan je spoj 18 (5,0 g; 15,96 mmol) u atmosferi argona. Reakcijska smjesa je
miješana 20 min na temperaturi 60 °C, a zatim uparena do suhog. Nakon kolonske
kromatografije ostatka od uparavanja (diklormetan : metanol = 30 : 1) izolirani su uljasti
spojevi 35 (1,8 g; 49 %) i 36 (1,7 g; 45 %).
35: MS (ESI): m/z = 399,2 ([M+H]+); 1H NMR: () 7,89 (1H, s, H-6), 4,12 (2H, t, H-2', J =
6,6 Hz), 4,03 (4H, d, H-4'', J = 5,8 Hz), 3,85 (3H, s, OCH3), 3,83 (2H, t, H-1'', J = 7,7 Hz),
2,60 (2H, t, H-1', J = 6,6 Hz), 2,02 (6H, s, COCH3), 2,001,98 (4H, m, COCH3, H-3''), 1,67
(2H, q, H-2'', J = 7,1 Hz) ppm. 13C NMR: () 170,8 (COCH3), 169,9 (C-4), 155,6 (C-2), 147,7
(C-6), 103,3 (C-5), 64,0 (C-4''), 62,6 (C-2'), 54,3 (OCH3), 47,2 (C-1''), 34,9 (C-3''), 27,9 (C-1')
26,0 (C-2''), 21,1 (COCH3) ppm.
36: MS (ESI): m/z = 399,2 ([M+H]+); 1H NMR: (δ) 8,14 (1H, s, H-6), 4,34 (2H, t, H-1'', J
= 6,6 Hz), 4,14 (2H, t, H-2', J = 6,6 Hz), 4,05 (4H, m, H-4''), 3,91 (3H, s, OCH3), 2,74 (2H, t,
H-1', J = 6,6 Hz), 2,18 (1H, m, H-3''), 2,00 (6H, s, COCH3), 1,96 (3H, s, COCH3), 1,78 (2H,
m, H-2'') ppm. 13C NMR: (δ) 170,3 (COCH3), 170,2 (COCH3), 168,9 (C-4), 163,4 (C-2),
108
EKSPERIMENTALNI DIO
158,1 (C-6), 110,9 (C-5), 64,5 (C-1''), 63,7 (C-4''), 62,2 (C-2'), 53,9 (OCH3), 34,1 (C-3''), 27,2
(C-2''), 25,5 (C-1'), 20,7 (COCH3), 20,6 (COCH3) ppm.
5-(2-hidroksietil)-N-1-[4-hidroksi-3-(hidroksimetil)butil]pirimidin-2,4-dion (37, 5-HEU-
PCV)
Spoj 37 sintetiziran je prema postupku opisanom za pripravu spoja 25. Reagensi koji su
korišteni: spoj 35 (62,4 mg; 0,16 mmol) i 1 M NaOH (5 ml). Nakon kolonske kromatografije
(diklormetan : metanol = 5 : 1) dobiven je bijeli prašksti spoj 37 (28,2 mg; 70 %; t.t. = 8384
°C). MS (ESI): m/z = 259,1 ([M+H]+). 1H NMR: () 11,15 (1H, bs, NH), 7,46 (1H, s, H-6), 4,54 (1H, t, OH, J = 5,5 Hz), 4,40
(2H, t, OH, J = 5,2 Hz), 3,69 (2H, t, H-1'', J = 7,6 Hz), 3,45 (2H, q, H-2', J = 6,3 Hz),
3,423,32 (4H, m, H-4''), 2,32 (2H, t, H-1', J = 6,7 Hz), 1,55 (2H, q, H-2'', J = 7,3 Hz), 1,47
(1H, m, H-3'', J = 5,9 Hz) ppm. 13C NMR: () 164,5 (C-4), 151,2 (C-2), 142,9 (C-6), 109,3
(C-5), 61,9 (C-4''), 59,9 (C-2'), 46,2 (C-1''), 41,2 (C-3''), 30,4 (C-1'), 28,2 (C-2'') ppm.
2-[4-hidroksi-3-(hidroksimetil)butoksi]-5-(2-hidroksietil)-4-metoksipirimidin (38)
Spoj 38 pripravljen je prema postupku opisanom za pripravu spoja 25. Reagensi koji su
korišteni su spoj 36 (0,4 g; 1,00 mmol), metanol (10 ml), 1 M NaOH (1 ml). Nakon
kromatografije na koloni (diklormetan : metanol = 10 : 1) izoliran je uljasti spoj 38 (0,2 g; 88
%). MS (ESI): m/z = 273,2 ([M+H]+). 1H NMR: (δ) 8,08 (1H, s, H-6), 4,62 (1H, t, OH, J = 5,5 Hz), 4,40 (2H, t, OH, J = 5,2 Hz),
4,32 (2H, t, H-1'', J = 6,6 Hz), 3,89 (3H, s, OCH3), 3,51 (2H, m, H-2'), 3,42 (4H, m, H-4''),
2,56 (2H, t, H-1', J = 6,8 Hz), 1,68 (2H, m, H-2''), 1,67 (1H, m, H-3'') ppm. 13C NMR: (δ)
168,8 (C-4), 163,4 (C-2), 158,0 (C-6), 111,8 (C-5), 65,3 (C-1''), 61,4 (C-4''), 59,6 (C-2'), 53,7
(OCH3), 40,2 (C-3''), 29,6 (C-1'), 27,3 (C-2'').
2,4-diklorpirimidin (40)121
Reakcijska smjesa uracila (7,0 g; 0,06 mol), POCl3 (107 ml; 1,15 mol) i N,N-dietilanilina
(12 ml; 0,08 mol) je zagrijavana 1 h na temperaturi refluksa. Otapalo je upareno pod sniženim
tlakom, a nastali produkt je ekstrahiran s diklormetanom i vodom. Organski sloj je sušen
iznad bezvodnog MgSO4. Nakon filtriranja dobiven je spoj 40 (8,0 g; 86 %). MS (ESI): m/z =
150,2 ([M+H]+). 1H NMR: (δ) 8,77 (1H, d, H-6, J = 5,3 Hz), 7,81 (1H, d, H-5, J = 5,3 Hz) ppm.
109
EKSPERIMENTALNI DIO
2,4-dimetoksipirimidin (41)
Reakcijska smjesa spoja 40 (8,0 g; 0,05 mol) i natrijevog metoksida pripremljenog
otapanjem Na (6,2 g; 0,27 mol) u metanolu (269 ml) je miješana 20 sati na sobnoj
temperaturi. Otapalo je upareno, a nastali produkt je pročišćen kromatografijom na koloni
(diklormetan : metanol = 100 : 1). Izoliran je uljasti spoj 41 (1,3 g; 19 %). 1H NMR: (δ) 8,29 (1H, d, H-6, J = 5,7 Hz), 6,56 (1H, d, H-5, J = 5,7 Hz), 3,37 (6H, s,
OCH3) ppm. 13C NMR: (δ) 173,6 (C-4), 167,7 (C-2), 161,6 (C-6), 104,4 (C-5), 57,1 (OCH3)
ppm.
N-1-[(1,3-dibenziloksi-2-propoksi)metil]-4-metoksipirimidin-2-on (42)
Suspenzija spoja 41 (440,0 mg; 3,14 mmol) i K2CO3 (564,1 mg; 4,08 mmol) u bezvodnom
diklormetanu (60 ml) je miješana 45 min u atmosferi argona. Potom je dokapan spoj 21 (1,3
g; 4,08 mmol). Reakcijska smjesa je miješana na sobnoj temperaturi 24 h, zatim je K2CO3
odfiltriran, otapalo upareno, a nastali produkt pročišćen kromatografijom na koloni
(diklormetan : metanol = 100 : 1). Dobiven je uljasti spoj 42 (603,8 mg; 47 %). MS (ESI): m/z
= 411,4 ([M+H]+). 1H NMR: (δ) 7,99 (1H, d, H-6, J = 7,2 Hz), 7,377,26 (10H, m, Ph), 5,93 (2H, d, H-5, J =
7,2 Hz), 5,31 (2H, s, H-1''), 4,49–4,41 (4H, m, CH2Ph), 4,08–4,00 (1H, m, H-3''), 3,80 (s, 3H,
OCH3), 3,49 (4H, ABX sustav, H-4'', Jax = 4,2 Hz, Jab = 10,5 Hz, Jbx = 6,2 Hz). 13C NMR: (δ)
171,9 (C-4), 156,0 (C-2), 148,9 (C-6), 138,7 (Cq-Ph), 128,7 (CH-Ph), 127,9 (CH-Ph), 127,8
(CH-Ph), 95,2 (C-5), 77,9 (C-3''), 77,5 (C-1''), 72,7 (CH2Ph), 70,3 (C-4''), 54,2 (OCH3) ppm.
N-1-[(1,3-dibenziloksi-2-propoksi)metil]pirimidin-2,4-dion (43)
Metoda A: Reakcijska smjesa spoja 42 (111,3 mg; 0,27 mmol) i AcCl (4,1 ml; 0,06 mmol)
je zagrijavana 24 sata, a potom je dodano 6 ml vode. Otapalo je upareno, a ostatak od
uparavanja pročišćen kolonskom kromatografijom (etil-acetat). Izoliran je uljasti spoj 43
(25,0 mg; 23 %). MS (ESI): m/z = 397,2 ([M+H]+).
Metoda B: Reakcijska smjesa spoja 42 (99,3 mg; 0,24 mmol) i 1 M NaOH (5 ml) je
miješana preko noći na temperaturi 65 °C te je potom neutralizirana s HCl i otapalo je
upareno. Nakon kolonske kromatografije (etil-acetat) izoliran je uljasti spoj 43 (45,0 mg; 41
%).
Metoda C: Reakcijskoj smjesi spoja 42 (600,0 mg; 1,87 mmol) u acetonitrilu (40 ml) je
dodan TMSCl (0,9 ml; 6,56 mmol) i NaI (963,5 mg; 6,56 mmol) te je reakcijska smjesa
refluksirana 3 h i miješana preko noći na sobnoj temperaturi. Otapalo je upareno, a ostatak od
110
EKSPERIMENTALNI DIO
uparavanja ekstrahiran s etil-acetatom i vodom te sa zasićenom otopinom natrijevog
tiosulfata. Organski sloj je sušen iznad bezvodnog MgSO4, odfiltriran, a otapalo je upareno.
Nakon kolonske kromatografije ostataka od uparavanja (etil-acetat), izoliran je uljasti spoj 43
(350,7 mg; 47 %). 1H NMR: (δ) 11,28 (1H, s, NH), 7,69 (1H, d, H-6, J = 7,9 Hz), 7,377,22 (10H, m, Ph),
5,55 (1H, d, H-5, J = 7,9 Hz), 5,20 (2H, s, H-1''), 4,47 (4H, s, CH2Ph), 4,023,96 (1H, m, H-
3''), 3,48 (4H, ABX sustav, H-4'', Jax = 4,2 Hz, Jab = 10,5 Hz, Jbx = 6,3 Hz) ppm. 13C NMR:
(δ) 164,1 (C-4), 151,7 (C-2), 145,5 (C-6), 138,7 (Cq-Ph), 128,7 (CH-Ph), 127,9 (CH-Ph),
127,8 (CH-Ph), 102,0 (C-5), 77,3 (C-3''), 76,6 (C-1''), 72,7 (CH2Ph), 70,2 (C-4'') ppm.
N-1-[(1,3-dibenziloksi-2-propoksi)metil]-N-3-(2-benzoiloksietil)pirimidin-2,4-dion (44)
U otopinu spoja 43 (147,0 mg; 0,37 mmol) i K2CO3 (132,1 mg; 0,96 mmol) u smjesi
otapala aceton i DMF (5 ml; 1 : 1) dokapan je spoj 48 (161,9 mg; 0,76 mmol). Reakcijska
smjesa je miješana 24 sata uz zagrijavanje pri temperaturi 50 °C te je K2CO3 odfiltriran, a
otapalo upareno. Ostatak od uparavanja je pročišćen flash kromatografijom (diklormetan, a
zatim diklormetan : metanol = 100 : 1) pri čemu je dobiven uljasti spoj 44 (30,0 mg; 15 %). 1H NMR: (δ) 7,86 (2H, d, Ph-2''', J = 7,0 Hz), 7,75 (1H, d, H-6, J = 7,9 Hz), 7,60–7,52
(2H, m, Ph-4'''), 7,45 (2H, t, Ph-3''', J = 7,6 Hz), 7,36–7,22 (10H, m, Ph), 5,70 (1H, d, H-5, J =
7,9 Hz), 5,27 (2H, s, H-1''), 4,40–4,30 (2H, t, H-2', J = 5,0 Hz), 4,41 (4H, s, CH2Ph), 4,18
(2H, t, H-1', J = 4,9 Hz), 3,40–3,30 (5H, m, H-4'', H-3'') ppm.
N-3-(2-benzoiloksietil)-N-1-[(1,3-dihidroksi-2-propoksi)metil]pirimidin-2,4-dion (45)
U ohlađenu reakcijsku smjesu (–68 °C) spoja 44 (16,5 mg; 0,03 mmol) u diklormetanu (2
ml) dodan je BCl3 (0,1 ml; 1,52 mmol) u struji argona te je miješanje nastavljeno 3 h na –68
°C. Reakcija je prekinuta dodatkom 5 ml smjese diklormetan : metanol. Otapalo je upareno, a
nastali produkt pročišćen kromatografijom na koloni (diklormetan : metanol = 10 : 1) pri
čemu je dobiven uljasti spoj 45 (10,9 mg; 93 %). MS (ESI): m/z = 356,1 ([M+H]+). 1H NMR: (δ) 7,91 (2H, d, Ph-2''', J = 7,4 Hz), 7,76 (2H, d, H-6, J = 7,9 Hz), 7,65 (1H, t,
Ph-4''', J = 7,2 Hz), 7,51 (2H, t, Ph-3''', J = 7,5 Hz), 5,76 (1H, d, H-5, J = 7,9 Hz), 5,23 (2H, s,
H-1''), 4,61 (2H, t, OH, J = 5,4 Hz), 4,46 (2H, t, H-2', J = 5,1 Hz), 4,23 (2H, t, H-1', J = 5,0
Hz), 3,59–3,47 (1H, m, H-3''), 3,49–3,30 (4H, m, H-4'') ppm. 13C NMR: (δ) 166,1 (CO), 162,9
(C-4), 151,8 (C-2), 144,3 (C-6), 133,7 (Ph-4'''), 130,1 (Ph-1'''), 129,7 (Ph-3'''), 129,1 (Ph-2'''),
101,0 (C-5), 81,3 (C-3''), 77,5 (C-1''), 62,2 (C-2'), 61,4 (C-4''), 40,0 (C-1') ppm.
111
EKSPERIMENTALNI DIO
N-3-(2-hidroksietil)-N-1-[(1,3-dihidroksi-2-propoksi)metil]pirimidin-2,4-dion (46)
Otopini spoja 45 (26,1 mg; 0,07 mmol) u metanolu (0,7 ml) dodana je 1 M NaOH (0,1 ml)
i reakcijska smjesa je miješana preko noći na sobnoj temperaturi, a potom neutralizirana
dodatkom HCl. Otapalo je upareno, a ostatak od uparavanja pročišćen kolonskom
kromatografijom (diklormetan : metanol = 10 : 1) pri čemu je izoliran spoj 46 (10,0 mg; 54
%). 1H NMR : (δ) 7,72 (1H, d, H-6, J = 7,9 Hz), 5,71 (1H, d, H-5, J = 7,9 Hz), 5,22 (2H, s, H-
1''), 4,76 (1H, t, OH, J = 5,9 Hz), 4,61 (2H, t, OH, J = 5,5 Hz), 4,38 (1H, t, H-2', J = 5,6 Hz),
3,88 (2H, t, H-1', J = 6,8 Hz), 3,59–3,37 (5H, m, H-4'', H-3'') ppm. 13C NMR: (δ) 163,0 (C-4),
151,7 (C-2), 143,9 (C-6), 101,1 (C-5), 81,3 (C-3''), 77,6 (C-1''), 63,5 (C-4''), 61,4 (C-4''), 57,8
(C-2'), 42,7 (C-1') ppm.
2-brometil-benzoat (48)
2-brometanol (47; 0,3 ml; 4,00 mmol) otopljen je u diklormetanu (10 ml) te je u atmosferi
argona dodan trietilamin (Et3N; 3,3 ml; 0,02) i anhidrid benzojeve kiseline (Bz2O; 1,6 g; 7,17
mmol). Reakcijska smjesa je miješana preko noći na sobnoj temperaturi. Otapalo je upareno,
a ostatak od uparavanja je pročišćen flash kromatografijom (20 % aceton : n-heksan). Izoliran
je uljasti spoj 48 (596,8 mg; 70 %). 1H NMR: (δ) 8,11–8,05 (2H, m, Ph-2'''), 7,61–7,56 (1H, m, Ph-4'''), 7,49–7,43 (2H, m, Ph-
3'''), 4,64 (2H, t, H-2', J = 6,1 Hz), 3,65 (2H, t, H-1', J = 6,1 Hz) ppm.
5-(2-hidroksietil)-N-1-[4-hidroksi-3-(hidroksimetil)butil]-4-metoksipirimidin-2-on (49)
Spoju 35 (1,8 g; 4,60 mmol) otopljenom u metanolu (46 ml) dodana je 0,1 M otopina
NaOCH3/CH3OH (4,6 ml) te je reakcijska smjesa miješana 1 sat na sobnoj temperaturi i
neutralizirana s HCl. Otapalo je upareno, a ostatak od uparavanja pročišćen kolonskom
kromatografijom (diklormetan : metanol = 5 : 1) pri čemu je izoliran spoj 49 (1,1 g; 90 %)
kao bezbojno ulje. MS (ESI): m/z = 273,2 ([M+H]+). 1H NMR: (δ) 7,76 (1H, s, H-6), 4,62 (1H, t, OH, J = 5,4 Hz), 4,41 (2H, t, OH, J = 5,2 Hz),
3,82 (3H, s, OCH3), 3,80 (2H, d, H-1'', J = 6,7 Hz), 3,493,46 (2H, m, H-2'), 3,403,37 (4H,
m, H-4''), 2,41 (2H, t, H-1', J = 6,7 Hz), 1,581,55 (2H, m, H-2''), 1,481,46 (1H, m, H-3'')
ppm. 13C NMR: (δ) 169,5 (C-4), 155,2 (C-2), 146,9 (C-6), 103,9 (C-5), 61,4 (C-4''), 59,5 (C-
2'), 53,8 (OCH3), 47,4 (C-1''), 40,8 (C-3''), 29,5 (C-1'), 27,9 (C-2'') ppm.
112
EKSPERIMENTALNI DIO
5-(2-hidroksietil)-N-1-[2-(2,2-dimetil-1,3-dioksan-5-il)etil]-4-metoksipirimidin-2-on (50)
Otopini spoja 49 (726,0 mg; 2,67 mmol) u DMF-u (9 ml) dodan je 2,2-dimetoksipropan
(0,6 ml; 3,89 mmol) i p-toluensulfonska kiselina monohidrat (15,2 mg; 0,08 mmol).
Reakcijska smjesa je miješana 2 sata na sobnoj temperaturi i potom neutralizirana s
trietilaminom. Otapalo je upareno, a ostatak od uparavanja pročišćen kolonskom
kromatografijom (diklormetan : metanol = 10 : 1). Izoliran je bijeli kristalinični spoj 50 (494,7
mg; 59 %; t.t. = 120–121 °C). MS (ESI): m/z = 313,2 ([M+H]+). 1H NMR: (δ) 7,78 (1H, s, H-6), 4,60 (1H, t, OH, J = 4,5 Hz), 3,83 (3H, s, OCH3),
3,823,72 (4H, m, H-4'', H-2'), 3,573,44 (4H, m, H-4'', H-1''), 2,41 (2H, t, H-1', J = 6,7 Hz),
1,701,58 (1H, m, H-3''), 1,53 (2H, q, H-2'', J = 7,1 Hz), 1,33 (3H, s, CH3), 1,27 (3H, s, CH3)
ppm. 13C NMR: (δ) 170,0 (C-4), 155,7 (C-2), 147,2 (C-6), 112,7 (C-5), 104,4 (C-5''), 63,9 (C-
4''), 61,9 (C-2'), 60,0 (C-4''), 54,3 (OCH3), 47,8 (C-1''), 41,3 (C-3''), 30,0 (C-1'), 28,3 (C-2''),
27,1 (CH3), 21,6 (CH3) ppm.
5-(2-fluoretil)-N-1-[2-(2,2-dimetil-1,3-dioksan-5-il)etil]-4-metoksipirimidin-2-on (51)
Otopina spoja 50 (296,7 mg; 0,95 mmol) u diklormetanu (7 ml) ohlađena je na 68 °C i
dodan je dietilaminosumporov trifluorid (DAST; 0,3 ml; 2,04 mmol) u atmosferi argona.
Reakcijska smjesa je miješana 3 h na 40 °C, zatim je otapalo upareno, a ostatak od
uparavanja pročišćen kolonskom kromatografijom (diklormetan : metanol = 15 : 1). Dobiven
je uljasti spoj 51 (100,2 mg; 34 %). MS (ESI): m/z = 315,1 ([M+H]+). 1H NMR: (δ) 7,89 (1H, s, H-6), 4,52 (2H, dt, H-2', JHF = 47,1 Hz, JHH = 6,3 Hz), 3,84 (3H,
s, OCH3), 3,803,74 (2H, m, H-4''), 3,553,50 (4H, m, H-4'', H-1''), 2,722,64 (2H, dt, H-1',
JHF = 23,4 Hz, JHH = 6,3 Hz), 1,671,61 (1H, m, H-3''), 1,551,51 (2H, m, H-2''), 1,32 (3H, s,
CH3), 1,27 (3H, s, CH3) ppm.
5-(2-fluoretil)-N-1-[4-hidroksi-3-(hidroksimetil)butil]pirimidin-2,4-dion (HHB-5-FEP,
52)
Metoda A: Otopini spoja 51 (40,0 mg; 013 mmol) u acetonitrilu (2 ml) dodani su TMSCl
(0,1 ml; 0,39 mmol) i NaI (39,5 mg; 0,26 mmol). Reakcijska smjesa je miješana na
temperaturi refluksa 10 min. Otapalo je upareno, a ostatak od uparavanja pročišćen
kolonskom kromatografijom (etil-acetat: metanol = 10 : 1). Dobiven je žuti uljasti spoj 52 (8,0
mg; 24 %). MS (ESI): m/z = 261,2 ([M+H]+).
113
EKSPERIMENTALNI DIO
Metoda B: Spoj 51 (37,3 mg; 0,12 mmol) otopljen je u koncentriranoj HCl (1,6 ml) i
reakcijska smjesa je miješana na temperaturi refluksa 10 min te potom neutralizirana
dodatkom 6 M NaOH. Nastala sol je odfiltrirana, a otapalo upareno. Ostatak od uparavanja je
pročišćen kolonskom kromatografijom (diklormetan : metanol = 10 : 1) pri čemu je izoliran
uljasti spoj 52 (9,0 mg; 29 %). 1H NMR: (δ) 11,24 (1H, s, NH), 7,58 (1H, s, H-6), 4,50 (2H, dt, H-2', JHF = 47,3 Hz, JHH =
6,3 Hz), 4,37 (2H, bs, OH), 3,29 (2H, t, H-1'', J = 7,6 Hz), 3,37 (4H, ABX sustav, H-4'', Jax =
5,7 Hz, Jab = 10,5 Hz, Jbx = 5,5 Hz), 2,17 (2H, dt, H-1', JHF = 23,1 Hz, JHH = 6,3 Hz), 1,14
(2H, q, H-2'', J = 7,2 Hz), 1,09–1,03 (1H, m, H-3'') ppm. 13C NMR: (δ) 163,8 (C-4), 150,6 (C-
2), 143,1 (C-6), 115,3 (C-5), 81,6 (d, C-2', JCF = 164,7 Hz), 61,4 (C-4''), 45,9 (C-1''), 40,7 (C-
3''), 27,8 (C-2''), 27,4 (d, C-1', JCF = 21,1 Hz) ppm.
N-1-[2-(2,2-dimetil-1,3-dioksan-5-il)etil]-4-metoksi-5-[2-(p-
toluensulfoniloksi)etil]pirimidin-2-on (53)
Ohlađenoj otopini (0 °C) p-toluensulfonil-klorida (TsCl; 357,0 mg; 1,87 mmol) u piridinu
(3 ml) dodan je spoj 50 (100,0 mg; 0,32 mmol) otopljen u piridinu (5 ml). Reakcijska smjesa
je miješana 1 h na 0 °C, a zatim još 1 h na sobnoj temperaturi. U reakcijsku smjesu je dodan
etil-acetat (50 ml) i organski sloj je ekstrahiran s vodom (3 x 30 ml), a vodeni sloj s etil-
acetatom (3 x 30 ml). Organski slojevi su spojeni i sušeni iznad bezvodnog MgSO4,
odfiltrirani i upareni. Ostatak od uparavanja pročišćen je kolonskom kromatografiijom
(diklormetan : metanol = 15 : 1) pri čemu je izoliran uljasti spoj 53 (102,2 mg; 68 %). MS
(ESI): m/z = 467,3 ([M+H]+). 1H NMR: (δ) 7,76 (1H, s, H-6), 7,69–7,65 (m, 2H, Ph-2'), 7,43–7,39 (2H, m, Ph-3'), 4,14
(2H, t, H-2', J = 6,3 Hz), 3,82–3,76 (2H, m, H-4''), 3,73–3,69 (2 H, m, H-1''), 3,71 (3H, s,
OCH3), 3,55–3,51 (2H, m, H-4''), 2,57 (2H, t, H-1', J = 6,3 Hz), 2,41 (3H, s, CH3-Ph-4'),
1,67–1,60 (1H, m, H-3''), 1,52 (2H, q, H-2'' J = 7,3 Hz), 1,34 (3H, s, CH3-5''), 1,28 (3H, s,
CH3-5'') ppm. 13C NMR: (δ) 168,9 (C-4), 155,0 (C-2), 147,4 (C-6), 145,0 (Ph-4'), 132,1 (Ph-
1'), 130,0 (Ph-3'), 127,3 (Ph-2'), 101,4 (C-5), 101,1 (C-5''), 68,6 (C-4''), 63,3 (C-2'), 61,5 (C-
4''), 53,7 (OCH3), 46,3 (C-1''), 40,1 (C-3''), 31,2 (CH3-Ph-4'), 27,7 (C-1'), 26,4 (CH3-5''), 25,9
(C-2''), 21,4 (CH3-5'') ppm.
114
EKSPERIMENTALNI DIO
Dobivanje [18F]fluorida: [18F]fluorid je dobiven djelovanjem protonske zrake jakosti 18
MeV na tekuću metu izotopski obogaćenu s [18O]H2O (1900 µl, 97 %, Cambridge Isotope
Laboratories) na 18/9 ciklotronu (IBA, Belgija). Dobivena je radioaktivnost (31–54 GBq)
koja je s kontinuiranom strujom helija premještena u vruću ćeliju za sintezu. Vodena otopina
[18F]fluorida propuštena je kroz Sep-Pak Light Accell Plus carb QMA punjenje (Waters) bez
prethodnog kondicioniranja kolone. Ispiranje [18F]fluorida je provedeno s otopinom K2CO3
(1,8 mg; 13 μmol)/kriptofiks2,2,2 (10,0 mg; 26,60 μmol)/H2O (0,6 ml)/acetonitril (1,4 ml).
Eluens je skupljen u zatvoreni reaktor Wheaton (5 ml), a otapalo je upareno u vremenu od 10
minuta na 90 °C uz sniženi tlak i u struji dušika. Zatim je acetonitril (1 ml) dodavan tri puta i
uparavanje do suhog je ponovljeno tri puta (3 x 3 min na 90 °C). Nakon toga je primijenjen
potpuni vakuum bez dušika (5 min na 90 °C).
5-(2-[18F]fluoretil)-N-1-[4-hidroksi-3-(hidroksimetil)butil]pirimidin-2,4-dion ([18F]52,
HHB-5-[18F]FEP)
Prekursor 53 (4,0 mg; 8,60 µmol) je otopljen u bezvodnom acetonitrilu (300 µl) i dodan
azeotropski osušenom kompleksu [18F]fluorid-kriptat (25–42 GBq). Otopina je zagrijavana 8
min na 100 °C nakon čega je ostavljena 5 min da se ohladi na sobnu temperaturu. Reakcijskoj
smjesi je dodan acetonitril (1 ml) i otopina je propuštena kroz kolonu punjenu silika-gelom
Sep-Pak light (Waters; prethodno kondicionirana s 5 ml Et2O) kako bi se izdvojio nastali spoj
[18F]51 od neizreagiranog [18F]fluorida i kriptofiks2.2.2/karbonatne soli. Reaktor je dodatno
ispran s acetonitrilom (1 ml) i organski dio je ponovno propušten kroz kolonu punjenu silika-
gelom Sep-Pak light. Acetonitril je uparen na 90 °C uz sniženi tlak i struju dušika.
Za deprotekciju je korištena koncentrirana HCl (0,5 ml) koja je dodana u reakcijsku bočicu
i otopina je zagrijavana 10 min na 100 °C pri čemu je nastao spoj [18F]52. Nakon 5 min
hlađenja, dodana je 5 M NaOH (1 ml) kako bi se neutralizirala kisela otopina. Za razrjeđenje
do volumena 3 ml, dodani su 0,6 M PBS (1 ml) i voda (0,5 ml). Konačni radiooznačeni
produkt ([18F]52, HHB-5-[18F]FEP) je pročišćen uz semi-preparativni radio-HPLC. Frakcije s
produktom su propuštene kroz sterilni filter u sterilnu bočicu bez pirogena. Kromatogrami
HPLC analize pročišćavanja produkta (slike p-9 i p-10), kromatogram potvrde kemijskog
identiteta radiooznačenog spoja (slika 34) te kromatogram kontrole kvalitete formuliranog
spoja (slika p-11) prikazani su u prilozima i poglavlju Rezultati i rasprava.
115
EKSPERIMENTALNI DIO
Radiosinteza [18F]FHBG (56)
Tosilni prekursor 54 (3,0 mg; 3,15 µmol) otopljen u acetonitrilu (400 µL) dodan je
azeotropski osušenom kompleksu [18F]fluorid-kriptata (30–38 GBq). Reakcijska smjesa je
zagrijavana 20 min na 115 °C i potom je ostavljena 10 min da se ohladi na sobnu temperaturu.
Nakon dodatka smjese otapala 15 % metanol u diklormetanu (1 ml), reakcijska smjesa je
propuštena kroz kolonu punjenu silika-gelom Sep-Pak light (kondicionirana s 5 ml Et2O).
Reaktor je dodatno ispran s 15 % metanol u diklormetanu (3 ml) i otopina je propuštena kroz
kolonu punjenu silika-gelom Sep-Pak light. Organski dio je uparen do suhog na 90 °C uz
sniženi tlak i u struji dušika. Za deprotekciju metoksitritilne skupine u reakcijsku bočicu je
dodana 1 M HCl (0,6 ml) i reakcijska smjesa je zagrijavana 10 min na 115 °C pri čemu je
nastao [18F]FHBG (56). Nakon hlađenja (5 min), dodana je 1 M NaOH (0,6 ml) kako bi se
neutralizirala kisela otopina. Za razrjeđenje do volumena 3 ml dodana je 0,6 M PBS (1 ml) i
voda (0,8 ml). Radioprodukt [18F]FHBG (56) je pročišćen uz semi-preparativni radio-HPLC.
Frakcije s produktom su propuštene kroz sterilni filter u sterilnu bočicu bez pirogena.
2,4-diklor-5,6-dimetilpirimidin (57)122
Otopina 5,6-dimetilpirimidin-2,4-diona (10,0 g; 0,07 mol) u POCl3 (50 ml) refluksirana je
1 sat. POCl3 je uparen pri sniženom tlaku, a u ostatak od uparavanja je dodana hladna voda.
Vodeni sloj je ekstrahiran s diklormetanom. Organski slojevi su spojeni i sušeni iznad
bezvodnog MgSO4. Nakon filtriranja i upravanja otapala, dobiven je narančasti praškasti
produkt 57 (11, 0 g; 86 %; t.t. = 70−71 °C). 1H NMR: () 2,47 (3H, s, CH3-6), 2,26 (3H, s, CH3-5) ppm. 13C NMR: () 171,5 (C-6),
155,2 (C-4), 160,5 (C-2), 127,7 (C-5), 22,8 (CH3-6), 14,4 (CH3-5) ppm.
5,6-dimetil-2,4-dimetoksipirimidin (58)122
Otopljenom natriju (3,1 g; 0,14 mol) u metanolu (93 ml) dodan je spoj 57 (11,0 g; 0,06
mol) i reakcijska smjesa je refluksirana 1,5 h. Otapalo je upareno, a u ostatak od uparavanja je
dodana voda (100 ml) koja otapa nastali NaCl. Vodeni sloj je ekstrahiran s diklormetanom (2
x 100 ml). Organski sloj je sušen iznad bezvodnog MgSO4, a nakon filtriranja i uparavanja
otapala izolirano je svijetlo žuto ulje koje hlađenjem kristalizira u spoj 58 (8,5 g; 72 %; t.t. =
39−40 °C). 1H NMR: () 3,87 (3H, s, OCH3), 3,82 (3H, s, OCH3), 2,29 (3H, s, CH3-6), 1,98 (3H, s,
CH3-5) ppm. 13C NMR: (δ) 168,7 (C-4), 165,7, (C-6), 162,1 (C-2), 107,3 (C-5), 54,0 (OCH3),
53,7 (OCH3), 21,5 (CH3-6), 9,7 (CH3-5) ppm.
116
EKSPERIMENTALNI DIO
1,3-bis(benziloksi)propan-2-on (60)122
Suspenziji N-klorsukcinimida (NBS; 36,9 g; 0,27 mol) u bezvodnom diklormetanu (190
ml) ohlađenoj na −25 °C dodan je dimetil-sulfid (20,5 ml; 0,28 mmol) u atmosferi argona.
Nakon 40 min dokapan je 1,3-bis(benziloksi)propan-2-ol (59) (25,0 g, 0,10 mol) otopljen u
bezvodnom diklormetanu (100 ml). Miješanje je nastavljeno tijekom 2 h na −25 °C nakon
čega je dodan Et3N (47,3 g; 0,47 mol). Reakcijska smjesa je miješana preko noći na sobnoj
temperaturi. Reakcija je prekinuta dodatkom 130 ml 1 M HCl (do pH = 7) i slojevi su
odvojeni. Organski sloj je ispran sa zasićenom otopinom natrijevog klorida (2 x 90 ml), a
vodeni sloj je ispran s etil-acetatom (2 x 70 ml). Organski slojevi su spojeni i sušeni iznad
bezvodnog MgSO4. Otapalo je nakon filtriranja upareno, a ostatak od uparavanja pročišćen
kolonskom kromatografijom (n-heksan : etil-acetat = 4 : 1). Izoliran je uljasti spoj 60 (18,0 g;
73 %). 1H NMR: () 7,23 (10H, Ph), 4,46 (4H, s, CH2Ph), 4,13 (4H, s, CH2O) ppm.
6-(3-benziloksi-2-benziloksimetil-2-hidroksipropil)-5-metil-2,4-dimetoksipirimidin
(61)122
Spoj 58 (8,5 g; 0,05 mol) je otopljen u tetrahidrofuranu (THF; 100 ml). Pri temperaturi −71
°C dokapan je litijev diizopropilamid (LDA; 51 ml; 0,13 mol) u atmosferi argona. Miješanje
je nastavljeno tijekom pola sata na temperaturi −55 °C. U reakcijsku smjesu je dodana otopina
1,3-bis(benziloksi)propan-2-ona (60; 13,3 g; 0,06 mol) u THF-u (50 ml) i miješanje je
nastavljeno 4 sata na temperaturi −55 °C nakon čega je reakcijska smjesa miješana preko noći
na sobnoj temperaturi. Reakcijska smjesa je potom zakiseljena s octenom kiselinom (4 ml).
Otapalo je upareno, a ostatak od uparavanja otopljen u etil-acetatu (100 ml) i ekstrahiran s
vodom (2 x 100 ml). Organski sloj sušen je iznad bezvodnog MgSO4, otapalo je nakon
filtriranja upareno, a ostatak od uparavanja pročišćen kolonskom kromatografijom (n-heksan :
etil-acetat = 4 : 1). Izoliran je spoj 61 kao žuto ulje (5,0 g; 23 %). 1H NMR: () 7,30−7,28 (10H, m, Ph), 5,09 (1H, s, OH), 4,48 (4H, s, CH2Ph), 3,87 (4H, s,
H-3'), 3,76 (3H, s, OCH3), 3,44 (3H, s, OCH3), 2,83 (2H, s, H-1'), 1,99 (3H, s, CH3-5) ppm.
6-(3-benziloksi-2-benziloksimetil-2-hidroksipropil)-1,5-dimetil-4-metoksipirimidin-2-on
(62)107
Reakcijska smjesa suhog spoja 61 (5,0 g; 0,01 mol) u metil-jodidu (50 ml) miješana je
četiri dana pri temperaturi 52 °C. Metil-jodid je uparen, a nastali produkt pročišćen
117
EKSPERIMENTALNI DIO
kromatografijom na koloni (diklormetan : metanol = 20 : 1). Izoliran je bijeli kristalinični spoj
62 (3,3 g; 66 %; t.t. = 105−108 °C). MS (ESI): m/z = 439,2 ([M+H]+). 1H NMR: () 7,307,32 (10H, m, Ph), 5,02 (1H, s, OH), 4,52 (4H, s, CH2Ph), 3,81 (3H, s,
OCH3), 3,45 (4H, s, H-3'), 3,41 (3H, s, CH3-N), 2,99 (2H, s, H-1'), 1,90 (3H, s, CH3-5) ppm. 13C NMR: () 168,8 (C-4), 156,2 (C-2), 153,7 (C-6), 138,2 (Cq-Ph), 128,3 (CH-Ph), 127,4
(CH-Ph), 102,5 (C-5), 74,5 (C-2'), 72,5 (C-3', CH2Ph), 53,6 (OCH3) 33,7 (CH3-N), 32,5 (C-
1'), 11,0 (CH3) ppm.
6-[2,3-dihidroksi-2-(hidroksimetil)propil]-1,5-dimetilpirimidin-2,4-dion (63)107
U otopinu spoja 62 (3,3 g; 7,56 mmol) u diklormetanu (80 ml) u atmosferi dušika i pri
temperaturi −70 °C dokapan je BCl3 (23 ml; 1 M u diklormetanu) te je reakcijska smjesa
miješana 3,5 h na −40 °C. Reakcija je prekinuta dodatkom diklormetana i metanola (60 ml; 1 :
1). Nakon pročišćavanja kolonskom kromatografijom (diklormetan : metanol = 10 : 1)
izoliran je žuti kristalinični spoj 63 (1,0 g; 54 %; t.t. = 144−147 °C). MS (ESI): m/z = 245,1
([M+H]+). 1H NMR: () 11,33 (1H, s, NH), 4,75 (2H, t, OH, J = 5,4 Hz), 4,43 (1H, s, OH), unutar
signala za vodu (H-3'), 3,39 (3H, s, CH3-N), 2,83 (2H, s, H-1'), 1,86 (3H, s, CH3-5) ppm. 13C
NMR: () 163,8 (C-4), 151,9 (C-2), 150,5 (C-6), 109,2 (C-5), 76,2 (C-3'), 64,8 (C-2'), 32,7
(CH3-N), 32,2 (C-1'), 12,5 (CH3-5) ppm.
6-(3-acetoksi-2-acetoksimetil-2-hidroksipropil)-1,5-dimetilpirimidin-2,4-dion (64)107
Reakcijska smjesa spoja 63 (165,0 mg; 0,67 mmol), piridina (1 ml) i acetanhidrida (0,14
ml; 1,43 mmol) je miješana na sobnoj temperaturi 1 h te prekinuta dodatkom vode (0,5 ml).
Otapalo je upareno. Nakon kolonske kromatografije ostatka od uparavanja (diklormetan :
metanol = 10 : 1) izoliran je bijeli kristalinični spoj 64 (167,0 mg; 77 %; t.t = 196−198 °C).
MS (ESI): m/z = 329,1 ([M+H]+). 1H NMR: () 11,31 (1H, s, NH), 5,45 (1H, s, OH), 4,03 (d, 2H, H-3', J = 11,2 Hz), 3,91
(2H, d, H-3', J = 11,6 Hz), 3,39 (3H, s, CH3-N), 2,95 (2H, s, H-1'), 2,04 (s, 6H, COCH3), 1,81
(3H, s, CH3-5) ppm. 13C NMR: () 170,5 (COCH3), 163,8 (C-4), 151,8 (C-2), 148,8 (C-6),
95,3 (C-5), 73,1 (C-3'), 66,2 (C-2'), 33,5 (C-1'), 32,8 (CH3-N), 21,0 (COCH3), 12,5 (CH3-5)
ppm.
118
EKSPERIMENTALNI DIO
6-(3-acetoksi-2-acetoksimetil-2-fluorpropil)-1,5-dimetilpirimidin-2,4-dion (65) i 6-[3-
acetoksi-2-(acetoksimetil)propenil]-1,5-dimetilpirimidin-2,4-dion (66)107
Otopini spoja 64 (600,0 mg; 1,82 mmol) u diklormetanu (200 ml) ohlađenoj na −75 °C
dodan je DAST (3 ml; 0,02 mol) u atmosferi argona. Reakcijska smjesa je miješana 4 sata na
temperaturi je −40 °C, a potom je miješana preko noći na sobnoj temperaturi. U reakcijsku
smjesu je dodan metanol (10 ml) i otapalo je upareno. Ostatak od uparavanja je pročišćen
kolonskom kromatografijom (diklormetan : metanol = 10 : 1) pri čemu su izolirani spojevi 65
i 66 (299 mg, prema omjeru iz 1H NMR spektra, 24 % za 65 i 27 % za 66).
65: MS (ESI): m/z = 331,2 ([M+H]+); 1H NMR: () 11,33 (1H, s, NH), 4,28 (2H, d, H-3',
JHF = 19,0 Hz), 3,91 (2H, d, H-3', JHF = 11,6 Hz), 3,33 (3H, s, CH3-N), 3,26 (2H, d, H-1', JHF
= 7,5 Hz), 2,05 (6H, s, COCH3), 1,84 (3H, s, CH3-5) ppm. 13C NMR: () 170,2 (COCH3),
163,6 (C-4), 151,7 (C-2), 146,8 (C-6), 110,5 (C-5), 95,8 (d, C-2', JCF = 184,5 Hz), 64,1 (d, C-
3', JCF = 24,4 Hz), 32,5 (CH3-N), 32,0 (d, C-1', JCF = 20,3 Hz), 20,8 (COCH3), 12,6 (CH3-5)
ppm.
66: MS (ESI): m/z = 311,2 ([M+H]+); 1H NMR: () 11,30 (1H, s, NH). 6,42 (1H, s, H-1'),
4,74 (2H, s, H-3'), 4,60 (1H, d, H-3', J = 12,9 Hz), 4,43 (1H, d, H-3', J = 13,5 Hz), 3,09 (3H,
s, CH3-N), 2,10 (3H, s, COCH3), 1,97 (3H, s, COCH3), 1,64 (3H, s, CH3-5) ppm. 13C NMR:
() 170,5 (COCH3), 170,4 (COCH3), 163,8 (C-4), 151,4 (C-2), 147,0 (C-6), 138,0 (C-2'),
122,3 (C-1'), 107,6 (C-5), 64,1 (C-3'), 60,9 (C-3'), 32,1 (CH3-N), 21,1 (COCH3), 20,8
(COCH3), 11,9 (CH3-5) ppm.
6-[3-hidroksi-2-(hidroksimetil)propenil]-1,5-dimetilpirimidin-2,4-dion (67)107
Otopini natrija (4,0 mg, 0,17 mol) u metanolu (2 ml) dodana je smjesa spojeva 65 i 66 (13
mg; 0,04 mmol). Reakcijska smjesa je refluksirana 1,5 h na temperaturi 100 °C. Otapalo je
upareno, a ostatak od uparavanja je pročišćen kromatografijom na koloni (diklormetan :
metanol = 5 : 1). Izoliran je žuti praškasti spoj 67 (5,0 mg, 56 %; t.t. = 144−147 °C). MS
(ESI): m/z = 227,2 ([M+H]+). 1H NMR: () 11,23 (1H, s, NH), 6,10 (1H, s, H-1'), 5,16 (1H, t, OH, J = 5,6 Hz), 4,90 (1H,
t, OH, J = 5,5 Hz), 4,15 (2H, d, H-3', J = 5,3 Hz), 3,85 (1H, dd, H-3', J = 12,7 Hz, J = 5,3
Hz), 3,81 (1H, dd, H-3', J = 12,7 Hz, J = 5,8 Hz), 3,39 (3H, s, CH3-N), 1,65 (3H, s, CH3-5)
ppm. 13C NMR: () 163,4 (C-4), 151,2 (C-2), 148,6 (C-2'), 148,6 (C-6), 114,4 (C-1'), 106,7
(C-5), 61,3 (C-3'), 58,2 (C-3'), 31,8 (CH3-N), 11,7 (CH3-5) ppm.
119
EKSPERIMENTALNI DIO
6-[3-hidroksi-2-[(4-metoksitrifenilmetil)oksimetil]propenil]-1,5-dimetilpirimidin-2,4-
dion (68)
Hladnoj otopini spoja 67 (53,0 mg; 0,23 mmol) u DMF-u (2 ml) i Et3N-u (0,1 ml) u
atmosferi argona dodan je usitnjeni 4-dimetilaminopiridina (DMAP; 0,5 mg; 4,2 x 10-3 mmol).
Reakcijska smjesa je miješana 15 min pri 0 ºC i dodan je metoksitritil-klorid (MTrCl; 158,5
mg; 0,51 mmol). Miješanje je nastavljeno tijekom 3 sata na sobnoj temperaturi. Reakcija je
prekinuta dodatkom metanola (10 ml) i otapalo je upareno. Ostatak od uparavanja je
pročišćen kolonskom kromatografijom (diklormetan : metanol = 10 : 1) pri čemu je izoliran
bijeli kristalinični spoj 68 (60,0 mg; 52 %; t.t. = 172–174 ºC). MS (ESI): m/z = 499,1
([M+H]+).
Z-68: 1H NMR: () 11,19 (1H, s, NH), 7,446,84 (14H, m, Ph), 6,25 (1H, s, H-1'), 5,23
(1H, dd, OH-b, J = 5,9 Hz, J = 5,5 Hz), 4,22 (1H, dd, H-3'b, J = 15,3 Hz, J = 5,5 Hz), 4,17
(1H, dd, H-3'b, J = 15,3 Hz, J = 5,9 Hz), 3,73 (3H, s, OCH3), 3,35 (H-3'a, pomak je doznat iz
spektra HSQC), 3,11 (3H, s, CH3-N), 1,44 (3H, s, CH3-5) ppm. 13C NMR: () 163,2 (C-4),
158,2 (Cq-MTr), 150,9 (C-2), 148,1 (C-6), 143,5145,3 (Cq-MTr), 134,5 (Cq-MTr),
126,5129,9 (CH-MTr), 117,0 (C-1'), 113,1 (CH-MTr), 106,5 (C-5), 86,0 (C-4'), 62,1 (C-3'b),
60,1 (C-3'a), 55,0 (OCH3-Ph-4'), 31,7 (CH3-N), 11,5 (CH3-5) ppm.
E-68: 1H NMR: () 11,27 (1H, s, NH), 7,446,84 (14H, m, Ph), 6,47 (1H, s, H-1'), 4,81
(1H, t, OH-b, J = 5,5 Hz), 3,75 (3H, s, OCH3), 3,18 (3H, s, CH3-N), 1,68 (3H, s, CH3-5) ppm,
signali za H-3'a i H-3'b se nisu mogli jednoznačno odrediti zbog preklapanja signala. 13C NMR: () 163,4 (C-4), 157,8158,3 (Cq-MTr), 151,0 (C-2), 148,0148,1 (C-6),
143,5145,3 (Cq-MTr) 135,1 (Cq-MTr), 126,5129,9 (CH-MTr), 115,6 (C-1'), 112,8113,3
(CH-MTr), 106,9 (C-5), 86,3 (C-4'), 63,7 (C-3'b), 58,4 (C-3'a), 55,0 (OCH3-Ph-4'), 31,8 (CH3-
N), 11,6 (CH3-5) ppm.
120
EKSPERIMENTALNI DIO
6-(2-fluormetil-3-hidroksipropenil)-1,5-dimetilpirimidin-2,4-dion (69) i 6-[3-fluor-2-
(fluormetil)propenil]-1,5-dimetilpirimidin-2,4-dion (70)
Otopina spoja 68 (60,0 mg; 0,12 mmol) u diklormetanu (25 ml) je ohlađena na –75 ºC i
dodan je DAST (0,08 ml; 0,61 mmol) u atmosferi argona. Reakcijska smjesa je miješana na
sobnoj temperaturi 2 h, a potom je dodan metanol (5 ml) i otapalo je upareno. Ostatak od
uparavanja je otopljen u 5 % HCl u metanolu (4 ml) i refluksiran 15 min. Nakon uparavanja,
reakcijska smjesa je pročišćena kolonskom kromatografijom (diklormetan : metanol = 20 : 1) i
izolirani su kristalinični spojevi 69 (6,5 mg; 24 %; t.t. = 152–154ºC) i 70 (9,2 mg; 36 %; t.t. =
233–235 ºC).
69: MS (ESI): m/z = 229,2 ([M+H]+);
Z-69: 1H NMR: () 11,28 ili 11,30 (1H, s, NH), 6,37 (1H, s, H-1'), 5,31 (1H, t, OH-b, J =
5,3 Hz), 4,84 (1H, dd, H-3'a, JHF = 46,8 Hz, JHH = 11,4 Hz), 4,87 (1H, dd, H-3'a, JHF = 46,8
Hz, JHH = 11,4 Hz), 4,204,16 (2H, m, H-3'b), 3,10 (3H, s, CH3-N), 1,65 (3H, s, CH3-5) ppm. 13C NMR: () 163,3 (C-4), 151,0 (C-2), C-6 signal izomera Z-69 i E-69 se ne može
jednoznačno pripisati: 147,1 (d, JCF = 1,5 Hz); 147,0 (s), 143,4 (d, C-2', JCF = 14,5 Hz), 118,7
(d, C-1', JCF = 8,4 Hz), 107,0 (C-5), 79,6 (d, C-3'a, JCF = 160,2 Hz), 60,7 (C-3'b), 31,8 (CH3-
N), 11,6 (CH3-5) ppm. 19F NMR: () 221,0 (m, C-3'aF, J = 46,8 Hz, J = 2,1 Hz) ppm.
E-69: 1H NMR: () 11,28 ili 11,30 (1H, s, NH), 6,27 (1H, s, H-1'), 5,04 (1H, t, OH-b, J =
5,1 Hz), 5,10 (1H, dd, JHF = 46,8 Hz, H-3'a, JHH = 12,2 Hz), 5,14 (1H, dd, H-3'a, JHF = 46,8
Hz, JHH = 12,2 Hz), 3,953,87 (2H, m, H-3'b), 3,13 (3H, s, CH3-N), 1,65 (3H, s, CH3-5) ppm. 13C NMR: () 163,4 (C-4), 151,0 (C-2), C-6 signal izomera Z-69 i E-69 se ne može
jednoznačno pripisati: 147,1 (d, JCF = 1,5 Hz); 147,0 (s), 143,2 (d, C-2', JCF = 13,0 Hz), 118,1
(d, C-1', JCF = 12,2 Hz), 107,0 (C-5), 82,7 (d, C-3'a, JCF = 166,3 Hz), 57,4 (C-3'b), 31,7
(CH3-N), 11,5 (CH3-5) ppm. 19F NMR: () 219,3 (m, C-3'aF, J = 46,8 Hz, J = 2,9 Hz) ppm.
70: MS (ESI): m/z = 231 ([M+H]+); 1H NMR: () 11,35 (1H, s, NH), 6,58 (1H, s, H-1'), 5,17 (2H, d, H-3'b, JHF = 46,4 Hz),
5,074,83 (2H, m, H-3'a), 3,11 (3H, s, CH3-N), 1,65 (3H, s, CH3-5) ppm. 13C NMR: () 163,3
(C-4), 150,9 (C-2), 145,7 (m, C-6), 138,0 (dd, C-2', JCF = 15,1 Hz, J = 14,0 Hz), 123,0 (dd, C-
1', JCF = 11,4 Hz, JCF = 7,6 Hz), 107,3 (C-5), 82,1 (dd, C-3'b, JCF = 166,3 Hz, JCF = 3,4 Hz),
79,0 (dd, C-3'a, JCF = 161,0 Hz, J = 2,7 Hz), 31,7 (CH3-N), 11,5 (CH3-5) ppm. 19F NMR: ()
222,2; 218,5 (m, C-3'aF, C-3'bF, J = 46,4 Hz, J = 2,1 Hz, m, J = 46,4 Hz, J = 2,8 Hz) ppm.
121
EKSPERIMENTALNI DIO
6-[3-metansulfoniloksi-2-[(4-metoksitrifenilmetil)oksimetil]propenil]-1,5-
dimetilpirimidin-2,4-dion (71) i 6-(2-hidroksimetil-3-klorpropenil)-1,5-dimetilpirimidin-
2,4-dion (72)
Hladnoj otopini spoja 68 (10,0 mg; 0,02 mmol) u bezvodnom piridinu (0,3 ml) dodan je
metansulfonil-klorid (0,05 ml; 0,65 mmol) u atmosferi argona. Reakcijska smjesa je miješana
1 h na –8 ºC. Miješanje je nastavljeno tijekom 2 h na 0 ºC nakon čega je dodana smjesa
metanol i voda (1 ml; 1 : 1). Otapalo je upareno, a ostatak od uparavanja je pročišćen
kolonskom kromatografijom (diklormetan : metanol = 20 : 1) pri čemu su izolirani uljasti
spojevi 71 (3,0 mg; 26 %) i 72 (3,0 mg; 50 %).
71: MS (ESI): m/z = 577,1 ([M+H]+);
Z-71: 1H NMR: () 11,33 (1H, s, NH), 7,456,84 (14H, m, Ph), 6,66 (1H, s, H-1'), 4,57
(1H, d, H-3'b, J = 11,5 Hz), 4,50 (1H, d, H-3'b, J = 11,4 Hz), 3,53 (1H, d, H-3'a, J = 11,6
Hz), 3,45 (1H, d, H-3'a, J = 11,5 Hz), 3,76 (3H, s, OCH3), 3,19 (3H, s, CH3-N), 3,09 (3H, s,
CH3-Ms), 1,69 (3H, s, CH3-5) ppm. 13C NMR: () 163,5 (C-4), 158,7 (Cq-MTr), 151,2 (C-2),
149,6 (C-6), 144,3144,6 (Cq-MTr), 134,8 (Cq-MTr), 127,5130,4 (CH-MTr), 121,0 (C-1'),
113,9 (CH-MTr), 105,3 (C-5), 86,1 (C-4'), 70,2 (C-3'b), 60,0 (C-3'a), 55,6 (OCH3-Ph-4'), 38,7
(CH3-Ms), 32,1 (CH3-N), 11,7 (CH3-5) ppm.
E-71: 1H NMR: () 11,27 (1H, s, NH), 7,456,84 (14H, m, Ph), 6,57 (1H, s, H-1'), 4,57
(1H, d, H-3'a, J = 11,8 Hz), 4,50 (1H, d, H-3'a, J = 11,5 Hz), 3,53 (1H, d, H-3'b, J = 11,5
Hz), 3,45 (1H, d, H-3'b, J = 11,6 Hz), 3,74 (3H, s, OCH3), 3,14 (3H, s, CH3-N), 3,09 (3H, s,
CH3-Ms), 1,42 (3H, s, CH3-5) ppm. 13C NMR: (), 163,9 (C-4), 158,7 (Cq-MTr), 151,5 (C-2),
149,6 (C-6), 144,3144,6 (Cq-MTr), 135,3 (Cq-MTr), 127,5130,4 (CH-MTr), 121,0 (C-1'),
113,6 (CH-MTr), 107,3 (C-5), 87,1 (C-4'), 65,5 (C-3'a), 63,8 (C-3'b), 55,5 (OCH3-Ph-4'), 38,7
(CH3-Ms), 32,2 (CH3-N), 12,2 (CH3-5) ppm.
72: MS (ESI): m/z = 247,2 ([M+H]+).
Z-72: 1H NMR: () 11,31 ili 11,30 (1H, s, NH), 6,36 (1H, s, H-1'), 5,35 (1H, t, OH-b, J =
5,7 Hz), 4,47 (1H, d, H-3'a, J = 12,1 Hz), 4,40 (1H, d, H-3'a, J = 11,7 Hz), 4,124,11 (2H, m,
H-3'b), 3,10 (3H, s, CH3-N), 1,67 (3H, s, CH3-5) ppm.
E-72:1H NMR: 11,31 ili 11,30 (1H, s, NH), 6,43 (1H, s, H-1'), 5,01 (1H, t, OH-b, J = 6,0
Hz), 4,214,19 (2H, m, H-3'b), 3,943,92 (2H, m, H-3'a), 3,11 (3H, s, CH3-N), 1,64 (3H, s,
CH3-5) ppm.
122
EKSPERIMENTALNI DIO
6-(2-acetoksimetil-3-hidroksipropenil)-1,5-dimetilpirimidin-2,4-dion (73) i 6-[3-acetoksi-
2-(acetoksimetil)propenil]-1,5-dimetilpirimidin-2,4-dion (74)
Suspenziji spoja 67 (76,0 mg; 0,33 mmol) u acetonitrilu (5 ml) dodani su DMAP (3,0 mg;
0,03 mmol), Et3N (0,1 ml; 0,65 mmol) te acetanhidrid (0,1 ml; 1,07 mmol). Reakcijska
smjesa je miješana 45 min na sobnoj temperaturi. Reakcija je prekinuta dodatkom vode (0,5
ml) i uparena do suhog. Pročišćavanjem ostataka od uparavanja kolonskom kromatografijom
(diklormetan : metanol = 10 : 1) izolirani su uljasti spojevi 73 (6,0 mg; 47 %) i 74 (4,0 mg; 26
%).
73: MS (ESI): m/z = 269,1 ([M+H]+);
Z-73: 1H NMR: () 11,28 (1H, s, NH), 6,32 (1H, s, H-1'), 5,27 (1H, t, OH-b, J = 5,7 Hz),
4,55 (1H, d, H-3'a, J = 12,8 Hz), 4,38 (1H, d, H-3'a, J = 12,5 Hz), 4,124,10 (2H, m, H-3'b),
3,10 (3H, s, CH3-N), 2,10 (3H, s, COCH3), 1,65 (3H, s, CH3-5) ppm. 13C NMR: () 170,5
(COCH3), 163,9 (C-4), 151,5 (C-2), 147,8 (C-6), 143,3 (C-2'), 117,9 (C-1'), 107,4 (C-5), 61,7
(C-3'b), 61,1 (C-3'a), 32,2 (CH3-N), 20,8 (COCH3), 12,0 (CH3-5) ppm.
E-73: 1H NMR: () 11,28 (1H, s, NH), 6,14 (1H, s, H-1'), 5,01 (1H, t, OH-b, J = 5,5 Hz),
signal za H-3'a protone se nije mogao jednoznačno odrediti, 3,903,85 (2H, m, H-3'b), 3,10
(3H, s, CH3-N), 1,95 (3H, s, COCH3), 1,63 (3H, s, CH3-5) ppm. 13C NMR: () 170,6
(COCH3), 163,9 (C-4), 151,5 (C-2), 148,2 (C-6), 143,8 (C-2'), 118,4 (C-1'), 107,5 (C-5), 64,1
(C-3'b), 58,6 (C-3'a), 32,2 (CH3-N), 21,2 (COCH3), 12,1 (CH3-5) ppm.
74: MS (ESI): m/z = 311 ([M+H]+); 1H NMR: () 11,33 (1H, s, NH), 6,42 (1H, s, H-1'),
4,73 (2H, s, H-3'b), 4,60 (1H, d, H-3'a, J = 13,3 Hz), 4,42 (1H, d, H-3'a, J = 13,1 Hz), 3,09
(3H, s, CH3-N), 1,97 (3H, s, COCH3), 2,10 (3H, s, COCH3), 1,63 (3H, s, CH3-5) ppm. 13C
NMR: () 170,5170,4 (COCH3), 163,8 (C-4), 151,4 (C-2), 147,0 (C-6), 138,0 (C-2'), 122,2
(C-1'), 107,6 (C-5), 64,1 (C-3'b), 60,9 (C-3'a), 32,1 (CH3-N), 21,1 (COCH3), 20,8 (COCH3),
12,0 (CH3-5) ppm.
6-[2-acetoksimetil-3-(metansulfoniloksi)propenil]-1,5-dimetilpirimidin-2,4-dion (75)
Hladnoj suspenziji spoja 73 (11,0 mg; 0,04 mmol) u piridinu (0,3 ml) dodan je MsCl (0,15
ml; 1,94 mmol) u atmosferi argona. Reakcija je miješana 4 h na –5 ºC te prekinuta dodatkom
metanola i vode (5 ml; 1 : 1). Otapalo je upareno, a ostatak od uparavanja je pročišćen
kolonskom kromatografijom (diklormetan : metanol = 20 : 1) pri čemu je izoliran uljasti spoj
75 (3,0 mg; 55 %).
75: MS (ESI): m/z = 347,2 ([M+H]+);
123
EKSPERIMENTALNI DIO
Z-75: 1H NMR: () 11,33 (1H, s, NH), 6,24 (1H, s, H-1'), 3,953,88 (2H, m, H-3'b),
3,413,38 (2H, m, H-3'a), 3,28 (3H, s, CH3-N), 2,95 (3H, s, CH3-Ms), 2,16 (3H, s, COCH3),
1,83 (3H, s, CH3-5) ppm. 13C NMR: () 165,8 (COCH3), 162,9 (C-4), 152,5 (C-2), 147,2 (C-
6), 139,7 (C-2'), 123,1 (C-1'), 105,4 (C-5), 73,5 (C-3'a), 60,3 (C-3'b), 32,4 (CH3-Ms), 31,0
(CH3-N), 20,5 (COCH3), 11,7 (CH3-5) ppm.
E-75: 1H NMR: () 11,33 (1H, s, NH), 6,14 (1H, s, H-1'), 4,043,97 (2H, m, H-3'b),
3,553,52 (2H, m, H-3'a), 3,27 (3H, s, CH3-N), 3,09 (3H, s, CH3-Ms), 2,00 (3H, s, COCH3),
1,84 (3H, s, CH3-5) ppm. 13C NMR: () 165,8 (COCH3), 162,9 (C-4), 152,5 (C-2), 147,3 (C-
6), 139,5 (C-2'), 121,9 (C-1'), 105,5 (C-5), 73,5 (C-3'a), 63,8 (C-3'b), 32,4 (CH3-Ms), 31,0
(CH3-N), 20,8 (COCH3), 12,0 (CH3-5) ppm.
5-(furan-2-il)pirimidin-2,4-dion (76)
Reakcijska smjesa 5-joduracila (300,0 mg; 1,26 mmol), katalizatora
bis(trifenilfosfin)paladijev(II) diklorid ((Ph3P)2PdCl2; 97,0 mg; 0,14 mmol) i 2-
(tributilstanil)furana (3 ml; 9,56 mmol) u THF-u (25 ml) zagrijavana je 3 sata na temperaturi
refluksa (85 °C). Nakon hlađenja na sobnu temperaturu, reakcijskoj smjesi je dodan KF i
miješanje je nastavljeno tijekom 2 h. Krutina je odfiltrirana, a otapalo je upareno uz sniženi
tlak. Zaostalo crno ulje je pročišćeno kromatografijom na koloni (diklormetan : metanol = 20 :
1) pri čemu je izoliran bijeli praškasti spoj 76 (139,1 mg; 62 %). 1H NMR: (δ) 11,37 (1H, s, NH), 11,20 (1H, s, NH), 7,70 (1H, s, H-6), 7,65–7,60 (1H, m,
H-5'), 6,82 (1H, d, H-3', J = 3,2 Hz), 6,50 (1H, dd, H-4', J = 3,3 Hz, J = 1,9 Hz) ppm. 13C
NMR: (δ) 161,6 (C-4), 150,8 (C-2), 147,2 (C-2'), 141,7 (C-6), 136,7 (C-5'), 112,0 (C-4'),
107,8 (C-3'), 104,9 (C-5) ppm.
5-(furan-2-il)-N-1-[4-hidroksi-3-(hidroksimetil)butil]pirimidin-2,4-dion (77) i 5-(furan-2-
il)-N,N-1,3-bis[4-hidroksi-3-(hidroksimetil)butil]pirimidin-2,4-dion (78)
Otopini spoja 76 (195,0 mg; 0,57 mmol) u DMF-u (11 ml) dodan je K2CO3 (113,7 mg;
0,57 mmol) u atmosferi argona, a nakon pola sata dokapan je spoj 18 (258,0 mg; 0,82 mmol)
te je miješanje nastavljeno 2 h. Otapalo je upareno pri sniženom tlaku, a ostatak od
uparavanja pročišćen kromatografijom na koloni (diklormetan : metanol = 20 : 1). Izolirani su
praškasti spoj 77 (27,6 mg; 14 %; t.t. = 200−203 °C) i uljasti spoj 78 (13,3 mg; 7 %).
77: MS (ESI): m/z = 281,2 ([M+H]+); 1H NMR: (δ) 11,54 (1H, s, NH), 8,08 (1H, s, H-6),
7,66 (1H, d, H-5', J = 1,1 Hz), 6,86 (1H, d, H-3', J = 3,3 Hz), 6,54 (1H, dd, H-4', J = 3,3 Hz, J
124
EKSPERIMENTALNI DIO
= 1,8 Hz), 4,42 (2H, t, OH, J = 5,2 Hz), 3,95–3,74 (2H, m, H-1''), 3,44–3,40 (4H, m, H-4''),
1,63 (2H, q, H-2'', J = 6,9 Hz), 1,58–1,47 (1H, m, H-3'') ppm. 13C NMR: (δ) 161,0 (C-4),
150,3 (C-2), 147,0 (C-2'), 140,7 (C-6), 136,3 (C-5'), 112,5 (C-4'), 108,2 (C-3'), 107,8 (C-5),
61,9 (C-4''), 46,6 (C-1''), 41,3 (C-3''), 28,5 (C-2'') ppm.
78: MS (ESI): m/z = 383,2 ([M+H]+); 1H NMR: (δ) 8,13 (1H, s, H-6), 7,67 (1H, d, H-5', J
= 1,1 Hz), 6,91 (1H, d, H-3', J = 3,1 Hz), 6,55 (1H, dd, H-4', J = 3,2 Hz, J = 1,9 Hz), 4,43
(2H, t, OH, J = 5,2 Hz), 4,35 (2H, t, OH, J = 5,0 Hz), 3,97–3,90 (4H, m, H-1''), 3,49–3,36
(8H, m, H-4''), 1,69–1,60 (2H, m, H-3''), 1,60–1,43 (4H, m, H-2'') ppm. 13C NMR: (δ) 159,3
(C-4), 149,7 (C-2), 146,5 (C-2'), 141,4 (C-6), 138,4 (C-5'), 111,6 (C-4'), 107,8 (C-3'), 104,2
(C-5), 61,5 (C-4''), 61,4 (C-4''), 47,7 (C-1''), 41,3 (C-3''), 40,7 (C-3''), 27,7 (C-2''), 26,2 (C-2'')
ppm.
3-benzoilpirimidin-2,4-dion (79)
Reakcijska smjesa uracila (4,5 g; 40,0 mmol), benzoil-klorida (10,4 ml; 89,6 mmol),
acetonitrila (40 ml) i piridina (16 ml) miješana je 24 h na sobnoj temperaturi. Otapalo je
upareno, a u ostatak od uparavanja dodan je diklormetan i voda (150 ml; 1 : 1) pri čemu je
iskristalizirao bijeli sirasti talog koji je odfiltriran. Dobiveni talog je prekristaliziran u smjesi
otapala aceton/voda (1 : 1). Dobiven je bijeli kristalinični spoj 79 (7,4 g; 85 %; t.t. = 218–221
°C). 1H NMR: (δ) 11,57 (1H, s, NH), 7,98–7,92 (2H, m, Ph-2'''), 7,82–7,74 (1H, m, Ph-4'''),
7,65 (1H, d, H-6, J = 7,7 Hz), 7,60 (2H, t, Ph-3''', J = 7,7 Hz), 5,73 (1H, d, H-5, J = 7,7 Hz)
ppm.
3-benzoil-5-jodpirimidin-2,4-dion (80)
U reakcijsku smjesu spoja 79 (2,2 g; 10,28 mmol) u acetonitrilu (102 ml) dodan je jod (1,6
g; 10,28 mmol) i amonijev cerijev(IV) nitrat (CAN; 3,4 g; 10,28 mmol). Reakcijska smjesa je
zagrijavana na temperaturi refluksa 2 sata. Otapalo je upareno, a dobiveni produkti
ekstrahirani su etil-acetatom (150 ml) i vodom (100 ml) te zasićenom otopinom Na2SO3 (100
ml). Organski sloj je sušen iznad bezvodnog MgSO4. Nakon filtriranja, izoliran je bijeli
kristalinični spoj 80 (1,9 g; 55 %; t.t. = 209−211 °C). 1H NMR: (δ) 11,89 (1H, s, NH), 8,13 (1H, s, H-6), 8,00–7,95 (m, 2H, Ph-2'''), 7,79 (1H, t,
Ph-4''', J = 7,4 Hz), 7,60 (2H, t, Ph-3''', J = 7,9 Hz) ppm. 13C NMR: (δ) 170,2 (CO), 161,0 (C-
4), 150,7 (C-2), 148,8 (C-6), 136,5 (Ph-4'''), 131,9 (Ph-1'''), 131,3 (Ph-3'''), 130,4 (Ph-2'''),
67,5 (C-5) ppm.
125
EKSPERIMENTALNI DIO
N-1-[4-acetoksi-3-(acetoksimetil)butil]-N-3-benzoil-5-jodpirimidin-2,4-dion (81)
Otopini spoja 80 (572,8 mg; 1,68 mmol) u DMF-u (8 ml) dodan je K2CO3 (231,5 mg; 1,68
mmol). Reakcijska smjesa je miješana 30 minuta na sobnoj temperaturi i dodan je spoj 18
(684,2 mg; 2,18 mmol) otopljen u DMF-u (2 ml) te je miješanje nastavljeno preko noći.
Otapalo je upareno, a ostatak od uparavanja pročišćen kolonskom kromatografijom
(diklormetan : metanol = 200 : 1) pri čemu je izoliran žuti uljasti spoj 81 (607,0 mg; 67 %). 1H NMR: (δ) 8,48 (1H, s, H-6), 8,04–7,95 (2H, m, Ph-2'''), 7,80 (1H, t, Ph-4''', J = 7,4 Hz),
7,61 (2H, t, Ph-3''', J = 7,8 Hz), 4,04 (4H, d, H-4'', J = 5,7 Hz), 3,91–3,70 (2H, m, H-1''),
2,14–1,95 (7H, m, COCH3, H-3''), 1,72 (2H, q, H-2'', J = 6,8 Hz) ppm. 13C NMR: (δ) 170,3
(COCH3), 168,9 (CO), 159,6 (C-4), 150,7 (C-2), 149,3 (C-6), 135,6 (Ph-4'''), 130,7 (Ph-1'''),
130,4 (Ph-3'''), 129,5 (Ph-2'''), 67,2 (C-4''), 63,6 (C-4''), 46,4 (C-1''), 34,4 (C-3''), 27,3 (C-2''),
20,6 (COCH3).
N-1-[4-acetoksi-3-(acetoksimetil)butil]-N-3-benzoil-5-(tiofen-2-il)pirimidin-2,4-dion (82)
U otopinu spoja 81 (353,1 mg; 0,67 mmol) u toluenu (5 ml) dodani su katalizator
tetrakis(trifenilfosfin)paladij(0) ((PPh3)4Pd; 255,0 mg; 0,22 mmol) te 2-(tributilstanil)tiofen
(0,4 ml; 1,34 mmol) u atmosferi argona. Reakcijska smjesa je refluksirana preko noći, a zatim
je reakcijskoj smjesi dodan KF i miješanje je nastavljeno 2 h na sobnoj temperaturi. Krutina je
odfiltrirana, a otapalo upareno. Ostatak od uparavanja je pročišćen kolonskom
kromatografijom (diklormetan : metanol = 30 : 1) pri čemu je izoliran žuti uljasti spoj 82
(100,0 mg; 30 %). 1H NMR: (δ) 8,48 (1H, s, H-6), 7,90–7,66 (5H, m, Ph-2''', Ph-3''', Ph-4'''), 7,48–7,41 (2H,
m, H-5', H-3'), 7,05 (1H, dd, H-4', J = 5,1 Hz, J = 3,7 Hz), 4,02 (4H, d, H-4'', J = 5,7 Hz),
3,88–3,77 (2H, m, H-1''), 2,06–2,00 (1H, m, H-3''), 2,00 (6H, s, COCH3), 1,71 (2H, q, H-2'', J
= 6,8 Hz). 13C NMR: (δ) 170,3 (COCH3, CO), 161,7 (C-4), 149,9 (C-2), 140,9 (C-6), 133,9
(Ph-4'''), 133,1 (C-2'), 132,0 (Ph-1'''), 131,5 (Ph-3'''), 128,7 (Ph-2'''), 126,3 (C-5'), 125,5 (C-4'),
122,7 (C-3'), 107,8 (C-5), 63,6 (C-1''), 34,4 (C-3''), 27,5 (C-2''), 20,6 (COCH3) ppm.
N-1-[4-hidroksi-3-(hidroksimetil)butil]-5-(tiofen-2-il)pirimidin-2,4-dion (83)
Otopini spoja 82 (95,0 mg; 0,20 mmol) u metanolu (3 ml) dodana je 0,1 M otopina
NaOCH3/CH3OH (0,6 ml). Reakcija je miješana preko noći na sobnoj temperaturi te
neutralizirana dodatkom HCl/CH3OH. Otapalo je upareno, a ostatak od uparavanja je
pročišćen kolonskom kromatografijom (diklormetan : metanol = 10 : 1) pri čemu je izoliran
bijeli kristalinični spoj 83 (15 mg; 25 %; t.t. = 93−96 °C) MS (ESI): m/z = 297,2 ([M+H]+).
126
EKSPERIMENTALNI DIO
1H NMR: (δ) 11,57 (1H, s, NH), 8,26 (1H, s, H-6), 7,48–7,41 (2H, m, H-5', H-3'), 7,06
(1H, dd, H-4', J = 5,1 Hz, J = 3,7 Hz), 4,40 (2H, t, OH, J = 5,2 Hz), 3,89–3,78 (2H, m, H-1''),
3,49–3,35 (4H, m, H-4''), 1,63 (2H, q, H-2'', J = 6,9 Hz), 1,53–1,49 (1H, m, H-3'') ppm.
N-1-[4-acetoksi-3-(acetoksimetil)butil]-N-3-benzoil-5-[(3,5-difluorfenil)etinil]pirimidin-
2,4-dion (84a)
U otopinu spoja 81 (449,6 mg; 0,85 mmol) u toluenu (25 ml) dodani su CuI (34,0 mg; 0,17
mmol), (PPH3)4Pd (98,4 mg; 0,09 mmol), Et3N (0,3 ml; 1,73 mmol) u atmosferi argona
Potom je dokapan 2-(3,5-difluorfenil)etin (0,1 ml; 1,02 mmol). Reakcijska smjesa je miješana
preko noći na sobnoj temperaturi te je potom dodan Amberlit IRA 400 i aktivni ugljen.
Reakcijska smjesa je odfiltrirana, a filtrat uparen. Zaostalo žuto ulje pročišćeno je kolonskom
kromatografijom (diklormetan : metanol = 200 : 1) pri čemu je izoliran bijeli kristalinični spoj
84a (264,2 mg; 58 %; t.t. = 94−96 °C). 1H NMR: (δ) 8,54 (1H, s, H-6), 8,09–7,98 (2H, m, Ph-2'''), 7,81 (1H, t, Ph-4''', J = 7,4 Hz),
7,62 (2H, t, Ph-3''', J = 7,8 Hz), 7,35 (1H, tt, Ph-4', JHF = 9,5 Hz, JHF = 2,3 Hz), 7,25–7,16
(2H, m, Ph-2', Ph-6'), 4,03 (4H, d, H-4'', J = 5,7 Hz), 3,93–3,79 (1H, m, H-1''), 2,07–2,02 (1H,
m, H-3''), 2,00 (6H, s, COCH3), 1,76 (2H, q, H-2'', J = 7,0 Hz) ppm. 13C NMR: (δ) 170,3
(COCH3), 168,7 (CO), 162,3 (dd, Ph-3', Ph-5', JCF = 247,3 Hz, JCF = 14,2 Hz), 160,5 (C-4),
150,6 (C-6), 148,6 (C-2), 135,6 (Ph-4'''), 130,8 (Ph-1'''), 130,5 (Ph-3'''), 129,5 (Ph-2'''), 124,9
(t, Ph-1', JCF = 12,0 Hz), 114,3 (dd, Ph-2', Ph-6', JCF = 21,0 Hz, JCF = 5,9 Hz), 105,1 (t, Ph-4'
JCF = 25,8 Hz), 96,7 (C-5), 90,2 (C-2'), 83,7 (C-1'), 63,6 (C-4''), 46,9 (C-1''), 34,4 (C-3''), 27,3
(C-2''), 20,6 (COCH3) ppm.
N-1-[4-acetoksi-3-(acetoksimetil)butil]-N-3-benzoil-5-[(p-bromfenil)etinil]pirimidin-2,4-
dion (84b)
Spoj 84b sintetiziran je prema postupku opisanom za pripravu spoja 84a. Reagensi: spoj 81
(583,1 mg; 1,10 mmol), CuI (47,3 mg; 0,25 mmol), Et3N (0,3 ml; 2,21 mmol), (PPh3)4Pd
(130,5 mg; 0,11 mmol), 2-(p-bromfenil)etin (316,3 mg; 1,37 mmol), toluen (25 ml). Nakon
kolonske kromatografije (diklormetan : metanol = 200 : 1) izoliran je bijeli kristalinični spoj
84b (267,0 mg; 42 %; t.t. = 64−66 °C). MS (ESI): m/z = 581,1; 583,1 ([M+H]+). 1H NMR: (δ) 8,52 (1H, s, H-6), 8,04 (2H, d, Ph-2''', J = 7,3 Hz), 7,81 (1H, t, Ph-4''', J = 7,4
Hz), 7,61 (4H, t, Ph-3', Ph-3''', J = 7,5 Hz), 7,41 (2H, d, Ph-2', J = 8,5 Hz), 4,03 (4H, d, H-4'',
J = 5,7 Hz), 3,93–3,82 (2H, m, H-1''), 2,11–2,03 (1H, m, H-3''), 2,01 (6H, s, COCH3), 1,75
(2H, q, H-2'', J = 6,9 Hz) ppm. 13C NMR: (δ) 170,9 (COCH3), 169,2 (CO), 161,1 (C-4), 150,4
127
EKSPERIMENTALNI DIO
(C-6), 149,1 (C-2), 136,2 (Ph-4'''), 133,4 (Ph-2'), 132,4 (Ph-3'), 131,3 (Ph-1'''), 131,0 (Ph-3'''),
130,0 (Ph-2'''), 122,7 (Ph-4'), 121,8 (Ph-1'), 97,8 (C-5), 92,0 (C-2'), 83,0 (C-1'), 64,1 (C-4''),
47,3 (C-1''), 34,9 (C-3''), 27,7 (C-2''), 21,1 (COCH3).
N-1-[4-acetoksi-3-(acetoksimetil)butil]-5-(ciklopropiletinil)pirimidin-2,4-dion (84c)
Spoj 84c sintetiziran je prema postupku za pripravu spoja 84a. Reagensi: spoj 81 (447,3
mg; 0,85 mmol), CuI (36,0 mg; 0,19 mmol), Et3N (0,3 ml; 1,73 mmol), (PPh3)4Pd (99,5 mg;
0,09 mmol), 2-ciklopropiletin (0,1 ml; 1,02 mmol), toluen (25 ml). Nakon kolonske
kromatografije (diklormetan : metanol = 200 : 1) izoliran je bijeli kristalinični spoj 84c (279,6
mg; 71 %; t.t. = 107−110 °C). 1H NMR: (δ) 8,25 (1H, s, H-6), 8,03–7,95 (2H, m, Ph-2'''), 7,79 (1H, t, Ph-4''', J = 7,4 Hz),
7,60 (2H, t, Ph-3''', J = 7,8 Hz), 4,01 (4H, d, H-4'', J = 5,7 Hz), 3,87–3,74 (2H, m, H-1''),
2,09–2,01 (1H, m, H-3''), 2,00 (6H, s, COCH3), 1,71 (2H, q, H-2'', J = 6,9 Hz), 1,51 (1H, tt,
H-3', J = 8,2 Hz, J = 5,0 Hz), 0,91–0,83 (2H, m, H-4', H-5'), 0,69–0,62 (2H, m, H-4', H-5')
ppm. 13C NMR: (δ) 170,8 (COCH3), 169,4 (CO), 161,6 (C-4), 149,4 (C-6), 149,1 (C-2), 136,0
(Ph-4'''), 131,4 (Ph-1'''), 130,9 (Ph-3'''), 129,9 (Ph-2'''), 98,7 (C-5), 97,7 (C-2'), 67,4 (C-1'),
64,1 (C-4''), 47,0 (C-1''), 35,0 (C-3''), 27,7 (C-2''), 21,1 (COCH3), 8,8 (C-4', C-5'), 0,3 (C-3')
ppm.
N-1-[4-acetoksi-3-(acetoksimetil)butil]-N-3-benzoil-5-[(p-pentilfenil)etinil]pirimidin-2,4-
dion (84d)
Spoj 84d sintetiziran je prema postupku opisanom za pripravu spoja 84a. Reagensi: spoj 81
(446,6 mg; 0,85 mmol), CuI (33,8 mg; 0,18 mmol), Et3N (0,3 ml; 1,73 mmol), (PPh3)4Pd
(97,9 mg; 0,08 mmol), 2-(4-pentilfenil)etin (0,2 ml; 1,02 mmol), toluen (25 ml). Nakon
kolonske kromatografije (diklormetan : metanol = 200 : 1) izoliran je bezbojni uljasti spoj 84d
(393,7 mg; 81 %). 1H NMR: (δ) 8,48 (1H, s, H-6), 8,05 (2H, dd, Ph-2''', J = 7,9 Hz, J = 0,6 Hz), 7,81 (1H, t,
Ph-4''', J = 7,4 Hz), 7,62 (2H, t, Ph-3''', J = 7,8 Hz), 7,37 (2H, d, Ph-2', J = 8,1 Hz), 7,24 (2H,
d, Ph-3', J = 8,2 Hz), 4,03 (4H, d, H-4'', J = 5,6 Hz), 3,92–3,81 (2H, m, H-1''), 2,65–2,53 (2H,
m, H-3'), 2,04–2,02 (1H, m, H-3''), 2,00 (6H, s, COCH3), 1,75 (2H, q, H-2'', J = 7,0 Hz),
1,62–1,50 (2H, m, H-4'), 1,36–1,21 (4H, m, H-5', H-6'), 0,85 (3H, t, CH3-7', J = 6,9 Hz) ppm. 13C NMR: (δ) 170,3 (COCH3), 168,8 (CO), 160,7 (C-4), 149,4 (C-6), 148,6 (C-2), 143,5 (Ph-
4'), 135,6 (Ph-4'''), 131,0 (Ph-3'''), 130,9 (Ph-1'''), 130,5 (Ph-2'), 129,5 (Ph-3'), 128,7 (Ph-2'''),
128
EKSPERIMENTALNI DIO
119,3 (Ph-1'), 97,7 (C-5), 92,8 (C-2'), 80,6 (C-1'), 63,6 (C-4''), 46,7 (C-1''), 34,9 (C-3'), 34,4
(C-3''), 30,8 (CH2), 30,2 (CH2), 27,2 (C-2''), 21,9 (CH2), 20,6 (COCH3), 13,8 (CH3-7') ppm.
N-1-[4-acetoksi-3-(acetoksimetil)butil]-N-3-benzoil-5-(heptinil)pirimidin-2,4-dion (84e)
MetodaA: Spoj 84e sintetiziran je prema postupku opisanom za pripravu spoja 84a.
Reagensi: spoj 81 (137,5 mg; 0,26 mmol); CuI (10,4 mg; 0,05 mmol), Et3N (0,1 ml; 0,55
mmol), (PPh3)4Pd (30,1 mg; 0,03 mmol), heptin (0,04 ml; 0,31 mmol), toluen (5 ml). Nakon
kolonske kromatografije (diklormetan : metanol = 200 : 1) izoliran je bezbojni uljasti spoj 84e
(93,0 mg; 72 %).
Metoda B: Reakcijskoj smjesi spoja 81 (138,2 mg; 0,26 mmol) u toluenu (5ml) dodani su
CuI (10,5 mg; 0,05 mmol), Et3N (0,1 ml; 0,55 mmol), (PPh3)4Pd (30,2 mg; 0,03 mmol), i
heptin (0,04 ml; 0,31 mmol) te je zatim reakcijska smjesa zagrijavana 4 h u mikrovalnom
reaktoru pri temperaturi 60 °C. Nakon kolonske kromatografije (diklormetan : metanol = 200
: 1) izoliran je uljasti spoj 84e (87,8 mg; 68 %). 1H NMR: 8,26 (1H, s, H-6), 8,04–7,96 (2H, m, H-2'''), 7,79 (1H, t, H-4''', J = 7,4 Hz), 7,60
(2H, t, H-3''', J = 7,8 Hz), 4,01 (4H, d, H-4'', J = 5,7 Hz), 3,88–3,76 (2H, m, H-1''), 2,38 (2H,
t, H-3', J = 6,9 Hz), 2,03–2,00 (1H, m, H-3''), 2,00 (6H, s, COCH3), 1,71 (2H, q, H-2'', J = 7,1
Hz), 1,55–1,44 (2H, m, H-4'), 1,43–1,22 (4H, m, H-5', H-6'), 0,87 (3H, t, CH3-7', J = 7,1 Hz)
ppm. 13C NMR: (δ) 170,8 (COCH3), 169,4 (CO), 161,6 (C-4), 153,1 (C-2), 149,1 (C-6), 136,0
(Ph-4'''), 131,4 (Ph-1'''), 130,9 (Ph-3'''), 130,0 (Ph-2'''), 98,8 (C-5), 94,7 (C-2'), 72,3 (C-1'),
64,1 (C-4''), 47,0 (C-1''), 34,9 (C-3''), 30,9 (CH2), 28,2 (CH2), 27,7 (C-2''), 22,1 (CH2), 21,1
(COCH3), 19,1 (CH2), 14,3 (CH3-7') ppm.
N-1-[4-acetoksi-3-(acetoksimetil)butil]-N-3-benzoil-5-(5-klorpentinil)pirimidin-2,4-dion
(84f)
Spoj 84f sintetiziran je prema postupku opisanom za pripravu spoja 84a. Reagensi: spoj 81
(212,3 mg; 0,40 mmol), CuI (16,1 mg; 0,08 mmol), Et3N (0,1 ml; 0,86 mmol), (PPh3)4Pd
(46,5 mg; 0,04 mmol), 5-klorpentin (0,1 ml; 0,48 mmol), toluen (10 ml). Nakon kolonske
kromatografije (diklormetan : metanol = 200 : 1) izoliran je bezbojni uljasti spoj 84f (115,7
mg; 57 %). 1H NMR: (δ) 8,30 (1H, s, H-6), 8,01–7,98 (2H, m, Ph-2'''), 7,79 (1H, t, H-4''', J = 7,4 Hz),
7,60 (2H, t, H-3''', J = 7,9 Hz), 4,02 (4H, d, H-4'', J = 5,7 Hz), 3,85–3,80 (2H, m, H-1''), 3,75
(2H, t, H-5', J = 6,4 Hz), 2,55 (2H, t, H-3', J = 6,9 Hz), 2,05–2,01 (1H, m, H-3''), 2,00 (6H, s,
COCH3), 1,94 (2H, p, H-4', J = 6,7 Hz), 1,72 (2H, q, H-2'', J = 6,9 Hz) ppm. 13C NMR: 170,8
129
EKSPERIMENTALNI DIO
(COCH3), 169,4 (CO), 161,6 (C-4), 149,5 (C-6), 149,1 (C-2), 136,1 (Ph-4'''), 131,4 (Ph-1'''),
130,9 (Ph-3'''), 130,0 (Ph-2'''), 98,5 (C-5), 92,9 (H-2'), 73,1 (C-1'), 64,1 (C-4''), 47,0 (C-1''),
44,5 (C-5'), 34,9 (C-3''), 31,4 (C-4'), 27,7 (C-2''), 21,1 (COCH3), 16,7 (C-3') ppm.
N-1-[4-acetoksi-3-(acetoksimetil)butil]-N-3-benzoil-5-(dekinil)pirimidin-2,4-dion (84g)
Spoj 84g sintetiziran je prema postupku opisanom za pripravu spoja 84a. Reagensi: spoj 81
(313,0 mg; 0,06 mmol), CuI (23,7 mg; 0,12 mmol), Et3N (0,2 ml; 1,29 mmol), (PPh3)4Pd
(68,6 mg; 0,06 mmol), dekin (0,1 ml; 0,71 mmol), toluen (15 ml). Nakon kolonske
kromatografije (diklormetan : metanol = 200 : 1) izoliran je žuti uljasti spoj 84g (214,0 mg;
67 %). 1H NMR: (δ) 8,26 (1H, s, H-6), 8,03–7,96 (2H, m, Ph-2'''), 7,79 (1H, t, H-4''', J = 7,4 Hz),
7,60 (2H, t, H-3''', J = 7,8 Hz), 4,01 (4H, d, H-4'', J = 5,7 Hz), 3,88–3,78 (2H, m, H-1''), 2,37
(2H, t, H-3', J = 6,8 Hz), 2,10–2,02 (1H, m, H-3''), 2,04–1,91 (6H, m, COCH3), 1,71 (2H, q,
H-2'', J = 6,9 Hz), 1,54–1,42 (2H, m, CH2), 1,44–1,20 (10H, m,5 x CH2), 0,84 (3H, t, CH3, J =
6,7 Hz) ppm. 13C NMR: (δ) 170,3 (COCH3), 167,0 (CO), 161,1 (C-4), 148,4 (C-6), 145,1 (C-
2), 135,6 (Ph-4'''), 130,9 (Ph-1'''), 130,4 (Ph-3'''), 129,5 (Ph-2'''), 98,3 (C-5), 94,2 (C-2'), 71,8
(C-1'), 63,5 (C-4''), 46,4 (C-1''), 34,3 (C-3''), 31,2 (CH2), 28,6 (CH2), 28,5 (CH2), 28,2 (CH2),
28,1 (CH2), 27,2 (C-2''), 20,6 (COCH3), 18,7 (CH2), 13,9 (CH3) ppm.
N-1-[4-acetoksi-3-(acetoksimetil)butil]-N-3-benzoil-5-(3-fenilpropinil)pirimidin-2,4-dion
(84h)
Spoj 84h sintetiziran je prema postupku opisanom za pripravu spoja 84a. Reagensi: spoj 81
(308,0 mg; 0,58 mmol), CuI (23,3 mg; 0,12 mmol), Et3N (0,2 ml; 1,22 mmol), (PPh3)4Pd
(68,5 mg; 0,06 mmol), 3-fenilpropin (0,1 ml; 0,91 mmol), toluen (15 ml). Nakon kolonske
kromatografije (diklormetan : metanol = 200 : 1) izoliran je žuti uljasti spoj 84h (211,1 mg;
70 %). 1H NMR: (δ) 8,36 (1H, s, H-6), 8,05–7,98 (2H, m, Ph-2'''), 7,80 (1H, t, Ph-4''', J = 7,4 Hz),
7,60 (2H, t, Ph-3''', J = 7,8 Hz), 7,42–7,29 (4H, m, Ph-2', Ph-3'), 7,28–7,21 (1H, m, Ph-4'),
4,01 (4H, d, H-4'', J = 5,7 Hz), 3,87 (2H, s, H-3'), 3,87–3,81 (2H, m, H-1''), 2,09–2,01 (1H, m,
H-3''), 2,00 (6H, s, COCH3), 1,72 (2H, q, H-2'', J = 6,9 Hz) ppm. 13C NMR: (δ) 170,8
(COCH3), 169,4 (CO), 161,6 (C-4), 149,5 (C-6), 149,2 (C-2), 136,8 (Ph-1'), 136,1 (Ph-4'''),
131,4 (Ph-1'''), 131,0 (Ph-3'''), 130,0 (Ph-2'''), 128,95 (Ph-2'), 128,35 (Ph-3'), 127,0 (Ph-4'),
98,5 (C-5), 92,4 (C-2'), 74,1 (C-1'), 64,1 (C-4''), 47,0 (C-1''), 34,9 (C-3''), 27,7 (C-2''), 25,3
(C-3'), 21,1 (CH3) ppm.
130
EKSPERIMENTALNI DIO
N-1-[4-acetoksi-3-(acetoksimetil)butil]-N-3-benzoil-5-(3,3-dimetilbutinil)pirimidin-2,4-
dion (84i)
Spoj 84i sintetiziran je prema postupku opisanom za pripravu spoja 84a. Reagensi: spoj 81
(187,0 mg; 0,35 mmol), CuI (14,1 mg; 0,07 mmol), Et3N (0,1 ml; 0,88 mmol), (PPh3)4Pd
(40,9 mg; 0,04 mmol), 3,3-dimetilbutin (0,1 ml; 0,42 mmol), toluen (10 ml). Nakon kolonske
kromatografije (diklormetan : metanol = 200 : 1) izoliran je bezbojni uljasti spoj 84i (140,0
mg; 83 %). 1H NMR: (δ) 8,23 (1H, s, H-6), 8,08–7,90 (2H, m, Ph-2'''), 7,79 (1H, t, Ph-4''', J = 7,4 Hz),
7,60 (2H, t, Ph-3''', J = 7,8 Hz), 4,02 (4H, d, H-4'', J = 5,7 Hz), 3,89–3,70 (2H, m, H-1''),
2,08–2,02 (1H, m, H-3''), 2,02 (6H, s, COCH3), 1,78–1,60 (2H, m, H-2''), 1,24 (9H, s, CH3)
ppm. 13C NMR: (δ) 170,3 (COCH3), 168,9 (CO), 160,9 (C-4), 159,9 (C-2), 148,6 (C-6), 135,5
(Ph-4'''), 130,9 (Ph-3'''), 130,4 (Ph-1'''), 129,4 (Ph-2'''), 101,9 (C-5), 98,1 (C-2'), 70,3 (C-1'),
63,6 (C-4''), 46,4 (C-1''), 34,4 (C-3''), 30,6 (CH3), 27,7 (C-3'), 27,2 (C-2''), 20,6 (COCH3)
ppm.
5-[(3,5-difluorfenil)etinil]-N-1-[4-hidroksi-3-(hidroksimetil)butil]pirimidin-2,4-dion
(85a)
Otopini spoja 84a (87,4 mg; 0,16 mmol) u metanolu (1 ml) dodana je 1 M NaOH (1,7 ml).
Reakcijska smjesa je miješana 10 min na temperaturi refluksa, a potom neutralizirana
dodatkom HCl/CH3OH. Otapalo je upareno, a ostatak od uparavanja pročišćen kolonskom
kromatografijom (diklormetan : metanol = 20 : 1) pri čemu je izoliran je bijeli kristalinični
spoj 85a (5,9 mg; 13 %; t.t. = 167−169 °C). MS (ESI): m/z = 351,1 ([M+H]+). 1H NMR: (δ) 11,64 (1H, s, NH), 8,24 (1H, s, H-6), 7,40–7,25 (1H, m, Ph-4'), 7,20 (2H, dd,
Ph-2', Ph-6', J = 8,1 Hz, J = 2,0 Hz), 4,41 (2H, t, OH, J = 5,2 Hz), 3,87–3,68 (2H, m, H-1''),
3,50–3,32 (4H, m, H-4''), 1,60 (2H, q, H-2'', J = 6,9 Hz), 1,50–1,45 (1H, m, H-3'') ppm. 13C
NMR: (δ) 162,8 (dd, Ph-3', Ph-5', J = 245,2 Hz, J = 14,1 Hz), 162,2 (C-4), 150,5 (C-6), 150,3
(C-2), 125,9 (t, Ph-1', J = 12,2 Hz), 115,0–114,4 (m, Ph-2', Ph-6'), 105,3 (t, Ph-4', J = 25,8
Hz), 96,9 (C-5), 90,0 (C-2'), 85,5 (C-1'), 62,0 (C-4''), 47,1 (C-1''), 41,2 (C-3''), 28,3 (C-2'')
ppm.
5-[(p-bromfenil)etinil]-N-1-[4-hidroksi-3-(hidroksimetil)butil]pirimidin-2,4-dion (85b)
Otopini spoja 84b (95,5 mg; 0,16 mmol) u metanolu (2,3 ml) je dodana svježe pripravljena
0,1 M otopina NaOCH3/CH3OH (0,7 ml). Reakcijska smjesa je miješana preko noći na sobnoj
temperaturi, te potom neutralizirana dodatkom Amberlista 15. Reakcijska smjesa je filtrirana,
131
EKSPERIMENTALNI DIO
filtrat uparen, a ostatak od uparavanja pročišćen kolonskom kromatografijom (diklormetan :
metanol = 20 : 1). Izoliran je bijeli kristalinični spoj 85b (15,4 mg; 24 %; t.t. = 183−185 °C). 1H NMR: (δ) 11,59 (1H, s, NH), 8,21 (1H, s, H-6), 7,62–7,58 (2H, m, Ph-3'), 7,42–7,38
(2H, m, Ph-2'), 4,39 (2H, t, OH, J = 5,2 Hz), 3,80–3,74 (2H, m, H-1''), 3,44–3,40 (2H, m, H-
4''), 3,37–3,33 (2H, m, H-4''), 1,60 (2H, q, H-2'', J = 6,8 Hz), 1,52–1,45 (1H, m, H-3'') ppm. 13C NMR: (δ) 162,3 (C-4), 150,4 (C-2), 149,8 (C-6), 133,4 (Ph-2'), 132,3 (Ph-3'), 122,3 (Ph-
4'), 122,2 (Ph-1'), 97,4 (C-5), 91,2 (C-2'), 84,3 (C-1'), 61,9 (C-4''), 47,1 (C-1''), 41,2 (C-3''),
28,3 (C-2'') ppm.
5-(ciklopropil-etinil)-N-1-[4-hidroksi-3-(hidroksimetil)butil]pirimidin-2,4-dion (85c)
Spoj 85c sintetiziran je prema postupku opisanom za pripravu spoja 85b. Reagensi: spoj
84c (253,0 mg; 0,52 mmol), metanol (3,2 ml) i 0,1 M NaOCH3/CH3OH (1,4 ml). Kolonskom
kromatografijom (etil-acetat : metanol = 10: 1, a zatim diklormetan : metanol = 20 : 1)
izoliran je bijeli kristalinični spoj 85c (30,7 mg; 21 %; t.t. = 99−100 °C). 1H NMR: (δ) 11,41 (1H, s, NH), 7,93 (1H, s, H-6), 4,37 (2H, t, OH, J = 5,2 Hz), 3,76–3,67
(2H, m, H-1''), 3,45–3,29 (4H, m, H-4''), 1,55 (2H, q, H-2'', J = 6,8 Hz), 1,51–1,38 (2H, m, H-
3'', H-3'), 0,90–0,78 (2H, m, H-4', H-5'), 0,71–0,60 (2H, m, H-4', H-5') ppm. 13C NMR: (δ)
162,9 (C-4), 150,4 (C-2), 148,7 (C-6), 98,4 (C-5), 96,5 (C-2'), 68,5 (C-1'), 61,9 (C-4''), 46,8
(C-1''), 41,2 (C-3''), 28,2 (C-2''), 8,7 (C-4', C-5'), 0,3 (C-3') ppm.
N-1-[4-hidroksi-3-(hidroksimetil)butil]-5-[(p-pentilfenil)-etinil]pirimidin-2,4-dion (85d)
Spoj 85d sintetiziran je prema postupku opisanom za pripravu spoja 85b. Reagensi: spoj
84d (186,8 mg; 0,33 mmol), metanol (3,2 ml) i 0,1 M NaOCH3/CH3OH (1,4 ml). Kolonskom
kromatografijom (diklormetan : metanol = 10 : 1) izoliran je bijeli kristalinični spoj 85d (50,2
mg; 40 %; t.t. = 140−142 °C). 1H NMR: (δ) 11,57 (1H, s, NH), 8,16 (1H, s, H-6), 7,36 (2H, d, Ph-2', J = 8,1 Hz), 7,22
(2H, d, Ph-3', J = 8,0 Hz), 4,40 (2H, t, OH, J = 5,2 Hz), 3,77 (2H, t, H-1'', J = 7,3 Hz), 3,48–
3,32 (4H, m, H-4''), 2,63–2,55 (2H, m, H-3'), 1,65–1,54 (4H, m, H-4', H-2''), 1,52–1,40 (1H,
m, H-3'''), 1,36–1,25 (4H, m, H-5', H-6'), 0,86 (3H, t, CH3-7', J = 6,8 Hz) ppm. 13C NMR: (δ)
162,5 (C-4), 150,4 (C-2), 149,2 (C-6), 143,6 (Ph-4'), 131,5 (Ph-2'), 129,2 (Ph-3'), 120,2 (Ph-
1'), 97,9 (C-5), 92,4 (C-2'), 82,3 (C-1'), 61,9 (C-4''), 47,0 (C-1''), 41,2 (C-3''), 35,4 (C-3'), 31,3
(CH2), 30,7 (CH2), 28,3 (C-2''), 22,4 (CH2), 14,3 (CH3-7') ppm.
132
EKSPERIMENTALNI DIO
5-(heptinil)-N-1-[4-hidroksi-3-(hidroksimetil)butil]pirimidin-2,4-dion (85e)
Spoj 85e sintetiziran je prema postupku opisanom za pripravu spoja 85b. Reagensi: spoj
84e (82,6 mg; 0,17 mmol), metanol (1,7 ml) i 0,1 M NaOCH3/CH3OH (0,7 ml). Kolonskom
kromatografijom (diklormetan : metanol = 20 : 1) izoliran je bijeli kristalinični spoj 85e (35,5
mg; 70 %; t.t. = 89−92 °C). 1H NMR: (δ) 11,45 (1H, s, NH), 7,95 (1H, s, H-6), 4,41 (2H, t, OH, J = 5,2 Hz), 3,79–3,65
(2H, m, H-1''), 3,48–3,34 (4H, m, H-4''), 2,35 (2H, t, H-3', J = 7,0 Hz), 1,61–1,41 (4H, m, H-
2'', H-4'), 1,41–1,20 (4H, m, H-5', H-6'), 0,88 (3H, t, CH3, J = 7,1 Hz) ppm. 13C NMR: (δ)
162,3 (C-4), 149,9 (C-2), 147,9 (C-6), 98,1 (C-5), 93,0 (C-2'), 72,8 (C-1'), 61,5 (C-4''), 46,3
(C-1''), 40,7 (C-3''), 30,4 (CH2), 27,9 (CH2), 27,7 (C-2''), 21,6 (CH2), 18,7 (C-3'), 13,8 (CH3)
ppm.
N-1-[4-hidroksi-3-(hidroksimetil)butil]-5-(5-klorpentinil)pirimidin-2,4-dion (85f)
Spoj 85f sintetiziran je prema postupku opisanom za pripravu spoja 85b. Reagensi: spoj
84f (78,0 mg; 0,16 mmol), metanol (1,4 ml) i 0,1 M NaOCH3/CH3OH (0,7 ml). Kolonskom
kromatografijom (diklormetan : metanol = 20 : 1) izoliran je bijeli kristalinični spoj 85f (44,4
mg; 91 %; t.t. = 133−135 °C). 1H NMR: (δ) 11,46 (1H, s, NH), 7,99 (1H, s, H-6), 4,39 (2H, t, OH, J = 5,2 Hz), 3,80–3,68
(4H, m, H-1'', H-5'), 3,44–3,33 (4H, m, H-4''), unutar signala za DMSO (H-3'), 1,93 (2H, p,
H-4', J = 6,7 Hz), 1,56 (2H, q, H-2'', J = 6,8 Hz), 1,51–1,41 (1H, m, H-3'') ppm. 13C NMR: (δ)
162,8 (C-4), 150,4 (C-2), 148,7 (C-6), 98,2 (C-5), 91,8 (C-2'), 74,1 (C-1'), 61,9 (C-4''), 46,8
(C-1''), 44,6 (C-5'), 41,2 (C-3''), 31,6 (C-4'), 28,2 (C-2''), 16,8 (C-3') ppm.
5-(dekinil)-N-1-[4-hidroksi-3-(hidroksimetil)butil]pirimidin-2,4-dion (85g)
Spoj 85g sintetiziran je prema postupku opisanom za pripravu spoja 85b. Reagensi: spoj
84g (145,0 mg; 0,27 mmol), metanol (2,6 ml) i 0,1 M NaOCH3/CH3OH (1,3 ml). Kolonskom
kromatografijom (diklormetan : metanol = 20 : 1) izoliran je bijeli kristalinični spoj 85g (75,5
mg; 80 %; t.t. = 132−135 °C). 1H NMR: (δ) 11,45 (1H, s, NH), 7,95 (1H, s, H-6), 4,40 (2H, t, OH, J = 5,2 Hz), 3,76–3,66
(2H, m, H-1''), 3,46–3,33 (4H, m, H-4''), 2,35 (2H, t, H-3', J = 6,9 Hz), 1,62–1,19 (15H, m, H-
2'', H-3'', H-4', H-5', H-6', H-7', H-8', H-9'), 0,86 (3H, t, CH3-10', J = 6,7 Hz) ppm. 13C NMR:
(δ) 162,8 (C-4), 150,4 (C-2), 148,4 (C-6), 98,6 (C-5), 93,5 (C-2'), 73,3 (C-1'), 62,0 (C-4''),
46,8 (C-1''), 41,2 (C-3''), 31,7 (CH2), 29,1 (CH2), 29,0 (CH2), 28,8 (CH2), 28,7 (CH2), 28,2
(C-2''), 22,5 (CH2), 19,3 (C-3'), 14,4 (CH3-10') ppm.
133
EKSPERIMENTALNI DIO
134
5-(3-fenilpropinil)-N-1-[4-hidroksi-3-(hidroksimetil)butil]pirimidin-2,4-dion (85h)
Spoj 85h sintetiziran je prema postupku opisanom za pripravu spoja 85b. Reagensi: spoj
84h (152,0 mg; 0,29 mmol), metanol (2,7 ml) i 0,1 M NaOCH3/CH3OH (1,4 ml). Kolonskom
kromatografijom (etil-acetat : metanol = 10: 1, a zatim diklormetan : metanol = 20 : 1)
izoliran je uljasti spoj 85h (50 mg; 52 %). 1H NMR: δ 11,48 (1H, s, NH), 8,05 (1H, s, H-6), 7,43–7,19 (5H, m, Ph), 4,39 (2H, t, OH, J
= 5,2 Hz), 3,84 (2H, s, H-3'), 3,79–3,64 (2H, m, H-1''), 3,48–3,29 (4H, m, H-4''), 1,57 (2H, q,
H-2'', J = 6,8 Hz), 1,44–1,47 (1H, m, H-3'') ppm. 13C NMR: (δ) 162,4 (C-4), 149,9 (C-2),
148,4 (C-6), 136,6 (Ph-1'), 128,5 (CH-Ph), 127,9 (CH-Ph), 126,6 (Ph-4'), 97,7 (C-5), 90,8 (C-
2'), 74,7 (C-1'), 61,4 (C-4''), 46,4 (C-1''), 40,7 (C-3''), 27,7 (C-2''), 24,9 (C-3') ppm.
5-(3,3-dimetilbutinil)-N-1-[4-hidroksi-3-(hidroksimetil)butil]pirimidin-2,4-dion (85i)
Spoj 85i sintetiziran je prema postupku opisanom za pripravu spoja 85b. Reagensi: spoj
84i (100,0 mg; 0,21 mmol), metanol (1,8 ml) i 0,1 M NaOCH3/CH3OH (1 ml). Kolonskom
kromatografijom (etil-acetat : metanol = 10: 1, a zatim diklormetan : metanol = 20 : 1)
izoliran je bijeli kristalinični spoj 85i (31 mg; 51 %; t.t. = 95−98 °C). 1H NMR: (δ) 11,41 (1H, s, NH), 7,92 (1H, s, H-6), 4,39 (2H, t, OH, J = 5,2 Hz), 3,75–3,67
(2H, m, H-1''), 3,46–3,35 (2H, m, H-4''), 3,35–3,32 (2H, m, H-4''), 1,55 (2H, dd, J = 14,9 Hz,
J = 6,8 Hz), 1,49–1,42 (1H, m, H-3''), 1,24 (9H, s, CH3) ppm. 13C NMR: (δ) 162,7 (C-4), 150,4 (C-2), 148,4 (C-6), 101,2 (C-5), 98,4 (C-2'), 71,8 (C-1'),
61,9 (C-4''), 46,8 (C-1''), 41,2 (C-3''), 31,3 (CH3), 28,2 (C-2''), 28,1 (C-3') ppm.
5. ZAKLJUČAK
ZAKLJUČAK
Sintetizirani su ciljani 5-supstituirani pirimidini s 2,3-dihidroksipropilnim lancem (25)
te lancima poput aciklovirnog (27), ganciklovirnog (29) i penciklovirnog (37) u
položaju N-1 pirimidina. U optimiranju reakcije primijenjena su dva sintetska pristupa
za N-alkiliranje. Sintetski put A za dobivanje spojeva 27 i 29 u kojem su primijenjeni
N-anionski 5-supstituirani pirimidinski derivati, kao intermedijari, bio je uspješniji (sa
sveukupnim iskorištenjima od 26 % i 20 %) od sintetskog puta B u kojem je N-
alikiliranje pirimidina provedeno primjenom reakcije sililiranja (sa sveukupnim
iskorištenjima 4 % i 5 %).
Sintetizirani su novi konformacijski ograničeni C-6 izobutenilni N-metilni derivati
timina 68, 69, 7173 i 75 kao smjese Z- i E-izomera u kojima Z-izomer prevladava.
Pripravljeni su, također, C-5 supstituirani heteroarilni (77, 83) i alkinilni (85ai) N-
aciklički derivati pirimidina reakcijama kataliziranih paladijem.
Kristalna struktura spojeva 10, 77, 80 i 84g određena je rentgenskom strukturnom
analizom. Atomi dihidroksiizobutilnog lanca spojeva 77 i 85g čine ravninu koja je
gotovo okomita u odnosu na pirimidinski prsten.
Ispitana je antitumorska aktivnost in vitro za N-acikličke 5-furilne (77) i 5-alkinilne
pirimidinske derivate 81, 84ad, 85a i 85b na stanične linije zloćudnih tumora
porijeklom iz čovjeka: karcinom dojke (MCF-7), karcinom debelog crijeva (SW 620),
karcinom vrata maternice (HeLa) i na normalne diploidne fibroblaste porijeklom iz
čovjeka (BJ). Pirimidinski derivati koji sadrže 5-ciklopropiletinilni 84c i 5-(p-
pentilfenil)etinilni supstituent 84d pokazali su najizraženije antiproliferativno
djelovanje (0,2 μM) u nanomolarnoj koncentraciji na karcinom dojke (MCF-7).
Također, 5-jodpirimidinski derivat 81 i 5-furilni derivat 77 su imali izraženo
inhibitorno djelovanje (1,2 i 7,3 μM) na tumorske stanice MCF-7. Spojevi 84c i 84d sa
selektivnim antiproliferativnim djelovanjem na stanične linije MCF-7 i normalne
fibroblaste porijeklom iz čovjeka (BJ) u nanomolarnoj koncentraciji odabrani su kao
predvodni spojevi za daljnje optimiranje strukture.
N-aciklički lanac pokazao je znatan utjecaj na fosforiliranje ispitanih spojeva 25, 27,
29 i 37 pomoću enzima HSV1-TK. Aciklički nukleozidi s dihidroksipropilnim lancem
(25), lancem poput aciklovirnog (27) i ganciklovirnog (29) nisu fosforilirani pomoću
enzima HSV1-TK. Regioizomer spoja 29, N-3-hidroksietilni pirimidinski derivat 46 s
lancem poput ganciklovirnog u položaju N-1, također nije supstrat HSV1-TK.
136
ZAKLJUČAK
Nasuprot tome, C-5 supstituirani pirimidinski derivati 37 i 39 s lancem poput
penciklovirnog supstrati su enzima HSV1-TK. Navedeni spojevi nisu supstrati TK iz
čovjeka (hTK). Mala promjena strukture poput zamjene metilenske skupine spoja 37
atomom kisika u spoju 29, utjecala je na reakciju fosforiliranja ispitanog spoja. Kisik u
položaju 2' pobočnog lanca, kao elektron-donorski atom, nepovoljno je utjecao na
interakciju supstrata i enzima i onemogućio fosforiliranje spoja 29 s lancem poput
ganciklovirnog. Također, veličina supstituenta na položaju C-5 pirimidina utjecala je
na interakciju spoja s enzimom. Tako je 5-(2-hidroksietilni)pirimidinski derivat 37
bolji supstrat enzima HSV1-TK od 5-(3-hidroksipropilnog)pirimidinskog derivata 39.
Nadalje, ciljani spojevi 25, 27, 29 i 37 nisu pokazali toksičnost na normalne ljudske
fibroblaste u koncentraciji do 100 μM.
5-(2-hidroksietil)pirimidin s dihidroksiizobutilnim lancem u položaju N-1 37 koji se
djelotvorno fosforilirao pomoću HSV1-TK i nije pokazao citotoksičnost na normalne
stanice zadovoljio je osnovne preduvjete za primjenu u praćenju enzimske aktivnosti
HSV1-TK. Stoga je taj spoj odabran kao predvodni spoj za razvoj molekule PET-
tragača.
Radiosinteza spoja HHB-5-[18F]FEP ([18F]52) je provedena u dva stupnja,
nukleofilnom supstitucijom prekursora s tosilatnom odlazećom skupinom primjenom
kompleksa [18F]fluorid-kriptat i hidrolizom zaštitnih skupina u kiselim uvjetima.
Radiokemijsko iskorištenje od 45 % u sintezi spoja HHB-5-[18F]FEP bilo je znatno
veće od iskorištenja (16 %) u sintezi spoja [18F]FHBG (56).
Ispitivanje in vitro ulaska spoja HHB-5-[18F]FEP ([18F]52) u transducirane stanice
pokazalo je 35–41 puta veće nakupljanje radioaktivnosti u stanicama TK+ koje imaju
aktivnost HSV1-TK nego u kontrolnim stanicama.
Ispitivanja in vivo radiooznačene molekule kandidata HHB-5-[18F]FEP ([18F]52)
uspoređena su s poznatim PET-tragačem, [18F]FHBG (56). N-aciklički pirimidinski
derivat HHB-5-[18F]FEP je u miševima s tumorom jasno vizualizirao aktivnost HSV1-
TK. U usporedbi s [18F]FHBG novi je spoj pokazao manju selektivnost. Prednost
spoja HHB-5-[18F]FEP, u usporedbi s [18F]FHBG, je manje nakupljanje
radioaktivnosti u abdominalnom području za HHB-5-[18F]FEP. Novi spoj je također
pokazao metaboličku stabilnost, odnosno nisku vrijednost defluoriranja in vivo. Stoga
bi HHB-5-[18F]FEP bio pogodan za promatranje ekspresije HSV1-tk u područjima
blizu abdominalnog područja što nije moguće primjenom [18F]FHBG.
137
ZAKLJUČAK
138
6. LITERATURA
LITERATURA
140
1. D. Papathanassiou, C. Bruna-Muraille, J.-C. Liehn, T.D. Nguyen, H. Curé, Crit. Rev.
Oncol. Hemat. 72 (2009) 239–54.
2. Z. Li, P.S. Conti, Adv. Drug Deliver. Rev. 62 (2010) 1031–51.
3. C. Avendano, J.C. Menendez, Medicinal Chemistry of Anticancer Drugs, Elsevier,
Amsterdam, 2008.
4. B. Alberts, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, P. Walter, Molecular Biology of the
Cell, fourth ed., Garland Science, New York, 2002.
5. G.U. Dachs, M.A. Hunt's, S. Syddall, D.C. Singleton, A.V.E. Patterson, Molecules 14
(2009) 4517–45.
6. J.G. Tjuvajev, M. Doubrovin, T. Akhrust, S. Cai, J. Balatoni, M.M. Alauddin, R. Finn, W.
Bornmann, H. Thaler, P.S. Conti, R.G. Blasberg, J. Nucl. Med. 43 (2002) 1072–83.
7. M.M. Alauddin, P.S. Conti, Nucl. Med. Biol. 25 (1998) 175–80.
8. S.S. Gambhir, Nat. Rev. Cancer 2 (2002) 683–93.
9. L.I. Wiebe, K.W. Morin, E.E. Knaus, Q. J. Nucl. Med. 41 (1997) 79–89.
10. S. Raić-Malić, A. Johayem, S.M. Ametamey, S. Batinac, E. De Clerq, G. Folkers, L.
Scapozza, Nucleosides, Nucleotides Nucleic Acids 23 (2004) 1707–21.
11. S. Purser, P.R. Moore, S. Swallow, V. Gouverneur, Chem. Soc. Rev. 37 (2008) 320–30.
12. E. De Clercq, H.J. Field, Brit. J. Pharmacol. 147 (2006) 1–11.
13. E. De Clerq, Nature Rev. 1 (2002) 13–25.
14. C.K. Chu, S.J. Cutler, J. Heterocyclic. Chem. 23 (1986) 289–319.
15. W. Streicher, G. Werner, B. Rosenwirth, Chem. Scripta 26 (1986) 179–83.
16. E. De Clerq, A. Holý, J. Med. Chem. 22 (1979) 510–3.
17. G.B. Elion, P.A. Furman, J.A. Fyfe, P. de Miranda, L. Beauchamp, H.J. Schaeffer, Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (1977) 5716–20.
18. H.J. Schaeffer, L. Beauchamp, P. de Miranda, G.B. Ellion, D.J. Bauer, P. Collins, Nature
272 (1978) 583–5.
19. P.A. Furman, M.H. St. Clair, R. Spector, J. Biol. Chem. 259 (1984) 9575–9.
20. F. Li, H. Maag, T. Alfredson, J. Pharm. Sci. 97 (2008) 1109–34.
21. M.H. St. Clair, C.U. Lambe, P.A. Furman, Antimicrob. Agents Ch. 31 (1987) 844–9.
22. D.D. Ilsley, S.H. Lee, W.H. Miller, R.D. Kuchta, Biochemistry 34 (1995) 2504–10.
23. M.R. Boyd, T.H. Bacon, D. Sutton, M. Cole, Antimicrob. Agents Ch. 31 (1987) 1238–42.
LITERATURA
24. E. De Clerq, J. Descamps, P. de Somer, A. Holý, Science 200 (1978) 563–5.
25. E. De Clerq, Antivir. Res. 67 (2005) 56–75.
26. J.L. Kelley, H.J. Schaffer, J. Heterocyclic. Chem. 23 (1986) 271–3.
27. M.J. Robins, P.W. Hatfield, Can. J. Chem. 60 (1982) 547–53.
28. H. Vorbrüggen, K. Krolikiewicz, B. Bennua, Chem. Ber. 114 (1981) 1234–55.
29. K. Izawa, H. Shiragami, Pure Appl. Chem. 70 (1998) 313–18.
30. H. Shiragami, Y. Koguchi, Y. Tanaka, S. Takamatsu, Y. Uchida, T. Ineyama, K. Izawa,
Nucleosides, Nucleotides Nucleic Acids 14 (1995) 337–40.
31. J.C. Martin, Can. J. Chem. 64 (1986) 1885–9.
32. G.J. Koomen, Rec. Trav. Chim. Pays-Bas. 112 (1993) 51–65.
33. J.-Q. Wang, Q.-H. Zheng, X. Fei, B.H. Mock, G.D. Hutchins, Bioorg. Med. Chem. Lett.
13 (2003) 3933–8.
34. C.J. Anderson, J.W.M. Bulte, K. Chen, X. Chen, B.A. Khaw, M. Shokeen, K.L. Wooley,
H.F. Vanbrocklin, J. Nucl. Med. 51 (2010) 3S–17S.
35. M.P.S. Dunphy, J.S. Lewis, J. Nucl. Med. 50 (2009) 106S–121S.
36. K.-L. Xiong, Q.-W. Yang, S.-G. Gong, W.-G. Zhang, Nucl. Med. Commun. 31 (2010) 4–
11.
37. G. Lappin, R.C. Garner, Nat. Rev. Drug Discov. 2 (2003) 233–40.
38. C. Heidelberger, Cancer Treat. Rep. 65 (1981) 3–9.
39. G. Brix, M.E. Bellemann, Nucl. Med. Biol. 23 (1996) 897–906.
40. A.F. Shields, J.R. Grierson, B.M. Dohmen, H.J. Machulla, J.C. Stayanoff, J.M. Lawhorn-
Crews, J.E. Obradovich, O. Muzik, T.J. Mangner, Nat. Med. 4 (1998) 1334–36.
41. H. Vesselle, J. Grierson, M. Muzi, J.M. Pugsley, R.A. Schmidt, P. Rabinowitz, L.M.
Peterson, E. Vallières, D.E. Wood, Clin. Cancer Res. 8 (2002) 3315–23.
42. R. Blasberg, Eur. J. Cancer 38 (2002) 2137–46.
43. J.R. Bading, A.F. Shields, J. Nucl. Med. 49 (suppl.) (2008) 64S–80S.
44. H. Barthel, M.C. Cleij, D.R. Collingridge, O.C. Hutchinson, S. Osman, Q. He, S.K.
Luthra, F. Brady, P.M. Price, E.O. Aboagye, Cancer Res. 63 (2003) 3791–8.
45. L. Lu, L. Samuelsson, M. Bergstrom, K. Sato, K.J. Fasth, B. Langstrom, J. Nucl. Med. 43
(2002) 1688–98.
46. J.L. Sherley, T.J. Kelly, J. Biol. Chem. 263 (1988). 8350–8.
141
LITERATURA
47. J.R. Bading, A.H. Shahinian, A. Vail, P. Bathija, G.W. Koszalka, R.T. Koda, M.M.
Alauddin, J.D. Fissekis, P.S. Conti, Nucl. Med. Biol. 31 (2004) 407–18.
48. L. Kostakoglu, S.J. Goldsmith, J. Nucl. Med. 44 (2003) 224–39.
49. S.Yu, Biomed. Imaging Interv. J. 2 (2006) 1–11.
50. R. Kubota, S. Yamada, K. Kubota, K. Ishiwata, N. Tamahashi, T. Ido, J. Nucl. Med. 33
(1992) 1972–80.
51. S. Soghomonyan, A. Hajitou, R. Rangel, M. Trepel, R. Pasqualini, W. Arap, J.G.
Gelovani, M.M. Alauddin, Nat. Protoc. 2 (2007) 416–23.
52. S.S. Gambhir, J.R. Barrio, H.R. Herschman, M.E. Phelps, Nucl. Med. Biol. 26 (1999)
481–90.
53. M.M. Alauddin, J.G. Tjuvajev, Curr. Top. Med. Chem. 10 (2010) 1617–32.
54. I. Serganova, V. Ponomarev, R. Blasberg, Nucl. Med. Biol. 34 (2007) 791–807.
55. S.S. Yaghoubi, M.A. Couto, C.C. Chen, L. Polavaram, G. Cui, L. Sen, S.S. Gambhir, J.
Nucl. Med. 47 (2006) 706–15.
56. S.S. Yaghoubi, J.R. Barrio, M. Dahlbom, M. Iyer, M. Namavari, N. Satyamurthy, R.
Goldman, H.R. Herschman, M.E. Phelps, S.S. Gambhir, J. Nucl. Med. 42 (2001) 1225–34.
57. A.-M. Chacko, E. Blankemeyer, B.P. Lieberman, W. Qu, H.F. Kung, Nucl. Med. Biol. 36
(2009) 29–38.
58. M. Hua, P.M. Korkowski, R. Vince, J. Med. Chem. 30 (1987) 198–200.
59. J. Zemlicka, Nucleosides, Nucleotides Nucleic Acids 16 (1997) 1003–12.
60. A. Johayem, Development of novel nucleoside analogues for the PET imaging of herpes
simplex virus type1 thymidine kinase gene expression. Ph. D. Thesis, Diss. ETH No.:15450,
Eidgenőssische Technische Hochschule Zürich, Switzerland, 2004.
61. A. Johayem, S. Raić-Malić, K. Lazzati, P.A. Schubiger, L. Scapozza, S.M. Ametamey,
Chem. Biodiver. 3 (2006) 274–83.
62. U. Müller, M. Martić, T. Gazivoda Kraljević, S. Krištafor, T.L. Ross, C. Ranadheera, A.
Müller, M. Born, S.D. Krämer, S. Raić-Malić, S.M. Ametamey, Nucl. Med. Biol. 39 (2012)
235–46.
63. S.M. Selkirk, Postgrad. Med. J. 80 (2004) 560–70.
64. K.A. Whartenby, C.N. Abboud, A.J. Marrogi, R. Ramesh, S.M. Freeman, Lab. Invest. 72
(1995) 131–45.
65. G. Vassaux, P. Martin-Duque, Exper Opin. Biol. Ther. 4 (2004) 519–30.
142
LITERATURA
66. K.Yazawa, W.E. Fisher, F.C. Brunicardi, World J. Surg. 26 (2002) 783–9.
67. S. Duarte, G. Carle, H. Faneca, M.C. Pedroso de Lima, V. Pierrefite-Carle, Cancer Lett.
324 (2012) 160–70.
68. B.E. Huber, E.A. Austin, C.A. Richards, S.T. Davis, S.S. Good, Cancer Res. 53 (1993)
4619–26.
69. D. Evoy, E.A. Hirschowitz, H.A. Naama, X.K. Li, R.G. Crystal, J.M. Daly, M.D.
Lieberman, J. Surg.Res. 69 (1997) 226–31.
70. L.M. Anderson, S. Krotz, S.A. Weitzman, B. Thimmapaya, Cancer Gene. Ther. 7 (2000)
845–52.
71. Z. Li, N. Shanmugam, D. Katayose, B. Huber, S. Srivastava, K. Cowan, P. Seth, Cancer
Gene. Ther. 4 (1997) 113–7.
72. M. Bentires-Alj, A.C. Hellin, C. Lechanteur, F. Princen, M. Lopez, G. Fillet, J. Gielen,
M.-P. Merville, V. Bours, Cancer Gene Ther. 7 (2000) 20–6.
73. F.L. Moolten, Cancer Res. 46 (1986) 5276–81.
74. C. Fillat, M. Carrió, A. Cascante, B. Sangro, Curr. Gene Ther. 3 (2003) 13–26.
75. Y. Lu, C.O. Madu, Expert Opin. Drug Deliv. 7 (2010) 19–35.
76. Z. Ram, K.W. Culver, E.M. Oshireo, J.J. Viola, H.L. DeVroom, E. Otto, Y. Chiang, G.J.
McGarrity, L.M. Muul, D. Kartz, R.M. Blease, E.H. Oldfield, Nat. Med. 3 (1997) 1354–61.
77. D. Deville-Bonne, C. El Amri, P. Meyer, Y. Chen, L.A. Agrofoglio, J. Janin, Antivir. Res.
86 (2010) 101–20.
78. A.K. Field, M.E. Davies, C. DeWitt, H.C Perry, R. Liou, J. Germershausen, J.D. Karkas,
W.T. Ashton, D.B. Johnston, R.L. Tolman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983) 4139–43.
79. P. Brader, R.J. Wong, G. Horowitz, Z. Gil, Adv. Drug Deliver. Rev. 22 (1996) 351–64.
80. F.L. Moolten, J.M. Wells, R.A. Heyman, R.M. Evans, Hum. Gene Ther. 1 (1990) 125–34.
81. S.M. Freeman, C.N. Abboud, K.A. Whartenby, C.H. Packman, D.S. Koeplin, F.L.
Moolten, G.N. Abraham, Cancer Res. 53 (1993) 5274–83.
82. M. Mesnil, C. Piccoli, G. Tiraby, K. Willecke, H. Yamasaki, Cancer Res. 57 (1997)
2929–32.
83. B. Degréve, E. De Clercq, J. Balzarini, Gene Ther. 6 (1999) 162–70.
84. N.G. Rainov, Hum. Gene Ther. 11 (2000) 2389–401.
85. J. Voges, R. Reszka, A. Gossmann, C. Dittmar, R. Richter, G. Garlip, L. Kracht, H.H.
Coenen, V. Sturm, K. Wienhard, W.D. Heiss, A.H. Jacobs, Ann. Neurol. 54 (2003) 479–87.
143
LITERATURA
86. F. Xu, S. Li, X.L. Li, Y. Guo, B.Y. Zou, R. Xu, H. Liao, H.Y. Zhao, Y. Zhang, Z.Z. Guan,
L. Zhang, Cancer Gene Ther. 16 (2009) 723–70.
87. N. Li, J. Zhou, D. Weng, C. Zhang, L. Li, B. Wang, Y. Song, Q. He, D. Lin, D. Chen, G.
Chen, Q. Gao, S. Wang, G. Xu, L. Meng, Y. Lu, D. Ma, Clin. Cancer Res. 13 (2007) 5847–
54.
88. S.O. Freytag, B. Movsas, I. Aref, H. Stricker, J. Peabody, J. Pegg, Y. Zhang, K.N. Barton,
S.L. Brown, M. Lu, A. Savera, J.H. Kim, Mol. Ther. 15 (2007) 1016–23.
89. Y. Nasu, T. Saika, S. Ebara, N. Kusaka, H. Kaku, F. Abarzua, D. Manabe, T.C. Thomson,
H. Kumon, Mol. Ther. 15 (2007) 834–40.
90. E.H. Oldfield, Z. Ram, K. Culver, R.M. Blease, H.L. DeVroom, W.F. Anderson, Hum.
Gene Ther. 4 (1993) 39–46.
91. R. Chinchilla, C. Nájera, Chem. Soc. Rev. 40 (2011) 5084–121.
92. L.A. Agrofoglio, I. Gillaizeau, Y. Saito, Chem. Rev. 203 (2003) 1875–916.
93. M.K. Samantaray, M.M. Shaikh, P. Ghosh, J. Organomet. Chem. 694 (2009) 3477–86.
94. C.E. Domini, G.F. Silbestri, B.F. Band, A.B. Chopa, Ultrason. Sonochem. 19 (2012) 410–
4.
95. C.M. Crawforth, S. Burling, I.J.S. Fairlamb, A.R. Kapdi, R.J.K. Taylor, A.C. Whitwood,
Tetrahedron 61 (2005) 9736–51.
96. D. Crich, S. Sun, J. Org. Chem. 61 (1996) 7200–1.
97. P. Renaud, E. Lacote, L. Quaranta, Tetrahedron Lett. 39 (1998) 2131–2.
98. J.E. Leibner, J. Jacobus, J. Org. Chem. 44 (1979) 449–50.
99. J.K. Stille, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 25 (1986) 508–24.
100. A. Meščić, S. Krištafor, I. Novaković, A. Osmanović, U. Muller, D. Završnik, S.M.
Ametamey, L. Scapozza, S. Raić-Malić, Molecules 18 (2013) 5104–24.
101. A. Meščić, D. Glavač, A. Osmanović, D. Završnik, M. Cetina, D. Makuc, J. Plavec, S.
M. Ametamey, S. Raić-Malić, J. Mol. Struct. 1039 (2013) 160–6.
102. S. Krištafor, A. Meščić, M. Cetina, S. Korunda, D. Makuc, J. Plavec, S. Raić-Malić, J.
Fluor. Chem. 132 (2011) 573–8.
103. A. Meščić, T. Betzel, A. Muller, R. Slavik, S. Čermak, S. Raić-Malić, S.M. Ametamey,
Molecules 18 (2013) 8535–49.
104. G.E. Hilbert, T.B. Johnson, J. Am. Chem. Soc. 52 (1930) 448994.
105. E.J. Corey, C.U. Kim, J. Am. Chem. Soc. 94 (1972) 75867.
144
LITERATURA
106. S. Krištafor, T. Gazivoda Kraljević, S.M. Ametamey, M. Cetina, I. Ratkaj, R. Tandara
Haček, S. Kraljević Pavelić, S. Raić-Malić, Chem. Bioodivers. 8 (2011) 145569.
107. S. Krištafor, I. Novaković, T. Gazivoda Kraljević, S. Kraljević Pavelić, P. Lučin, Y.
Westermaier, L. Pernot, L. Scapozza, S.M. Ametamey, S. Raić-Malić, Bioorg. Med. Chem.
Lett. 21 (2011) 61615.
108. S. Krištafor, T. Gazivoda Kraljević, M. Cetina, D. Makuc, J. Plavec, S. Raić-Malić, J.
Mol. Struct. 923 (2009) 1923.
109. Oxford Diffraction, Xcalibur CCD System. CrysAlisPro. Agilent Technologies,
Abingdon, Engleska, 2013.
110. M.C. Burla, R. Caliandro, M. Camalli, B. Carrozzini, G.L. Cascarano, L. De Caro, C.
Giacovazzo, G. Polidori, R. Spagna, J. Appl. Crystallogr. 38 (2005) 381–8.
111. G.M. Sheldrick, Acta Crystallogr. A64 (2008) 112–22.
112. A.L. Spek, J. Appl. Crystallogr. 36 (2003) 7–13.
113. C.F. Macrae, P.R. Edgington, P. McCabe, E. Pidcock, G.P. Shields, R. Taylor, M.
Towler, J. van de Streek, J. Appl. Crystallogr. 39 (2006) 453–7.
114. T. Gazivoda, S. Raić-Malić, V. Krištafor, D. Makuc, J. Plavec, S. Bratulic, S. Kraljević
Pavelić, K. Pavelić, L. Naesens, G. Andrei, R. Snoeck, J. Balzarini, M. Mintas Bioorg. Med.
Chem. 16 (2008) 5624–563.
115. J.D. Fissekis, A. Miles, G.B. Brown, J. Org. Chem. 29 (1964) 26703.
116. J.D. Fissekis, F. Sweet, J. Org. Chem. 38 (1973) 2649.
117. H. Griengl, E. Wanek, W. Schwarz, W. Strecher, B. Rosenwirth, E. De Clercq, J. Med.
Chem. 30 (1987) 1199204.
118. C.-S. Yu, F. Oberdorfer, Synthesis 12 (1999) 205764.
119. G.R. Geen, T.J. Grinter, P.M. Kincei, R.L. Jarvest, Tetrahedron 46 (1990) 690314.
120. B. Brand, C.B. Reese, Q. Song, C. Visintin, Tetrahedron 55 (1999) 523952.
121. S. Gronowitz, A.-B. Hörnfeldt, V. Kristjansson, T. Musil, Chem. Scr. 26 (1986) 3059.
122. M. Martić, L. Pernot, Y. Westermaier, R. Perozzo, T. Gazivoda Kraljević, S. Krištafor,
S. Raić-Malić, L. Scapozza, S.M. Ametamey, Nucleosides, Nucleotides Nucleic Acids 30
(2011) 293−315.
145
7. PRILOZI
PRILOZI
Slika p-1. Kromatogrami HPLC za inkubaciju dT (1 mM) s enzimom HSV1-TK i ATP te
kromatogrami HPLC slijepih proba (bez enzima ili bez dt). Reakcije su prekinute nakon a) 30
min, b) 60 min, c) 90 min.
a) nakon 30 min
slijepa proba 1 (bez HSV1-TK) slijepa proba 2 (bez dT)
ATP ATP
dT ADP
ADP
reakcija nakon 30 min
ATP
ADP
dT-MP dT
b) nakon 60 min
slijepa proba 1 (bez HSV1-TK) slijepa proba 1 (bez dT)
ATP ATP
dT ADP ADP
PRILOZI
reakcija nakon 60 min
ATP
ADP
dT-MP dT
c) nakon 90 min
slijepa proba 1 (bez HSV1-TK) slijepa proba 1 (bez dT)
ATP ATP
dT ADP ADP
reakcija nakon 90 min
ADP ATP
dT-MP
PRILOZI
Slika p-2. Kromatogrami HPLC za inkubaciju spoja 25 s enzimom (HSV1-TK ili hTK) i
ATP. Spoj 25 nije supstrat navedenih enzima.
HSV1-TK hTK
spoj 25 ATP spoj 25 ATP
HN
N
O
O
OH
OH
OH
Slika p-3. Kromatogrami HPLC za inkubaciju spoja 27 s enzimom (HSV1-TK ili hTK) i
ATP. Spoj 27 nije supstrat navedenih enzima.
HSV1-TK hTK
O
ATP
HN
N
spoj 27 spoj 27 ATP
OH
OOH
O
PRILOZI
Slika p-4. Kromatogrami HPLC za inkubaciju spoja 29 s enzimom (HSV1-TK ili hTK) i
ATP. Spoj 29 nije supstrat navedenih enzima.
HN
NO
OH
OH
O
O
R
Slika p-5. Kromatogrami HPLC za inkubaciju spoja 37 s enzimom HSV1-TK i ATP te
kromatogrami HPLC slijepih proba (bez enzima ili bez spoja 37). Reakcije su prekinute
nakon a) 30 min, b) 60 min, c) 90 min. Eluiranje s mobilnom fazom 0,2 M NaH2PO4, 25 mM
tetrabutilamonijevim hidrogensulfatom i 1 % metanola, protok 1 ml/min i kolonom
LiCrospher® 100 RP-18 (5 µm) nije omogućilo djelotvorno razdvajanje spoja 37 i ADP.
Dvije slijepe probe su provođene usporedno s reakcijama kako bi se eliminirala autohidroliza
ATP-a.
a) nakon 30 min
slijepa proba 1 (bez HSV1-TK) slijepa proba 2 (bez spoja 37)
ATP ATP
spoj 37
ADP
PRILOZI
reakcija nakon 30 min
ATP
ADP spoj 37
37-MP
b) nakon 60 min
slijepa proba 1 (bez HSV1-TK) slijepa proba 2 (bez spoja 37)
ATP ATP
spoj 37
ADP
reakcija nakon 60 min
ATP
ADP 37-MP spoj.37
PRILOZI
c) nakon 90 min
slijepa proba 1 (bez HSV1-TK) slijepa proba 2 (bez spoja 37)
ATP ATP
spoj 37 ADP
reakcija nakon 90 min
ATP
ADP
spoj 37 37-MP
Slika p-6. Kromatogrami HPLC za inkubaciju spoja 52 s enzimom HSV1-TK i ATP te
kromatogrami HPLC slijepih proba (bez enzima ili bez spoja 52). Reakcije su prekinute
nakon a) 30 min, b) 60 min, c) 90 min.
a) nakon 30 min
slijepa proba 1 (bez HSV1-TK) slijepa proba 2 (bez spoja 52)
ATP ATP
spoj 52
ADP ADP
PRILOZI
reakcija nakon 30 min
ATP
ADP
52-MP spoj 52
b) nakon 60 min
slijepa proba 1 (bez HSV1-TK) slijepa proba 2 (bez spoja 52)
ATP
ATP
ADP spoj 52 ADP
reakcija nakon 60 min
ATP ADP
52-MP spoj 52
PRILOZI
c) nakon 90 min
slijepa proba 1 (bez HSV1-TK) slijepa proba 2 (bez spoja 52)
ATP
ATP
ADP spoj 52 ADP
reakcija nakon 90 min
ADP ATP
52-MP spoj 52
Slika p-7. Kromatogrami HPLC za inkubaciju spoja 46 s enzimom HSV1-TK i ATP te
kromatogrami HPLC slijepih proba (bez enzima ili bez spoja 46). Reakcije su prekinute
nakon a) 30 i b) 60 min.
a) nakon 30 min
slijepa proba 1 (bez HSV1-TK) slijepa proba 2 (bez spoja 46)
ATP ATP
spoj 46
ADP ADP
PRILOZI
reakcija nakon 30 min
ATP
spoj 46
ADP
b) nakon 60 min
reakcija nakon 60 min
ATP
spoj 46
ADP
PRILOZI
Slika p-8. Radiokromatogrami UPLC tijeka reakcije radiooznačavanja prekursora 53
izotopom 18F. a) reakcijska smjesa nakon [18F]radiooznačavanja; b) reakcijska smjesa nakon
pročišćavanja koloni punjenoj silika-gelom Sep-Pak light: c) nakon hidrolize s 37 % HCl.
a)
b)
c)
Slika p-9. Kromatogrami HPLC (UV i radiokromatogram) pročišćavanja radiooznačenog
spoja HHB-5-[18F]FEP ([18F]52) uz eluens acetonitril/H2O.
[18F]-
N
N
OCH3
O
18F
O O
HN
N
O
O
18F
OH OH
PRILOZI
Slika p-10. Kromatogrami HPLC (UV i radiokromatogram) pročišćavanja radiooznačenog
spoja HHB-5-[18F]FEP ([18F]52) uz eluens 5 % etanol/20 mM fosfatni pufer (natrijev
hidrogen fosfat/natrijev fosfat).
HN
N
O
O
18F
Slika p-11. Kromatogrami HPLC (UV i radiokromatogrami) formuliranog produkta [18F]52
nakon radiooznačavanja (t = 0 h) te 4 h nakon radiooznačavanja.
t=0 h
t=4 h
OH OH
18 18F]52, HHB-[[ F]FEP
PRILOZI
Tablica p-1. Kemijski pomaci (δ/ppm) i konstante sprege (J/Hz) u spektrima a)1H, b)13C i
c)19F NMR za monofluorirane (E-69 i Z-69) derivate pirimidina i difluorirani (70) derivat.
a) SPOJ NH H-1' H-3'a H-3'b CH3-N CH3-5 OH-b
E-69 11,28 (1H, s) /
11,30 (1H, s)a 6,27 (1H, s)
5,10 (1H, dd, J=12,2 Hz,
JHF = 46,8 Hz)
5,14 (1H, dd, J=12,2 Hz,
JHF = 46,8 Hz)
3,873,95 (2H, m) 3,13 (3H, s) 1,65 (3H, s) 5,04
(1H, t, J = 5,1 Hz)
Z-69
11,28 (1H, s) /
11,30 (1H, s)a 6,37 (1H, s)
4,84 (1H, dd, J=11,4 Hz,
JHF = 46,8 Hz)
4,87 (1H, dd, J=11,4 Hz,
JHF =46,8 Hz)
4,16-4,20 (2H, m) 3,10 (3H, s) 1,65 (3H, s) 5,31
(1H, t, J = 5,3 Hz)
70 11,35 (1H, s) 6,58 (1H, s) 4,835,07 (2H, m) 5,17
(2H, d, JHF = 46,4 Hz) 3,11 (3H, s) 1,65 (3H, s)
a kemijski pomaci za NH nisu se mogli jednoznačno pripisati pojedinom izomeru
b) SPOJ CH3-5 CH3-N C-2 C-4 C-5 C-6 C-1' C-2' C-3'a C-3'b
E-69 11,5 31,7 151,0 163,4 107,0
147,1
(d, J CF = 1,5
Hz) /
147,0 (s)a
118,1
(d, J CF = 12,2
Hz)
143,2
(d, J CF = 13,0
Hz)
82,7
(d,
JCF = 166,3
Hz)
57,4
Z-69 11,6 31,8 151,0 163,3 107,0
147,1 (d,
J CF =1,5 Hz)/
147,0 (s)a
118,7
(d, J CF = 8,4 Hz)
143,4
(d,
J CF = 14,5
Hz)
79,6
(d,
J CF =160,2
Hz)
60,7
70 11,5 31,7 150,9 163,3 107,3 145,7 (m)
123,0
(dd, J CF = 11,4
Hz, J = 7,6 Hz)
138,0
(dd,
J CF = 15,1 Hz,
J = 14,0 Hz)
79,0
(dd,
J CF=161,0
Hz, J = 2,7
Hz)
82,1
(dd,
J CF =166,3
Hz, J = 3,4
Hz)
c)
SPOJ C-3'aF C-3'bF
E-69 -219,3
(m, J = 46,8 Hz, J = 2,9 Hz)
Z-69 -221,0 (m, J = 46,8 Hz, J = 2,1 Hz)
70 222,2 (m, J = 46,4 Hz, J = 2,1 Hz) 218,5
(m, J = 46,4 Hz, J= 2,8 Hz)
ŽIVOTOPIS
ŽIVOTOPIS
OSOBNE
INFORMACIJE
Andrijana Meščić
TTdatum rođenja: TT10/05/1985
mjesto rođenja: Gradačac, Bosna i Hercegovina
email: [email protected]
tel. +385 1 4597216
RADNO ISKUSTVO
2009.−danas znanstveni novak, Zavod za organsku kemiju, Fakultet kemijskog inženjerstva i tehnologije, Sveučilište u Zagrebu
OBRAZOVANJE
01.11.2012.–28.11.2012. Institut farmaceutskih znanosti, ETH Zürich, Švicarska __provela radiooznačavanje izotopom 18F, iskustvo u uzgoju stanica
23.10.2011.–30.11.2011. Section des Sciences Pharmaceutiques, Faculté des Sciences, Université de Genève, Švicarska __provela test fosforiliranja prethodno sintetiziranih spojeva pomoću enzima HSV1-TK
2009.–danas poslijediplomski doktorski studij Inženjerska kemija
2004.–2009. Fakultet kemijskog inženjerstva i tehnologije, smjer: Organski procesi i proizvodi, Sveučilište u Zagrebu
2000.–2004. Gimnazija Petra Preradovića u Virovitici, opća gimnazija
DODATNE
INFORMACIJE
rad na popularizaciji znanosti jedna od voditeljica radionica za javnost: Duga na kemijskom stolu; Zabavni i poučni eksperimenti u kemiji sudjelovanje na Festivalu znanosti 2010., 2011., 2012 i 2013. u Zagrebu sudjelovanje na ‘Noć istraživača 2012.' u Slavonskom Brodu sudjelovanje u HRT emisiji Školski sat; prilog Boje
nagrade 2005.- najbolji student prve godine u akademskoj godini 2004./2005. 2007 - najbolji student treće godine u akademskoj godini 2006./2007. 2008 - najbolji student četvrte godine i najuspješniji student smjera: Kemijsko inženjerstvo i tehnologija u akademskoj godini 2007./2008.
projekti rad na međunarodnom i nacionalnom projektu: ‘Development of novel C-5 fluoroalkyl N-acyclic pyrimidine nucleoside
analogs as PET tracers for in situ monitoring of gene and cell-based therapies using HSV1-TK as a reporter gene', SCOPES 2009–2012 (SNF) ‘Razvoj i primjena novih molekula u pozitronskoj emisijskoj tomografiji (PET)' (Ministarstvo znanosti obrazovanja i sporta)
znanstveni radovi A. Meščić, T. Betzel, A. Muller, R. Slavik, S. Čermak, S. Raić-Malić, S.M. Ametamey, Synthesis and Biological Evaluation of a New Acyclic Pyrimidine Derivative as a Probe for Imaging Herpes Simplex Virus Type 1 Thymidine Kinase Gene Expression, Molecules 18 (2013) 8535–49.
A. Meščić, S. Krištafor, I. Novaković, A. Osmanović, U. Müller, D. Završnik, S.M. Ametamey, L. Scapozza, S. Raić-Malić, C-5 Hydroxyethyl and Hydroxypropyl Acyclonucleosides as Substrates for Thymidine Kinase of Herpes Simplex Virus Type 1 (HSV-1 TK): Synthesis and Biological Evaluation, Molecules 18 (2013) 5104–24.
ŽIVOTOPIS
A. Meščić, D. Glavač, A. Osmanović, D. Završnik, M. Cetina, D. Makuc, J. Plavec, S. M. Ametamey, S. Raić-Malić, N-alkylated and O-alkylated Regioisomers of 5-(Hydroxyalkyl)pyrimidines: Synthesis, Structural and Conformational Study, J. Mol. Struct. 1039 (2013) 160–6.
S. Krištafor, A. Meščić, M. Cetina, S. Korunda, D. Makuc, J. Plavec, S. Raić-Malić, Synthesis, structural and conformational studies of Z- and E-isomers of fluorinated C-6 isobutenyl N-methyl thymine derivatives, J. Fluor. Chem. 132 (2011) 573–8.
sudjelovanje na kongresima A. Meščić, D. Glavač, S. Raić-Malić, Sinteza i biološka ispitivanja C-
5 supstituiranih N-dihidroksiizobutilnih derivata pirimidina, Nove tehnologije i transfer znanja, Zagreb, 2012, Knjiga sažetaka, str.149.
S. Raić-Malić, S. Krištafor, T. Gazivoda Kraljević, A. Meščić, L. Pernot, L. Scapozza, S.M. Ametamey, Novel Pyrimidine Nucleoside Analogs Comprising a Dihydroxyisoalkyl or Dihydroxyisoalkenyl Unit as Ligands for Gene Expression Monitoring, Interfacing Chemical Biology and Drug Discovery, Poitiers, France, 2012, Knjiga sažetaka, str. 220.
A. Meščić, S. Krištafor, S.M. Ametamey, L. Scapozza, S. Raić-Malić, Sinteze i biološka ispitivanja C-5 hidroksietil N- acikličkih pirimidinskih analoga nukleozida, XXII. Hrvatski skup kemičara i kemijskih inženjera, Zagreb, 2011, Knjiga sažetaka, str. 179.
I. Kikaš, M. Kovács, A. Meščić, M. Šindler, I. Škorić, O. Horváth, Synthesis, photophysical and photochemical characterization of novel functionalized 2, 3- distyrylfurans ; Substituent and solvent effects on their photobehaviour, Central European Conference on Photochemistry_CECP 2010, Graz, Austria, 2010, Knjiga sažetaka.
M. Klika, M. Petrović, A. Meščić, S. Raić-Malić, S. Krištafor, Novi derivati pirimidina kao potencijalni PET-"tragači", VIII. susret mladih kemijskih inženjera, Zagreb, 2010, Knjiga sažetaka, str. 99.
I. Novaković, A. Meščić, S. Krištafor, S. Raić-Malić, Sinteza novih C-6 alkenilnih derivata pirimidina za in vivo praćenje ekspresije gena HSV1-TK, VIII. susret mladih kemijskih inženjera, Zagreb, 2010, Knjiga sažetaka, str. 105.
Recommended
